專利名稱：Nppa基因snp檢測特異性引物和液相芯片的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及醫(yī)學和生物技術，具體的是涉及一種NPPA基 因SNP檢測特異性引物和液相芯片。
背景技術：
心房利鈉肽(Atrial natriuretic peptide，ANP)屬于利鈉肽家族，ANP通過與受
體結合激活鳥苷酸環(huán)化酶，促進細胞內(nèi)環(huán)鳥苷酸水平升高，從而發(fā)揮生物學功能。心 房利鈉肽具有利鈉、利尿、舒張血管平滑肌、抑制細胞增殖等多種作用，在維持血壓、 水/鈉平衡以及在心血管疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。心房利鈉肽的編碼基因 (Natriuretic peptide precursor A, NPPA)位于染色體 Ip36，研究表明，NPPA 基因多態(tài)性 在哮喘和高血壓發(fā)生進展過程中起著重要作用，此多態(tài)性位點包括位于外顯子3中的 T2238C(rs5065)突變，此突變使第152位的精氨酸被蘇氨酸取代(Argl52Ter)，發(fā)生在外 顯子1中的G664A突變(rs5063)，此突變使第32位的蛋氨酸突變成纈氨酸(Met32Val)， 以及發(fā)生在3，非編碼區(qū)的T85C突變，即rs5067 (A > G)。目前，檢測NPPA突變的檢測方法一般是基于PCR技術的RT-PCR、熒光定量 PCR, PCR-RFLP等，該技術存在靈敏度低，樣品易污染、假陽性率高的缺點，同時由 于檢測通量的局限性，不能滿足實際應用的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供NPPA基因SNP檢測液相芯片。該液相芯片可用于檢 測NPPA基因三種常見基因型rs5063 (A > G)、rs5065 (Τ > C)和rs5067 (A > G)的野生
型和突變型。實現(xiàn)上述目的的技術方案如下一種NPPA基因SNP檢測液相芯片，主要包括有(A)針對NPPA基因的SNP位點，分別設計的野生型和突變型的ASPE引物對 每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對SNP位點的特異性引物組成，所述特 異性引物是針對rs5063SNP位點的SEQ IDN0.7和SEQ IDN0.8、針對rs5065SNP位點 的 SEQ IDN0.9 和 SEQ IDN0.10、禾口 / 或針對 rs5067SNP 位點的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO.12 ；所述 tag 序列選自 SEQID N0.1 SEQ ID N0.6 ；(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag 序列選自SEQ IDN0.13 SEQ ID NO. 18中的序列，且所述anti-tag序列能相應地與(A) 中所選的tag序列互補配對，且所述anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；(C)用于擴增出具有rs5063、rs5065和/或rs5067的SNP位點的ADRBl基因 目標序列的擴增引物。優(yōu)選地，所述擴增引物為針對rs5063SNP位點的SEQ ID NO.19和SEQ ID N0.20、針對 rs5065SNP 位點的 SEQ ID N0.21 和 SEQ ID N0.22、和 / 或針對 rs5067SNP位點的 SEQ ID N0.23 和 SEQ IDN0.24。 優(yōu)選地，所述ASPE弓丨物對為針對rs5063SNP位點的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0.7組成的序列以及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.8組成的序列、針對rs5065SNP位 點的由SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.9組成的序列以及由SEQ ID N0.4和SEQ ID NO. 10組 成的序列、禾日/或針對rs5067SNP位點的由SEQ ID N0.5和SEQ ID NO. 11組成的序列以 及由SEQ ID N0.6和SEQ ID NO. 12組成的序列。優(yōu)選地，所述anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述間隔臂序列 為5-10個T。本發(fā)明的另一目的是提供用于NPPA基因SNP檢測的特異性引物。具體技術方案如下一種用于NPPA基因SNP檢測的特異性引物，包括有針對rs5063SNP位點的 SEQ ID N0.7 和 SEQ ID N0.8、針對 rs5065SNP 位點的 SEQ ID NO.9 和 SEQ ID N0.10、 和 / 或針對 rs5067SNP 位點的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于1.本發(fā)明所提供的液相芯片與測序法的結果吻合率高達100%。所制備的NPPA 基因SNP檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設計的探針以及anti-tag序列 之間基本上不存在交叉反應，tag標簽序列、anti-tag標簽序列的選取以及tag標簽序列與 具體ASPE引物的結合，能夠避免交叉反應，實現(xiàn)多個SNP位點的并行檢測。2.本發(fā)明設計的ASPE型特異性引物具有非常好的特異性，能準確區(qū)分各種型別 的基因型。3.本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，三種SNPs檢測可通過一步多重PCR即可完成三 個含有SNP位點的目標序列的擴增，避免了反復多次PCR等復雜操作過程中存在的諸多 不確定因素，因而可大大提高檢測準確率，體現(xiàn)了精確的同時定性、定量分析特征。4.本發(fā)明所提供的檢測方法所需要的時間遠遠低于常用的測序技術，特別符合 實際應用需要。5.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測結果的可重復性差的缺 陷，同時對現(xiàn)有的液相芯片技術進行改進，使得所制備微球能適用于不同的檢測項目， 具有很強的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進一步得到提 高，信噪比增強，檢測結果更加準確可靠。
具體實施例方式實施例1 NPPA基因SNP檢測液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物針對NPPA 基因的三種常見基因型 rs5063 (A > G)、rs5065 (Τ > C)和 rs5067 (A
>G)的野生型和突變型，分別設計特異性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特異性 引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示表INPPA基因的ASPE引物序列(Tag序列+特異性引物序列)
權利要求
1.一種NPPA基因SNP檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(A)針對NPPA基因的SNP位點，分別設計的野生型和突變型的ASPE引物對每 種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對SNP位點的特異性引物組成，所述特異性 引物是針對rs5063SNP位點的SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8、針對rs5065SNP位點的 SEQ ID N0.9 和 SEQ ID N0.10、禾口 / 或針對 rs5067SNP 位點的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12 ；所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.6 ；(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti-tag序 列選自SEQID NO. 13 SEQ ID NO. 18中的序列，且所述anti-tag序列能相應地與(A)中 所選的tag序列互補配對，所述anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；(C)用于擴增出具有rs5063、rs5065和/或rs5067SNP位點的ADRBl基因目標序列 的擴增引物。
2.根據(jù)權利要求1所述的NPPA基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引 物為針對 rs5063SNP 位點的 SEQ ID N0.19 和 SEQ ID N0.20、針對 rs5065SNP 位點的 SEQ ID N0.21 和 SEQ IDN0.22、禾Π / 或針對 rs5067SNP 位點的 SEQ ID N0.23 和 SEQ ID N0.24。
3.根據(jù)權利要求1所述的NPPA基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述ASPE引物 對為針對rs5063SNP位點的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7組成的序列以及由SEQ ID N0.2 和 SEQ IDN0.8 組成的序列、針對 rs5065SNP 位點的由 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.9 組成的序列以及由SEQID N0.4和SEQ ID NO. 10組成的序列、和/或針對rs5067SNP位 點的由SEQ ID N0.5和SEQ IDNO.ll組成的序列以及由SEQ ID N0.6和SEQ ID NO. 12組 成的序列。
4.根據(jù)權利要求1-3任一項所述的NPPA基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述 間隔臂序列為5-10個T。
5.—種用于NPPA基因SNP檢測的特異性引物，其特征是，包括有針對rs5063SNP 位點的 SEQID N0.7 和 SEQ ID N0.8、針對 rs5065SNP 位點的 SEQ ID N0.9 和 SEQ ID N0.10、和 / 或針對 rs5067SNP 位點的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID N0.12。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種NPPA基因SNP檢測特異性引物和液相芯片，該液相芯片主要包括有由5’端的tag序列和3’端針對SNP位點的特異性引物組成的ASPE引物，所述特異性引物是針對rs5063SNP位點的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、針對rs5065SNP位點的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、和/或針對rs5067SNP位點的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；所述tag序列選自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6；分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的微球；擴增引物。本發(fā)明所提供的液相芯片與測序法的結果吻合率高達100％。所制備的NPPA基因SNP檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比。
文檔編號C12Q1/68GK102010899SQ20101019684
公開日2011年4月13日 申請日期2010年6月8日 優(yōu)先權日2010年6月8日
發(fā)明者余剛, 曾濤, 秦會娟, 許嘉森 申請人:廣州益善生物技術有限公司