專利名稱：：能夠代謝亞磷酸鹽作為磷源的轉(zhuǎn)基因植物和真菌的制作方法能夠代謝亞磷酸鹽作為磷源的轉(zhuǎn)基因植物和真菌對優(yōu)先權(quán)申請的交叉引用根據(jù)35U.S.C.§119(e)、巴黎公約優(yōu)先權(quán)和任何及所有其它適用法律，本申請基于2008年11月19日提交的美國臨時專利申請系列號61/199，784并要求其權(quán)益，該申請為了所有目的通過引用全文并入本文。引言磷是植物和真菌生長的必需元素。這種元素以氧化形式摻入植物或真菌細(xì)胞中的許多生物分子，諸如以提供除了其它以外，遺傳材料、膜和分子信使。無機(jī)磷酸鹽(Pi)是植物的主要磷源。相應(yīng)地，基于磷酸鹽的肥料提供了強化植物生長的廉價且廣泛使用的方法。然而，基于磷酸鹽的肥料來自于不可再生的資源，已預(yù)計這種不可再生的資源將在下一個70年到100年中耗盡，或如果利用速率增加得比預(yù)期更快則耗盡時間更短。由于多種重要原因，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)常用的基于磷酸鹽的肥料通常不能被栽培植物有效利用。首先，磷酸鹽是高度反應(yīng)性的，并且可以與許多土壤組分形成不溶復(fù)合物，這減少了可利用的磷的量。其次，土壤微生物可以快速地將磷酸鹽轉(zhuǎn)化為植物通常不能有效代謝的有機(jī)分子，這進(jìn)一步減少了可利用的磷的量。第三，基于磷酸鹽的肥料能夠刺激雜草的生長，這不僅更進(jìn)一步減少了可利用的磷的量，而且還能鼓勵雜草與栽培植物競爭空間和其它營養(yǎng)。由于磷酸鹽轉(zhuǎn)化為對于植物攝取和利用不易獲得的無機(jī)形式和有機(jī)形式和與雜草競爭所致的損失意味著過量磷酸鹽肥料的使用，這不僅增加了生產(chǎn)成本，而且導(dǎo)致嚴(yán)重的生態(tài)學(xué)問題。因此，對減少農(nóng)業(yè)使用的磷酸鹽肥料的量存在迫切需求。磷酸鹽的還原形式亞磷酸鹽(Phi)也用在植物的栽培中。已經(jīng)顯示，用亞磷酸鹽處理可增加鱷梨和柑橘果實的植物產(chǎn)量(以果實大小和生物量測量)。亞磷酸鹽可利用與磷酸鹽相同的運輸系統(tǒng)運輸?shù)街参镏?，并且可在植物組織中積累延長的時間段。然而，明顯沒有植物中的任何酶能將亞磷酸鹽代謝為植物中的主要磷源磷酸鹽的報告。而且，即使在磷酸鹽饑餓期間，亞磷酸鹽明顯不能滿足植物的磷營養(yǎng)需求。因此，盡管與磷酸鹽相似，亞磷酸鹽是通常不能被植物直接代謝的磷形式，因此不是植物營養(yǎng)。盡管如此，亞磷酸鹽“肥料”在市場出售，即使科學(xué)文獻(xiàn)中似乎沒有證據(jù)或甚至跡象表示植物能同化亞磷酸鹽。亞磷酸鹽可間接地促進(jìn)植物生長。例如，亞磷酸鹽用作栽培植物的抗真菌劑(殺真菌劑)。認(rèn)為亞磷酸鹽阻止由卵菌(水霉)對不同植物如除了其它以外的馬鈴薯、煙草、鱷梨和番木瓜引起的疾病。如此，亞磷酸鹽可能促進(jìn)植物生長，不是直接作為植物營養(yǎng)，而是通過保護(hù)植物免受否則將影響植物生長的真菌病原體的影響。盡管如此，基于亞磷酸鹽的殺真菌劑通常仍標(biāo)為肥料。這種錯貼標(biāo)簽可能是被政府規(guī)章鼓勵的，如果制造商將殺真菌劑標(biāo)為肥料，政府規(guī)章使得批準(zhǔn)過程較短和較不復(fù)雜。亞磷酸鹽充當(dāng)殺真菌劑的建議機(jī)制是多方面的。例如，亞磷酸鹽可通過無機(jī)焦磷酸鹽(PPi)的積累的增加抑制磷酸化反應(yīng)來作用于真菌，這進(jìn)而可阻斷在代謝上關(guān)鍵的磷酸鹽途徑。可選地或此外，亞磷酸鹽可誘導(dǎo)植物中的天然防御反應(yīng)。在任何情況中，亞磷酸鹽作為殺真菌劑的效力可受許多因素影響，包括環(huán)境、病原體類型、植物類型和濃度。接觸植物的亞磷酸鹽的濃度可能是亞磷酸鹽有效性的關(guān)鍵因素，因為太多亞磷酸鹽可以對植物有毒。尤其是，亞磷酸鹽可能與磷酸鹽競爭進(jìn)入植物細(xì)胞，因為亞磷酸鹽可以經(jīng)由磷酸鹽運輸系統(tǒng)運輸?shù)街参镏?。因此，亞磷酸鹽的毒性可能是因為(1)植物對磷酸鹽的同化減少，連同(不能通過氧化為磷酸鹽而利用亞磷酸鹽作為磷源，這導(dǎo)致亞磷酸鹽在植物中積累。而且，亞磷酸鹽可能被植物感知為磷酸鹽，這阻止了植物誘導(dǎo)促進(jìn)植物在低磷酸鹽條件下存活的磷補救途徑。亞磷酸鹽毒性影響不同植物如黑芥(Brassicanigra),洋蔥(Alliumcepa、onion)、玉米(ZeamaysL.、corn)禾口擬南芥(Arabidopsisthaiiana)。因此，可能需要非常小心地控制植物對亞磷酸鹽的暴露。所以，需要更好的系統(tǒng)來利用亞磷酸鹽對植物的益處，同時減少其缺點。轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生有助于創(chuàng)建改進(jìn)的農(nóng)業(yè)系統(tǒng)。已經(jīng)建立了至少四種選擇系統(tǒng)用于通過選擇性生長鑒定轉(zhuǎn)基因植物。每種選擇系統(tǒng)是基于對抗生素(卡那霉素或潮霉素)或除草劑(草甘膦或草丁膦)的抗性。然而，每種選擇系統(tǒng)都有缺陷。例如，每種選擇系統(tǒng)可能具有毒性問題。而且，用抗生素選擇可能是無效率的，因為植物可能具有替代的抗性機(jī)制。此外，除了利用草丁膦的選擇系統(tǒng)以外，所有選擇系統(tǒng)都不能提供對大多數(shù)或所有植物“通用的”選擇性標(biāo)記。因此，需要用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的新的選擇性標(biāo)記。鍵本公開提供用于制備和使用代謝亞磷酸鹽作為磷源用于支持生長的轉(zhuǎn)基因植物和/或轉(zhuǎn)基因真菌的系統(tǒng)，包括方法和組合物。附圖簡述圖1是示意根據(jù)本公開的各方面，如下示例方法的示意性流程圖(i)制備能夠代謝還原形式的磷諸如亞磷酸鹽作為磷源用于支持生長的轉(zhuǎn)基因植物(或真菌)，和/或(ii)利用賦予代謝還原形式的磷諸如亞磷酸鹽作為磷源用于支持生長的能力的核酸作為選擇性標(biāo)記。圖2是根據(jù)本公開的各方面，用于圖1方法的示例核酸的示意圖。圖3是根據(jù)本公開的各方面，利用從施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)的PtxD和htxA基因表達(dá)的酶在細(xì)菌中將次磷酸鹽氧化為磷酸鹽的建議機(jī)制。圖4是根據(jù)本公開的各方面，用于產(chǎn)生將亞磷酸鹽代謝為磷酸鹽的轉(zhuǎn)基因植物而構(gòu)建的示例嵌合基因的示意圖。圖5是根據(jù)本公開的各方面，產(chǎn)生圖4的嵌合基因所遵循的策略的一部分的示意圖。圖6是根據(jù)本公開的各方面，顯示以圖4的嵌合基因用作選擇性標(biāo)記，通過選擇轉(zhuǎn)基因植物在磷酸鹽不存在時在含亞磷酸鹽的培養(yǎng)基上生長的能力而獲得的示例數(shù)據(jù)的一對照片。圖7是根據(jù)本公開的各方面，從有或沒有亞磷酸鹽(Wii)或磷酸鹽(Pi)作為磷源的液體生長培養(yǎng)基中萌發(fā)和培育的對照和轉(zhuǎn)基因(PtxD)擬南芥株系的生長試驗獲得的數(shù)據(jù)的一系列照片。圖8是根據(jù)本公開的各方面，從圖7的擬南芥株系自其生長培養(yǎng)基中得到磷的能力的試驗獲得的數(shù)據(jù)的柱狀圖，該植物在含有不同濃度的亞磷酸鹽(Phi)作為磷源的生長培養(yǎng)基中培育了45天。圖9是根據(jù)本公開的各方面，用于圖10和11實驗的對照(WT)和ptxD轉(zhuǎn)基因(PTXD)擬南芥植物在生長基質(zhì)上的分布的示意圖。圖10是根據(jù)本公開的各方面，根據(jù)圖9分布并且被檢驗在含有磷酸鹽(Pi)作為磷源的基質(zhì)上的生長的親代和PtxD轉(zhuǎn)基因植物的照片。圖11是根據(jù)本公開的各方面，根據(jù)圖9分布并且被測試在含有亞磷酸鹽(Wii)作為磷源的基質(zhì)上的生長的親代和PtxD轉(zhuǎn)基因植物的照片。圖12是根據(jù)本公開的各方面，從在不存在或存在磷酸鹽和/或亞磷酸鹽作為磷源時培育的圖7的擬南芥株系重量增加的能力試驗獲得的數(shù)據(jù)的柱狀圖。圖13是根據(jù)本公開的各方面，在磷酸鹽或亞磷酸鹽作為磷源存在時，萌發(fā)25天后煙草(Nicotianatabacum,tobacco)的對照(WT)和ptxD轉(zhuǎn)基因株系的一組照片。圖14是根據(jù)本公開的各方面，以圖13的對照和轉(zhuǎn)基因煙草株系進(jìn)行的另一生長實驗的一組照片。艦本公開提供用于制備和使用代謝亞磷酸鹽作為磷源用于支持生長的轉(zhuǎn)基因植物和/或轉(zhuǎn)基因真菌的系統(tǒng)，包括方法和組合物。植物和/或真菌任選地還可代謝次磷酸鹽作為磷源。本文公開的系統(tǒng)可實質(zhì)上改變磷的更還原的形式(相對于磷酸鹽)諸如亞磷酸鹽用作肥料和/或殺真菌劑的方式。系統(tǒng)還可提供用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物和/或真菌的新的選擇性標(biāo)記。系統(tǒng)還可以實質(zhì)上改變從廢水諸如工業(yè)/城市污水中去除至少一種還原形式的磷的方式。提供了核酸。核酸可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物和/或真菌。核酸可稱為構(gòu)建體，可包括賦予植物細(xì)胞和/或真菌細(xì)胞將至少一種還原形式的磷代謝為磷酸鹽的能力的至少一種嵌合基因。在一些實施方案中，核酸可包括表達(dá)亞磷酸鹽脫氫酶的基因、表達(dá)次磷酸鹽脫氫酶的基因、或二者。核酸可包括包含編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄啟動子的嵌合基因。編碼區(qū)可編碼一種亞磷酸鹽脫氫酶，除了其它以外，諸如來自施氏假單胞菌的PtxD、來自相同或另一細(xì)菌物種的PtxD同源物(homolog)、或兩者中的任一種的衍生物。在一些實例中，編碼區(qū)可與施氏假單胞菌的PtxD編碼序列至少80%、90%或95%(或完全)相同。啟動子可以是在植物、真菌、或二者中起作用的，并且可以可操作地連接于編碼區(qū)。啟動子可以是相對于編碼區(qū)異源的。嵌合基因可以能夠促進(jìn)該酶在包含該核酸的植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞中充分表達(dá)，以對所述細(xì)胞賦予代謝亞磷酸鹽(Phi)作為磷源用于支持生長的能力，從而使得所述細(xì)胞在沒有外部來源的磷酸鹽(Pi)時能夠生長。啟動子可以是(或可以不是)植物啟動子或植物病毒的病毒啟動子，并且可以能夠促進(jìn)酶在植物細(xì)胞中的充分表達(dá)。例如，啟動子，諸如從擬南芥PLDZ2基因獲得的啟動子是被低磷酸鹽可用性可誘導(dǎo)的?？蛇x地或此外，啟動子可以是根特異性啟動子。在其它情況中，啟動子可以是組成型的，并且可對應(yīng)于花椰菜花葉病毒的35S啟動子。在一些實施方案中，核酸可包括在植物細(xì)胞和/或真菌細(xì)胞中是起作用的并可操作地連接于啟動子和編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄終止子。在一些實施方案中，啟動子可以是能夠促進(jìn)酶在真菌細(xì)胞中充分表達(dá)的真菌啟動子。核酸可提供將至少一種還原形式的磷代謝為磷酸鹽的一種或多種多肽的表達(dá)，使得轉(zhuǎn)基因植物(或真菌)能夠使用還原形式的磷作為營養(yǎng)。一種或多種多肽的表達(dá)可以是可遺傳的。例如，該核酸可整合到植物(或真菌)基因組中。此外，除了其它以外，至少一種多肽的表達(dá)可處于組成型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子控制下(如，可被低磷酸鹽誘導(dǎo)，諸如通過使用來自擬南芥PLDZ2基因或植物高親和力磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的AtPTl基因的啟動子)，處于組織特異性啟動子(如，葉特異性或根特異性)控制下、或其組合。提供了從嵌合基因表達(dá)亞磷酸鹽脫氫酶的植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞。在多細(xì)胞結(jié)構(gòu)(如，植物或菌絲體)中，該細(xì)胞可與其它細(xì)胞隔離，或可與其它細(xì)胞結(jié)合(associate)。細(xì)胞還可能(或可能不)從嵌合基因表達(dá)次磷酸鹽脫氫酶。因此，細(xì)胞可代謝亞磷酸鹽、次磷酸鹽、或二者作為磷源用于支持生長。在一些實施方案中，細(xì)胞可以是植物細(xì)胞，并且亞磷酸鹽脫氫酶、次磷酸鹽脫氫酶(如果存在)、或二者的表達(dá)可被根特異性啟動子控制。植物細(xì)胞可來自任何適合的物種。例如，植物細(xì)胞可以是真核藻類細(xì)胞，諸如衣藻屬細(xì)胞。在其它情況中，植物細(xì)胞可以來自維管植物的物種。在一些實施方案中，細(xì)胞可以是屬于木霉屬(Trichoderma)物種或?qū)儆谀軌蚺c植物形成共生關(guān)系的真菌的菌根物種的真菌細(xì)胞。提供了從一種或多種嵌合基因表達(dá)亞磷酸鹽脫氫酶和任選的次磷酸鹽脫氫酶的轉(zhuǎn)基因植物(或植物部分)。植物可以經(jīng)由酶的表達(dá)來代謝亞磷酸鹽和/或次磷酸鹽作為磷源用于支持生長。植物可以是維管植物，諸如農(nóng)作物，例如，選自玉米、大豆、水稻、馬鈴薯、番茄、甘蔗和小麥組成的組的農(nóng)作物物種。還提供了萌發(fā)以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的種子。提供了減少植物真菌感染的方法。多個真菌細(xì)胞可施加到植物的種子形式、植物本身、已布置(dispose)或?qū)⒉贾弥参锏耐寥馈⒒蚱浣M合。真菌細(xì)胞可從嵌合基因表達(dá)亞磷酸鹽脫氫酶，并且可屬于木霉屬物種。提供了與多個真菌細(xì)胞結(jié)合以形成菌根的植物。這些真菌細(xì)胞可從嵌合基因表達(dá)亞磷酸鹽脫氫酶。通過將亞磷酸鹽氧化為磷酸鹽，這些真菌細(xì)胞可使得植物能夠在作為磷源的亞磷酸鹽(和/或次磷酸鹽)上生長。提供了利用次磷酸鹽和/或亞磷酸鹽作為磷源用于支持生長對農(nóng)作物施肥的方法。農(nóng)作物可表達(dá)亞磷酸鹽脫氫酶、次磷酸鹽脫氫酶、或二者。可選地或此外，農(nóng)作物可與表達(dá)亞磷酸鹽脫氫酶、次磷酸鹽脫氫酶、或二者的多個真菌細(xì)胞形成菌根?？上蛑参锖?或植物附近的土壤施加至少一種還原形式的磷諸如亞磷酸鹽和/或次磷酸鹽，以使該還原形式被植物和/或菌根代謝為磷酸鹽以支持植物的生長和生產(chǎn)力。提供了處理廢液(如，污水)以降低其還原磷的含量的方法。接觸是在(i)包含次磷酸鹽和/或亞磷酸鹽作為污染物的水與(ii)表達(dá)亞磷酸鹽脫氫酶、次磷酸鹽脫氫酶、或二者的多個植物細(xì)胞和/或真菌細(xì)胞之間進(jìn)行，從而至少一部分的次磷酸鹽和/或亞磷酸鹽被氧化為亞磷酸鹽和/或磷酸鹽。在一些情況中，接觸可在水與表達(dá)所述酶中的一種或兩種的多個維管植物之間進(jìn)行。該方法可提供由于工業(yè)生產(chǎn)而被污染的河流、水庫、土壤、收集槽等等的生物除污系統(tǒng)。例如，亞磷酸鹽是工業(yè)場所附近的河流和湖泊中的常見污染劑，諸如使用次磷酸鹽來減少化學(xué)電鍍工藝中的金屬離子的光盤(如，DVD和CD)制造廠。因此，通過獲取次磷酸鹽和/或亞磷酸鹽并將其轉(zhuǎn)化為磷酸鹽，本文公開的轉(zhuǎn)基因植物和/或真菌可幫助從受污染的水去除次磷酸鹽和/或亞磷酸鹽。使用植物和/或真菌可比利用基于細(xì)菌的系統(tǒng)更有效。提供了利用亞磷酸鹽脫氫酶的編碼序列作為選擇性標(biāo)記來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法。該方法可用于獲得以編碼亞磷酸鹽脫氫酶的核酸轉(zhuǎn)化的植物，所述亞磷酸鹽脫氫酶可9從作為選擇性標(biāo)記的核酸表達(dá)。植物細(xì)胞與包括該核酸的組合物可在促進(jìn)所述核酸被引入植物細(xì)胞的條件下接觸。植物細(xì)胞可在包含亞磷酸鹽作為用于植物細(xì)胞生長的主要或唯一磷源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)?？蓪νㄟ^接觸步驟和培養(yǎng)步驟產(chǎn)生并且由在所述培養(yǎng)基中生長而證明表達(dá)亞磷酸鹽脫氫酶的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞進(jìn)行選擇。可將至少一部分的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生為轉(zhuǎn)基因植物。本文公開的轉(zhuǎn)基因植物可提供實質(zhì)的益處。例如，在一些情況中，這些植物可利用NAD+作為電子受體來代謝亞磷酸鹽以產(chǎn)生NADH和磷酸鹽，這二者都是對植物有用的分子。轉(zhuǎn)基因植物還可以或可選地可以提供基于亞磷酸鹽的新農(nóng)業(yè)系統(tǒng)的開發(fā)。亞磷酸鹽在土壤中可能比磷酸鹽反應(yīng)性低，因此可能產(chǎn)生更少的植物不能利用的不溶化合物。而且，因為大多數(shù)土壤微生物不能代謝亞磷酸鹽，較少的亞磷酸鹽(相對于磷酸鹽)被轉(zhuǎn)化為植物不能利用的有機(jī)形式。此外，相對于磷酸鹽，亞磷酸鹽可對植物周圍的細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)具有更小的影響。雜草競爭也可以大大地減少，因為雜草應(yīng)該不能利用亞磷酸鹽。因此，使用亞磷酸鹽將減少肥料成本并減少肥料對環(huán)境的負(fù)面影響。本文公開的轉(zhuǎn)基因植物還可提供作為殺真菌劑同時作為肥料的亞磷酸鹽對轉(zhuǎn)基因植物的增加的效力。當(dāng)用作非轉(zhuǎn)基因植物的殺真菌劑時，亞磷酸鹽通常需要非常小心地使用以避免植物毒性。然而，在本文公開的轉(zhuǎn)基因植物中，亞磷酸鹽可被植物代謝變得無本文公開的系統(tǒng)可提供用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的實質(zhì)優(yōu)點。該系統(tǒng)的選擇性標(biāo)記可在植物中至少大幅普遍地起作用。此外，選擇劑(如，次磷酸鹽或亞磷酸鹽)對轉(zhuǎn)基因植物可以是無毒的，因為反應(yīng)產(chǎn)物可以是無害的(如，NADH和磷酸鹽)，并且還可以比其它選擇方案廉價。本公開的另外的方面在以下部分提供(I)定義、(II)轉(zhuǎn)基因植物和真菌的產(chǎn)生、(III)轉(zhuǎn)基因植物和真菌的使用、和(IV)實施例。I.定義在本公開中使用的各種術(shù)語通常各自具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)的含義，與使用各術(shù)語的上下文一致。然而，如下所述，以下術(shù)語可具有另外和/或替代的含義。filL-真核生物體的植物界成員，除了其它以外，可描述為樹、灌木、草、矮樹、草本、藤本、蕨類、蘚類、真核藻類、或其組合。植物通常具備纖維素細(xì)胞壁并且能夠進(jìn)行光合作用。植物可以是維管植物。在一些實施方案中，植物可以是一年生或多年生的。植物可以是開花植物，諸如單子葉植物或雙子葉植物。在一些實施方案中，除了其它以外，植物可產(chǎn)生谷粒、塊莖、果實、蔬菜、果仁、種子、纖維、或其組合。此外，植物可以是可在田地里栽培的農(nóng)作物。可適于根據(jù)本公開產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的示例農(nóng)作物包括煙草(如，N.tabacum)、馬鈴薯、玉米、水稻、小麥、苜蓿、大豆、番茄、甘蔗等等。植物部分-少于完整植物并且包括至少一個植物細(xì)胞的植物任何部分。因此，植物部分可以是植物組織，除了其它以外，諸如葉組織、根組織、莖組織、芽組織、愈傷組織、花組織、或其任意組合。植物部分可以是分離的植物細(xì)胞或植物細(xì)胞的集落或組。除了其它以外，植物細(xì)胞可以是原生質(zhì)體或可包括細(xì)胞壁。轉(zhuǎn)基因-包含核酸構(gòu)建體。在生物體細(xì)胞的任何亞組或至少基本上所有的生物體細(xì)胞中，構(gòu)建體可整合到生物體(和/或細(xì)胞)的基因組(如，核基因組或質(zhì)體基因組)中。例如，構(gòu)建體可存在于植物的種系中。因此，構(gòu)建體可以是可遺傳的，即，被生物體隨后的代或細(xì)胞子代的至少一個或多個成員或至少基本上所有的成員遺傳。被構(gòu)建體“轉(zhuǎn)化”的植物或真菌(或植物或真菌部分(如，細(xì)胞))已被修飾以便在該植物或真菌(或植物或真菌部分)的當(dāng)前一代或任何前一代或前幾代中包含構(gòu)建體。轉(zhuǎn)基因植物可由萌發(fā)形成轉(zhuǎn)基因植物的種子提供。而且，轉(zhuǎn)基因植物可產(chǎn)生一個或多個種子，這些種子萌發(fā)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代植物。MM.-包含核苷酸鏈的化合物。該鏈可主要由任何適合數(shù)目的核苷酸構(gòu)成，除了其它以外，諸如至少約10、100或1000個。核酸可稱為多核苷酸，并且例如，可以是單鏈、雙鏈、或其組合。皿-提供可表達(dá)單元以表達(dá)多肽和/或功能性RNA(除了其它以外，如，信使RNA、干擾RNA或酶RNA)的核酸或其區(qū)段。因此，基因可包括(a)界定多肽和/或功能性RNA的序列的編碼區(qū)(還稱為編碼序列，可以是連續(xù)或間斷的(諸如被一個或多個內(nèi)含子間斷))、(b)至少一個轉(zhuǎn)錄啟動子(還稱為啟動子序列)、和(c)任選地，至少一個轉(zhuǎn)錄終止子(還稱為終止序列)，轉(zhuǎn)錄啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子被可操作地連接于編碼區(qū)?；蛉芜x地可包括一個或多個其它控制區(qū)和/或非翻譯區(qū)，除了其它以外，諸如至少一個5’非翻譯區(qū)、3’非翻譯區(qū)、內(nèi)含子、或其任意組合。啟動子-控制(即，促進(jìn)、調(diào)節(jié)和/或驅(qū)動)基因的轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生初級轉(zhuǎn)錄物和/或信使RNA的核酸區(qū)域。啟動子可例如通過至少部分地決定基因被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄起始的速率來起作用。啟動子還可以或可選地可以決定轉(zhuǎn)錄起始后轉(zhuǎn)錄伸長的速率。啟動子可以是在植物和/或真菌中起作用的，因此可以是植物啟動子和/或真菌啟動子。嵌合基因-具有對彼此異源的序列元件諸如轉(zhuǎn)錄啟動子和編碼區(qū)的基因。術(shù)語“異源”是指序列元件(如，啟動子和編碼區(qū))來源于和/或衍生自各自不同的來源，諸如不同物種的生物體。嵌合基因還可包含轉(zhuǎn)錄終止子，該轉(zhuǎn)錄終止子可來源于與編碼區(qū)不同的來源，來自與啟動子相同的來源或不同的來源。嵌合基因中可使用的示例終止子包括花椰菜花葉病毒的35S終止子、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的胭脂堿合酶終止子、或類似物。構(gòu)建體-至少部分地利用遺傳工程的技術(shù)創(chuàng)建的核酸。因此，構(gòu)建體可稱為核酸構(gòu)建體。表達(dá)-從由核酸和/或基因提供的通常處于DNA形式的信息形成產(chǎn)物即RNA和/或多肽的過程。因此，核酸/基因可被表達(dá)以形成RNA和/或多肽，這表示RNA和/或多肽從核酸/基因表達(dá)。還原形式的磷-其中磷具有小于+5的氧化態(tài)諸如+3或+1的任何含磷化合物和/或離子。因此，除了其它以外，還原形式的磷可例如包括亞磷酸鹽和次磷酸鹽。還原形式的磷可縮寫為“RP”。磷酸鹽-磷酸(H3PO4)、其二元形式(H2PO41O、其一元形式(ΗΡ042_)、其三價離子形式(PO43-)、或其任意組合。磷酸鹽可以任何適合的磷酸鹽化合物或磷酸鹽化合物的組合而提供。除了其它以外，磷酸鹽的示例形式包括鈉、鉀、鋰、銣、銫、銨、鈣或鎂的磷酸鹽、或其任意組合。在磷酸鹽中，四個氧原子與磷原子直接成鍵。磷酸鹽還可以或可選地可以稱為“正磷酸鹽”和/或“無機(jī)磷酸鹽”，并且可縮寫為“Pi”。磷酸鹽不同于“有機(jī)磷酸鹽”，有機(jī)磷酸鹽是磷酸鹽的有機(jī)形式，其中一個或多個磷酸鹽的氧與有機(jī)部分成鍵，通常形成磷酸酯。亞磷酸鹽-亞磷酸(H3PO3)、其共軛堿/單價離子形式(H2PO31-)、或其二價離子形式(HPO32-)、或其任意組合。在亞磷酸鹽中，三個氧和一個氫與磷原子直接成鍵。亞磷酸鹽可以任何適合的亞磷酸鹽化合物或亞磷酸鹽化合物的組合而提供。除了其它以外，亞磷酸鹽的示例形式包括鈉、鉀、鋰、銣、銫、銨、鈣或鎂的亞磷酸鹽、或其任意組合。亞磷酸鹽可氧化為磷酸鹽。亞磷酸鹽還可以或可選地可以稱為“無機(jī)亞磷酸鹽”，并且可縮寫為“Phi”。亞磷酸鹽不同于“有機(jī)亞磷酸鹽”，有機(jī)亞磷酸鹽是亞磷酸鹽的有機(jī)形式，其中一個或多個亞磷酸鹽的氧與有機(jī)部分成鍵，通常形成亞磷酸酯。次磷酸鹽-次磷酸(H3PO2)和/或其共軛堿2Ρ02_)，次磷酸鹽可以任何適合的次磷酸鹽化合物或次磷酸鹽化合物的組合而提供。在次磷酸鹽中，兩個氧和兩個氫與磷原子直接成鍵。除了其它以外，次磷酸鹽的示例形式包括鈉、鉀、鋰、銣、銫、銨的次磷酸鹽、或其組合。次磷酸鹽可氧化為亞磷酸鹽和/或磷酸鹽。次磷酸鹽還可以或可選地可以稱為“無機(jī)次磷酸鹽”，并且可縮寫為“Hphi”。籃-被代謝以促進(jìn)生長和生殖、和/或是存活所需的任何物質(zhì)。IEiL-包括用于植物(和/或與植物結(jié)合的真菌)的一種或多種營養(yǎng)的任何組合物。外部來源-在棺物之外并目.通常可通過接觸棺物而為棺物獲取的供應(yīng)。除了其它以外，可適于本文所述的轉(zhuǎn)基因植物的示例外部來源可包括外部來源的磷、外部來源的磷酸鹽、或外部來源的還原磷。詵擇件標(biāo)記-如下的構(gòu)建體或其區(qū)段和/或基因當(dāng)通過與適合的培養(yǎng)基接觸來檢驗植物或植物部分(和/或真菌和/或真菌細(xì)胞)的生長時，所述構(gòu)建體或其區(qū)段和/或基因?qū)Π鰳?gòu)建體/基因的植物或植物部分(和/或真菌和/或真菌細(xì)胞)賦予生長優(yōu)勢。污水-攜帶廢料和/或與廢料混合的水。污水可以是流動的或可以不是流動的。示例污水可以是，例如，可與較大水體諸如溪流、河流、池塘、湖泊、沼澤、濕地、或類似水體混合的工業(yè)垃圾和/或廢水。修復(fù)-將水(如，廢水和/或污水)改良為更期望的組成的任何過程，諸如使得水毒性更小、更加環(huán)境友好、更符合政府標(biāo)準(zhǔn)等等。對還原形式的磷進(jìn)行氧化的酶-催化或促進(jìn)還原形式的磷(如，氧化態(tài)為+1或+3)氧化到更高氧化態(tài)(如，+1到+3、+1到+5、和/或+3到+5)的酶。例如，除了其它以外，酶可將次磷酸鹽氧化為亞磷酸鹽，亞磷酸鹽氧化為磷酸鹽，和/或次磷酸鹽氧化為磷酸鹽。為了方便，酶可稱為“氧化酶”，因為其催化/促進(jìn)氧化反應(yīng)，或可稱為“磷氧化還原酶”或“還原磷代謝酶”，為了本文的方便，可縮寫為“RP-OxRe”。對還原形式的磷進(jìn)行氧化的示例酶可包括亞磷酸鹽脫氫酶(例如，可稱為NAD亞磷酸鹽氧化還原酶、膦酸鹽脫氫酶、NAD-依賴性亞磷酸鹽脫氫酶、或類似物)、次磷酸鹽脫氫酶(如，次磷酸鹽2-氧代戊二酸鹽氧化還原酶)、或類似物。酶可利用細(xì)胞中和/或細(xì)胞附近存在的任何適當(dāng)?shù)妮o因子、輔酶、和/或底物來氧化還原形式的磷。此外，酶可來源于和/或衍生自細(xì)菌、真菌、植物或動物。亞磷酸鹽脫氫酶-催化亞磷酸鹽氧化為磷酸鹽的酶。該酶通常催化氧化的效力足12以使得植物細(xì)胞和/或真菌細(xì)胞能夠在作為磷源支持生長的亞磷酸鹽的存在下生長。該酶可為細(xì)菌來源的。該酶可以是PtxD多肽(S卩，PtxD或PtxD-樣)，是能夠催化亞磷酸鹽氧化為磷酸鹽的任何多肽，是(a)與施氏假單胞菌麗88的PtxD(SEQIDNO1；GenBankAAC71709.1)至少90%、95%、或完全相同，(b)SEQIDNO:1的PtxD的衍生物，(c)來自相同或不同細(xì)菌物種的PtxD(SEQIDNO:1)的同源物(S卩，旁系同源物或直系同源物)，或(d)(c)的衍生物。PtxD(SEQIDNO1)的同源物可與施氏假單胞菌的PtxD具有大致的相似性，該相似性可例如由blastp算法(如，程序BLASTP2.2.18+)確定，如以下兩個參考文獻(xiàn)描述的，其通過引用并入本文St印henF.Altschul等(1997)，“GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms(？！^ΠStJBLAST和PSI-BLAST:新一代蛋白數(shù)據(jù)庫搜索程序)，”ConstructsRes.25:3389-3402；和乂印1^11F.Altschul等(2005)"Proteindatabasesearchesusingcompositionallyadjustedsubstitutionmatrices(利用組成調(diào)整的取代矩陣進(jìn)行蛋白數(shù)據(jù)庫搜索)，”FEBSJ.2725101-5109。利用blastp算法、以最佳比對并且如果需要則引入缺口，除了其它以外，大致的相似性的實例包括至少50%、60%、70%、或80%的序列同一性，至少200或250的相似性分?jǐn)?shù)，和/或小于le-40、le-60或le_80的Ε-值。除了其它以外，施氏假單胞菌PtxD的示例同源物可由以下提供抗輻射不動桿菌(Acinetobacterradioresistens)SK82(SEQIDNO2；GenBankEET83888.1)；糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenesfaecalis)(SEQIDNO3；GenBankAAT12779.1)；藍(lán)桿藻(Cyanothecesp.)CCYO110(SEQIDNO4；GenBankEAZ89932.1)；鐵銹色披毛菌(Gallionellaferruginea)(SEQIDNO5；GenBankEES62080.1)；馬賽紫色桿菌(Janthinobacteriumsp.Marseille)(SEQIDNO6；GenBankABR91484.1)；肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)(SEQIDNO.7；GenbankABR80271.1)5^^(Marinobacteralgicola)(SEQIDNO8；GenBankEDM49754.1)；甲基扭曲桿菌(Methylobacteriumextorquens)(SEQIDNO9；NCBIYP_003066079.1)；念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostocsp.)PCC7120(SEQIDNO10；GenBankBAB77417.1)；產(chǎn)甲酸草酸桿菌(Oxalobacterformigenes)(SEQIDNO.11；NCBIZP_04579760.1)；斯維鏈霉菌(Str印tomycessviceus)(SEQIDNO:12;GenBankEDY59675.1)；硫堿弧菌(Thioalkalivibriosp.)HL_EbGR7(SEQIDNO:13;GenBankACL72000.1)；禾口黃黃色桿菌(Xanthobacterflavus)(SEQIDNO14；GenBankABG73582.1)。PtxD同源物的另外的方面描述于Metcalf等的美國專利申請公布號2004/0091985(“‘985出版物”)，其通過引用并入本文。亞磷酸鹽脫氫酶可具有與SEQIDNO1-14的一種或多種有至少50%、60%、80%、90%或95%或100%序列同一性的氨基酸序列。可能適合的施氏假單胞菌PtxD的示例衍生物描述于‘985出版物和^iao等的美國專利號7，402，419，其通過引用并入本文。衍生物可提供，例如，改變的輔因子親和性/特異性和/或改變的熱穩(wěn)定性。亞磷酸鹽脫氫酶可包含與以下共有基序的任一種或任意組合具有序列相似性或同一性的序列區(qū)NAD-結(jié)合基序，具有共有序列VGILGMGAIG(SEQIDNO:15)；D-異構(gòu)體特異性2-醇酸家族的保守特征序列，具有共有序列XPGALLVNPCRGSVVD(SEQIDNO:16)，其中X是K或R，或具有SEQIDNO16中更短的共有序列RGSVVD(SEQIDNO17)；和/或可使得氫化酶能夠利用亞磷酸鹽作為底物的基序，一般的共有序列為GWQPQFYGTGL(SEQIDNO:18)，但可更好地定義為GffX1PX2X3YX4X5GL(SEQIDNO.19)，其中X1是R、Q、T或K，X2是A、V、Q、R、K、H或E，)(3是L或F，&是G、F或S，且&是T、R、M、L、A或S。通過比較PtxD與PtxD同源物而發(fā)現(xiàn)的共有序列的另外的方面描述于Metcalf等的美國專利申請公布號2004/0091985，其通過引用并入本文。亞磷酸鹽脫氫酶可以是(或可以不是)對作為底物的亞磷酸鹽具有高特異性(如，Km50μM)和/或具有約36千道爾頓的分子量的NAD-依賴性酶。脫氫酶可以但不要求作為同二聚體起作用和/或在35°C和/或約7.25-7.75的pH具有最優(yōu)活性。次磷酸鹽脫氫酶-催化次磷酸鹽氧化為亞磷酸鹽的酶。該酶可以是例如，細(xì)菌酶，諸如來自施氏假單胞菌WM88的HtxA(SEQIDNO20；GenBankAAC71711.1)或糞產(chǎn)堿菌的HtxA(GenBankAAT12775.1)。HtxA多肽可以是但不要求是對作為底物的次磷酸鹽具有高特異性(如，Km0.54-0.62mM)和/或具有約32千道爾頓的分子量的Fe-依賴性酶。HtxA多肽可以但不要求作為同二聚體起作用和/或在27°C和/或約7.0的pH具有最優(yōu)活性。DtxD或htxA編碼區(qū)-分別編碼PtxD多肽(即，亞磷酸鹽脫氫酶)或HtxA多肽(即，次磷酸鹽脫氫酶)的序列。示例PtxD編碼區(qū)由施氏假單胞菌的ptxD提供(SEQIDNO21；GenBankAF061070.1)。在其它實例中，可利用與SEQIDNO:21具有至少80%或90%序列同一性的PtxD-樣編碼區(qū)。在其它實例中，可利用編碼與SEQIDNO:1-14的一種或多種多肽具有至少50%、60%、80%、90%、95%或完全的同一性的多肽的編碼區(qū)。II.轉(zhuǎn)基因植物和真菌的產(chǎn)生本公開提供制備具有改良的磷代謝的轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因真菌的方法。作為主要目的，該方法可用于產(chǎn)生攜帶編碼磷氧化酶的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物和/或真菌(或至少一個植物或真菌細(xì)胞)，諸如為了在農(nóng)業(yè)中在亞磷酸鹽和/或次磷酸鹽肥料上更好地生長?？蛇x地或此外，作為主要目的，該方法可用于產(chǎn)生攜帶包括另一目標(biāo)基因的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物和/或真菌，該構(gòu)建體還包括編碼磷氧化酶的基因，該磷氧化酶充當(dāng)便于鑒定和/或分離轉(zhuǎn)基因植物或真菌的選擇性標(biāo)記。在這一部分和本公開別處公開的方法步驟可以任何適當(dāng)?shù)慕M合、以任何適當(dāng)?shù)捻樞蜻M(jìn)行，并且可重復(fù)任何適當(dāng)?shù)拇螖?shù)。圖1顯示如下的示例方法20的示意流程圖(i)制備將至少一種還原形式的磷(“RP”)代謝為磷酸鹽的轉(zhuǎn)基因植物(和/或真菌)和/或(ii)利用賦予將還原形式的磷代謝為磷酸鹽的能力的核酸作為選擇性標(biāo)記?？色@得至少一種構(gòu)建體(或核酸)，如22所示。至少一種構(gòu)建體23可包括至少一種第一基因?qū)?，其可以是對催化還原形式的磷的氧化諸如亞磷酸鹽氧化為磷酸鹽的至少一種酶(“RP-OxRe”)諸如亞磷酸鹽脫氫酶進(jìn)行編碼的至少一種嵌合基因。構(gòu)建體23還可包括至少一種第二基因沈(“基因2”)，其也可以(或可以不)是嵌合基因。在一些實施方案中，該至少一種第一基因可以是編碼各自催化至少一種還原形式的磷的氧化的至少兩種不同多肽的一對基因。該至少兩種多肽可起作用按順序氧化磷底物(如，第一多肽催化次磷酸鹽氧化為亞磷酸鹽，然后第二多肽催化亞磷酸鹽氧化為磷酸鹽)。在一些實例中，除了其它以外，該至少一種第二基因可包括用于植物和/或真菌的選擇性標(biāo)記，和/或可包括主要目標(biāo)基因。第一基因M和第二基因沈可以被連接，諸如存在于同一多核苷酸中，或可存在于各自分離的多核苷酸上。每種基因可至少部分地在植物之外構(gòu)建，諸如在體外和/或在微生物(如，細(xì)菌、酵母等等)中。此外，每種基因可能在包含該基因的植物、真菌、或二者中表達(dá)。該至少一種基因(M和/或26)可被引入至少一種接受植物觀(或真菌)、植物或真菌組織、和/或植物或真菌細(xì)胞中，以30表示。在引入該至少一種基因之前，該至少一種植物、組織或細(xì)胞可能至少大致上需要磷酸鹽作為用于生長的外部磷源。換言之，該植物、組織或細(xì)胞可能至少大致上不能直接代謝還原形式的磷(諸如亞磷酸鹽)作為營養(yǎng)。該至少一種基因的引入可以在鼓勵該核酸被引入植物、組織和/或細(xì)胞的條件下，通過使(a)該至少一種植物/真菌、組織和/或細(xì)胞與(b)包括含該至少一種基因的核酸的組合物(改性劑(modifyingagent))接觸而進(jìn)行。接觸步驟可通過在該至少一種植物/真菌、組織和/或細(xì)胞與該組合物之間產(chǎn)生接觸的任何機(jī)制進(jìn)行。例如，該組合物可包括含該至少一種基因的一種或多種多核苷酸，該多核苷酸在載體中和/或在載體上。可能適合的示例載體包括生物細(xì)胞(如，細(xì)菌細(xì)胞)、植物病毒、惰性顆粒、脂質(zhì)(在膠束和/或脂質(zhì)體中)、和/或類似物。以包括該基因的組合物產(chǎn)生的示例接觸可包括使植物、植物組織或植物細(xì)胞與攜帶該至少一種基因的細(xì)菌(如，農(nóng)桿菌物種，諸如根癌農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes))接觸，或與攜帶該至少一種基因的一種或多種發(fā)射體(如，用包括該至少一種基因的多核苷酸包被并且從基因槍向植物、組織或細(xì)胞發(fā)射的顆粒)接觸。更通常地，引入該至少一種基因可通過感染、注射、顆粒轟擊、電穿孔、細(xì)胞融合、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、其任何組合等對植物/真菌、植物組織或真菌組織、和/或植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞進(jìn)行。如36所示，通過在植物、組織和/或細(xì)胞與組合物之間產(chǎn)生接觸和/或在此之后，可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因候選物34(還稱為轉(zhuǎn)化候選物)。轉(zhuǎn)基因候選物可以是用于接觸的植物/真菌、組織和/或細(xì)胞，或可衍生自植物/真菌、組織和/或細(xì)胞的任何后面的代(即，后代或分裂產(chǎn)物)。在任何情況中，轉(zhuǎn)基因候選物可以是種子、植物、組織、外植體、分離的細(xì)胞、細(xì)胞集落/聚集體、和/或類似物?？蓪D(zhuǎn)基因候選物34在選擇性培養(yǎng)基37中的生長(S卩，生長優(yōu)勢)進(jìn)行選擇，如38所示。具備在選擇性培養(yǎng)基上的生長優(yōu)勢的候選物34，諸如轉(zhuǎn)基因植物40，通常比其它候選物大得多。在其它實例中，選擇可以用轉(zhuǎn)化的植物(或真菌)細(xì)胞進(jìn)行，并且可包括在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)該植物(或真菌)細(xì)胞。在這些情形中，培養(yǎng)細(xì)胞可允許選擇和/或分離由培養(yǎng)步驟形成的一個或多個細(xì)胞集落。集落可以表達(dá)對還原形式的磷進(jìn)行氧化的酶諸如亞磷酸鹽脫氫酶，如通過在培養(yǎng)基中形成集落而證明的?？筛鶕?jù)由引入的至少一種第一基因和/或選擇性標(biāo)記(第二)基因提供的選擇性標(biāo)記而利用任何適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基37。例如，選擇性培養(yǎng)基可包括還原形式的磷，諸如次磷酸鹽和/或亞磷酸鹽。還原形式的磷可以是主要的外部磷源，和/或可以是培養(yǎng)基中存在的至少基本上僅有的磷，這表示培養(yǎng)基至少基本上沒有磷酸鹽(即，低磷酸鹽或無磷酸鹽培養(yǎng)基)?？蛇x地或此外，如果對生長的選擇是基于引入植物/真菌、組織、和/或細(xì)胞中的第二基因26(如，hph或bar)，那么選擇性培養(yǎng)基可包括另一選擇劑諸如潮霉素或草丁膦。如果選擇是基于第二基因沈，可進(jìn)行另外的測試(如，在含亞磷酸鹽的培養(yǎng)基中生長、PCR、DNA印跡等等)以檢驗編碼至少一種RP-氧化還原酶的至少一種第一基因的引入。在任何情況中，培養(yǎng)基可包括或主要是液體，并且可(或可不)包括基質(zhì)或底質(zhì)，除了其它以外，諸如凝膠(如，瓊脂、瓊脂糖、明膠、等等)或土壤。對生長的選擇可在任何適當(dāng)?shù)钠髅?2(和/或容器)中進(jìn)行，或可沒有器皿或容器而進(jìn)行，諸如在田地中?？赡苓m合的示例器皿是帶蓋或不帶蓋的，并且包括單孔或多孔的板或皿(如，皮氏培養(yǎng)皿)、盆、盤、盒、等等?？煞蛛x轉(zhuǎn)基因植物40，如44所示。相對于轉(zhuǎn)基因植物40所來自的植物非轉(zhuǎn)基因品種(如，植物觀)，植物40可具有由核酸23賦予的靠還原形式的磷生長的生長優(yōu)勢。換句話說核酸23可賦予將還原形式的磷代謝為營養(yǎng)的能力。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物40可從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織再生。例如，在選擇性(如，亞磷酸鹽)培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物細(xì)胞而產(chǎn)生的細(xì)胞集落的至少一部分可用于再生轉(zhuǎn)基因植物。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物和真菌的進(jìn)一步方面在本公開別處描述，諸如在IV部分的實施例中。圖2顯示用在方法20(圖1)中的核酸23的示意圖?；騇可稱為RP-OxRe基因46，如48所示，其表達(dá)還原磷氧化還原酶50(如，亞磷酸鹽脫氫酶)。基因M包括編碼該氧化還原酶的編碼區(qū)52?；騇還可包括可操作地連接于編碼區(qū)52的轉(zhuǎn)錄啟動子54、和可操作地連接于編碼區(qū)52的轉(zhuǎn)錄終止子56。啟動子M和終止子56可以是在植物和/或真菌中起作用的。因此，除了其它以外，啟動子和/或終止子可來源于植物或真菌、或感染植物或真菌的病毒或細(xì)菌?？蛇m于植物中使用的示例啟動子包括花椰菜花葉病毒的35S啟動子。可適于植物中使用的其它啟動子包括來自擬南芥磷脂酶DZ2(PLDZ》基因(基因模型AT3G05630.1；TAiR登錄基因2078036)的PLDZ2啟動子，其在植物低磷酸鹽可用性條件下是可誘導(dǎo)的(Cruz-Ramirez等，PNAS2006,103:6765-6770，其公開內(nèi)容通過引用并入本文)?？蛇x地或此外，啟動子可以是根特異性啟動子，諸如擬南芥Witl；2磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因(NCBINM_123703.1；基因ID:834355)、或蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)MtPTl基因或MtPT2基因(GenBankAF000354.1^PAF000355.1)的啟動子(Xiao等，PlantBiology,2006,8:439_449，其公開內(nèi)容通過引用并入本文)。此外，第一基因M可包括轉(zhuǎn)錄但不翻譯的區(qū)域，諸如5’前導(dǎo)序列和/或5’非翻譯區(qū)58、3’非翻譯區(qū)60、和/或一個或多個內(nèi)含子62。第一基因M可由核酸23提供，核酸23包括任何其它適當(dāng)?shù)男蛄校似渌酝?，諸如至少一個第二基因26、用于在細(xì)菌或另一非植物物種中復(fù)制的復(fù)制控制序列、用于另一物種(如，細(xì)菌)的選擇性標(biāo)記、或其任意組合。在一些實施方案中，核酸23可以是以下的任意組合線性或環(huán)狀(S卩，閉合環(huán))的、至少大部分雙鏈或至少大部分單鏈的、以及DNA或RNA。圖3顯示在細(xì)菌中由從ptxD基因和htxA基因表達(dá)的酶催化次磷酸鹽氧化為磷酸鹽的建議機(jī)制70。此處展示的建議機(jī)制僅是為了闡述的目的，并且不意為限制顯示的任何組分諸如PtxD基因或htxA基因或PtxD多肽或HtxA多肽的定義，或限制本發(fā)明的范圍。機(jī)制70顯示，次磷酸鹽離子72可被htxA基因編碼的HtxA多肽76(次磷酸鹽2-氧化戊二酸鹽雙加氧酶)的作用氧化為亞磷酸鹽離子74。HtxA多肽76可使用狗2+78作為輔因子，且使用2-氧化戊二酸鹽80作為電子供體。此外，酶76可將2-氧化戊二酸鹽80轉(zhuǎn)化為丁二酸鹽82，并且將分子氧84轉(zhuǎn)化為二氧化碳86。亞磷酸鹽離子74進(jìn)而可被PtxD多肽90的作用氧化為磷酸鹽離子88。多肽90可使用NAD+92作為被還原為NADH94的電子受體。III.轉(zhuǎn)基因棺物和真菌的使用本文公開的轉(zhuǎn)基因植物可用于任何適當(dāng)?shù)哪康?。示例目的包括產(chǎn)生商業(yè)產(chǎn)品(如，食品、木材、藥物、染料、油、潤滑劑、墨水、橡膠、棉、纖維、生物燃料等等)和/或水體修復(fù)。本文所用的水體修復(fù)通常包括從水體和/或從已接觸污染水的土壤對污染或至少一種污染物的任何去除。提供了水體修復(fù)的方法。本文公開的任何轉(zhuǎn)基因植物、真菌、或二者可用于此方法。在這一部分和本公開別處公開的方法步驟可以按任何適當(dāng)順序、以任何適當(dāng)組合進(jìn)行，每個步驟可進(jìn)行任何適當(dāng)?shù)拇螖?shù)?？色@得一種或多種轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)基因植物可以在當(dāng)前代或在任何隨后的代被賦予氧化至少一種還原形式的磷的能力的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。獲得一種或多種轉(zhuǎn)基因植物可包括任何適當(dāng)?shù)姆桨?。例如，獲得步驟可包括向當(dāng)前代轉(zhuǎn)基因植物，或更通常地，向更早代的轉(zhuǎn)基因植物中引入編碼將還原形式的磷氧化為磷酸鹽的一種或多種多肽的一種或多種構(gòu)建體?！N或多種轉(zhuǎn)基因植物可接觸待修復(fù)的水。植物與水接觸可包括以下的任何組合將水帶到植物，將植物帶到水，并且萌發(fā)與水接觸的植物的種子。相對于植物，水可以是大致上靜止的或可以是流動的。在一些實施方案中，接觸步驟可包括植物與工業(yè)和/或城市污水接觸。IV.實施例以下實施例描述本公開的精選方面和實施方案，諸如制備代謝亞磷酸鹽作為磷源的轉(zhuǎn)基因植物(包括藻類)和轉(zhuǎn)基因真菌的示例方法、示例轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因真菌、和利用編碼亞磷酸鹽脫氫酶的基因作為選擇性標(biāo)記來選擇轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因真菌的示例方法。實施例僅為了闡述的目的展示，并且不意為限定或限制本公開的范圍。實施例1.表達(dá)細(xì)菌亞磷酸鹽脫氫酶的轉(zhuǎn)基因植物的示例產(chǎn)生本實施例描述了產(chǎn)生具有改良的磷代謝的轉(zhuǎn)基因植物的示例方法；參見圖4-6。圖4顯示為了用于產(chǎn)生將亞磷酸鹽代謝為磷酸鹽的轉(zhuǎn)基因植物以允許在磷酸鹽不存在時依靠亞磷酸鹽生長而構(gòu)建的示例核酸，即嵌合基因100。如以下各段所述，利用Gateway系統(tǒng)(GatewayTechnology,2003,Invitrogen)構(gòu)建該基因。基因100包括可操作地連接于來自施氏假單胞菌WM88WptxD的編碼序列104(SEQIDNO21)的來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子序列102。如106所示，從而產(chǎn)生PtxD多肽(亞磷酸鹽脫氫酶)的基因100的表達(dá)被35S啟動子102控制/驅(qū)動?；?00任選地可包括布置在編碼序列(和啟動子序列)的下游并可操作地連接于編碼序列(和啟動子序列)的終止序列107，諸如來自CaMV的35S終止子。該基因可進(jìn)一步包括布置在啟動子序列與PtxD編碼序列之間的5’非翻譯序列、和/或布置在ptxD編碼序列與終止序列之間的3’非翻譯序列。此外，基因可包括與ptxD編碼序列一起轉(zhuǎn)錄并且通過轉(zhuǎn)錄后剪接從轉(zhuǎn)錄物去除的內(nèi)含子。圖5顯示用于產(chǎn)生圖4的基因100的策略的一部分的示意圖。合成正向引物108(SEQIDNO22)和反向引物110(SEQIDNO:23)。每種引物具有雜交區(qū)112、114，所述雜交區(qū)以正向或反向與在圖的下部標(biāo)為116、118的ptxD編碼區(qū)104的末端雜交。每種引物具有位于雜交區(qū)112或114的5，的attB位點120、122(attBl或attB2)。這些引物用于利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從質(zhì)粒(pWM3(^)擴(kuò)增編碼序列104，以產(chǎn)生ptxD擴(kuò)增產(chǎn)物。產(chǎn)生預(yù)計大小為約1000個堿基對的構(gòu)建體，如通過對擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳和染色檢測的?？蛇x地可將引物設(shè)計為從PtxD編碼序列的上游和/或下游擴(kuò)增其它的非翻譯序列。接下來利用由Gateway系統(tǒng)提供的位點特異性重組將ptxD擴(kuò)增產(chǎn)物摻入質(zhì)粒載體中。經(jīng)由PDONR221的attPl位點和attP2位點以及該擴(kuò)增產(chǎn)物的attBl位點和attB2位點將該擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒pD0NR221重組，以產(chǎn)生pD0NR221的ptxD衍生物，即“初始克隆”PD0NR221。該初始克隆具有兩側(cè)為相對的attLl位點和attL2位點的全長ptxD編碼序列。然后通過進(jìn)一步的位點特異性重組將該初始克隆的ptxD序列移入接受載體中以產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建體pB7WG2D-ptxD。該接受載體是pB7WG2D.1，其按照圍繞載體的順序包括(1)35S啟動子、(2)設(shè)置在35S啟動子的下游的attRl位點和attR2位點、(3)35S終止子、(4)“bar”基因(賦予草丁膦抗性)作為植物中的選擇性標(biāo)記、(5)基因SmSpK作為細(xì)菌，尤其是農(nóng)桿菌(賦予大觀霉素(Sp)和鏈霉素(Sm)抗性)中的選擇性標(biāo)記、和(6)EgfpER基因。Gateway-系統(tǒng)指導(dǎo)的重組形成包括基因100(參見圖4)、bar、SmSpK和EgfpER的表達(dá)克隆(pB7WG2D-ptxD)。該表達(dá)構(gòu)建體用于通過電穿孔轉(zhuǎn)化電感受態(tài)的根癌農(nóng)桿菌。選擇攜帶該表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌克隆用于繼代培養(yǎng)。利用修改的蘸花(floraldip)方法，將轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌克隆用于轉(zhuǎn)化擬南芥(生態(tài)型Col-O)(通常在本文稱為“野生型”(WT))。利用草丁膦抗性選擇轉(zhuǎn)化的TO后代。具體地，用含草丁膦O0mg/L)的MS0.IX培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。通過PCR擴(kuò)增ptxD基因而鑒定觀株抗性株系。利用含草丁膦O0mg/L)的MS0.IX培養(yǎng)基分析每株抗性株系的Tl后代，以尋找Tl后代的31(抗性敏感)分離，以鑒定顯示ptxD基因的孟德爾遺傳的植物。從展現(xiàn)31遺傳的Tl后代的T2后代建立10株純合的ptxD轉(zhuǎn)基因植物。檢驗了ptxD轉(zhuǎn)基因植物在僅含亞磷酸鹽(如，約0.1至5mM)作為外部磷源的培養(yǎng)基中生長的能力。對照植物在這種培養(yǎng)基中顯示無實質(zhì)生長(即，顯示的生長限于種子中積累的內(nèi)部磷儲備)，而轉(zhuǎn)基因植物有效地生長，從而證明轉(zhuǎn)基因植物能夠代謝還原形式的磷(亞磷酸鹽)作為磷源。還使用PtxD表達(dá)構(gòu)建體提供用于選擇具有改良的磷代謝的轉(zhuǎn)基因植物的選擇性標(biāo)記。利用包含PtxD表達(dá)構(gòu)建體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化野生型Col-O植物。將TO后代(種子)種植在以亞磷酸鹽(5mM)作為磷源的培養(yǎng)基上。圖6顯示TO后代相對于野生型植物在亞磷酸鹽培養(yǎng)基上生長的示例數(shù)據(jù)。相對于野生型植物132(左圖)和相對于明顯未以表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化和/或沒有從引入的構(gòu)建體有效表達(dá)PtxD多肽的其它TO后代134，轉(zhuǎn)基因植物130(右圖圓圈中)具有實質(zhì)的生長優(yōu)勢。產(chǎn)生具有改良的磷代謝的轉(zhuǎn)基因植物的進(jìn)一步方面描述在2008年11月19日提交的美國臨時專利申請系列號61/199，784中，其通過引用并入本文。實施例2.表達(dá)PtxD的擬南芥植物的表征本實施例展示對親代(“野生型”(WT)或?qū)φ?擬南芥株系Col-O和實施例1描述的包含實施例1的PtxD表達(dá)構(gòu)建體的兩種轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的生長特征的研究；參見圖7-12。稱為PT)(D-3和PT)(D-5的兩種轉(zhuǎn)基因擬南芥株系按實施例1所述來制備和分離。每種株系對于實施例1的PtxD表達(dá)構(gòu)建體是純合的。檢驗親代株系和PT)(D-3與PT)(D-5轉(zhuǎn)基因株系在有或沒有無機(jī)磷酸鹽(Pi)作為磷源的液體培養(yǎng)基上生長的能力。使來自親代株系和轉(zhuǎn)基因株系的種子在液體培養(yǎng)基中萌發(fā)并檢驗其生長。在磷酸鹽(和亞磷酸鹽)不存在時，親代株系和轉(zhuǎn)基因株系都不顯示超出萌發(fā)的顯著生長。(每種株系在短時間展現(xiàn)可忽略不計的生長，這顯然是種子中的磷酸鹽儲備允許的，種子中的磷酸鹽儲備迅速地從種子中耗盡。)相反，親代(WT)株系和轉(zhuǎn)基因株系二者在50、100和1000μM磷酸鹽存在下有效生長。圖7顯示從親代(WT)株系和轉(zhuǎn)基因PT)(D-3與PT)-5株系在有或沒有亞磷酸鹽(Phi)或磷酸鹽(Pi)作為磷源的液體生長培養(yǎng)基上生長的試驗獲得的數(shù)據(jù)的照片。圖7中，不存在或存在持續(xù)的植物生長(超出萌發(fā)階段)分別標(biāo)為減號(_)或加號(+)符號。親代株系和轉(zhuǎn)基因株系在50μM無機(jī)磷酸鹽存在時均有效地生長(底行)。而且，親代株系和轉(zhuǎn)基因株系在磷酸鹽和亞磷酸鹽二者不存在時都不顯示可檢測的生長。然而，兩種轉(zhuǎn)基因株系而不是親代株系，在50、100和1000μM無機(jī)亞磷酸鹽作為磷源存在時有效生長。因此，轉(zhuǎn)基因株系獲得了代謝亞磷酸鹽作為磷源支持植物生長的能力。圖8顯示了從圖7的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系減少生長培養(yǎng)基中的總磷的量的能力試驗獲得的數(shù)據(jù)的柱狀圖，所述生長培養(yǎng)基含有不同濃度的亞磷酸鹽(50、100和1000μΜ)作為磷源。將野生型和兩種轉(zhuǎn)基因擬南芥株系PT)(D-3與PT)(D-5在含有缺少磷酸鹽并補充50、100或1000微摩爾亞磷酸(H3PO3)的0.IXMurashige和Skoog液體培養(yǎng)基的一升塑料容器中萌發(fā)和培育。允許每個塑料容器100株植物在生長室的塑料容器中生長45天，每M小時期間的光暗周期為16:8。覆蓋植物以避免喪失水分。在種子被播種萌發(fā)的位置，即每個塑料容器的液體培養(yǎng)基頂部放置雙層塑料網(wǎng)。生長45天后，移去植物，利用釩-鉬酸鹽方法確定液體培養(yǎng)基中的總磷含量。簡略地說，將來自每種樣品的5mL液體培養(yǎng)基用硝酸高氯酸(HNO3HClO4；51)消化。然后，基于70%高氯酸中的鉬酸銨QOmM)和偏釩酸銨(IOmM)的溶液的添加，用比色方法確定磷含量。在室溫孵育20分鐘后，用分光光度計測量400nm的吸光度。在圖8中，標(biāo)為“初始”的前三個柱代表無植物的培養(yǎng)基中總磷的初始濃度。標(biāo)為WT(Col-O)、PTXD-3和PT)(D-5的柱的組代表在相應(yīng)擬南芥株系存在時培養(yǎng)45天后培養(yǎng)基(最初50μΜ、100μM或1000μM亞磷酸鹽)中的總磷含量。轉(zhuǎn)基因植物(PT)(D-3和PT)(D-5)而不是野生型植物，減少培養(yǎng)基中的磷含量多于50%。磷含量的減少在這種情形中代表從培養(yǎng)基去除亞磷酸鹽，是由于植物對亞磷酸鹽的攝取。轉(zhuǎn)基因株系具有從培養(yǎng)基去除亞磷酸鹽的高能力，因為它們能夠?qū)喠姿猁}轉(zhuǎn)化成磷酸鹽用于維持植物生長。可利用這種從含水培養(yǎng)基去除亞磷酸鹽的能力以從廢水中去除亞磷酸鹽，所述廢水諸如⑶/DVD工廠產(chǎn)生的污水。圖9顯示用于圖10和11的實驗的親代(WT)和ptxD轉(zhuǎn)基因(PT)(D)擬南芥植物的分布的示意圖。圖10和11顯示按照圖9分布并被檢驗在含有加入的磷酸鹽(Pi)(圖10)或亞磷酸鹽(Wii)(圖11)作為磷源的基質(zhì)上的生長的親代和PtxD轉(zhuǎn)基因植物的照片。不存在或存在持續(xù)生長(超出萌發(fā)階段)分別標(biāo)為加號(+)或減號(_)符號。圖10顯示野生型和轉(zhuǎn)基因植物依靠磷酸鹽的相似生長。相反，圖11顯示只有轉(zhuǎn)基因植物能夠依靠亞磷酸鹽持續(xù)生長。此處和圖11中的植物生長在沙土蛭石混合物(11)中，并且定期接受水和營養(yǎng)溶液(除了前面指明的以外，沒有任何其它磷源)。圖12顯示從圖7的擬南芥植物株系在不同磷源存在下培養(yǎng)時增加重量的能力的試驗獲得的數(shù)據(jù)的柱狀圖。在該圖中，將在作為基質(zhì)的沙土蛭石(11)中培養(yǎng)的三種植物的干重相對于每種具體植物株系和磷源繪圖。野生型植物在以亞磷酸鹽作為磷源時基本上不生長，而轉(zhuǎn)基因株系在亞磷酸鹽(Phi)上相對于磷酸鹽(Pi)上生長得相似或更好。實施例3.表汰PtxD的轉(zhuǎn)基因煙草棺物本實施例描述包含實施例1的PtxD表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotianatabacum,tobacco)的創(chuàng)建和表征；參見圖13。以實施例1所述的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化煙草。具體地，將煙草葉片外植體與T-DNA中包含35S::PtxD構(gòu)建體的農(nóng)桿菌菌株(實施例1)一起共培養(yǎng)。允許葉盤在包含ImM亞磷酸鹽作為唯一磷源的MS培養(yǎng)基中再生。將從含亞磷酸鹽的培養(yǎng)基上的這些葉盤再生的植物轉(zhuǎn)移到土壤，并且允許在溫室條件下結(jié)籽。圖13顯示35S::PtxD基因純合的T2轉(zhuǎn)基因煙草種子和對照煙草幼苗在含有磷酸鹽(ImMPi)或亞磷酸鹽(ImMPhi)作為唯一磷源的MS培養(yǎng)基中萌發(fā)25天后拍攝的照片。存在或不存在生長(耗盡種子供應(yīng)的磷之后)分別標(biāo)為加號(+)或減號(_)符號?？捎^察到，與供應(yīng)磷酸鹽作為磷源時相比，對照幼苗在含亞磷酸鹽的培養(yǎng)基中萌發(fā)但不能維持正常生長。相反，來自每種轉(zhuǎn)基因株系的煙草植物在亞磷酸鹽或磷酸鹽作為磷源存在時顯示持續(xù)生長。這些實驗證明了改良煙草中的磷代謝的能力。圖14顯示以圖13的對照和轉(zhuǎn)基因煙草株系進(jìn)行的其它生長實驗的照片。將幼苗在補充有ImM亞磷酸鹽作為唯一磷源的MS培養(yǎng)基中萌發(fā)并保持25天。然后將幼苗轉(zhuǎn)移到包含含有ImM亞磷酸鹽作為唯一磷源的MS的組織培養(yǎng)瓶，允許其在植物生長室在23°C生長另外25天，光周期是每M小時期間18小時的光、隨后6小時的黑暗?？梢杂^察到，ΡΤ)轉(zhuǎn)基因植物能夠在包含亞磷酸鹽作為唯一磷源的培養(yǎng)基中維持快速生長，而對照植物不能利用亞磷酸鹽用于其生長和發(fā)育。實施例4.具有改良的磷代謝的轉(zhuǎn)基因藻類本實施例描述了產(chǎn)生表達(dá)亞磷酸鹽脫氫酶的藻類轉(zhuǎn)基因株系的方法，所述亞磷酸鹽脫氫酶使得藻類能夠依靠亞磷酸鹽作為磷源而生長。光合的藻類已經(jīng)以轉(zhuǎn)基因方式適用于許多應(yīng)用，諸如產(chǎn)生生物燃料、藥物、抗原等等。藻類可在包含光系統(tǒng)以支持光合作用并促進(jìn)生長的大型發(fā)酵罐中培養(yǎng)。通常，發(fā)酵罐必須被保護(hù)免受不期望的藻類(或其它生物體)污染。為此，將藻類培養(yǎng)在人造光而不是日光下，以減少污染風(fēng)險。因此，在開放的罐或曠野(如，池塘中)中靠暴露于日光而生長藻類要廉價得多，但因為高污染風(fēng)險，目前是不可行的。通過改良目標(biāo)藻類以便依靠亞磷酸鹽作為磷源而生長，本公開使得日光和開放的曠野用于生長目標(biāo)藻類成為可能。改良的目標(biāo)藻類將能夠在包含亞磷酸鹽而缺乏磷酸鹽的培養(yǎng)基中茂盛地生長，這種培養(yǎng)基不能支持不需要的(污染物)藻類生長，因為它們將需要20磷酸鹽。因此，將減少或消除不需要的藻類的污染，允許目標(biāo)藻類以較低成本在開放的罐或曠野中培養(yǎng)，且光合作用由日光驅(qū)動。產(chǎn)生了用于轉(zhuǎn)化藻類物種諸如萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的表達(dá)構(gòu)建體。該構(gòu)建體可表達(dá)任何適當(dāng)?shù)膩喠姿猁}脫氫酶(且任選地也表達(dá)次磷酸鹽脫氫酶)。在本示例中，該構(gòu)建體從PtxD編碼序列表達(dá)PtxD。該構(gòu)建體利用雜合啟動子序列來驅(qū)動表達(dá)同時避免基因沉默HSP70A啟動子被融合到RBCS2啟動子的上游(每種啟動子由萊茵衣藻提供)(Schroda等，2000，PlantJ.21:121-131)。該雜合啟動子序列驅(qū)動融合到ptxD基因(施氏假單胞菌)的編碼序列的萊茵衣藻RBS2的第一內(nèi)含子的表達(dá)，該ptxD基因(施氏假單胞菌)的編碼序列轉(zhuǎn)而融合到RBS2基因的轉(zhuǎn)錄終止序列。為了增強PtxD多肽從該構(gòu)建體表達(dá)，可修飾PtxD編碼序列以在允許這一改變的密碼子的第三位置中具有G或C(經(jīng)由遺傳密碼的簡并性)，來優(yōu)化萊茵衣藻中的翻譯的密碼子利用。除了其它以外，PtxD表達(dá)構(gòu)建體可被提供為包含在大腸桿菌中起作用的復(fù)制起點、大腸桿菌的選擇性標(biāo)記(如，氨芐西林抗性基因)、和在萊茵衣藻中起作用的選擇性標(biāo)記的質(zhì)粒。萊茵衣藻的示例選擇性標(biāo)記編碼賦予對zeomycin和腐草霉素的抗性的zeomycin結(jié)合蛋白(Lumbreras等，1998,PlantJ.14:441-447)。通過任何適當(dāng)?shù)臋C(jī)制將ptxD表達(dá)構(gòu)建體引入萊茵衣藻，所述機(jī)制除了其它以外，諸如顆粒轟擊(Debuchy等，1989，EMBOJ.8:2803-2809)或借助于玻璃珠(Kindle等，1991，PNAS88:1721-1725)。用玻璃珠轉(zhuǎn)化萊茵衣藻可如Kindle(1990，PNAS87=1228-1232)所述的進(jìn)行。通過在室溫下在未稀釋的自溶素中孵育萊茵衣藻細(xì)胞30-60min而去除細(xì)胞壁。處理的有效性通過對0.004%NonidetP-40去垢劑(Sigma)的敏感性來監(jiān)測。通過離心從自溶素收集細(xì)胞，重懸在液體培養(yǎng)基中，且立即轉(zhuǎn)化以避免細(xì)胞壁再生。用濃硫酸洗滌玻璃珠(0.45-0.52mm)，然后用蒸餾水徹底漂洗，干燥，并通過在250°C烘烤2-而滅菌。將玻璃珠(300mg)加到0.^iL細(xì)胞中，加入2微克質(zhì)粒DNA，并且在FisherVortexGenieII混合器上在15-mL錐形一次性聚丙烯離心管中以最大速度攪動細(xì)胞。允許珠子靜置，并且用玻璃涂布器將細(xì)胞涂布在選擇性瓊脂板上。為了直接選擇zeomycin抗性轉(zhuǎn)化子，將細(xì)胞與玻璃珠和DNA—起攪拌，在20mLTAP液體培養(yǎng)基中稀釋，并且通過伴隨輕柔搖動在光(80μEnT2iT1)中在25°C培養(yǎng)15-1而使其表達(dá)ble基因。然后通過離心使細(xì)胞成團(tuán)，重懸在包含0.5%熔化瓊脂的5mLTAP中，并且倒在含有20mg/mLzeOmyCin的TAP/2%瓊脂板的表面上。然后將komycin抗性集落涂布到缺乏任何磷酸鹽來源、但補充ImM亞磷酸鹽作為磷源的TAP培養(yǎng)基中。在光中在25°C培養(yǎng)平板18至Mh，生長的集落能夠利用亞磷酸鹽作為磷源。實施例5.表達(dá)亞磷酸鹽脫氫酶的轉(zhuǎn)基因木霉屬本實施例描述了產(chǎn)生如下的木霉屬真菌的方法被修飾表達(dá)亞磷酸鹽脫氫酶，以使得該真菌能夠依靠亞磷酸鹽作為磷源而生長。A.引言木霉屬物種是土壤和根生態(tài)系統(tǒng)中常見的獨立生存真菌。最近的發(fā)現(xiàn)顯示，它們表現(xiàn)為無毒的植物共生生物，以及是植物病原真菌(phytophatogenicfungi)的寄生生物。一些菌株建立了穩(wěn)固和持久的根表面定植，并穿入外皮。作為廣泛的土壤居民和根際促生(rhizosphere-competent)真菌，木霉屬物種已經(jīng)成功地用作控制植物病原體的生物控制劑。已經(jīng)對木霉屬提出了許多生物控制機(jī)制，包括競爭、真菌寄生、和由于植物根細(xì)胞內(nèi)空間的定植而引入植物防御反應(yīng)(Howell，2003；Yedidia等，1999)。被木霉屬物種根定植還常常促進(jìn)根的生長和發(fā)育、作物生產(chǎn)力、對非生物脅迫的抗性、以及營養(yǎng)的攝取和利用。可改良木霉屬物種以表達(dá)PtxD或其直向同源物或衍生物，以使得木霉屬能夠依靠亞磷酸鹽生長。任選地，還可改良木霉屬以表達(dá)次磷酸鹽脫氫酶(如，HtxA)。在任何情況中，這些轉(zhuǎn)基因木霉屬可置于多種用途。例如，它們可用于生物除污目的，諸如從⑶和DVD工業(yè)的廢水排放中消除亞磷酸鹽(和/或次磷酸鹽)。轉(zhuǎn)基因木霉屬可單獨用于生物除污，或與轉(zhuǎn)基因植物(如，實施例1)聯(lián)合用于生物除污。使用聯(lián)合的轉(zhuǎn)基因植物/真菌系統(tǒng)來去除亞磷酸鹽(和/或次磷酸鹽)可比單獨使用任一種更有效?？蛇x地，轉(zhuǎn)基因木霉屬可與植物結(jié)合以保護(hù)植物不受病原真菌侵害。在這種情形下，植物可以是非轉(zhuǎn)基因的，從而它們要求磷酸鹽作為磷源，或可以是能夠依靠亞磷酸鹽作為磷源而生長的轉(zhuǎn)基因植物(如，實施例1)。在任何情況中，轉(zhuǎn)基因木霉屬可作為強有力的殺真菌劑發(fā)揮作用，因為木霉屬本身及其對亞磷酸鹽的利用均可保護(hù)植物。B.方案深綠木霉(Trichodermaatroviride)(IMI206040)原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化利用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，所述方法除了其它以外，諸如PEG-CaCl2方法(Herrera-Estrella等，1990；Baek&Kenerley，1998)、生物射彈法(Lorito等，1993)、或電穿孔(Goldman等，1990)。轉(zhuǎn)化DNA是攜帶處于里氏木霉(Trichodermareesei)pki啟動子或構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)trpC啟動子、以及深綠木霉blul7或構(gòu)巢曲霉trpC終止子的控制下的編碼亞磷酸鹽脫氫酶(如，PtxD)的基因的質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物。利用QiagenPlasmidMidi試劑盒或氯化銫梯度純化質(zhì)粒。對于選擇而言，利用包含1.2M山梨醇和200mMH3PO3作為唯一磷源的瓊脂覆層將100、200和500μL的等份鋪板，在處理后立即進(jìn)行，或在原生質(zhì)體在1.2Μ山梨醇中2-4小時的培養(yǎng)階段后進(jìn)行。在培養(yǎng)三至四天后，能夠依靠亞磷酸鹽作為磷源而生長的集落將出現(xiàn)在平板上。轉(zhuǎn)化子應(yīng)只在以攜帶PtxD編碼序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化時才出現(xiàn)。對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行三輪單孢子培養(yǎng)以獲得同核體?？蛇x地，木霉屬轉(zhuǎn)化子可通過利用用于選擇的抗生素抗性標(biāo)記(諸如賦予潮霉素抗性的hph)聯(lián)合攜帶ptxD基因的構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化而獲得。在后一種策略中，首先選擇攜帶PtxD基因的潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子，并且如上所述可在后面的階段選擇能夠利用亞磷酸鹽作為磷源的菌株，或在通過檢驗PtxD基因的表達(dá)的篩選中鑒定能夠利用亞磷酸鹽作為磷源的菌株。攜帶亞磷酸鹽利用盒的轉(zhuǎn)化子的分生孢子通過本領(lǐng)域已知的固態(tài)或深層發(fā)酵工藝產(chǎn)生(Cavalcante等，2008)。除了其它以外，可將分生孢子施加于植物、其種子、或施加于土壤。例如，除了其它以外，可將分生孢子施加于種子(如，利用膠乳粘著物(sticker)諸如lihoplexB-15J)，以孢子懸液直接施加于植物根(如，利用粘著物)，或在水中作為孢子懸液或以小麥麩/泥灰制品混合物(0.5%，w/w)施加于土壤。以下參考文獻(xiàn)通過引用并入本文Baek,J.M.&Kenerley,C.Μ.(1998).Thearg2geneofTrichodermavirenscloninganddevelopmentofahomologoustransformationsystem(綠木霉的arg2基因:同源轉(zhuǎn)化體系的克隆和開發(fā)).FungalGenet.Biol.23:34-44.Cavalcante,R.S.,Lima,H.L.S.,Pinto,G.Α.S.,Gava,C.Α.Τ.,禾口Rodrigues,S.(2008).EffectofMoistureonTrichodermaConidiaProductiononCornandWheatBranbySolidStatei^ermentation(水分對固態(tài)發(fā)酵時玉米和小麥麩上的木霉菌屬分生孢子的產(chǎn)生的作用).FoodBioprocess.Technol.1:100-104.Goldman,G.H.,VanMontagu,Μ.,禾口Herrera-Estrella,A.(1990)·TransformationofTrichodermaharzianumbyhigh-voltageelectricpulse(1Mfli電脈沖轉(zhuǎn)化哈茨木霉).Curr.Genet.17:169-174.Herrera-Estrella,Α.，Goldman,G.H.，禾口VanMontagu,M.(1990).Highefficiencytransformationsystemforthebiocontrolagents,Trichodermaspp.(用于生物控制劑木霉屬物種的高效轉(zhuǎn)化體系)Mol.Microbiol.4:839-843.Howell,C.R.(2003)MechanismsemployedbyTrichodermaspeciesinthebiologicalcontrolofplantdiseases(木霉屬物種在植物疾病的生物控制中采用的機(jī)制)·PlantDis.87:4-10.Lorito,Μ.，Hayes,C.K.，DiPietro,Α.，禾口Harman，G.Ε.(1993).BiolistictransformationofTrichodermaharzianumandGliocladiumvirensusingplasmidandgenomicDNA(利用質(zhì)粒和基因組DNA對哈茨木霉和綠粘帚霉的生物射彈法轉(zhuǎn)化)·Curr.Genet.24:349-356.Yedidia,I.,Benhamou,N.,禾口Chet,I.(1999).Inductionofdefenseresponsesincucumberplants(CucumissativusL.)bythebiocontrolagentTrichodermaharzianum(由生物控制劑哈茨木霉在黃瓜植物(CucumissativusL.)中誘導(dǎo)防御反應(yīng))·Appl.Environ.Microbiol.651061-1070.實施例6.與表達(dá)細(xì)菌亞磷酸鹽脫氫酶的真菌形成菌根本實施例描述了產(chǎn)生以轉(zhuǎn)基因方式改良以表達(dá)亞磷酸鹽脫氫酶(和/或細(xì)菌次磷酸鹽脫氫酶)的菌根型真菌的方法，所述亞磷酸鹽脫氫酶(和/或細(xì)菌次磷酸鹽脫氫酶)使得該轉(zhuǎn)基因真菌能夠依靠亞磷酸鹽(和/或次磷酸鹽)作為磷源生長。還公開了通過將該轉(zhuǎn)基因真菌與植物結(jié)合而形成菌根的方法。這些轉(zhuǎn)基因真菌與植物形成的菌根可向植物供應(yīng)磷酸鹽用于生長。因此，植物本身不需要是轉(zhuǎn)基因的，因為菌根將完成將亞磷酸鹽(和/或次磷酸鹽)轉(zhuǎn)化為磷酸鹽的所有工作。A.引言磷(P)是自然生態(tài)系統(tǒng)和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中可限制植物生產(chǎn)力的必需的營養(yǎng)。植物可與菌根真菌形成天然共生關(guān)系，菌根真菌作為植物根系的延伸起作用，為植物提供礦物營養(yǎng)，尤其是磷酸鹽，以交換植物光合活性產(chǎn)生的含碳分子(Smith和Read，1997)。菌根真菌穿入植物的根細(xì)胞，真菌的質(zhì)膜與植物的質(zhì)膜建立緊密的聯(lián)系以形成所謂的叢枝結(jié)構(gòu)。叢枝結(jié)構(gòu)中，礦物營養(yǎng)，尤其是磷酸鹽可從真菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。除了礦物營養(yǎng)以外，菌根還可改進(jìn)植物攝取水的能力，并可保護(hù)植物不受重金屬侵害(Khan，A.G.，2006；Forbes等，1998)。菌根必須與其它微生物競爭磷酸鹽可用性。因此，表達(dá)編碼能夠?qū)喠姿猁}轉(zhuǎn)化為磷酸鹽的亞磷酸鹽脫氫酶的基因的轉(zhuǎn)基因菌根菌株可用于向植物供應(yīng)磷酸鹽。在這種情形，菌根真菌將把亞磷酸鹽轉(zhuǎn)化為磷酸鹽，然后磷酸鹽可轉(zhuǎn)移到不能代謝亞磷酸鹽的非轉(zhuǎn)基因植物的根?？蛇x地，為了使得該系統(tǒng)更有效，可使用都表達(dá)編碼亞磷酸鹽脫氫酶的基因的轉(zhuǎn)基因菌根真菌和轉(zhuǎn)基因植物的聯(lián)合。轉(zhuǎn)基因菌根真菌與非轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因植物的聯(lián)合可用于利用其中磷酸鹽已被亞磷酸鹽代替的肥料來增強植物生產(chǎn)力，或可用于生物修復(fù)來自⑶或DVD生產(chǎn)工廠的污水或其中亞磷酸鹽用作殺真菌劑的土壤(Ohtake，H.，1995)。B.方案本實施例利用來自施氏假單胞菌的ptxD編碼序列。然而，可利用任何適當(dāng)?shù)膩喠姿猁}脫氫酶編碼序列。通過將ptxD編碼序列放置在構(gòu)巢曲霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)啟動子和構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶(trpC)基因的轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)的控制下，產(chǎn)生基因構(gòu)建體。在轉(zhuǎn)化分子中還包括選擇性標(biāo)記，諸如來自大腸桿菌、賦予對潮霉素的抗性的aph基因，或賦予對腐草霉素的抗性的ble基因(Barrett等，1990)。對于轉(zhuǎn)化，按照Barrett等(1990)的方案獲得菌根真菌(如，雙色蠟?zāi)?Laccariabicolor)、土生空團(tuán)菌(Cenococcumgeophilum)、Hebelomacylindrosporium、銀盤菌(Paxillusinvolotus)、玫瑰紅巨孢囊霉(Gigasporarosea)、摩西球囊霉(Glomusmosseae)、聚叢球囊霉(Glomusaggregatum)、根內(nèi)球囊霉(Glomusintraradices)、彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius)等等)的原生質(zhì)體。為了分離原生質(zhì)體，收集菌絲體，并用無菌水洗滌幾次，然后用滲透溶液(PDB；含有0.8M甘露醇或0.6M蔗糖的馬鈴薯-葡萄糖-肉湯)中的水解酶(纖維素酶、幾丁質(zhì)酶和蛋白酶的混合物，每種酶5至10mg/mL)處理以降解細(xì)胞壁。伴隨恒定攪動(IOOrpm)，將菌絲體與酶在32°C孵育1至3小時。過濾原生質(zhì)體懸液，并用滲透溶液洗滌。通過在SOOrpm離心IOmin回收原生質(zhì)體，并將原生質(zhì)體小團(tuán)重懸在PDB緩沖液中，通過在顯微鏡下計數(shù)來確定原生質(zhì)體的數(shù)目。將原生質(zhì)體Q50μL中1-3XIO7個)與5至20微克基因構(gòu)建體混合，并且在4°C在PEG轉(zhuǎn)化溶液05-60%聚乙二醇4000、10-25mMCaCl2UOmMTris-HCl,pH7.5)中孵育45分鐘。加入另外的ImLPEG轉(zhuǎn)化溶液，并且在室溫繼續(xù)孵育20分鐘。允許原生質(zhì)體在液體培養(yǎng)基中再生細(xì)胞壁，并在固體培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)化子。取決于用于轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記，固體培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)包含100μg/mL潮霉素或100μg/mL腐草霉素。將生長的集落轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基三次以分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的菌絲體。選擇性標(biāo)記以及PtxD基因的存在由PCR證實。分離穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子之后，將菌絲體的2mm部分轉(zhuǎn)移到缺乏磷酸鹽并且補充有ImM亞磷酸鹽的PDA培養(yǎng)基以鑒定表達(dá)ptxD基因構(gòu)建體的集落。DNA印跡分析用于證實相應(yīng)基因的存在。為了證實轉(zhuǎn)基因真菌可向植物提供磷酸鹽，對土壤接種ptxD-轉(zhuǎn)化真菌的菌絲體，并且在該土壤中萌發(fā)煙草種子。對土壤施以正常濃度的氮和鉀，以亞磷酸鹽作為磷源。將煙草植物在接種PtxD轉(zhuǎn)基因真菌的土壤中從種子的生長與在未被接種的對照土壤中的生長進(jìn)行比較。以下參考文獻(xiàn)通過引用并入本文Barrett,V.,Dixon,R.K.,和Lemke,P.Α.(1990)Genetictransformationofamycorrhizalfungus(菌根真菌的遺傳轉(zhuǎn)化).Appl.Micobiol.Biotechnol.33:313-316.Bills,S.N.，Richter,D.L.，和PodilaG.K.(1995)GenetictransformationoftheectomycorrhizalfungusPaxillusinvolutusbyparticlebombardment(通過顆f立轟擊對外生菌根真菌銀盤菌的遺傳轉(zhuǎn)化).MycologicalResearch99:557-561.Bills,S.N.，Podila,G.K.，禾口Hiremath，S.Τ.(1999)GeneticengineeringoftheectomycorrhizalfungusLaccariabicolorforuseasabiologicalcontrolagent(對用作生物控制劑的外生菌根真菌雙色蠟?zāi)⒌倪z傳工程).MyC0l0gia91237-242.Forbes,P.J.，Mi11am,S.，Hooker,J.Ε.，禾口HarrierL.Α.(1998)TransformationofthearbuscularmycorrhizaGigasporaroseabyparticlebombardment(轟擊對叢枝菌根玫瑰紅巨孢囊霉的轉(zhuǎn)化).Mycol.Res.，102=497-501.Hanif，M.，Pardo,A.G.，Gorfer,M.，禾口Raudaskoski，M.(2002)T-DNAtransferandintegrationintheectomycorrhizalfungusSuillusbovinususinghygromycinBasaselectablemarker(利用潮霉素B作為選擇性標(biāo)記，在外生菌根真菌粘蓋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述本發(fā)明的精選的實施方案，展示為一系列索引的段落。A.一種核酸，包括包含以下的嵌合基因(a)編碼亞磷酸鹽脫氫酶的編碼區(qū)和(b)可操作地連接于該編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄啟動子，其中該啟動子相對于該編碼區(qū)是異源的，并且在植物、真菌、或二者中是起作用的，且其中該嵌合基因提供該酶在包含該嵌合基因的植物或真菌細(xì)胞中的充分表達(dá)，以賦予該細(xì)胞代謝亞磷酸鹽(Phi)作為磷源用于支持生長的能力，從而使得該細(xì)胞在沒有外部來源的磷酸鹽(Pi)時能夠生長。本段的核酸可被進(jìn)一步描述如下(Al)其中該亞磷酸鹽脫氫酶是細(xì)菌來源的；(A2)其中該亞磷酸鹽脫氫酶是施氏假單胞菌的PtxD(SEQIDNO1),PtxD(SEQIDNO=D的類似物或衍生物、或來自另一細(xì)菌物種的PtxD-樣同源物；(A3)其中該細(xì)菌亞磷酸鹽脫氫酶具有與SEQIDNO:1_14的至少一種具有至少50%、60%、80%、90%、或95%序列同一性的氨基酸序列；(A4)其中該亞磷酸鹽脫氫酶具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列包括第一序列區(qū)，所述第一序列區(qū)含與VGILGMGAIG(SEQIDNO15)具有序列相似性或同一性的NAD-結(jié)合基序，第二序列區(qū)，所述第二序列區(qū)與XPGALLVNPCRGSVVD(SEQIDNO:16)具有序列相似性或同一性，其中X是K或R，第三序列區(qū)，所述第三序列區(qū)與GWXiP^y^YXJfUSEQIDNO.19)具有序列相似性或同一性，其中X1是R、Q、T或K，&是A、V、Q、R、K、H或EJ3是L或FJ4是G、F或S，且)(5是T、R、Μ、L、A或S，或者包括第一序列區(qū)、第二序列區(qū)與第三序列區(qū)的任何組合；(AO其中該亞磷酸鹽脫氫酶具有與來自施氏假單胞菌的PtxD(SEQIDNO1)至少90%相同的氨基酸序列；(A6)其中該嵌合基因還包括可操作地連接于該編碼區(qū)并相對于編碼區(qū)異源的轉(zhuǎn)錄終止子；(A7)其中該啟動子是植物啟動子或植物病毒的病毒啟動子，并且能夠促進(jìn)該酶在植物細(xì)胞中的充分表達(dá)；(A8)其中A7的啟動子對應(yīng)于花椰菜花葉病毒的35S啟動子；(A9)其中A7的啟動子是由低磷酸鹽可用性可誘導(dǎo)的；(AlO)其中A9的啟動子對應(yīng)于擬南芥PLDZ2基因的啟動子；(All)其中該嵌合基因能夠促進(jìn)該酶在各自包含該嵌合基因的植物細(xì)胞和真菌細(xì)胞二者中的充分表達(dá)；(Al》其中該啟動子是能夠促進(jìn)該酶在真菌細(xì)胞中的充分表達(dá)的真菌啟動子；(AU)其中該編碼區(qū)的一個或多個密碼子已被體外改變以改進(jìn)在植物和/或真菌中的翻譯效率；(A14)還包含與該編碼區(qū)連接且被構(gòu)造為與該編碼區(qū)一起轉(zhuǎn)錄且在轉(zhuǎn)錄后被剪接去除的內(nèi)含子，其中該內(nèi)含子任選地設(shè)置在該編碼區(qū)中；(AK)其中該編碼區(qū)與SEQIDNO21具有至少90%的序列同一性；或(A16)A1至A15的任何組合。B.一種植物細(xì)胞，其包含在該植物細(xì)胞中表達(dá)亞磷酸鹽脫氫酶的核酸，并能夠代謝亞磷酸鹽作為磷源用于支持生長。任選地，該核酸是根據(jù)段落A的核酸。本段的植物細(xì)胞可被進(jìn)一步描述如下(Bi)還包含在該植物細(xì)胞中表達(dá)次磷酸鹽脫氫酶的核酸，該次磷酸鹽脫氫酶任選地為細(xì)菌來源的；(B》Bl的植物細(xì)胞，其中這些核酸共同地賦予該細(xì)胞代謝次磷酸鹽(Hphi)作為磷源用于支持生長的能力；(B3)其中Bl或B2的其它核酸編碼與施氏假單胞菌的HtxA(SEQIDNO20)具有至少95%序列同一性的多肽；(B4)B1至B3任何之一的植物細(xì)胞，其中這些核酸彼此相鄰地整合到該植物細(xì)胞的基因組中；(BQ其中亞磷酸鹽脫氫酶、次磷酸鹽脫氫酶、或二者的表達(dá)被根特異性啟動子控制；(B6)其中該植物細(xì)胞對于該核酸是純合的；(B7)其中該植物細(xì)胞是真核藻類細(xì)胞；(B8)其中B7的藻類細(xì)胞是衣藻屬細(xì)胞；(B9)其中該植物細(xì)胞來自維管植物的物種；或(BlO)Bl至B9的任何組合。C.一種主要由多個根據(jù)段落B的植物細(xì)胞構(gòu)成的植物。本段的植物可被進(jìn)一步描述如下(Cl)其中該植物是維管植物，諸如農(nóng)作物物種，(C2)其中Cl的農(nóng)作物物種選自以下組成的組玉米、大豆、水稻、馬鈴薯、番茄、甘蔗和小麥。D.一種真菌細(xì)胞，其包含在該真菌細(xì)胞中表達(dá)亞磷酸鹽脫氫酶的核酸并且能夠代謝亞磷酸鹽作為磷源用于支持生長。任選地，該核酸是根據(jù)段落A的核酸。本段的真菌細(xì)胞可被進(jìn)一步描述如下(Dl)還包含在該真菌細(xì)胞中表達(dá)次磷酸鹽脫氫酶的核酸；(D2)Dl的真菌細(xì)胞，其中這些核酸共同地賦予細(xì)胞代謝次磷酸鹽(Hphi)作為磷源用于支持該真菌細(xì)胞生長的能力；(D!3)其中該真菌細(xì)胞來自木霉屬的物種；(D4)其中該真菌細(xì)胞是能夠與植物形成共生關(guān)系的菌根真菌物種的成員；或(M)Dl至D4的任何組合。E.一種減少植物真菌感染的方法，包括向植物的種子形式、植物本身、布置植物的土壤、或其組合施加多個段落D的真菌細(xì)胞。在一些情況中，該真菌細(xì)胞可以是孢子。F.一種與多個根據(jù)段落D的真菌細(xì)胞結(jié)合以形成菌根的植物。任選地，該真菌細(xì)胞使得該植物能夠在包含亞磷酸鹽(Phi)、次磷酸鹽(Hphi)、或二者作為磷源用于支持生長的培養(yǎng)基上生長。G.一種利用次磷酸鹽和/或亞磷酸鹽作為磷源用于支持生長的對農(nóng)作物施肥的方法，所述農(nóng)作物(a)包括多個含段落A的核酸的細(xì)胞，(b)與含段落A的核酸的菌根真菌形成菌根，和/或(c)與包含權(quán)利要求1所述的核酸的木霉屬真菌結(jié)合，所述方法包括向該植物和/或向該植物附近的土壤施加磷的至少一種還原形式，從而該還原形式被該植物和/或該真菌代謝為磷酸鹽以支持該植物的生長和生產(chǎn)力。H.一種對段落C的植物施肥的方法，該方法包括向該植物和/或向該植物附近的土壤施加磷的至少一種還原形式，從而該還原形式被該植物代謝為磷酸鹽以支持該植物的生長和生產(chǎn)力。任選地，該還原形式可作為葉面肥料施加或被加入以修改土壤，從而提供磷酸鹽來源以維持植物生長和植物生殖。I.一種處理水以降低其還原磷的含量的方法，該方法包括將包含次磷酸鹽和/或亞磷酸鹽的水與多個包含段落A的核酸的植物細(xì)胞和/或真菌細(xì)胞接觸，從而至少一部分的次磷酸鹽和/或亞磷酸鹽被氧化為亞磷酸鹽和/或磷酸鹽。任選地，該接觸步驟包括將水與多個主要由包含段落A的核酸的植物細(xì)胞構(gòu)成的維管植物接觸的步驟。J.一種處理廢液以降低其還原磷的含量的方法，該方法包括將(i)包含次磷酸鹽和/或亞磷酸鹽作為污染物的水與(ii)多個包含段落A的核酸的植物細(xì)胞和/或真菌細(xì)胞接觸，從而至少一部分的次磷酸鹽和/或亞磷酸鹽被氧化為亞磷酸鹽和/或磷酸鹽。K.一種利用段落A的核酸來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生期間選擇包含段落A的核酸作為選擇性標(biāo)記的植物細(xì)胞的生長。L.一種獲得用編碼亞磷酸鹽脫氫酶的核酸轉(zhuǎn)化的植物的方法，該酶可從作為選擇性標(biāo)記的核酸表達(dá)，該方法包括將植物細(xì)胞與包括該核酸的組合物在促進(jìn)該核酸被引入至少一小組(subset)所述植物細(xì)胞中的條件下接觸；在包含亞磷酸鹽作為主要或唯一磷源用于生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述植物細(xì)胞；選擇由接觸步驟和培養(yǎng)步驟產(chǎn)生并由在所述培養(yǎng)基中生長而證明表達(dá)該亞磷酸鹽脫氫酶的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；并將至少一部分的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生為轉(zhuǎn)基因植物。本段的方法可被進(jìn)一步描述如下(Li)其中該組合物包括在接觸步驟期間供應(yīng)核酸的農(nóng)桿菌細(xì)胞；或(U)其中該組合物包括在接觸步驟中向該植物細(xì)胞發(fā)射的發(fā)射體。M.一種植物，包含包含表達(dá)亞磷酸鹽脫氫酶的嵌合基因的核酸，從而該植物能夠代謝亞磷酸鹽(Phi)作為磷源用于支持生長，從而使得該植物在沒有外部來源的磷酸鹽(Pi)時能夠生長。本段的植物可被進(jìn)一步描述如下(Ml)其中該核酸穩(wěn)定地整合到該植物的基因組中；(M》其中該植物是維管植物；(Μ；)其中該植物是藻類的物種；(M4)其中亞磷酸鹽脫氫酶具有段落A的任何特征；或(IK)Ml至M4的任何組合。N.一種真菌，包含包含表達(dá)亞磷酸鹽脫氫酶的嵌合基因的核酸，從而所述真菌能夠代謝亞磷酸鹽O^hi)作為磷源用于支持生長，從而使得所述真菌在沒有外部來源的磷酸鹽(Pi)時能夠生長。本段的真菌可進(jìn)一步被描述如下(Ni)其中該核酸穩(wěn)定地整合到該真菌的基因組中；(擬)其中該真菌是木霉屬的物種；(N；)其中該真菌是能夠與植物形成共生關(guān)系的菌根物種；(N4)還包括與該真菌結(jié)合以形成菌根的植物；(陽)其中所述亞磷酸鹽脫氫酶具有段落A的任何特征；或(N6)m至N5的任何組合。以上列出的公開內(nèi)容可涵蓋具有獨立用途的多種不同發(fā)明。盡管這些發(fā)明的每一種已經(jīng)以其優(yōu)選形式被公開，在本文公開和闡述的其具體實施方案不應(yīng)被認(rèn)為是限制意義，因為可以有許多變化。這些發(fā)明的主題包括本文公開的各種要素、特征、功能和/或性質(zhì)的所有新穎且非顯而易見的組合和亞組合。以下權(quán)利要求書具體地指出了被認(rèn)為新穎和非顯而易見的某些組合和亞組合。以特征、功能、要素、和/或性質(zhì)的其它組合和亞組合實現(xiàn)的發(fā)明可在要求本申請或相關(guān)申請優(yōu)先權(quán)的申請中要求保護(hù)。這樣的權(quán)利要求書，無論是針對不同發(fā)明還是相同發(fā)明，無論范圍比最初的權(quán)利要求書更寬、更窄、相等還是不同，也被認(rèn)為包括在本公開的發(fā)明的主題中。權(quán)利要求1.一種核酸，所述核酸包括嵌合基因，所述嵌合基因包括(a)編碼亞磷酸鹽脫氫酶的編碼區(qū)和(b)可操作地連接于所述編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄啟動子，其中所述啟動子相對于所述編碼區(qū)是異源的，并且在植物、真菌或二者中是起作用的，并且其中所述嵌合基因提供所述酶在包含所述嵌合基因的植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞中的充分表達(dá)，以對所述細(xì)胞賦予代謝亞磷酸鹽(Phi)作為磷源用于支持生長的能力，從而使得所述細(xì)胞在沒有外部來源的磷酸鹽(Pi)時能夠生長。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述亞磷酸鹽脫氫酶是細(xì)菌來源的。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸，其中所述亞磷酸鹽脫氫酶是施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)的PtxD(SEQIDN0:1)、SEQIDNO1的PtxD的類似物或衍生物、或來自另一細(xì)菌物種的PtxD-樣同源物。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸，其中所述細(xì)菌亞磷酸鹽脫氫酶具有與SEQIDNO1-14的至少一種具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述亞磷酸鹽脫氫酶具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列包括第一序列區(qū)，所述第一序列區(qū)具有與VGILGMGAIG(SEQIDNO:15)具有序列相似性或序列同一性的NAD-結(jié)合基序；第二序列區(qū)，所述第二序列區(qū)與XPGALLVNPCRGSVVD(SEQIDNO16)具有序列相似性或序列同一性，其中X是K或R；和第三序列區(qū)，所述第三序列區(qū)與GWX1PX2X3YX4X5GL(SEQIDNO.19)具有序列相似性或序列同一性，其中X1是R、Q、T或K，X2是A、V、Q、R、K、H或E，X3是L或F，X4是G、F或S，并且X5是T、R、M、L、A或S。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述亞磷酸鹽脫氫酶具有與施氏假單胞菌的PtxD(SEQIDNO1)至少90%相同的氨基酸序列。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述嵌合基因還包括可操作地連接于所述編碼區(qū)并且相對于所述編碼區(qū)異源的轉(zhuǎn)錄終止子。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述啟動子是植物啟動子或植物病毒的病毒啟動子，并且能夠促進(jìn)所述酶在植物細(xì)胞中的充分表達(dá)。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸，其中所述啟動子對應(yīng)于花椰菜花葉病毒的35S啟動子。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸，其中所述啟動子是由低磷酸鹽可用性可誘導(dǎo)的。11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸，其中所述啟動子對應(yīng)于擬南芥(Arabidopsisthaliana)的PLDZ2基因的啟動子。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述嵌合基因能夠促進(jìn)所述酶在各自包含所述嵌合基因的植物細(xì)胞和真菌細(xì)胞中的充分表達(dá)。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述啟動子是能夠促進(jìn)所述酶在真菌細(xì)胞中的充分表達(dá)的真菌啟動子。14.一種植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞包含權(quán)利要求1-12任一項所述的核酸并能夠代謝亞磷酸鹽作為磷源用于支持生長。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的植物細(xì)胞，還包含在所述植物細(xì)胞中表達(dá)細(xì)菌次磷酸鹽脫氫酶的核酸。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的植物細(xì)胞，其中所述核酸共同賦予所述細(xì)胞代謝次磷酸鹽(Hphi)作為磷源用于支持生長的能力。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的植物細(xì)胞，其中所述亞磷酸鹽脫氫酶、所述細(xì)菌次磷酸鹽脫氫酶、或二者的表達(dá)受根特異性啟動子控制。18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞是真核藻類細(xì)胞。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的植物細(xì)胞，其中所述藻類細(xì)胞是衣藻屬(Chlamydomonas)細(xì)胞。20.根據(jù)權(quán)利要求14所述的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來自維管植物物種。21.一種植物，所述植物主要由多個根據(jù)權(quán)利要求14所述的植物細(xì)胞構(gòu)成。22.—種植物，所述植物主要由多個根據(jù)權(quán)利要求20所述的植物細(xì)胞構(gòu)成。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的植物，其中所述植物是農(nóng)作物物種。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的植物，其中所述農(nóng)作物物種選自以下組成的組玉米、大豆、水稻、馬鈴薯、番茄、甘蔗和小麥。25.一種真菌細(xì)胞，所述真菌細(xì)胞包含權(quán)利要求1-7、12和13任一項所述的核酸并能夠代謝亞磷酸鹽作為磷源用于支持生長。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的真菌細(xì)胞，還包含在所述真菌細(xì)胞中表達(dá)細(xì)菌次磷酸鹽脫氫酶的核酸。27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的真菌細(xì)胞，其中所述核酸共同賦予所述細(xì)胞代謝次磷酸鹽(Hphi)作為磷源用于支持生長的能力。28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的真菌細(xì)胞，其中所述真菌細(xì)胞來自木霉屬(Trichoderma)的物種。29.一種減少植物真菌感染的方法，所述方法包括向植物的種子形式、植物本身、已布置或?qū)⒉贾弥参锏耐寥馈⒒蚱浣M合施加多個權(quán)利要求25所述的真菌細(xì)胞。30.根據(jù)權(quán)利要求25所述的真菌細(xì)胞，其中所述真菌細(xì)胞是能夠與植物形成共生關(guān)系的菌根真菌的物種的成員。31.一種植物，所述植物與多個根據(jù)權(quán)利要求30所述的真菌細(xì)胞結(jié)合以形成菌根。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的植物，其中所述真菌細(xì)胞使得所述植物能夠在含有亞磷酸鹽(Phi)作為磷源用于支持生長的培養(yǎng)基上生長。33.一種利用次磷酸鹽和/或亞磷酸鹽作為磷源用于支持生長的對農(nóng)作物施肥的方法，所述農(nóng)作物(a)包括多個包含權(quán)利要求1所述的核酸的細(xì)胞，(b)與包含權(quán)利要求1所述的核酸的菌根真菌形成菌根，和/或(c)與包含權(quán)利要求1所述的核酸的木霉屬真菌結(jié)合，所述方法包括向所述植物和/或向所述植物附近的土壤施加磷的至少一種還原形式，從而所述還原形式被所述植物和/或所述真菌代謝為磷酸鹽以支持所述植物的生長和生產(chǎn)力。34.一種對權(quán)利要求22所述的植物施肥的方法，所述方法包括向所述植物和/或向所述植物附近的土壤施加磷的至少一種還原形式，從而所述還原形式被所述植物代謝為磷酸鹽以支持所述植物的生長和生產(chǎn)力。35.一種處理廢液以降低其還原磷的含量的方法，所述方法包括將(i)包含次磷酸鹽和/或亞磷酸鹽作為污染物的水與(ii)多個包含權(quán)利要求1所述的核酸的植物細(xì)胞和/或真菌細(xì)胞接觸，從而至少一部分的次磷酸鹽和/或亞磷酸鹽被氧化為亞磷酸鹽和/或磷酸鹽。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中接觸步驟包括將所述水與多個主要由包含權(quán)利要求1所述的核酸的植物細(xì)胞構(gòu)成的維管植物接觸的步驟。37.一種分離包含權(quán)利要求1所述的核酸的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的方法，所述方法包括將選自植物細(xì)胞和真菌細(xì)胞的細(xì)胞與包含權(quán)利要求1所述的核酸的組合物接觸；和通過在包含亞磷酸鹽并缺少支持生長的足夠磷酸鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞而選擇性地增殖已被所述核酸轉(zhuǎn)化的一個或多個細(xì)胞。38.一種利用權(quán)利要求1所述的核酸來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括在轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生期間選擇包含權(quán)利要求1所述的核酸作為選擇性標(biāo)記的植物細(xì)胞的生長。39.一種獲得用編碼亞磷酸鹽脫氫酶的核酸轉(zhuǎn)化的植物的方法，所述亞磷酸鹽脫氫酶可從作為選擇性標(biāo)記的所述核酸表達(dá)，所述方法包括將植物細(xì)胞與包括所述核酸的組合物在促進(jìn)所述核酸被引入至少一小組所述植物細(xì)胞中的條件下接觸；在包含亞磷酸鹽作為主要或唯一磷源用于生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述植物細(xì)胞；選擇由接觸步驟和培養(yǎng)步驟產(chǎn)生并由在所述培養(yǎng)基中生長而證明表達(dá)所述亞磷酸鹽脫氫酶的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；并且將至少一部分的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生為轉(zhuǎn)基因植物。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述組合物包括在接觸步驟期間供應(yīng)所述核酸的農(nóng)桿菌(Agrobacterium)細(xì)胞。41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述組合物包括在接觸步驟中向所述植物細(xì)胞發(fā)射的發(fā)射體。42.一種植物，所述植物包含包含表達(dá)亞磷酸鹽脫氫酶的嵌合基因的核酸，從而所述植物能夠代謝亞磷酸鹽(Wii)作為磷源用于支持生長，從而使得所述植物在沒有外部來源的磷酸鹽(Pi)時能夠生長。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的植物，其中所述核酸穩(wěn)定地整合到所述植物的基因組中。44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的植物，其中所述植物是維管植物。45.根據(jù)權(quán)利要求42所述的植物，其中所述植物是藻類的物種。46.一種真菌，所述真菌包含包含表達(dá)亞磷酸鹽脫氫酶的嵌合基因的核酸，從而所述真菌能夠代謝亞磷酸鹽(Wii)作為磷源用于支持生長，從而使得所述真菌在沒有外部來源的磷酸鹽(Pi)時能夠生長。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的真菌，其中所述核酸穩(wěn)定地整合到所述真菌的基因組中。48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的真菌，其中所述真菌是木霉屬的物種。49.根據(jù)權(quán)利要求46所述的真菌，其中所述真菌是能夠與植物形成共生關(guān)系的菌根物種。50.根據(jù)權(quán)利要求46所述的真菌，還包括與所述真菌結(jié)合以形成菌根的植物。全文摘要用于制備和使用代謝亞磷酸鹽作為磷源用于支持生長的轉(zhuǎn)基因植物和/或轉(zhuǎn)基因真菌的系統(tǒng)，包括方法和組合物。文檔編號C12N15/82GK102282156SQ200980154899公開日2011年12月14日申請日期2009年11月19日優(yōu)先權(quán)日2008年11月19日發(fā)明者路易斯·拉斐爾·赫雷拉-埃斯特里拉,達(dá)瑪·莉茲貝思·洛佩斯-阿雷東多,阿爾弗雷多·埃里維托·赫雷拉-埃斯特里拉申請人:國家政治研究所高級研究中心(高級研究中心)