專利名稱：有效表達(dá)核轉(zhuǎn)基因的生產(chǎn)菌株的產(chǎn)生的制作方法
有效表達(dá)核轉(zhuǎn)基因的生產(chǎn)菌株的產(chǎn)生本發(fā)明涉及產(chǎn)生適于轉(zhuǎn)基因在其中表達(dá)的真核細(xì)胞的方法，其包括(a)將編碼響 應(yīng)于選擇試劑(selecting agent)的選擇標(biāo)記的核酸導(dǎo)入到細(xì)胞核中，其中所述選擇標(biāo)記 的表達(dá)水平與對所述選擇試劑的表型響應(yīng)(phenotypic responsiveness)水平成正比； (b)在步驟(a)得到的細(xì)胞中選擇所述選擇標(biāo)記的表達(dá)可檢測的細(xì)胞；(c)任選地繁殖步驟 (b)所選擇的細(xì)胞；(d)誘變步驟(b)所選擇的細(xì)胞或步驟(c)繁殖的細(xì)胞、或允許步驟(b) 所選擇的細(xì)胞或步驟(c)繁殖的細(xì)胞中出現(xiàn)自發(fā)突變；和(e)選擇相比起步驟(b)得到的 細(xì)胞的表達(dá)，顯示出所述選擇標(biāo)記表達(dá)增加的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的 真核細(xì)胞，在用本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞中生成目標(biāo)化合物的方法，其包括(a)將編碼(i)目 標(biāo)化合物，其是蛋白質(zhì)或RNA ；或(ii)合成所述目標(biāo)化合物的必要蛋白質(zhì)；并且任選地響應(yīng) 于選擇試劑的選擇標(biāo)記的核酸導(dǎo)入到所述細(xì)胞中；(b)在細(xì)胞中表達(dá)所述蛋白質(zhì)；和(c)分 離產(chǎn)生的目標(biāo)化合物；以及試劑盒，其包括(a)可由本發(fā)明的方法得到的細(xì)胞，以及任選地 在所述細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)優(yōu)化的載體；或(b)本發(fā)明的細(xì)胞。在本說明書中引用了許多文件，包括專利申請和制造商手冊(manufacturer’ s manual)。這些文件的公開內(nèi)容被認(rèn)為與本發(fā)明的專利性無關(guān)，通過引用其全部內(nèi)容將其并 入本文。更具體而言，所有引用的文件以引用的方式被并入本文，該引用的程度如同每個單 獨(dú)的文件被特定地和單獨(dú)地指明通過引用并入本文。重組蛋白質(zhì)或核酸在并非自然含有所述蛋白質(zhì)和核酸的細(xì)胞中的表達(dá)在研究中 以及大規(guī)模生產(chǎn)各種化合物，如藥物或酶中已經(jīng)成為一種有價值的工具。原核生物中的重 組表達(dá)如今已被優(yōu)化，并且，如果產(chǎn)生的化合物在轉(zhuǎn)錄和/或翻譯后并不自然地經(jīng)受化學(xué) 改性，該重組表達(dá)是有用的。在原核生物中表達(dá)、并沒有以那種方式被改性的化合物往往不 發(fā)揮其生物活性。另一方面，真核細(xì)胞中的重組表達(dá)有重大缺陷，即表達(dá)量通常低，或者甚至根本就 不表達(dá)。這是由于這些細(xì)胞使用的一些機(jī)制以抑制基因表達(dá)，如基因沉默。考慮到具有所 有修飾以實(shí)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物的真核細(xì)胞的潛在應(yīng)用，它們已經(jīng)成為生產(chǎn)“綠色化學(xué)制品”、生物 燃料和重組蛋白，如生物藥物(疫苗、抗體)的目標(biāo)。這適于有前景的真核有機(jī)體，如各種 植物，例如，藻類或植物細(xì)胞培養(yǎng)、真菌或哺乳動物細(xì)胞。作為含有單個大葉綠體的單細(xì)胞藻類，衣藻屬(Chlamydomonas)的藻類代表最簡 單的光合真核生物(photosynthetic eukaryote)之一。它們可以有性繁殖或無性繁殖， 并且可以光合自養(yǎng)、異養(yǎng)或混合營養(yǎng)生長。在衣藻物種中，綠藻萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)已經(jīng)成為廣泛的生物學(xué)問題，包括例如，鞭毛功能、光生物學(xué)和光合作用 研究的極好的模式生物(Hippler et al. ,1998 ；Harris, 2001 ；Pedersen et al. ,2006 ； Schmidt et al.，2006)。此外，萊茵衣藻將強(qiáng)大的遺傳學(xué)和和獨(dú)特的遺傳和基因組資源的 可用性結(jié)合起來所有三個基因組都被完全測序(核、質(zhì)體和線粒體基因組；Merchant et al.，2007)，大的突變體庫已經(jīng)被建立，并且三個基因組都可接受通過轉(zhuǎn)化進(jìn)行的基因操作 (Hippler et al. , 1998 ；Remacle et al.,2006)o最近，萊茵衣藻基因組測序工程的完成(Merchant et al.，2007)已經(jīng)為光合真核生物的進(jìn)化提供了新的視野，并為探索藻類作為植物后基因組學(xué)研究中的模式系統(tǒng)鋪平了 道路。系統(tǒng)功能基因組學(xué)需要的大部分工具都能在萊茵衣藻中得到，包括高頻率轉(zhuǎn)化方案 (Kindle，1990)、化學(xué)誘變和插入誘變的有效方法(Dent et al. ,2005)以及RNA干擾可使 用的方案(RNAi ；Rohr et al.，2004)。然而，如在許多其它真核細(xì)胞中觀察到的，萊茵衣藻 研究的主要障礙是由令人失望的來自藻類核基因組轉(zhuǎn)基因的弱表達(dá)造成的。鑒于上述原因，存在對具有增加的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的真核細(xì)胞或真核有機(jī)體株系的需 要。因此，本發(fā)明涉及產(chǎn)生真核細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞適于轉(zhuǎn)基因在其中表達(dá)、優(yōu)選為 增加的表達(dá)，所述方法包括(a)將編碼響應(yīng)于選擇試劑的選擇標(biāo)記的核酸導(dǎo)入到細(xì)胞核 中，其中所述選擇標(biāo)記的表達(dá)水平與對所述選擇試劑的表型響應(yīng)水平成正比；(b)在步驟 (a)得到的細(xì)胞中選擇所述選擇標(biāo)記的表達(dá)可檢測的細(xì)胞；(c)任選地繁殖步驟(b)所選擇 的細(xì)胞；(d)誘變步驟(b)所選擇的細(xì)胞或步驟(c)繁殖的細(xì)胞、或允許步驟(b)所選擇的 細(xì)胞或步驟(c)繁殖的細(xì)胞中出現(xiàn)自發(fā)突變；和(e)選擇相對于步驟(b)得到的表達(dá)，顯示 出所述選擇標(biāo)記表達(dá)增加的細(xì)胞。包含在細(xì)胞核中基因的表達(dá)分兩步發(fā)生轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核中進(jìn)行并產(chǎn)生mRNA產(chǎn)物， mRNA產(chǎn)物被輸出到細(xì)胞溶質(zhì)中，其在細(xì)胞溶質(zhì)中被翻譯成形成肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列且 可能在翻譯后被修飾。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“表達(dá)”指產(chǎn)生表達(dá)產(chǎn)物的過程，表達(dá)產(chǎn)物 可以是蛋白質(zhì)或肽，也稱為“(多)肽”，表達(dá)產(chǎn)物或者可以是不被翻譯成(多)肽的核酸， 諸如某些RNA種類，例如，rRNA、siRNA、shRNA、miRNA、核酶、核開關(guān)或反義RNA?！稗D(zhuǎn)基因的 表達(dá)”是導(dǎo)入到細(xì)胞中的外源基因在所述細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物的生成。本發(fā)明上下文中所使用 的術(shù)語“增加的表達(dá)”指步驟(d)中真核細(xì)胞中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因的較高表達(dá)產(chǎn)物量，其是相對 于經(jīng)過步驟(b)以后在所述細(xì)胞中可以觀察到的所述轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)物水平。例如，如果在步 驟(b)后在細(xì)胞中可檢測到特殊轉(zhuǎn)基因的低表達(dá)，“增加的表達(dá)”優(yōu)選地表示獲得的表達(dá)產(chǎn) 物量增加至少10%，優(yōu)選為至少25%，更優(yōu)選為至少50%，甚至更優(yōu)選為至少100%，如至 少200%、至少300 %、至少400 %，而且最優(yōu)選為至少500%。如果轉(zhuǎn)基因?qū)?xì)胞是異源的 基因，即來自不同的株系或種，增加通常意為改進(jìn)的表達(dá)，超過用現(xiàn)有技術(shù)方法，即，沒有使 用本發(fā)明方法的細(xì)胞或有機(jī)體獲得的表達(dá)量。或者，增加是用常規(guī)檢測手段可檢測的超出 背景水平的表達(dá)產(chǎn)物量。優(yōu)選地，增加量為各個細(xì)胞中表達(dá)的總蛋白的至少0. 0001%,如至 少0. 001 %或至少0.01%，更優(yōu)選為至少0.05%，甚至更優(yōu)選為至少0.1%，如至少0.2%。 增加的量可以通過將用現(xiàn)有方法獲得的產(chǎn)量與用本發(fā)明方法獲得的產(chǎn)量比較來測量。該測 量可以通過使用本領(lǐng)域已知的方法和/或本說明書中描述的方法來實(shí)現(xiàn)。增加的百分?jǐn)?shù)通 常與以上提到的數(shù)值相對應(yīng)。通常，編碼將被表達(dá)的蛋白質(zhì)或核酸的基因以表達(dá)載體的形式被導(dǎo)入到細(xì)胞中。 在不同的有機(jī)體或不同物種的細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的條件在本領(lǐng)域是周知的，而且取決于所 要表達(dá)的蛋白質(zhì)以及使用的細(xì)胞。典型的真核表達(dá)載體含有啟動子元件，其調(diào)節(jié)mRNA的初始轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)編碼序列 以及轉(zhuǎn)錄終止需要的信號和轉(zhuǎn)錄本的聚腺苷酸化。另外的元件可能包括增強(qiáng)子、Kozak序 列和兩側(cè)具有RNA剪接供體位點(diǎn)和受體位點(diǎn)的間插序列。高效率的轉(zhuǎn)錄可以用來自SV40 的早期啟動子和晚期啟動子、來自反轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)序列(LTRs)，例如，RSV、HTLVI、HIVI、和巨細(xì)胞病毒(CMV)的早期啟動子來完成。然而，細(xì)胞元件也可以被使用(例如， 人類肌動蛋白啟動子)。保證轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控元件可能的例子包括巨細(xì)胞病毒(CMV)啟 動子、RSV啟動子(勞氏肉瘤病毒)、lacZ(i3-半乳糖苷酶基因)啟動子、gallO啟動子、 人類延伸因子Ia啟動子、CMV增強(qiáng)子、鈣調(diào)蛋白激酶(CaM-kinase)啟動子、苜蓿銀紋夜 蛾多核型多角體病毒(AcMNPV)多角體啟動子或者SV40增強(qiáng)子。植物啟動子的例子是組 成型啟動子，如無花果瘤花葉病毒35S啟動子、花椰菜花葉病毒啟動子、CaMV35S啟動子 或MAS啟動子，或者組織特異啟動子，如康乃馨花瓣GSTl啟動子或擬南芥(Arabidopsis) SAG 12 啟動子(參考，例如，J. C. Palaqui etal.，Plant Physiol.，112 1447-1456 (1996)； Morton et al. ,Molecular Breeding 1 123-132(1995) ；Fobert et al. ,Plant Journal, 6:567-577(1994)；和 Ganetal，Plant Physiol.，113 :313 (1997))。酵母啟動子是，例如， GallO啟動子或者TPI丙糖磷酸異構(gòu)酶啟動子。轉(zhuǎn)錄終止信號的例子是CaMV35S或Nos終 止子、SV40聚腺苷酸(poly-A)位點(diǎn)或tk聚腺苷酸位點(diǎn)或SV40、IacZ和AcMNPV多角體多 腺苷酸化信號、多核苷酸下游。此外，也可以包括這樣的元件，如復(fù)制起點(diǎn)、耐藥基因、調(diào)節(jié) 子(作為誘導(dǎo)型啟動子的一部分)或者內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。本文使用的術(shù)語“(多)肽”描述了一組分子，其包括由多達(dá)30個氨基酸組成的一 組肽，以及由大于30個氨基酸組成的一組多肽，多肽也稱為蛋白質(zhì)。(多)肽還可以形成 二聚體、三聚體和更高的低聚體，即，由一個以上(多)肽分子組成。形成這種二聚體、三聚 體等的(多)肽分子可以是相同的或不同的。因此，相應(yīng)的更高級的結(jié)構(gòu)稱為同源二聚體 或異源二聚體、同源三聚體或異源三聚體等。術(shù)語“(多)肽”和“蛋白質(zhì)”也指自然修飾的 (多)肽/蛋白質(zhì)，其中這種修飾是通過例如，糖基化、乙?；饔谩⒘姿峄饔靡约邦愃谱?用實(shí)現(xiàn)的。這樣的修飾在本領(lǐng)域是眾所周知的。根據(jù)本發(fā)明的“核酸”包括DNA，如cDNA或基因組DNA以及RNA，正義鏈和反義鏈， 以及常規(guī)修飾的或衍生的核酸分子。就這點(diǎn)而言，作為表達(dá)產(chǎn)物的核酸優(yōu)選為RNA，然而，即 將被導(dǎo)入到細(xì)胞中的核酸優(yōu)選為DNA。“轉(zhuǎn)基因”是被從一個生物體轉(zhuǎn)移到另一個生物體的核酸分子。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”優(yōu) 選地描述已經(jīng)從一個生物體中分離出來的DNA片段，或者根據(jù)所述生物體中發(fā)現(xiàn)的核酸序 列半合成產(chǎn)生的或合成產(chǎn)生的DNA片段，并且其被導(dǎo)入到不同的生物體中。這種非固有的 DNA片段，即在新的宿主生物體中的“轉(zhuǎn)基因”可以在轉(zhuǎn)基因生物中保留被表達(dá)成RNA或肽 或蛋白質(zhì)的能力。根據(jù)上述定義的“轉(zhuǎn)基因”可以是cDNA或自然存在于基因組DNA中的基 因，包括非編碼區(qū)，如內(nèi)含子?；蛘?，轉(zhuǎn)基因可以是編碼RNA物質(zhì)的DNA序列。在這種情況 下，轉(zhuǎn)基因的最小長度至少為25個核苷酸、優(yōu)選為至少40個核苷酸、更優(yōu)選為至少60個核 苷酸。如本領(lǐng)域已知的，如果轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生了 siRNA、shRNA或miRNA，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的長度范圍優(yōu) 選為17到27、更優(yōu)選為19到21個核苷酸，形成雙鏈并任選地含有一個或兩個突出端。在 本發(fā)明的上下文中，轉(zhuǎn)基因可以是來源于與轉(zhuǎn)基因生物所屬物種不同的物種中的基因，但 也可以是從一個物種的一個個體(細(xì)胞)中分離并被導(dǎo)入到同一物種的不同個體(細(xì)胞) 中的基因。后者包括，例如，在一個物種的某些個體中發(fā)現(xiàn)的一個基因的突變等位基因。換 言之，被導(dǎo)入到根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因可以是同源的或異源的核酸序列。術(shù)語“導(dǎo)入核酸”指將核酸應(yīng)用到細(xì)胞中、及其隨后的吸收以及整合到所述細(xì)胞， 尤其是核的遺傳信息中。根據(jù)細(xì)胞的種類，即，與什么類型的真核細(xì)胞有關(guān)，即，其屬于哪類生物體(植物、真菌、動物，例如，脊椎動物，或者更具體而言哺乳動物)，不同的術(shù)語被用來 表示這種過程(process)。一般而言，由外源遺傳物質(zhì)的導(dǎo)入/吸收和表達(dá)導(dǎo)致的細(xì)胞的遺 傳學(xué)改變被稱為“轉(zhuǎn)化”，但是該術(shù)語也僅用于描述非動物真核細(xì)胞，如真菌、藻類和植物中 非病毒DNA的轉(zhuǎn)移。術(shù)語“轉(zhuǎn)導(dǎo)”被用于由病毒導(dǎo)入的DNA導(dǎo)致的遺傳學(xué)改變。動物細(xì)胞， 尤其是哺乳動物細(xì)胞的“轉(zhuǎn)化”通常被稱為“轉(zhuǎn)染”。酵母和真菌可以用眾所周知的方法，如 乙酸理/單鏈載體DNA/聚乙二醇方法轉(zhuǎn)化(Gietz and Woods, 2002) 0酵母轉(zhuǎn)化的另外一 個選擇是冷凍酵母轉(zhuǎn)化方案(Frozen Yeast Protocol)，其結(jié)果產(chǎn)生解凍后仍能轉(zhuǎn)化的冷 凍酵母細(xì)胞(Schiestl et al.，1993)?；驑屴D(zhuǎn)化是用包被有DNA的金或鎢納米顆粒實(shí)現(xiàn) 的，包被有DNA的金或鎢納米顆粒被射入到例如，真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或植物胚胎中，因而 將它們轉(zhuǎn)化。用這種方法的轉(zhuǎn)化效率在植物中比細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效率低，但大部分植物可 以用這種方法轉(zhuǎn)化。通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，真菌孢子或植物細(xì)胞通過除去細(xì)胞壁能被轉(zhuǎn)變成 原生質(zhì)體，然后被浸入到含有DNA的溶液中被被轉(zhuǎn)化。沒有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化也可 以用玻璃珠法實(shí)現(xiàn)(Kindle et al，1990)。農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是最容易和最簡單的植物轉(zhuǎn)化(An，1987)。 例如植物組織(通常是葉)被切成小片，例如，IOXlOmm(毫米)，并在含有懸浮農(nóng)桿菌的流 體中浸泡10分鐘。沿著切口的一些細(xì)胞會被細(xì)菌轉(zhuǎn)化，細(xì)菌將其DNA插入到細(xì)胞中。當(dāng)被 放到生根和發(fā)芽選擇培養(yǎng)基上后，植物會再生長。一些植物物種可以僅僅通過將花浸漬到 農(nóng)桿菌的懸浮液中，然后將種子種在選擇性培養(yǎng)基上而被轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌也可以通過使用電 穿孔而被轉(zhuǎn)化(Weigel and Glazebrook，2006)。在植物細(xì)胞病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)中，預(yù)期的遺傳物質(zhì)被包裝到合適的植物病毒中，然后所得 的病毒可以感染植物。如果遺傳物質(zhì)是DNA，它可以與染色體重組產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞。動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染通常包括開啟細(xì)胞質(zhì)膜上的瞬時孔隙或“洞”以吸收物質(zhì)。除了電 穿孔，轉(zhuǎn)染可以通過各種將外源DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中的方法來實(shí)現(xiàn)。一種方法是通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染(見，例如，Nature Methods 2, 319-320) 0含有磷酸 鹽離子的HEPES緩沖鹽溶液(HeBS)與含有將被轉(zhuǎn)染的DNA的氯化鈣溶液結(jié)合。當(dāng)兩種溶 液被結(jié)合時，將會形成帶正電荷的鈣和帶負(fù)電荷的磷酸鹽的細(xì)小沉淀物，將待被轉(zhuǎn)染的DNA 結(jié)合其表面上。然后，沉淀物的懸浮液被加入到即將被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(通常是以單細(xì)胞層生 長的細(xì)胞培養(yǎng)物)。許多物質(zhì)已經(jīng)被用作轉(zhuǎn)染的載體，其中(陽離子)聚合物、脂質(zhì)體和納 米顆粒(見例如，美國專利5948878，F(xiàn)eigner等，1987 ；Martien et al.，2008)。這樣的方 法使用例如，高支化有機(jī)化合物，即所謂的樹狀大分子來結(jié)合DNA。非常有效的方法是將待 被轉(zhuǎn)染的DNA包含到脂質(zhì)體中，該脂質(zhì)體能夠與細(xì)胞膜融合，將DNA釋放到細(xì)胞中。對于真 核細(xì)胞，基于脂質(zhì)-陽離子的轉(zhuǎn)染更經(jīng)常被使用，因?yàn)榧?xì)胞更敏感。另一種方法是使用陽離 子聚合物，如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亞胺。帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合到聚陽離子上，并且絡(luò)合物 通過胞吞作用被細(xì)胞吸收。如上所述，轉(zhuǎn)染也可以通過基因槍實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)染的其它方法包括核轉(zhuǎn)染、熱擊、磁轉(zhuǎn)染，和轉(zhuǎn)染試劑，如Lipofectamine 、 Dojindo HiIyMax> Fugene> jetPEI 、Effectene 或 DreamFect 。優(yōu)選地是核酸的導(dǎo)入是穩(wěn)定的，即，它穩(wěn)定地駐留于細(xì)胞核中。如果導(dǎo)入的核酸本 身并不編碼選擇標(biāo)記——該選擇標(biāo)記使細(xì)胞具有選擇優(yōu)勢，如對某種除草劑、毒素或抗生 素的抵抗力，以及如果導(dǎo)入的核酸沒有穩(wěn)定地整合到細(xì)胞核中，則可以通過與另一種編碼這樣的選擇標(biāo)記的核酸的共轉(zhuǎn)化促進(jìn)整合。導(dǎo)入到細(xì)胞核中的核酸如果編碼蛋白質(zhì)，其通常在細(xì)胞溶質(zhì)細(xì)胞溶質(zhì)中被翻譯 (胞質(zhì)表達(dá))。本方法旨在增加胞質(zhì)表達(dá)，然而，表達(dá)也發(fā)生在細(xì)胞器中，如線粒體或葉綠 體，它們自己具有編碼細(xì)胞器特異基因的基因組。然而，本發(fā)明優(yōu)選地不考慮后面的表達(dá)類 型。結(jié)合本發(fā)明所使用的“選擇標(biāo)記”表示遺傳信息，其使細(xì)胞與不含所述選擇標(biāo)記的 其它細(xì)胞相比具有選擇優(yōu)勢。選擇標(biāo)記的例子包括毒素、除草劑或抗生素抗性基因的表達(dá) 產(chǎn)物，或者編碼恢復(fù)細(xì)胞對特殊有機(jī)化合物原養(yǎng)型的蛋白質(zhì)的基因表達(dá)產(chǎn)物，或者編碼使 在不利條件下能夠生長的蛋白質(zhì)的基因表達(dá)產(chǎn)物。在本方法的背景下，使用對選擇試劑做出響應(yīng)的選擇標(biāo)記，并且其中所述選擇標(biāo) 記的表達(dá)水平與對選擇試劑的表型響應(yīng)水平成正比。選擇試劑使不含有編碼響應(yīng)于所述選 擇試劑的選擇標(biāo)記的基因的細(xì)胞具有劣勢，選擇標(biāo)記能抵消所述選擇試劑的作用?！氨硇晚?應(yīng)”表示表達(dá)選擇標(biāo)記的細(xì)胞對選擇試劑的可檢測反應(yīng)的程度。換言之，所述選擇標(biāo)記在細(xì) 胞中的表達(dá)越高，在選擇試劑存在的情況下所述選擇標(biāo)記的表達(dá)越清楚地可檢測。在優(yōu)選實(shí)施方式中，對選擇試劑的響應(yīng)是對選擇試劑的抗性。在該實(shí)施方式中，選 擇標(biāo)記賦予抗性。所述抗性優(yōu)選為可以通過在所述選擇試劑存在的情況下細(xì)胞的存活或生 長檢測。這尤其適用于當(dāng)選擇試劑是抗生素、毒素或除草劑的情況，即，當(dāng)選擇標(biāo)記賦予對 所述抗生素、毒素或除草劑的抗性時。因此，賦予抗性的所述選擇標(biāo)記在細(xì)胞中的表達(dá)越 高，可應(yīng)用到所述細(xì)胞而不抑制其生長或?qū)⑵錃⑺赖倪x擇試劑，如抗生素、毒素或除草劑的 劑量就越高。通常在哺乳動物中導(dǎo)入并表達(dá)的賦予抗性的選擇標(biāo)記是，例如，賦予對環(huán)氯胍 抗性的二氫葉酸還原酶(dhfr)、賦予對霉酚酸抗性的次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶 (gpt)、賦予對新霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II或賦予對潮霉素B抗性的潮霉素活性鈍 化激酶。真菌細(xì)胞的選典型擇標(biāo)記基因包括例如，貝那諾霉素抗性(benA)基因、卡那霉素 抗性基因、G418抗性基因和博萊霉素抗性基因。植物細(xì)胞選擇標(biāo)記基因是那些表達(dá)寡霉素 抗性ATP合成酶(oliC)、潮霉素B抗性、卡那霉素抗性、G418(遺傳霉素)抗性、腐草霉素/ 博來霉素抗性、依米丁抗性、巴龍霉素抗性或賦予對除草劑BASTA抗性的BAR的基因。如上所述，選擇標(biāo)記可以是編碼恢復(fù)對有機(jī)化合物原養(yǎng)型的蛋白質(zhì)的基因，也稱 為原養(yǎng)型恢復(fù)基因的表達(dá)產(chǎn)物。在這種情況下，導(dǎo)入的選擇標(biāo)記使細(xì)胞本身能夠合成所述 化合物，以使其不再依賴于或更少依賴于通過培養(yǎng)基外源供應(yīng)的所述化合物。因此，如本發(fā) 明所使用的原養(yǎng)型恢復(fù)基因是編碼表達(dá)產(chǎn)物的基因，即選擇標(biāo)記，通過促進(jìn)其在細(xì)胞內(nèi)合 成而降低或優(yōu)選為消除宿主細(xì)胞對外源供應(yīng)有機(jī)化合物的依賴。對表達(dá)所述原養(yǎng)型恢復(fù) 基因的細(xì)胞的選擇是通過在不含所述化合物的培養(yǎng)基上/中培養(yǎng)所述細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。只有 表達(dá)所述原養(yǎng)型恢復(fù)基因的細(xì)胞會生長。所述基因的表達(dá)產(chǎn)物可以是合成途徑的組分，并 且所述組分產(chǎn)生的產(chǎn)物可能必須被進(jìn)一步加工以獲得有機(jī)化合物，否則就要外源供給有機(jī) 化合物。通常應(yīng)用到植物或真菌細(xì)胞的原養(yǎng)型恢復(fù)基因是，例如，那些表達(dá)能賦予精氨酸 原養(yǎng)型、色氨酸原養(yǎng)型、尿苷原養(yǎng)型的蛋白質(zhì)的基因，或者是能夠利用硝酸鹽或硫酸鹽的基 因。如果選擇標(biāo)記是原養(yǎng)型恢復(fù)基因的表達(dá)產(chǎn)物，選擇試劑是這樣的培養(yǎng)基，細(xì)胞在其中培 養(yǎng)而且其并不含有各自的有機(jī)化合物。在那種情況下響應(yīng)被表達(dá)，例如，細(xì)胞的生長率。因此，選擇標(biāo)記的表達(dá)越高，在不存在各自有機(jī)化合物的情況下，細(xì)胞的生長率越高。對于一些原養(yǎng)型恢復(fù)基因，足以產(chǎn)生原養(yǎng)型的表達(dá)產(chǎn)物的量很低。因此，區(qū)分以低 水平表達(dá)所述原養(yǎng)型恢復(fù)選擇標(biāo)記的細(xì)胞與以高水平表達(dá)所述原養(yǎng)型恢復(fù)選擇標(biāo)記的那 些細(xì)胞更加費(fèi)力。為了促進(jìn)所述區(qū)分，這樣的原養(yǎng)型恢復(fù)基因可以與編碼報告基因的核酸 一起被共同導(dǎo)入，所述報告基因的可檢測性與其表達(dá)水平成正比。因此，在該實(shí)施方式中， 根據(jù)本發(fā)明的選擇標(biāo)記由輔源營養(yǎng)基因和報告基因構(gòu)成。“報告基因”是其表達(dá)產(chǎn)物超過背景水平可測量、并通過常用和直接的方法可檢測 的基因。所述表達(dá)產(chǎn)物也稱為“報道分子”。報告基因一般可以用于獲取有關(guān)細(xì)胞表達(dá)行 為(expression behaviour)的信息、在與報告基因融合情況下的有關(guān)其它基因表達(dá)和定位 信息、或者有關(guān)控制報告基因的啟動子的活性的信息。某些表達(dá)的報道分子可以從視覺上 檢測，如熒光蛋白或磷光蛋白。其它的，如熒光素酶將底物轉(zhuǎn)換成從視覺上可檢測的產(chǎn)物， 其，例如，發(fā)出生物熒光。以上報道分子在細(xì)胞中可檢測。另外的報道分子是那些存在特異 結(jié)合分子，如抗體的報道分子。這些可以由本領(lǐng)域已知的方法應(yīng)用這樣的結(jié)合分子，如免疫 沉淀反應(yīng)或蛋白質(zhì)印跡法來檢測。核酸形式的報道分子或報告基因可以通過DNA印記法或 RNA印記法來檢測。然而，這些報道分子的檢測并不能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生，而是它們必需被從細(xì) 胞中釋放出來。本發(fā)明該實(shí)施方式中合適的報告基因的例子是以下進(jìn)一步詳細(xì)描述的熒光 蛋白或磷光蛋白，或者是那些調(diào)節(jié)生物熒光的報告基因。達(dá)到上述必要條件的用于生物體 衣藻的選擇標(biāo)記和報告基因的示例性組合由Arg基因和GFP或YFP組成。術(shù)語“熒光蛋白”或“熒光(多)肽”指以一定的波長激發(fā)后發(fā)出熒光的(多)肽 或蛋白質(zhì)。各種熒光蛋白可以用于本發(fā)明中。一組這樣的熒光蛋白包括從水母(Aequorea Victoria)中分離的綠色熒光蛋白(GFP)，以及許多GFP變異體，如青色熒光蛋白、藍(lán)色熒 光蛋白、黃色熒光蛋白等(Zhang et al.，2002 ;Zimmer，2002)。顏色轉(zhuǎn)移GFP突變子具有 藍(lán)色到黃綠色的發(fā)光顏色、增加的亮度以及光穩(wěn)定性(TSien，1998)。一種被稱為增強(qiáng)型黃 色熒光蛋白的這種GFP突變子顯示出529nm(納米)的最大發(fā)射波長。另外的具有改進(jìn)型 激發(fā)和發(fā)射光譜(美國專利申請200201231)、增強(qiáng)的熒光強(qiáng)度和熱耐受性(美國專利申請 20020107362A1 ；美國專利申請20020177189A1)、以及在降低的氧水平下形成生色團(tuán)(美國 專利第6，414，119號)的基于GFP的變異體已經(jīng)被描述。磷光是與熒光有關(guān)的特殊類型的光致發(fā)光。與熒光不同，磷光物質(zhì)并不立即重新 發(fā)射其吸收的輻射。重新發(fā)射的較慢時標(biāo)(time scale)與量子力學(xué)中“禁阻”能態(tài)躍遷有 關(guān)。因?yàn)檫@些躍遷在某些物質(zhì)中較少發(fā)生，吸收的輻射可以以較低的強(qiáng)度被重新發(fā)射達(dá)幾 個小時。磷光蛋白的例子是磷光金屬卟啉。生物發(fā)光是由于化學(xué)反應(yīng)由活生物體產(chǎn)生和發(fā)出光，在該化學(xué)反應(yīng)期間，化學(xué)能 被轉(zhuǎn)換成光能。生物發(fā)光可以由較大生物體中攜帶的共生生物自然產(chǎn)生。三磷腺苷(ATP) 包含于大部分例子中?；瘜W(xué)反應(yīng)可以或者發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，或者發(fā)生在細(xì)胞外。引起生物熒 光的示例性蛋白質(zhì)是螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶和長腹水蚤熒光素酶。對表達(dá)選擇標(biāo)記細(xì)胞的選擇條件依賴于所使用的選擇標(biāo)記的特性。如果抗生素抗 性被導(dǎo)入到細(xì)胞中，其將會在含有各自抗生素的培養(yǎng)基中/上被培養(yǎng)，各自抗生素的濃度 足夠保證轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇。如上所述，如果原養(yǎng)型恢復(fù)基因單獨(dú)被導(dǎo)入、或與報告基因結(jié)合被導(dǎo)入，該細(xì)胞將會在不含所述原養(yǎng)型恢復(fù)基因的基因產(chǎn)物合成的有機(jī)化合物的培養(yǎng)基上被培養(yǎng)。在本方法中，利用所述選擇標(biāo)記的可檢測表達(dá)實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的選擇。根據(jù)選擇標(biāo)記， 可檢測性表示為細(xì)胞的存活和/或生長，或者足夠量的待檢測選擇標(biāo)記的表達(dá)——例如通 過細(xì)胞改變的表型。關(guān)于抗生素抗性的例子，可檢測表達(dá)意為導(dǎo)入選擇標(biāo)記后獲得的不同 克隆每一個均受不同濃度的各自抗生素的影響。以在高濃度所述抗生素下生長和/或存活 表現(xiàn)出抗性的克隆在步驟(b)、并隨后在步驟(d)中被選擇。在原養(yǎng)型恢復(fù)基因的情況中， 在不含各自有機(jī)化合物而含有報告基因的培養(yǎng)基上生長的克隆在步驟(b)、并隨后在步驟 (d)中被選擇?！胺敝场北硎就ㄟ^在含有選擇試劑的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中/上培養(yǎng)，從一個或更多個細(xì) 胞，在該實(shí)例中是那些從步驟(b)中獲得的細(xì)胞開始增加細(xì)胞數(shù)目。一般而言，在步驟(b) 后得到的克隆在所述克隆繁殖后變得可檢測/可見和/或可區(qū)分，例如以菌落的形式。因 此，繁殖步驟是選擇步驟(b)的固有部分。然而，在某些情況下，例如，如果需要或要求高數(shù) 量的細(xì)胞，可以進(jìn)行另外的繁殖步驟?！罢T變細(xì)胞”表示隨機(jī)改變細(xì)胞中含有的遺傳信息的過程。根據(jù)使用的方法，誘變 產(chǎn)生更小程度上或更大程度上改變的細(xì)胞。在本發(fā)明的上下文中，誘變以細(xì)胞核中含有的 遺傳信息為目標(biāo)，因?yàn)楸徽J(rèn)是造成細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因弱表達(dá)的過程，例如，基因沉默機(jī)制，被假 定位于細(xì)胞核內(nèi)而不是細(xì)胞器中。誘變可以例如，通過化學(xué)誘變劑、通過輻射或通過遺傳學(xué) 方法實(shí)現(xiàn)?；瘜W(xué)誘變劑被定義為增加一些突變類型頻率的化合物。它們的潛能、它們與DNA 的反應(yīng)能力、它們的一般毒性、以及它們引入到DNA中的化學(xué)改變類型會被修復(fù)系統(tǒng)修正 的可能性會變化。描述了幾種化學(xué)誘變劑的種類堿基類似物誘變劑是模擬正常堿基并被DNA復(fù)制 系統(tǒng)使用的化學(xué)物。它們的基本性質(zhì)是它們用兩個不同的堿基進(jìn)行堿基配對，由于它們?nèi)?乏堿基配對一致性而引起突變。一個例子是5-溴脫氧尿苷(5BU)，其可以以兩種互變異構(gòu) 體形式存在通常，它以與A配對的酮式(T模擬型)存在，但它也可以以與G配對的烯醇式 (C模擬型)存在。因?yàn)槠洳粩噱e配的可能性，每個堿基類似物誘變劑會繼續(xù)隨著時間推移 誘變。因?yàn)檫@在復(fù)制過程中要求“錯配”，因此，接下來的幾輪復(fù)制是任何即將產(chǎn)生的突變所 必需的。此外，在突變被穩(wěn)定以前即，在DNA的兩個鏈都含有突變信息之前，需要另一輪復(fù) 制。這被稱為“突變固定”。錯配修復(fù)系統(tǒng)依然可以識別并清除錯誤的堿基直到突變固定發(fā) 生。烷化劑直接與某些堿基反應(yīng)，因而為了發(fā)揮作用并不需要活性DNA合成，但為了 產(chǎn)生“固定的突變”仍需要DNA合成。它們是很常用的，因?yàn)樗鼈儙缀踉诿總€生物系統(tǒng)中都 是強(qiáng)大的誘變劑。烷化劑的例子包括甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、硫酸二乙酯 (DES)和亞硝基胍(NTG、NG、MNNG)。這些誘變劑傾向于優(yōu)選富含G的區(qū)域，發(fā)生作用以形成 各種修飾的G殘基，結(jié)果經(jīng)常是脫嘌呤。這些修飾的G殘基中的一些具有誘導(dǎo)錯誤傾向修 復(fù)的特性，盡管改變的堿基的錯配也有可能發(fā)生。盡管堿基替換到目前為止是最頻繁的，由 于這些誘變劑，這種錯誤傾向修復(fù)的刺激使各種突變類型得以發(fā)生。而且，烷基化的堿基看 起來可以在復(fù)制過程中錯配。另外的化學(xué)誘變劑是引起特殊堿基氧化脫氨基作用的亞硝酸。它將腺嘌呤轉(zhuǎn)變成次黃嘌呤(其現(xiàn)在與C配對)，胞嘧啶轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(其現(xiàn)在與A配對)，并且最后將鳥嘌 呤轉(zhuǎn)變成黃嘌呤(其仍然繼續(xù)與C配對)。與以上誘變劑不同，亞硝酸將堿基直接改變成 “密碼錯編”形式，并因?yàn)槠湫?yīng)而不需要隨后的DNA合成。還有另外一種類型的化學(xué)誘變劑，即所謂的“ ICR”化合物(雜環(huán)氮芥)，包括移碼 突變，其需要DNA合成以產(chǎn)生突變。它們顯然通過鄰近堿基之間的“插入”來誘變，可能使 合成/修復(fù)系統(tǒng)認(rèn)為那個位置上有另外的堿基。由輻射引起的誘變優(yōu)選為由紫外線進(jìn)行誘變，所述紫外線在鄰近的嘧啶堿基處主 要產(chǎn)生環(huán)丁烷二聚體和焦(6-4)膿菌素光產(chǎn)物。其它基于輻射的誘變技術(shù)使用，例如，X光 或快速中子轟擊。遺傳誘變技術(shù)包括，例如，隨機(jī)插入誘變(例如，用質(zhì)?；蜣r(nóng)桿菌T-DNA構(gòu) 建物)和轉(zhuǎn)座子誘變，例如，Azpiroz-Leehan (1997)、Bouchez (1998)、Zhang (2003)、 Ostergaard (2004)、Alonso (2006)。除了積極誘變細(xì)胞以外的另外一種誘變也可以通過允許細(xì)胞內(nèi)自發(fā)突變的出現(xiàn) 而實(shí)現(xiàn)。由于細(xì)胞內(nèi)存在各種DNA修復(fù)系統(tǒng)，細(xì)胞中的突變速率通常很低。然而，某些環(huán)境 條件適于提高自發(fā)突變的速率。這樣的條件是，例如，培養(yǎng)過程中溫度的提高或者暴露于某 細(xì)胞或組織培養(yǎng)基(一種現(xiàn)象，也稱為“體細(xì)胞克隆變異”)。誘變之后，對與步驟(b)獲得的細(xì)胞相比，表現(xiàn)出選擇標(biāo)記表達(dá)增加的細(xì)胞進(jìn)行 選擇。在抗生素抗性作為選擇標(biāo)記的情況下，這意味著更高劑量的選擇試劑可以被應(yīng)用到 誘變后得到的克隆中，與應(yīng)用到步驟(b)中得到的克隆一樣，而不會抑制其生長或?qū)⑵錃?死。表達(dá)增加優(yōu)選地表示與步驟(b)中獲得的細(xì)胞相比，表達(dá)的基因產(chǎn)物增加至少10%、優(yōu) 選為至少25%、更優(yōu)選為至少50%、甚至更優(yōu)選為至少100%，如至少200%、至少300%或 至少400%，并且最優(yōu)選為至少500%。對于原養(yǎng)型恢復(fù)基因，克隆在培養(yǎng)基上生長，培養(yǎng)基 不含各自有機(jī)化合物并與其它克隆相比，顯示出更高的報告基因可檢測表達(dá)，其中表達(dá)比 步驟(b)中檢測的表達(dá)更高，其在步驟(d)中被選擇。本發(fā)明第一次公開了產(chǎn)生具有增加的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的真核細(xì)的有效方法。具有相同 目的的方法已經(jīng)在文獻(xiàn)中被多次建議過，然而，但是并沒有產(chǎn)生可比性的結(jié)果。本方法是基 于轉(zhuǎn)化到目標(biāo)細(xì)胞中選擇標(biāo)記的相互作用和隨后的誘變細(xì)胞步驟。基于對抑制細(xì)胞中轉(zhuǎn)基 因表達(dá)的過程的鈍化，只有這些步驟的組合才能夠選擇與自然發(fā)生的細(xì)胞相比所述選擇標(biāo) 記表達(dá)更高的細(xì)胞。用本方法獲得的細(xì)胞提供了有價值的研究手段。此外，它們可以作為 一些蛋白質(zhì)或核酸，如生物制藥或生物燃料組分的有效表達(dá)宿主，這些蛋白質(zhì)或核酸的重 組表達(dá)目前還不可能，因?yàn)槟承┥锘钚曰衔锊荒塬@得，例如，由于缺乏賦予所述活性必 需的翻譯后修飾。與原核生物相反，翻譯后修飾是在真核細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)中完成的。因此，轉(zhuǎn)基因的 有效表達(dá)與對表達(dá)產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)必要修飾以賦予它們生物活性的可能性的組合，使某些蛋白質(zhì) 或核酸的重組表達(dá)得到相當(dāng)大的提高。本發(fā)明的方法尤其適用于這樣的細(xì)胞，其易于培養(yǎng) 和繁殖，如植物細(xì)胞或工業(yè)使用的酵母。然而，由于表達(dá)增加，該方法甚至對生長更緩慢的 細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞也有價值。最后，本文開發(fā)的分離表現(xiàn)轉(zhuǎn)基因高表達(dá)能力細(xì)胞的策略不僅適用于外源蛋白質(zhì) 在其中的積累水平很低的細(xì)胞，通常也適用于不存在轉(zhuǎn)基因表達(dá)問題、但期望表達(dá)能力進(jìn)一步提高的細(xì)胞。該策略的適用性也不依賴于轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)基因弱表達(dá)原因——唯一的 區(qū)別是，篩選會產(chǎn)生不同的突變體。在優(yōu)選實(shí)施方式中，細(xì)胞是植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。適合于本發(fā)明 的植物細(xì)胞是，例如，紫花苜蓿、埃塞俄比亞芥、馬鈴薯、煙草、擬南芥屬(Arabidopsis)、浮 萍屬(Lemna)、水稻、香蕉、玉米、大豆、花椰菜、苔蘚、如小立宛蘚屬(Physcomitrella)、番 茄、谷物、含油種子、小麥或藻類，如真核紅藻類和綠藻類，例如，衣藻屬(Chlamydomonas)、 眼蟲屬(Euglena)和小球藻屬(Chlorella)。合適的真菌細(xì)胞選自，例如屬于曲霉科 (Aspergillus),如黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)或鐮孢 霉(Fusarium venenatum),或者酵母，如酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵 母(Saccharomyces diastaticus)或巴斯得畢赤酵母(Pichia pastoris)或其它工業(yè)使用 的酵母物種的菌株。經(jīng)常使用的哺乳動物表達(dá)宿主包括但不限于人類Hela(海拉細(xì)胞)、 HEK293 (胚胎腎細(xì)胞)、Η9 (Τ淋巴細(xì)胞)>SH-EPl和Jurkat細(xì)胞，鼠ΝΙΗ3Τ3和C2C12細(xì)胞， CosUCos7和CV1，鵪鶉QC1-3細(xì)胞，鼠L細(xì)胞，幼年敘利亞金黃地鼠腎(BHK)細(xì)胞和中國倉 鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。細(xì)胞可以是單細(xì)胞生物或者來自多細(xì)胞生物。在后者的情況下，例如，組織或組織 外植體的細(xì)胞可以被取出并培養(yǎng)。此外，如果合適的細(xì)胞，如非人類胚胎干細(xì)胞被選為原 始材料，用本發(fā)明的方法得到的細(xì)胞可以形成/發(fā)育成多細(xì)胞轉(zhuǎn)基因生物，例如，轉(zhuǎn)基因植 物、真菌或非人類轉(zhuǎn)基因動物。在另一個優(yōu)選實(shí)施方式中，細(xì)胞是衣藻細(xì)胞。盡管轉(zhuǎn)基因克隆可以依靠轉(zhuǎn)化衣藻細(xì)胞很容易地以高頻率獲得，但眾所周知很難 識別將目標(biāo)外源基因表達(dá)到相當(dāng)高水平的克隆(Fuhrmann et al. , 1999 ；Schroda et al.， 2000)。衣藻中轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率很低的分子水平的原因還未被了解。可能的機(jī)制包括異端 外遺傳基因沉默活性的存在和/或例外地壓縮染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，其一般不允許轉(zhuǎn)基因的活性轉(zhuǎn)錄。特化啟動子的使用(Schrodaet al.，2000 ；Fischer and Rochaix, 2001)和再合 成轉(zhuǎn)基因編碼區(qū)以調(diào)節(jié)其對衣藻高度富含GC的核基因組的密碼子使用(Fuhrmann et al., 1999 ；Fuhrmann et al. ,2004 ；Shao and Bock，2008)，這些在一定程度上減輕了一些情況 中的問題，但還沒有發(fā)現(xiàn)通用的解決方案。為了試圖克服在以模式生物萊茵衣藻為例的幾種真核生物中觀察到的轉(zhuǎn)基因表 達(dá)的局限，研發(fā)了一種遺傳篩選程序，其目的是使得能夠選擇在細(xì)胞溶質(zhì)中高水平表達(dá)導(dǎo) 入的轉(zhuǎn)基因的衣藻突變體。從所附的實(shí)施例中可以明顯看出，藻類表達(dá)菌株可以被分離，其 積累從核轉(zhuǎn)基因表達(dá)的熒光蛋白，多達(dá)可溶性蛋白總量的0.2%。菌株具有解決衣藻中嚴(yán)重 的轉(zhuǎn)基因表達(dá)問題并大大拓展衣藻細(xì)胞和分子生物學(xué)研究工具箱的潛力。在本發(fā)明中，開發(fā)了模式藻類萊茵衣藻的專用菌株，其高水平表達(dá)導(dǎo)入的外源基 因，即，轉(zhuǎn)基因(trangene)。這些菌株將會幫助克服用衣藻進(jìn)行基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中的可 以說最嚴(yán)重的限制。根據(jù)菌株高水平表達(dá)天然的衣藻基因、RPS14基因(CRYl-I)的抗生素 抗性等位基因的能力來選擇菌株。然而，不同的選擇標(biāo)記也同樣適于用本方法。重要的是，菌株也非常高水平地表達(dá)導(dǎo)入的異源轉(zhuǎn)基因，如實(shí)施例中所示的熒光 報告蛋白(fluorescent reporter protein)GFP和YFP的基因。此外，表達(dá)被證明是不依賴于啟動子的，因?yàn)楫?dāng)在PsaD和RBCS2啟動子控制下表達(dá)GFP時并不能觀察到實(shí)質(zhì)的差別。 這現(xiàn)在使得將以前不能用的整套技術(shù)應(yīng)用到衣藻中成為可能，包括使用FRET、BiFC以及相 似的方法進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析和體內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究。與最近完成的衣藻的 基因組序列一起，這些技術(shù)的可利用性預(yù)期會大大加快綠藻的后基因組學(xué)研究。此外，內(nèi)源 基因的過表達(dá)現(xiàn)在應(yīng)該變得沒那么麻煩，內(nèi)源基因的過表達(dá)通常會提供關(guān)于基因功能的有 價值的信息。為了生物技術(shù)的目的開發(fā)衣藻的興趣也在強(qiáng)烈增長，例如，作為生物燃料的生產(chǎn) 系統(tǒng)(Happe et al. ,2002 ；Kruse et al. ,2005)以及為了生物藥物受控制的和有效的表 達(dá),通常稱為分子耕作的領(lǐng)域(Franklin and Mayf ield, 2004 ；Walker et al. ,2005) 因 為目前為止，由于衣藻中獲得的非常低的轉(zhuǎn)基因水平，嚴(yán)重阻礙了所有這些應(yīng)用，本文所描 述的菌株也會有助于克服藻類生物技術(shù)中最嚴(yán)重的瓶頸之一。以前利用衣藻作為表達(dá)宿主的企圖基于導(dǎo)入到衣藻密碼子使用的轉(zhuǎn)基因密碼子 的適應(yīng)。有趣的是，本發(fā)明獲得的菌株中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的效率不再依賴于密碼子使用。密碼 子優(yōu)化的GFP和非密碼子優(yōu)化的YFP基因可以被相對高水平地表達(dá)。如本發(fā)明所實(shí)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的胞質(zhì)表達(dá)與在細(xì)胞器中的表達(dá)相比特別有利，因?yàn)榉?譯后修飾完全是在胞質(zhì)溶質(zhì)中完成的，翻譯后修飾往往是表達(dá)的蛋白具有生物活性的先決 條件。相反，最有可能從細(xì)菌發(fā)展而來的細(xì)胞器并不具有許多這樣的機(jī)制。因此，即使現(xiàn)有 技術(shù)中可以在細(xì)胞器，如衣藻的葉綠體中實(shí)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)的高表達(dá)，但較大部分的有用蛋 白質(zhì)將不會以生物活性形式被表達(dá)。此外，本發(fā)明中產(chǎn)生的所有獨(dú)立發(fā)生的轉(zhuǎn)基因克隆表現(xiàn)出相對高的外源蛋白積累 水平(圖2B)。這表明，與野生型菌株相比，表達(dá)水平不大依賴于在基因組中的插入位點(diǎn)。除了外源基因的弱表達(dá)之外，在衣藻中也已經(jīng)頻繁地觀察到轉(zhuǎn)基因表達(dá)的不穩(wěn)定 性(Fuhrmarm et al.，1999)。最初表現(xiàn)出一些轉(zhuǎn)基因表達(dá)的克隆后來又不明原因地失去表 達(dá)。至少對于目前用實(shí)驗(yàn)方法檢測的三個轉(zhuǎn)基因(CRY1-1、GFP和YFP)，沒有發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明 產(chǎn)生的菌株中轉(zhuǎn)基因表達(dá)不穩(wěn)定性的證據(jù)?，F(xiàn)有技術(shù)不能量化衣藻細(xì)胞細(xì)胞溶質(zhì)中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)量，因?yàn)楸磉_(dá)量通常 太低而不能被量化。因此，用本發(fā)明的方法，通過提供發(fā)揮增強(qiáng)的表達(dá)能力的菌株，使用衣 藻作為表達(dá)宿主的主要缺點(diǎn)可以被克服。根據(jù)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因，表達(dá)量可以高于或低于細(xì)胞 可溶性蛋白總量的0.2%。通過本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)雜交方法，也有可能將通過使用本發(fā)明的方法獲得的 衣藻菌株，如萊茵衣藻(Chlamydomonas rheinhardtii)菌株的有利特性轉(zhuǎn)移到其它的衣藻 菌株中。典型的菌株包括萊茵衣藻的細(xì)胞壁缺乏菌株和含細(xì)胞壁菌株和可互交的衣藻物 種，如Chlamydomonas Smithii0該技術(shù)可以被延伸到其它真核細(xì)胞中。因此，在進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法還包括將步驟(e)中選擇的細(xì) 胞與可互交的真核細(xì)胞進(jìn)行雜交的步驟，并選擇表現(xiàn)出如步驟(e)中觀察到的所述選擇標(biāo) 記的所述表達(dá)增加的非母細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，響應(yīng)是抗性，并且選擇標(biāo)記賦予抗性。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(b)和(d)中是選擇對最高濃度的所述抗生素表現(xiàn) 出抗性的細(xì)胞。
由于所用抗生素的不同作用機(jī)制以及根據(jù)所使用的細(xì)胞，抗生素的“更高濃度”或 “最高濃度”可以不同。使用的具體抗生素和具體細(xì)胞的實(shí)際“更高濃度”或“最高濃度”可 以由技術(shù)人員已知的常規(guī)方法確定。例如，可以用應(yīng)用到培養(yǎng)基的廣泛范圍的濃度粗篩顯 示，其中最高耐受所述濃度范圍會被發(fā)現(xiàn)。圍繞確定的初始濃度的更具體的篩選將會產(chǎn)生 精確的“更高或最高濃度”。對于本發(fā)明方法的這一方面，誘變前和誘變后適用于細(xì)胞的抗 生素濃度之間的差異被確定。通常獲得的抗生素的最高適用濃度可以以幾個數(shù)量級變化。 對于卡那霉素，例如，觀察到的濃度通常在10到1000mg/l (毫克/升)的范圍內(nèi)。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗性基因是CRYl-I基因。如上所述，所述CRYl-I基因是RPS14基因(CRYl-I)的等位基因，RPS14基因 (CRYl-I)的表達(dá)賦予抗依米丁性。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法還包括(a)’在步驟(b)之前將編碼 響應(yīng)于選擇試劑的選擇標(biāo)記的核酸導(dǎo)入到細(xì)胞中，所述核酸與步驟(a)中應(yīng)用的不同，和
(b)’用所述選擇試劑選擇對所述選擇標(biāo)記的響應(yīng)，優(yōu)選為在步驟(a)之后和在步驟(b)之
、r -該實(shí)施方式考慮到在步驟(b)中僅用以上定義的選擇標(biāo)記進(jìn)行選擇可能會更費(fèi) 力，因?yàn)橛^察到的表達(dá)水平或表達(dá)差異非常低。例如對于衣藻，如果用具體的抗生素，如吐 根堿進(jìn)行選擇，正是如此，因?yàn)楦髯赃x擇標(biāo)記，即CRYl-I基因的表達(dá)有時難以觀察。因此， 為促進(jìn)適當(dāng)?shù)倪x擇或?yàn)樵鰪?qiáng)步驟(b)中選擇的細(xì)胞的產(chǎn)量，編碼另外選擇標(biāo)記的核酸可以 被導(dǎo)入到細(xì)胞中，并且進(jìn)行另外的選擇步驟以選擇響應(yīng)于所述選擇標(biāo)記的細(xì)胞。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞對化合物是營養(yǎng)缺陷型的，其中，選擇標(biāo)記編碼 恢復(fù)所述化合物原養(yǎng)型的蛋白質(zhì)的輔源營養(yǎng)基因，并且，其中，步驟(b)’包括在步驟(a)之 后和步驟(b)之前選擇所述化合物原養(yǎng)型的恢復(fù)。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞是衣藻細(xì)胞，其對于Arg7基因是營養(yǎng)缺陷型 的。輔源營養(yǎng)型與上述原養(yǎng)型相對，并且表示有機(jī)體沒有能力合成自身生長所需的特 殊化合物(如IUPAC所定義的)。在遺傳學(xué)方法的背景下，如果一個細(xì)胞攜帶有突變，該突 變使其不能合成必需化合物，則該細(xì)胞就被認(rèn)為是營養(yǎng)缺陷型的。例如，酵母突變體中尿嘧 啶合成途徑中的基因失活，酵母突變體就是尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型。這樣的菌株不能合成尿嘧 啶，并且，如果可以從環(huán)境中吸收尿嘧啶，其才能生長。另一個實(shí)例是衣藻突變體，其中，編 碼用于精氨酸合成的酶的基因失活。因此，必需從細(xì)胞的外界環(huán)境，例如，培養(yǎng)基中吸收精 氨酸。在另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因是在PsaD或RBCS2啟動子的控制之下。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，誘變是通過輻射，優(yōu)選為紫外線輻射、化學(xué)誘變或基 因誘變實(shí)現(xiàn)的，所有這些手段以上均已討論過。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，方法還包括在步驟重(e)之后重復(fù)步驟(d)和(e)。 該實(shí)施方式旨在獲得與僅一次經(jīng)歷步驟(d)和(e)的細(xì)胞相比選擇標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)一步增 加的細(xì)胞。步驟(d)和(e)被重復(fù)至少一次，其導(dǎo)致根據(jù)該優(yōu)選實(shí)施方式的步驟(a)、(b)、
(c)、(d)、(e)、(d)、(e)、…的示例性順序。步驟(d)和(e)可以一直被重復(fù)，直到與前輪 步驟(d)和(e)相比觀察不到表達(dá)進(jìn)一步增加為止。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，方法還包括鈍化或清除在步驟(a)中，并任選為在 步驟(e)之后的步驟(a)’中導(dǎo)入的選擇標(biāo)記。鈍化選擇標(biāo)記旨在恢復(fù)細(xì)胞對選擇試劑的原始響應(yīng)。這可以通過去掉原先導(dǎo)入的 編碼選擇標(biāo)記的基因來完成，即，將其清除，或者通過完全或部分除去所述基因以便其不產(chǎn) 生功能表達(dá)產(chǎn)物來完成。這些方法是技術(shù)人員所熟知的，而且包括，例如，通過位點(diǎn)特異性 重組進(jìn)行的標(biāo)記刪除(Ebinuma et al.，2001)。該實(shí)施方式旨在恢復(fù)細(xì)胞對選擇試劑的原始靈敏性以使有可能重新利用所述選 擇標(biāo)記導(dǎo)入目標(biāo)轉(zhuǎn)基因，如果必要或需要話。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，方法還包括(f)將編碼目標(biāo)轉(zhuǎn)基因，并且任選地響 應(yīng)于選擇試劑的選擇標(biāo)記的核酸分子導(dǎo)入到步驟(e)獲得的細(xì)胞中；和(g)在所述選擇試 劑存在的情況下，在所述細(xì)胞中分析所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)或由所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)產(chǎn)物調(diào)節(jié)的 化合物。優(yōu)選為在步驟(e)之后執(zhí)行步驟(f)。術(shù)語“由所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)產(chǎn)物調(diào)節(jié)的化合物”指細(xì)胞內(nèi)的任意化合物，其存在或 數(shù)量受所述表達(dá)產(chǎn)物影響。或者，該術(shù)語包括這樣的實(shí)施方式，其中，通過所述表達(dá)產(chǎn)物的 活性或存在，化合物從性質(zhì)上發(fā)生改變。該化合物可以，例如，是離析物或生成物。在數(shù)量 和存在上的改變包括這樣的實(shí)施方式，其中，轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物是siRNA、shRNA或miRNA，以 及其中表達(dá)產(chǎn)物是反義構(gòu)建物等。產(chǎn)物性質(zhì)改變的例子包括那些其中所述表達(dá)產(chǎn)物是酶和 化合物是酶的底物(或者是酶活性的代謝產(chǎn)物，如果化合物是產(chǎn)物)的變化。在包含導(dǎo)入核酸分子的本發(fā)明的該實(shí)施方式以及其它實(shí)施方式中，在合適的情況 下，轉(zhuǎn)基因和選擇標(biāo)記可以被包含在一個或多個核酸中。如果這種導(dǎo)入，例如，以轉(zhuǎn)化的形 式，通過使用一個核酸進(jìn)行，通常采用的形式是同時攜帶即將被導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因和選擇標(biāo)記 基因的質(zhì)粒。否則，可能要使用一個以上質(zhì)粒，其各攜帶一個基因。同樣，也可以使用各攜 帶一個或多個基因的質(zhì)?；旌衔铩?dǎo)入的一個或多個基因可以是報告基因，以下將進(jìn)一步描述報告基因的一般應(yīng) 用。如果導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因是報告基因，該具體的實(shí)施方式旨在確認(rèn)步驟(d)獲得的細(xì)胞除了 表達(dá)步驟(a)中導(dǎo)入的選擇標(biāo)記以外，還能夠高量表達(dá)轉(zhuǎn)基因。尤其適于該目的的報道分 子是熒光蛋白或磷光蛋白或調(diào)節(jié)生物熒光的蛋白。如果不能獲得單獨(dú)導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，選擇標(biāo)記被共同導(dǎo)入。在這種情況下，選 擇標(biāo)記優(yōu)選地不同于步驟(a)中導(dǎo)入的選擇標(biāo)記以增加獲得表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的機(jī)會。然 而，擇標(biāo)記也可以與步驟(a)中導(dǎo)入的選擇標(biāo)一樣，如果后者在所用的細(xì)胞中已經(jīng)被鈍化， 這是優(yōu)選的情況。如上已經(jīng)簡單介紹的，本發(fā)明的方法不僅能使導(dǎo)入到細(xì)胞中的具體選擇標(biāo)記的表 達(dá)增加，更重要地，一般還能使轉(zhuǎn)基因表達(dá)。這樣的轉(zhuǎn)基因包括那些產(chǎn)生工業(yè)上重要的蛋白 質(zhì)(如酶)，例如，用于生產(chǎn)生物燃料、生物藥物等的轉(zhuǎn)基因。換言之，本發(fā)明的該實(shí)施方式 提供了用于制備各種各樣的表達(dá)產(chǎn)物的生產(chǎn)植物。如果轉(zhuǎn)基因的表達(dá)產(chǎn)物本身就是目標(biāo)產(chǎn) 物，那么期望更高數(shù)值的這種表達(dá)產(chǎn)物，優(yōu)選為至少(可溶性)蛋白總量的0.001%。如果 由所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)產(chǎn)物調(diào)節(jié)的化合物被分析，那么轉(zhuǎn)基因的表達(dá)產(chǎn)物量可能會非常低。 例如，就SiRNA分子來說，為了獲得減少的或消除的目標(biāo)基因的表達(dá)，很少的分子本身可能就足夠了。同樣地，如果轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物是酶，為了獲得由即將被分析的化合物的底物產(chǎn)生 的期望產(chǎn)物(如果化合物是產(chǎn)物)，更少數(shù)量的分子可能就足夠了。如果期望化合物是生物 藥物，這更是如此。同樣地，本方法導(dǎo)致引起真核細(xì)胞轉(zhuǎn)基因表達(dá)消弱的一般機(jī)制的鈍化， 而不只是導(dǎo)致導(dǎo)入的選擇標(biāo)記的選擇性表達(dá)。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方式中，方法還包括在導(dǎo)入所述轉(zhuǎn)基因后，分析步驟(f)中 所得細(xì)胞的細(xì)胞核中編碼所述轉(zhuǎn)基因的核酸分子的完整轉(zhuǎn)錄單位的存在。完整的轉(zhuǎn)錄單位包括轉(zhuǎn)基因的編碼序列以及存在于最初導(dǎo)入到細(xì)胞中的核酸中 的任選的調(diào)控元件，如啟動子。如果選擇標(biāo)記在同一轉(zhuǎn)錄盒中被共轉(zhuǎn)化，所述標(biāo)記的編碼區(qū) 以及所述標(biāo)記的上述調(diào)控元件也必需存在。該實(shí)施方式旨在證明可檢測的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的缺失是由沒有或沒有完全被整合到 細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)基因引起的。評估在細(xì)胞核中編碼轉(zhuǎn)基因的核酸存在的方法為技術(shù)人員所熟 知，而且包括PCR、RT-PCR、RNA印記法或DNA印記法。任選地，為了比較目的，編碼轉(zhuǎn)基因的所述核酸和任選地選擇標(biāo)記，也可以被導(dǎo)入 到步驟(b)所得的細(xì)胞中。在這種情況下，分析編碼所述轉(zhuǎn)基因的核酸分子的完整轉(zhuǎn)錄單 位的存在，以及任選地，如果從步驟(b)所得細(xì)胞中期望的轉(zhuǎn)基因表達(dá)不能被觀察到，選擇 標(biāo)記可以作為核酸被整合的陽性對照。確定核酸存在的技術(shù)包括、但不限于PCR及其各種修飾，如qRT_PCR(也稱為實(shí)時 RT-PCR)。PCR在本領(lǐng)域是眾所周知的，并且被用來大量復(fù)制目標(biāo)序列。這是在自動循環(huán)設(shè) 備上完成的，其可以在非常短的時間內(nèi)加熱和冷卻裝有反應(yīng)混合物的容器。PCR通常由一個 循環(huán)的多次重復(fù)組成，循環(huán)包括(a)變性步驟，其將DNA分子的兩條鏈解開，并終止所有先 前的酶反應(yīng)；(b)退火步驟，其目的在于使引物特異地與解開的DNA分子鏈復(fù)性；和(c)延 伸步驟，其通過使用模板鏈提供的信息延長退火的引物。通常，PCR可以，例如在50μ 1(微 升)的反應(yīng)混合物中進(jìn)行，50 μ 1反應(yīng)混合物含有5μ 1 10 XPCR緩沖液，其中有1. 5mM(毫 摩爾)MgCl2 ；每種脫氧核苷三磷酸各200 μ M(微摩爾)；每種引物各0.5μ1(10μΜ)；約10 到IOOng(納克)模板DNA ；和1到2. 5個單位Taq DNA聚合酶。用于擴(kuò)增的引物可以被標(biāo) 記或不標(biāo)記。DNA擴(kuò)增可以，例如，通過型號2400熱循環(huán)儀(Applied Biosystems, Foster City, CA)來進(jìn)行94°C，2分鐘；接下來是30到40個循環(huán)，由退火(例如50°C，30秒)、延 伸(例如72°C，1分鐘，取決于DNA模板的長度和所用的酶)、變性(例如94°C，10秒)和 最后的在55°C退火1分鐘的步驟組成；以及最后的在72°C延伸5分鐘的步驟。適合與DNA 模板使用的聚合酶包括例如，大腸桿菌(E. coli)DNA聚合酶I或其克列諾夫片段(Klenow fragment)、T4 DNA聚合酶、Tth聚合酶、Taq聚合酶、從棲熱水生菌(Thermus aquaticus) 中分離出來的熱穩(wěn)定DNA聚合酶Vent、Amplitaq、Pfu和K0D，它們當(dāng)中的一些可以表現(xiàn)出 校正功能和/或不同的最佳溫度。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道怎樣優(yōu)化用不同長度和/ 或組成的引物擴(kuò)增具體核酸分子的PCR條件或按比例縮小或增加反應(yīng)混合物的體積。當(dāng)即 將被擴(kuò)增的核酸由RNA組成時，應(yīng)用“逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)” (RT-PCR)。術(shù)語“逆轉(zhuǎn)錄酶”指 催化脫氧核苷三磷酸聚合以形成與核糖核酸模板互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的酶。酶在引物的3'端開始合成，然后向模板的5'端前進(jìn)，直到合成結(jié)束。將RNA目 標(biāo)序列轉(zhuǎn)換成互補(bǔ)的復(fù)制DNA(cDNA)序列的合適的聚合劑的例子是禽成髓細(xì)胞瘤病毒逆 轉(zhuǎn)錄酶和嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus) DNA聚合酶，嗜熱棲熱菌DNA聚合酶是具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的耐熱DNA聚合酶，其在市場上被Perkin Elmer所銷售。通常，基因組RNA/ cDNA雙鏈體模板在初始反轉(zhuǎn)錄步驟后的第一次變性步驟中被熱變性，使DNA鏈可以作為擴(kuò) 增的模板。高溫RT使引物特異性更高并提高效率。1991年8月15日提交的美國專利申請 序列號07/746，121介紹了 “同源RT-PCR”，其中相同的引物和聚合酶滿足反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò) 增步驟，以及反應(yīng)條件被優(yōu)化以便兩個反應(yīng)均能發(fā)生而不用更換試劑。嗜熱棲熱菌DNA聚 合酶是具有逆轉(zhuǎn)錄酶作用的耐熱DNA聚合酶，其可以被用于所有的引物延伸步驟，無論模 板怎樣。兩個過程都能被完成而不需要打開試管以更換或添加試劑；只有溫度分布被調(diào)節(jié) 在第一循環(huán)(RNA模板)與剩下的擴(kuò)增循環(huán)(DNA模板)之間。RT反應(yīng)可以，例如，在20μ 1 的反應(yīng)混合物中完成，其含有4μ 1 5XAMV-RT緩沖液、2μ 1寡脫氧胸苷酸(Oligo dT) (100 μ g/ml (微克/毫升))、2 μ 1 IOmM dNTPs、1 μ 1總RNA, 10單位AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，加水至 終體積20μ 1。反應(yīng)可以，例如，通過使用以下條件進(jìn)行，這些條件是反應(yīng)在70°C持續(xù)15 分鐘以允許逆轉(zhuǎn)錄。然后，反應(yīng)溫度被提高到95°C持續(xù)1分鐘以將RNA-cDNA雙鏈體變性。 接下來，反應(yīng)溫度經(jīng)歷兩個循環(huán)95°C，15秒和60°C，20秒，其后是38個循環(huán)90°C，15秒和 60°C，20秒。最后，反應(yīng)溫度在60°C持續(xù)4分鐘作為最后的延伸步驟，冷卻到15°C，并持續(xù) 該溫度直到進(jìn)一步處理擴(kuò)增樣品。任何上述反應(yīng)條件可以根據(jù)具體情況的需要被按比例增 加。DNA印記被用于檢測DNA樣品中DNA序列的存在。RNA印記法將按大小分離DNA 的瓊脂糖凝膠電泳與將按大小分離的DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上用于探針雜交的方法結(jié)合起來 (Southern,1975)。RNA印記法是用于研究基因表達(dá)的技術(shù)。它由于其程序與用于研究DNA的DNA印 記程序相似而得名，兩者的關(guān)鍵區(qū)別在于，在RNA印記中，RNA而非DNA是被電泳和用雜交 探針檢測分析的物質(zhì)(Alwine et al.，1977)。如何進(jìn)行兩種印記技術(shù)的方案是技術(shù)人員熟知的。在不同的方面，本發(fā)明涉及在由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞中生成目標(biāo)化合物的方 法，其包括(a)將編碼(i)目標(biāo)化合物——其是蛋白質(zhì)或RNA——；或(ii)合成所述目標(biāo) 化合物的必要蛋白質(zhì)；以及任選地響應(yīng)于選擇試劑的選擇標(biāo)記的核酸導(dǎo)入到所述細(xì)胞中； (b)在細(xì)胞中表達(dá)所述蛋白質(zhì)；喝(c)分離產(chǎn)生的目標(biāo)化合物。當(dāng)目標(biāo)化合物是蛋白質(zhì)或RNA時，所述蛋白質(zhì)或RNA增加的表達(dá)已經(jīng)產(chǎn)生了目標(biāo) 產(chǎn)物。表達(dá)一被完成，蛋白質(zhì)或RNA就可以被從細(xì)胞中分離。在這種情況下——即目標(biāo)化 合物不是蛋白質(zhì)或RNA而是可以由一種或多種蛋白質(zhì)或RNA合成的物質(zhì)，所述一種或多種 蛋白質(zhì)或RNA的表達(dá)導(dǎo)致它們的積累，并相應(yīng)地導(dǎo)致目標(biāo)化合物的合成。目標(biāo)化合物可以是，例如，藥物，包括疫苗、毒素、抗生素、抗體或治療酶；生物燃料 組分；診斷化合物或化學(xué)品，如聚合物或代謝物。如果不能獲得單獨(dú)導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，選擇標(biāo)記被共同導(dǎo)入。在這種情況下，選 擇標(biāo)記優(yōu)選不同于用于產(chǎn)生真核細(xì)胞的本發(fā)明方法的步驟(a)中導(dǎo)入的選擇標(biāo)記，以增加 獲得表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的機(jī)會。然而，選擇標(biāo)記也可以與所述方法的步驟(a)中導(dǎo)入的選 擇標(biāo)記相同，如果后者標(biāo)記在所使用的細(xì)胞中已經(jīng)被鈍化，這是優(yōu)選的情況。該方法適用于 可以用本發(fā)明的方法獲得的細(xì)胞，其還未被轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化，例如，根據(jù)步驟(f)。本領(lǐng)域存在大量的在合適的宿主中產(chǎn)生多肽(或融合蛋白)的合適方法。如果宿主是單細(xì)胞有機(jī)體，如單細(xì)胞植物有機(jī)體或來自多細(xì)胞有機(jī)體，如哺乳動物或昆蟲、植物或 真菌中的細(xì)胞，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以恢復(fù)到各種培養(yǎng)條件。方便的是，通過建立的技術(shù)產(chǎn) 生的蛋白質(zhì)從培養(yǎng)基、培養(yǎng)的有機(jī)體的裂解產(chǎn)物或從分離的(生物)膜收獲。在多細(xì)胞有機(jī) 體的情況下，宿主可以是作為有機(jī)體的一部分的細(xì)胞或來自有機(jī)體的一部分的細(xì)胞，例如， 所述宿主細(xì)胞可以是植物可收獲的部分。優(yōu)選的方法包括上述宿主中蛋白質(zhì)的重組產(chǎn)生。 例如，包括目標(biāo)轉(zhuǎn)基的核酸序列因可以由PCR合成，并被插入到表達(dá)載體。隨后，用本發(fā)明 的方法產(chǎn)生的細(xì)胞可以用表達(dá)載體被轉(zhuǎn)化。其后，該細(xì)胞被培養(yǎng)以產(chǎn)生/表達(dá)期望的蛋白 質(zhì)，其被分離和純化。培養(yǎng)用于表達(dá)目的的衣藻的常用方法在所付實(shí)施例中描述，而且還可以進(jìn)一步地 被技術(shù)人員，例如，從Harris(1989)或Franklin and Mayfield(2004)中檢索到。類似 地，培養(yǎng)用于表達(dá)目的的其它有機(jī)體或細(xì)胞的方法也是眾所周知的，例如，對于高等植物 (Potrykus 1,199 ；McElroy and Brettell,1994 ；Hansen and Wright, 1999 ；Bilang et al, 1999 ；Ma et al.，2003)?！胺蛛x化合物”指在導(dǎo)入的核酸表達(dá)期間或表達(dá)后產(chǎn)生的化合物的分離。分裂細(xì)胞 后，各種分離方法是本領(lǐng)域已知的。在表達(dá)產(chǎn)物是蛋白質(zhì)或肽的情況下，所述蛋白質(zhì)或肽， 除了包括使蛋白質(zhì)有功能的必要的和足夠的序列之外，還可以包括另外的N或C端氨基酸 序列。這樣的蛋白質(zhì)有時也指融合蛋白。另外的氨基酸序列可以是促進(jìn)所述蛋白純化的標(biāo) 簽。示例性的標(biāo)簽是6 X組氨酸標(biāo)簽或GST (谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)簽。Tap標(biāo)簽使得能 夠以多步驟純化與它們的相互作用伴侶絡(luò)合中的蛋白質(zhì)。術(shù)語“融合蛋白”通常指由來自至少兩個不同蛋白質(zhì)或(多)肽的序列組成的嵌 合蛋白。只要能導(dǎo)致編碼本文所述的融合蛋白組分的核酸分子框架融合，可以通過技術(shù)人 員所知的任何技術(shù)進(jìn)行融合。組分的融合可以以任意順序完成。通常，由兩個或更多個單 獨(dú)的(多)肽或結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的融合蛋白是基于(Horton et al. , 1989)所介紹的“重疊延伸 雙側(cè)剪接法”。編碼單一(多)肽的片段在兩個單獨(dú)的初次PCR反應(yīng)中產(chǎn)生。初次PCR反 應(yīng)的內(nèi)部引物含有顯著的、大約20bp (堿基對)的互補(bǔ)區(qū)域，其允許再次PCR中的兩個結(jié)構(gòu) 域片段的融合?；蛘?，編碼區(qū)域可以通過使用限制性位點(diǎn)而被融合，限制性位點(diǎn)或者可以是 自然發(fā)生的或者可以由重組DNA技術(shù)導(dǎo)入。本發(fā)明貫穿使用的融合蛋白組分可以由連接體(linker)分開。連接體可以是肽 鍵或包含至少一個氨基酸殘基的一段氨基酸，其可以以任意順序在融合蛋白組分之間排 列。這樣的連接體在一些情況下可能是有用的，例如，用于提高單個結(jié)構(gòu)域的單獨(dú)折疊或調(diào) 節(jié)融合蛋白的穩(wěn)定性。此外，這樣的連接體殘基可以含有轉(zhuǎn)運(yùn)的信號、蛋白酶識別位點(diǎn)，或 者二級修飾的信號。形成連接體的氨基酸殘基可以是結(jié)構(gòu)化的或非結(jié)構(gòu)化的。優(yōu)選地，連 接體可以是短如一個氨基酸殘基，或達(dá)2、3、4、5、10、20或50個殘基。在特殊情況下，連接 體甚至可以包含多達(dá)100或150個殘基。蛋白質(zhì)分離和純化可以通過幾種已知的技術(shù)中的任意一種來完成；例如，并且沒 有限制地，離子交換色譜法、凝膠過濾色譜法和親和色譜法，高壓液相色譜法(HPLC)、反相 HPLC以及制備式盤狀凝膠電泳。蛋白質(zhì)分離/純化技術(shù)可能需要用常規(guī)方法修飾本發(fā)明的 蛋白質(zhì)。例如，組氨酸標(biāo)簽可以加入到蛋白質(zhì)中以允許在鎳柱上純化。其它的修飾可以引 起更高或更低的活性，使蛋白質(zhì)產(chǎn)生的水平能夠更高，或者使蛋白質(zhì)的純化簡單化。
在本發(fā)明方法中一個優(yōu)選實(shí)施方式中，導(dǎo)入的核酸已經(jīng)適應(yīng)了所述細(xì)胞的密碼子 使用。氨基酸在核酸水平上由稱為密碼子的核苷酸三聯(lián)體指定。由于存在有4個核苷 酸，因此有64個可能的三聯(lián)體，它們識別20種氨基酸和翻譯終止信號。因?yàn)檫@種冗余，除 了兩個氨基酸以外的所有氨基酸均由一個以上三聯(lián)體編碼。不同生物體對編碼相同特定氨 基酸的幾種密碼子中的一種時常表現(xiàn)出特殊的偏愛，這在本發(fā)明中被稱為“密碼子使用”。 普遍公認(rèn)的是，密碼子偏愛反映了翻譯優(yōu)化(translational optimization)的突變偏好 和自然選擇之間的平衡。在快速生長的微生物，如大腸桿菌或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的最佳密碼子反映了它們各自基因組tRNA庫的組成(composition)。最佳 密碼子被認(rèn)為有助于達(dá)到更快的翻譯速率和高精確性。由于這些因素，預(yù)期翻譯選擇在高 表達(dá)基因中更強(qiáng)，在上述有機(jī)體中確實(shí)如此。在其它并不表現(xiàn)出高生長速率或存在小基因 組的有機(jī)體中，通常不存在密碼子使用優(yōu)化，密碼子偏愛由在那個特殊基因組中觀察到的 特征突變偏好決定。其例子是人(Homo sapiens)和幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)。 表現(xiàn)出中間水平的密碼子使用優(yōu)化的有機(jī)體包括黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、 ^MKiiIf ^ii (Caenorhabditis elegans)(Arabidopsis thaliana) 目前尚不清楚是否是密碼子使用驅(qū)使了 tRNA進(jìn)化，還是tRNA驅(qū)使了密碼子使用 的進(jìn)化。至少已經(jīng)發(fā)展出了 一種數(shù)學(xué)模型，其中密碼子使用和tRNA表達(dá)均以反饋的方式 (即，已經(jīng)以高頻率存在的密碼子使它們相應(yīng)的tRNA的表達(dá)提高，而以高水平正常表達(dá)的 tRNA又使它們相應(yīng)的密碼子的頻率提高！)共同進(jìn)化，然而，這種模型似乎還沒有試驗(yàn)確 認(rèn)。已經(jīng)提出了與密碼子使用偏性有關(guān)的不同的因素，包括基因表達(dá)水平(反映tRNA豐度 對優(yōu)化翻譯過程的選擇)、％ G+C含量(反映水平基因轉(zhuǎn)移或突變偏性)、GC偏斜(反映 特異鏈突變偏性)、氨基酸保守性、蛋白質(zhì)親水性、轉(zhuǎn)錄選擇、RNA穩(wěn)定性、最佳生長溫度和 高鹽適應(yīng)性(Ermolaeva,2001 ；Lynn et al. ,2002) 在生物信息學(xué)和計(jì)算生物學(xué)領(lǐng)域，許多統(tǒng)計(jì)方法已經(jīng)被提議并被用于分析密碼子 使用偏性(Comeron and Aguade，1998)。方法，如‘最優(yōu)密碼子使用頻率’ (Fop)和‘密碼子 適應(yīng)指數(shù)’(CAI)被用于預(yù)測基因表達(dá)水平，而方法，如‘有效密碼子數(shù)’(Ne)和來自信息 理論的香農(nóng)熵被用于測量密碼子使用平直度(http://codonw. sourceforRe. net/Indices, html ；Suzuki et al.，2004)。多元統(tǒng)計(jì)方法，如相關(guān)性分析和主成分分析被廣泛地用于分 析基因之間的密碼子使用變化(Perriere and Thiolouse，2002)。有許多計(jì)算機(jī)程序執(zhí) 行以上列舉的統(tǒng)計(jì)分析，包括 Codonff (http //codonw. sourceforRe. net/)禾口 G—langimge GAE(http//www, g-language. org/wiki/)。Mayfield et al. (2003)和 Franklin et al. (2002)公開了使用密碼子適應(yīng)的核 酸用于在衣藻中表達(dá)的示例性實(shí)用方法。在不同的方面，本發(fā)明涉及由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的真核細(xì)胞。還有一方面，本發(fā)明涉及一種試劑盒，其包括(a)可由本發(fā)明的方法得到的細(xì)胞， 以及任選地在所述細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)優(yōu)化的載體；或(b)本發(fā)明的細(xì)胞。試劑盒的各種組分可以被包裝在一個或更多個容器中，如一個或更多個小瓶中。 除了組分以外，小瓶還可以包含用于儲存的防腐劑或緩沖液。如果可通過本發(fā)明的方法獲得的細(xì)胞還沒有用轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化，為了蛋白質(zhì)在所述細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的所述載體優(yōu)選地被包含于本發(fā)明的試劑盒中。在另外一方面，本發(fā)明涉及檢測蛋白質(zhì)在由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞中的表達(dá)和/ 或定位的方法，包括(a)在所述細(xì)胞中表達(dá)編碼與報道分子融合的所述蛋白的核酸或(a)’ 在所述細(xì)胞中表達(dá)編碼作為報道分子的所述蛋白質(zhì)的核酸；和(b)在所述細(xì)胞中檢測所述 報道分子的表達(dá)和/或定位。如果由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞還沒有用轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化，則該方法適用。在本申請的別的地方已經(jīng)定義了“報告基因”。某些基因被選為報道分子，因?yàn)樗?們賦予表達(dá)它們的有機(jī)體的特征易于識別和測量，或者因?yàn)樗鼈兪沁x擇標(biāo)記。報告基因可 以用于確定目標(biāo)基因是否已經(jīng)被吸收或在細(xì)胞中或有機(jī)體群(population)中表達(dá)。使用 在研究的細(xì)胞或有機(jī)體中不自然表達(dá)的報告基因很重要，因?yàn)閳蟮婪肿拥谋磉_(dá)正被用作成 功吸收目標(biāo)基因的標(biāo)記。通常使用的誘導(dǎo)視覺上可識別特征的報告基因在上面已經(jīng)被介紹 過，而它們一般包括熒光蛋白或磷光蛋白或催化產(chǎn)物易于識別的反應(yīng)的酶(例如，熒光素 酶、β -半乳糖苷酶、β "葡糖醛酸糖苷酶)。報告基因通常用于轉(zhuǎn)化，如轉(zhuǎn)染分析。以這種方式使用的報告基因通常在自己的 啟動子下表達(dá)，該啟動子獨(dú)立于導(dǎo)入的目標(biāo)基因的啟動子；在外部干涉下，如導(dǎo)入轉(zhuǎn)換表達(dá) 的試劑(agent switching on expression)，報告基因可以組成型表達(dá)或誘導(dǎo)型表達(dá)。結(jié) 果，報告基因的表達(dá)不依賴于目標(biāo)基因的表達(dá)，當(dāng)目標(biāo)基因僅在某些特殊條件下表達(dá)或者 在難以進(jìn)入的組織中表達(dá)時，這是一個優(yōu)勢。在例如賦予對抗生素的抗性或原養(yǎng)型恢復(fù)基 因的選擇標(biāo)記報道分子的情況下，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以在含有各自抗生素或不含營養(yǎng)缺陷型物 質(zhì)的底物上生長。報告基因的另一個應(yīng)用是在目標(biāo)基因表達(dá)的基因表達(dá)分析中，目標(biāo)基因表達(dá)可以 產(chǎn)生蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)對細(xì)胞培養(yǎng)物或有機(jī)體幾乎沒有明顯的或直接的作用。在這種情 況下，報道分子直接被連接到目標(biāo)基因上以產(chǎn)生基因融合。兩個基因受控于相同的啟動子， 并沒被轉(zhuǎn)錄成單個信使RNA分子。然后，mRNA被翻譯成蛋白質(zhì)。在這種情況下，盡管被融 合，然而，兩個蛋白質(zhì)均能夠正確地折疊成它們的活性構(gòu)象并與底物相互作用很重要。在構(gòu) 建DNA構(gòu)建物期間，通常包括編碼柔性肽連接體區(qū)域的DNA片段，以便報道分子和目標(biāo)基因 產(chǎn)物僅最低程度地彼此干擾。報告基因還可以被用于分析細(xì)胞或有機(jī)體中特殊啟動子的活性。在這種情況下， 沒有單獨(dú)的“目標(biāo)基因”；報告基因在目標(biāo)啟動子的控制下被簡單地放置，并且報告基因產(chǎn) 物的活性被定量測量。該結(jié)果通常相對于在已知誘導(dǎo)基因強(qiáng)表達(dá)的“共有序列”啟動子下 的活性而報道。在本發(fā)明的上下文中，編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的基因可以被融合到報告基因中。融合蛋 白已經(jīng)在上面進(jìn)一步介紹過了?？梢栽诓煌綄?shí)現(xiàn)表達(dá)的檢測。在轉(zhuǎn)錄水平上，由基因表達(dá)的mRNAs可以通過 以下方法檢測，如上述PCR、RT-PCR或RNA印記法。在翻譯水平，蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物可以在體 外使用例如，蛋白質(zhì)印跡法或免疫沉淀來檢測，這些方法都為技術(shù)人員所熟知。如果報告基 因具有能實(shí)現(xiàn)非入侵檢測的特性，可以確立在(活)細(xì)胞中檢測。示例性的特性是熒光、磷 光或生物熒光，其可以通過合適的顯微鏡或光度計(jì)檢測。檢測位置指檢測導(dǎo)入到細(xì)胞中的基因的表達(dá)產(chǎn)物的定位。如果目標(biāo)基因融合到報告基因上，可以通過檢測報告基因表達(dá)產(chǎn)物的定位來確定目標(biāo)基因的定位。其定位也可以 在體內(nèi)檢測的合適的報告基因是本申請其它地方所介紹的熒光、磷光或生物熒光蛋白。以 上示例性報道分子的檢測可以通過試驗(yàn)者或通過技術(shù)人員已知的專業(yè)軟件(例如，ImageJ co-localization plug-ins, http //rsb. info, nih. gov/i i/)來完成。在不同的方面，本發(fā)明涉及用于檢測由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)-蛋白 質(zhì)相互作用的體外方法，其包括(a)在所述細(xì)胞中表達(dá)(i)編碼包含融合到檢測標(biāo)記的目 標(biāo)(多)肽的融合蛋白的第一核酸，(ii)編碼融合蛋白的第二核酸，該融合蛋白包含被疑 為與所述第一(多)肽相互作用的、融合到不同檢測標(biāo)記的(多)肽；和(b)檢測兩個檢測 標(biāo)記的定位；其中，細(xì)胞中兩個檢測標(biāo)記的共定位表明有相互作用。如果由本方法可得的細(xì)胞還沒有用轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化，該方法優(yōu)選適用。術(shù)語“蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用”指兩個或更多個蛋白質(zhì)化合物，即多(肽)或蛋 白質(zhì)的特殊相互作用。特殊相互作用由最小結(jié)合強(qiáng)度(binding strength)或結(jié)合親和力 (binding affinity)表征。特殊相互作用的結(jié)合親和力通常達(dá)到pM到mM的范圍，并且也 主要依賴于化學(xué)環(huán)境，例如，PH值、離子強(qiáng)度、輔因子的存在等。在本發(fā)明的上下文中，該術(shù) 語尤其指在生理?xiàng)l件下，即在細(xì)胞中發(fā)生的蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用。術(shù)語“檢測標(biāo)記”指融合的蛋白質(zhì)可視的特性，而不干擾該標(biāo)記在其中表達(dá)的活細(xì) 胞。檢測標(biāo)記組因而組成報道分子的亞組。示例性檢測標(biāo)記發(fā)出輻射，如熒光(例如，GFP 及其顏色變異體)、磷光或生物熒光(例如，熒光素酶)?！凹?xì)胞中兩個檢測標(biāo)記的共定位”表示在細(xì)胞相同位置的兩個不同發(fā)射的定位。一 旦兩個蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，就能檢測到共定位。共定位，例如，作為細(xì)胞中兩個不同可檢 測(多)肽的發(fā)射的部分或完全空間重疊而被檢測。檢測可以通過實(shí)驗(yàn)者或通過技術(shù)人員 已知的專業(yè)軟件(例如，ImageJ co-localization pluR~ins, http://rsb. info, nih. rov/ 11Z)來完成。檢測標(biāo)記優(yōu)選為熒光蛋白或磷光蛋白。在該實(shí)施方式以及其它實(shí)施方式中——其中熒光被測定，優(yōu)選地通過使用熒光顯 微鏡來完成檢測。熒光顯微鏡是用于研究有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)性質(zhì)的光學(xué)顯微鏡，其是通過使用熒光 和磷光現(xiàn)象替代反射和吸收現(xiàn)象、或者通過除了反射和吸收現(xiàn)象之外使用熒光和磷光現(xiàn) 象。樣品用特定波長(或多個波長)的光——其被熒光團(tuán)吸收——照射，使它們發(fā)射更長 波長的光(與吸收的光的顏色不同)。通過使用發(fā)射濾器，照明光被從弱得多的發(fā)射的熒 光中分離出來。熒光顯微鏡的典型組成是光源(氙或汞弧形放電燈)、激發(fā)濾器、二向色鏡 (dichroic mirror)(或二色分光鏡(dichromatic beamsplitter))和發(fā)射濾器。濾器和二 向色鏡被選擇以與用于標(biāo)記樣品的熒光團(tuán)的光譜激發(fā)和發(fā)射特征相匹配。大部分使用中的 熒光顯微鏡是落射熒光顯微鏡(即熒光的激發(fā)和觀察是從樣品的上方(落射(印i))進(jìn)行 的)。這些顯微鏡已經(jīng)成為生物學(xué)領(lǐng)域的重要部分，其為更先進(jìn)的顯微鏡設(shè)計(jì)，如共聚焦激 光掃描顯微鏡(CLSM)和全內(nèi)角反射熒光顯微鏡(TIRF)開啟了大門。這些技術(shù)是技術(shù)人員 所熟知的。本發(fā)明還設(shè)想在由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞中用普通應(yīng)用的技術(shù)，如FRET、BiFC或 FRAP檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法。FGrster共振能量轉(zhuǎn)移(FRET，如果使用的兩個分子都是熒光的，也稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移)描述了在兩個生色團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移機(jī)制。處于激發(fā)狀態(tài)的供體生色團(tuán)能夠通過 非輻射的、遠(yuǎn)程偶極-偶極偶合機(jī)制(long-range dipole-dipole coupling mechanism) 將能量轉(zhuǎn)移到非常接近的受體生色團(tuán)(通常< lOnm)，這被稱為“F&ster共振能量轉(zhuǎn) 移，，(FRET) ( Forster5 1949)。在熒光顯微術(shù)、熒光共聚焦激光掃描顯微術(shù)以及分子生物學(xué)中，F(xiàn)RET是量化生物 物理學(xué)和生物化學(xué)中分子動力學(xué)，如蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-DNA相互作用和蛋 白質(zhì)構(gòu)象變化的有用工具(LakOWicZ，1999)。為了監(jiān)控兩個分子之間的復(fù)合物形成，其中 一個用供體標(biāo)記，另外一個用受體標(biāo)記，并且將這些熒光團(tuán)標(biāo)記的分子混合。當(dāng)它們被解離 時，供體發(fā)射在供體激發(fā)后立即被檢測到。另一方面，當(dāng)由于兩個分子的相互作用供體和受 體接近時(I-IOnm)，主要觀察到受體發(fā)射，這是因?yàn)閺墓w到受體的分子間FRET。為了監(jiān) 控蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，目標(biāo)蛋白質(zhì)在兩個位點(diǎn)用供體和受體標(biāo)記。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的扭曲或彎曲帶 來供體和受體距離或相對方位的變化時，就能觀察到FRET變化。如果分子間相互作用或蛋 白質(zhì)構(gòu)象變化依賴于配體結(jié)合，這種FRET技術(shù)適用于進(jìn)行配體檢測的熒光指示劑。FRET研究是可測量的從基于試管的實(shí)驗(yàn)的毫升尺度到基于顯微術(shù)的實(shí)驗(yàn)的飛 升尺度，能量轉(zhuǎn)移的程度經(jīng)常被量化。這種量化可以直接基于(激活發(fā)射方法)在兩個不同 的激發(fā)條件(原初供體和原初受體)下檢測兩個發(fā)射通道。然而，為了可靠性(robustness) 理由，F(xiàn)RET量化最?；谠诟淖儗?shí)驗(yàn)條件(例如，供體發(fā)射的顯微圖像被存在的受體接收。 然后受體被漂白，以便其不能夠接收能量轉(zhuǎn)移，并且獲得另外的供體發(fā)射)時測量熒光強(qiáng) 度或熒光壽命中的變化。臨時鈍化受體的另一種方法基于其熒光飽和度。采用光的偏振特 性，也可能僅用單次照射曝光進(jìn)行FRET量化。生物學(xué)應(yīng)用的最普遍的FRET對是青色熒光蛋白(CFP)-黃色熒光蛋白(YFP)對。 兩者均是綠色熒光蛋白(GFP)的顏色變異體。雖然用有機(jī)熒光燃料標(biāo)記需要經(jīng)過純化、化 學(xué)改性和細(xì)胞內(nèi)注射宿主蛋白的繁瑣過程，但通過基因工程，GFP變異體可以容易地附著到 宿主蛋白上。FRET的一個限制是要求外部照明以起始熒光轉(zhuǎn)移，這會導(dǎo)致直接激發(fā)受體結(jié)果中 的背景噪音或?qū)е鹿馔噬榱吮苊庠撊秉c(diǎn)，發(fā)展了生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(或BRET)。該 技術(shù)使用生物發(fā)光的熒光素酶(通常是來自海腎(Renilla reniformis)的熒光素酶)而 不是CFP來產(chǎn)生與YFP相容的初始光子發(fā)射。雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)是一種在活細(xì)胞內(nèi)觀察蛋白質(zhì)結(jié)合的方法(Hu et al.， 2002)。該方法基于一些蛋白質(zhì)，如GFP及其變異體的熒光特性。當(dāng)熒光蛋白被分裂成N端 和C端兩半時，該分子不產(chǎn)生熒光。兩個非熒光片段的每一個均融合到兩個假定的相互作 用伙伴上，通過重新建立分裂的熒光團(tuán)，導(dǎo)致細(xì)胞中熒光的恢復(fù)。該熒光通過熒光顯微鏡方 法被檢測，其可以被安裝的攝像機(jī)記錄。BiFC方法超過其它可視化蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作方 法的優(yōu)勢在于其給予相互作用的指示以及復(fù)合物的細(xì)胞定位。BiFC可以用作FRET的替代， 或者通過其與其它技術(shù)組合可能篩選蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)互作及其調(diào)節(jié)子，它可以補(bǔ)充FRET。FRAP (熒光在光褪色之后恢復(fù))方法表示一種能夠定量熒光標(biāo)記探針的擴(kuò)散和遷 移率的光學(xué)技術(shù)。該技術(shù)為蛋白質(zhì)結(jié)合的生物學(xué)研究提供了很大的用途，并且被普遍與熒 光蛋白聯(lián)合使用，其中研究的蛋白質(zhì)被融合到熒光蛋白上。當(dāng)經(jīng)特定的波長的光(通常用 激光束)激發(fā)時，蛋白質(zhì)會發(fā)熒光。當(dāng)正被研究的蛋白質(zhì)是與熒光蛋白融合產(chǎn)生的時，那么熒光可以被追蹤。在光裂解熒光蛋白(通常用強(qiáng)烈的/激烈的激光脈沖)后，褪色區(qū)域的 熒光恢復(fù)動力學(xué)提供了有關(guān)蛋白質(zhì)互作強(qiáng)度、細(xì)胞器連續(xù)性和蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)男畔?，其防?或延緩?fù)噬臀赐噬珶晒獾鞍椎慕粨Q。這種觀察資料最近已經(jīng)被用來研究蛋白質(zhì)結(jié)合。附圖顯示

圖1.遺傳篩查以選擇高水平表達(dá)核轉(zhuǎn)基因的衣藻菌株。(A)設(shè)計(jì)以產(chǎn)生衣藻表 達(dá)菌株的實(shí)驗(yàn)策略的概述(B)從誘變實(shí)驗(yàn)中鑒定出對核糖體抑制藥物吐根堿表現(xiàn)出高水 平抗性的候選菌株。對吐根堿表現(xiàn)出最高耐性的5株菌株(UVM4、UVM9、UVMlU UVMl2和 UVM13)被選擇以進(jìn)一步分析。圖2.鑒定高水平表達(dá)轉(zhuǎn)基因的衣藻菌株。(A)在該研究中構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載 體。載體PJR38含有合成的GFP基因，其被密碼子優(yōu)化以用于萊茵衣藻(CrGFP;10)，并由 PsaD啟動子驅(qū)動(PPsaD ;Fischer and Rochaix，2001)。質(zhì)粒也含有APHVIII基因作為選 擇標(biāo)記，其賦予對巴龍霉素的抗性(Sizova et al.，2001)，并由雜合啟動子驅(qū)動，雜合啟動 子由HSP70A基因(PHSP70)和RbcS2基因(PRBCS2)的融合表達(dá)元件組成。載體pJR39含 有‘天然的’YFP基因，其密碼子使用沒有被優(yōu)化。在載體PJR40中，合成的GFP基因受控于 RbcS2 啟動子。TPsaD :PsaD 基因的終止子(Fischer and Rochaix, 2001) (B)通過蛋白質(zhì) 印跡法使用抗GFP抗體分析GFP表達(dá)。5 μ g (微克)用載體pJR38轉(zhuǎn)化的藻類菌株的可溶 性總蛋白(TSP)被加樣到每個泳道中。為了定量GFP表達(dá)，包含了純化的GFP蛋白的一系 列稀釋物。菌株UVM4和UVMll中的所有GFP轉(zhuǎn)化體將報告基因表達(dá)到類似高的水平(TSP 的約0. 2% )。(C)通過RNA印記法分析GFP mRNA累積。3 μ g總RNA樣品通過變性瓊脂糖 凝膠電泳被分離，轉(zhuǎn)印并雜交到GFP特異探針上(上圖)。作為加樣對照，也顯示了溴化乙 錠染色膠(下圖)。注意，GFP mRNA累積水平在所有轉(zhuǎn)化的UVM4和UVMlllevels克隆中幾 乎是一致的。對照未轉(zhuǎn)化的UVMll菌株。圖3.通過共聚焦激光掃描顯微術(shù)分析熒光報告蛋白GFP和YFP的積累。顯示了用 PJR38 (GFP基因)或pJR39 (YFP基因)轉(zhuǎn)化的UVM4、UVM11和Elow47細(xì)胞的熒光。為了比 較和亞細(xì)胞定位，還顯示了明視場圖像、葉綠素?zé)晒夂蛨蟾娴鞍谉晒夂腿~綠素?zé)晒獾闹丿B。 (A)可視化GFP在細(xì)胞溶質(zhì)中的表達(dá)。(B)可視化YFP表達(dá)。比例尺10 μ m。圖4.衣藻表達(dá)菌株UVM4和UVMll與未誘變菌株Elow47相比的生長分析。㈧在 光能混合營養(yǎng)型條件下記錄的生長曲線。細(xì)胞以16小時光照/8小時黑暗的循環(huán)在TAP培 養(yǎng)基上生長。(B)于光能自養(yǎng)條件下在連續(xù)光照下生長于HSM培養(yǎng)基上。細(xì)胞數(shù)目用細(xì)胞 計(jì)數(shù)器在所示時間點(diǎn)確定。所有數(shù)據(jù)代表三個生物學(xué)重復(fù)的平均數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)誤差由誤差條表示。實(shí)施例說明了本發(fā)明。實(shí)施例1 材料和方法藻類菌株和培養(yǎng)條件。萊茵衣藻細(xì)胞壁缺乏、精氨酸原養(yǎng)型菌株(cwl5arg-由 M. Schroda, University Freiburg, Germany友情提供)被用于轉(zhuǎn)化，并或者在液體TAP培 養(yǎng)基中或者在固體TAP培養(yǎng)基上被光能混合營養(yǎng)地培養(yǎng)(Harris，1989)，其是于22°C培養(yǎng) 16小時8小時白天/夜晚的循環(huán)(光照強(qiáng)度50μΕ m-2s-l)，除非另作說明。如果需要，精 氨酸可以被加入到培養(yǎng)基中(100 μ g ml-1)。菌株Elow47在用pCRYl-1 (Nelson et al.， 1994)和 pCB412(由 C. F. Beck, University Freiburg，Germany 提供)-其各自帶有吐根堿抗性基因和ARG7基因——共轉(zhuǎn)化cwl5 arg-后獲得。所有UVM菌株均在紫外線誘導(dǎo)誘 變菌株Elow47后獲得。為了分析光能自養(yǎng)生長，在HSM液體培養(yǎng)基中(Harris，1989)培養(yǎng) 衣藻細(xì)胞。轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建。CrGFP序列(Fuhrmann et al.，1999)用引 物 PCrGFPfw (5 ‘ - CATATG GCCAAGGGCGAGG-3 ‘)禾口 PCrGFPrev (5 ‘ - GAATTC TTACTTGTACAGCTCGTCC-3’ )擴(kuò)增，其在5’和3’末端各引入NdeI和EcoRI位點(diǎn)(斜體 顯示的為限制位點(diǎn))。GFP編碼區(qū)隨后作為Nde I/EcoRI片段被插入到相似切割的載 體 pGenD-PsaF (Fischer and Rochaix，2001)中，產(chǎn)生質(zhì)粒 pJR37。然后，來自 pJR37GFP 的DNA序列組件(盒，cassette)作為Xhol/Xbal片段被插入到質(zhì)粒pSI103相似 消化的衍生物中，質(zhì)粒PSI103含有APHVIII選擇標(biāo)記基因(Sizova et al.，2001 ； 由Rachel Dent, UC Berkeley，USA友情提供)，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化載體pJR38 (圖2A)。含有 YFP作為報告基因的載體ρJR39通過使用PCR 引物PPsaD-YFPfw (5，-G TGCATTC TAGGACCCCACTGCTACTCACAACAAGC CCCATGG TGAGCAAGGGCGAGGAGC-3)禾P PPsaD-YFPrev (5，- GAATTC TTACTTGATCAGCTCGTCCATGC-3，擴(kuò)增來自質(zhì)?？寺?由 Dr. Marc Lohse, MPI-MP 友情提供)的 Venus YFP 變異體(Shyu et al.，2006)被 構(gòu)建，所述引物分別引入了 5’ BsmI位點(diǎn)(和含有翻譯起始密碼子的NcoI位點(diǎn))和 3，EcoRI位點(diǎn)(斜體顯示的為限制位點(diǎn))。通過用BsmI和EcoRI消化pJR38，并 將GFP序列替換為含YFP的Bsml/EcoRI片段獲得pJR39 (圖2A)。為了產(chǎn)生質(zhì)粒 PJR40 (圖 2A)，用弓丨物 P5，RBCS2-BamHI(5，-AA GGATCC CCGGGCGCGCCAGAAGG-3，)和 P3，RBCS2-NdeI (5，-GGCGGC CATATG. AAGATGTTGAGTG-3，)從質(zhì)粒 pBCl (在 APHVIII 基因 上游含有HSP70A-RBCS2雜合啟動子)中擴(kuò)增RBCS2啟動子片段，所述引物導(dǎo)入了 5，BamHI 位點(diǎn)和3，NdeI位點(diǎn)(斜體顯示的序列)。然后，RBCS2 PCR片段用BamHI和NdeI消化，并 被連接到用相同酶切割的PJR37上，因此將GFP上游的PsaD啟動子序列替換為RBCS2啟動 子。最后，RBCS2啟動子作為Xbal/Ndel片段被切離并被克隆到相似消化的載體pJR38上， 產(chǎn)生了轉(zhuǎn)化載體pJR40(圖2A)。根據(jù)生產(chǎn)商指示，于16°C過夜的條件下，DNA片段用T4 DNA 連接酶(New England Biolabs, Frankfurt a. Μ.，Germany)連接到線性化質(zhì)粒中。萊茵衣藻的轉(zhuǎn)化。采用玻璃珠法(Kindle，1990)進(jìn)行萊茵衣藻的核轉(zhuǎn)化。用 PCB412 (2. 4 μ g/ 轉(zhuǎn)化，用 EcoRI 成線性)和 pCRYl-Ι (1 μ g/ 轉(zhuǎn)化，用 EcoRI 成線性)的 cwl5 arg-的共轉(zhuǎn)化體在不含精氨酸的培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。紫外線誘變Elow47后得到的UVM菌 株用載體PJR38 (1 μ g用KpnI成線性的質(zhì)粒DNA)、pJR39 (1 μ g用KpnI成線性的質(zhì)粒DNA) 或pJR40 (0. 8 μ g用KpnI成線性的質(zhì)粒DNA)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化體的選擇在含5_10 μ g ml-1巴龍 霉素的TAP培養(yǎng)基上進(jìn)行。吐根堿敏感性測試。為了分離適合誘變和篩選的菌株，用不斷增加濃度的吐根堿 (0、5、25、80 μ g ml—1吐根堿)測試CRY1-1/ARG7共轉(zhuǎn)化體在TAP瓊脂平板上的生長。生長 于5 μ g ml—1吐根堿上、但對25 μ g ml—1吐根堿(并因而僅表現(xiàn)非常低的CRYl-I表達(dá))敏 感的菌株Elow47被選擇用于隨后的誘變實(shí)驗(yàn)(圖1A)。也在紫外線誘變后進(jìn)行了吐根堿敏 感性測試以分析在提高的吐根堿濃度(達(dá)120 μ g πιΓ1 ；圖1)下突變體的生長。紫外線誘變。Elow47細(xì)胞在200ml TAP培養(yǎng)基中生長到對數(shù)中期(細(xì)胞密度 3. 7X IO6mF1)，并經(jīng)離心法收集(1700Xg(克)，5分鐘)。將藻粒重新懸浮于2. 5ml新鮮的TAP培養(yǎng)基中，并且將8個樣品——每個250 μ 1 (相當(dāng)于7. 4Χ107個細(xì)胞)被涂到含有 60 μ g ml—1吐根堿的TAP瓊脂平板上，以直接選擇表現(xiàn)出CRYl-I轉(zhuǎn)基因表達(dá)增強(qiáng)的突變 體。于無菌條件下，培養(yǎng)皿在離紫外燈(ETX-20，254nm，100W，50/60Hz，LFT Labortechnik, ffasserburg, Germany) 13厘米的距離處暴露于紫外線1分鐘，并被直接轉(zhuǎn)移到黑暗中以使 光誘導(dǎo)的細(xì)胞修復(fù)機(jī)制最小化。在黑暗中過夜溫育之后，培養(yǎng)物在低光照(5 μ E m-2 s-1) 下被溫育兩周。最后，通過進(jìn)行吐根堿敏感性下降測試，分析UVM(紫外線誘變)菌株。在 提高的吐根堿濃度(100-120μ g πιΓ1 ；圖1)中表現(xiàn)生長的菌株通過用不同的啟動子-報告 基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)化被進(jìn)一步檢測(圖2A)。DNA提取、純化和PCR。根據(jù)公布的方法(Schroda et al.，2001)提取萊茵衣藻 的基因組DNA。為了 DNA片段的連接和雜交探針的分離，通過在瓊脂糖凝膠電泳之后用 GFXTM PCR (DNA and Gel Band Purification (DNA 和膠帶純化))試劑盒(GE Healthcare, Freiburg, Germany)提取切離的凝膠切片來純化DNA。PCR根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序(于95°C 1分 鐘，于58 °C -66 °C 90秒，于72 °C 90秒，32個循環(huán))進(jìn)行。通過PCR檢測用載體pJR38得 到的轉(zhuǎn)化體是否存在完整的GFP DNA序列盒。引物對APHVIIIrev (5，-CCTCAGAAGAACTCGT CCAACAGCC-3，)和 APHVIIIfw(5，-GGAGGATCTGGACGAGGAGCGGAAG-3，)被用于擴(kuò)增 APHVIII 基因的 3，端(360bp 產(chǎn)物)，而引物 PPsaDrev(5‘ -CGAGCCCTTCGAACAGCCAGGCCG-3，)和 M13fw(5，-GTAAAACGACGGCCAGT-3，)被用于擴(kuò)增 GFP 前面的 PsaD 啟動子的 5，(380bp)端。 兩個引物組合均能產(chǎn)生PCR產(chǎn)物的克隆被評價為全長GFPDNA序列組件陽性。RNA提取和RNA印記分析。使用SV RNA總提取試劑盒(SV RNA Total Isolation kit) (Promega, Mannheim, Germany)，根據(jù)生產(chǎn)商指示，從用 pJR38 轉(zhuǎn)化的 Elow47 和 UVM 菌 株中提取總細(xì)胞RNA。RNA樣品在含甲醛的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，并被轉(zhuǎn)印到Hybond 尼龍膜(GE Healthcare,Freiburg,Germany)上。根據(jù)生產(chǎn)商的方案，于65°C，在Rapid-Hyb 緩沖液(GE Healthcare)中進(jìn)行雜交。用引物 PCrGFPfw(5，-CATATGGCCAAGGGCGAGG-3，) 和 PCrGFPrev (5，-GAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCC-3，)經(jīng) PCR 擴(kuò)增用于產(chǎn)生 GFP 特異探針的 DNA模板。用[a-32P]dCTP(GE Healthcare)通過隨機(jī)引發(fā)對探針進(jìn)行放射性標(biāo)記。蛋白質(zhì)分離和蛋白質(zhì)印記分析。通過將粒狀衣藻細(xì)胞重新懸浮于200 μ 1裂解 緩沖液(50mM HEPES/K0H pH 7.5、10mM KAc、5mM MgAcUmM EDTAUmM DTT 禾口 IX 蛋白酶 抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail Complete) ；Roche, Mannheim, Germany)中，然 后通過聲波作用(Sonifier· , W-250D, G. Heinemann Ultraschal 1-und Labortechnik, Schwabisch Gmund, Germany ；振幅10%，15秒)分裂細(xì)胞，以制備可溶性蛋白總提取物。 根據(jù) Bradford 方法(Roti -Quant, Roth, Karlsruhe, Germany)量化蛋白質(zhì)量。代表 5μ g可溶性總蛋白的樣品于95°C被變性3分鐘，通過變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分 離，并通過使用Trans-Blot 電泳轉(zhuǎn)移細(xì)胞(Biorad，Munchen, Germany)和標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)移緩沖 液(25mM Tris/HCl、192mM甘氨酸，pH 8.3)被轉(zhuǎn)移到PVDF (聚偏氟乙烯)膜(Hybond P， GE Healthcare, Freiburg, Germany)上。使用 ECL 檢測系統(tǒng)(GE Healthcare, Freiburg, Germany)禾口抗鼠二抗(Sigma-Aldrich，Munich，Germany)用單克隆抗 GFP—抗(Clontech, Saint-Germain-en-Laye, France)檢測免疫生物化物蛋白質(zhì)。顯微鏡方法。報告蛋白質(zhì)熒光通過共聚焦激光掃描顯微術(shù)(TCS SP2 ；Leica, ffetzlar, Germany)使用氬激光器激發(fā)(對于GFP在488nm納米處，而對于YFP在514nm處)
25來測定，490-5IOnm的濾器用于檢測GFP熒光，510-535nm的濾器用于檢測YFP熒光，以及 630-720nm的濾器用于檢測葉綠素?zé)晒?。?shí)施例2 衣藻表達(dá)菌株的遺傳篩選。我們假定衣藻中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)問題有遺傳基礎(chǔ)，如，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常緊或者有效 沉默引入序列的外遺傳過程(印igenetic process) 0我們進(jìn)一步推理認(rèn)為，如果是這樣的 情況，應(yīng)該有可能分離出這樣的突變體，即，在其中這種轉(zhuǎn)基因失活機(jī)制是有缺陷的。我們 因此設(shè)計(jì)了遺傳篩選，旨在選擇這樣的突變體。篩選下面的實(shí)驗(yàn)策略概述于圖IA中。為了 能夠直接選擇有效的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，我們選擇了選擇標(biāo)記基因，其表達(dá)水平與對選擇試劑的 表型抗性水平成正比。CRYl-I基因滿足這樣的標(biāo)準(zhǔn)。它代表了胞質(zhì)核糖體蛋白S14的突變 等位基因，胞質(zhì)核糖體蛋白S14處于對翻譯抑制劑吐根堿敏感的狀態(tài)下(Nelson et al., 1994)。生產(chǎn)于細(xì)胞中的CRYl-I蛋白(=突變體S14蛋白)越多，吐根堿敏感野生型S14 蛋白被從胞質(zhì)核糖體中替代的效率就越高，并且細(xì)胞可以耐受的吐根堿的濃度就越高。通 過用ARG7選擇標(biāo)記基因共同轉(zhuǎn)化，我們將CRYl-I基因?qū)氲骄彼釥I養(yǎng)缺陷型衣藻菌株 的核基因組中，并選擇精氨酸原養(yǎng)型的恢復(fù)(圖1A)。然后，精氨酸原養(yǎng)型菌株被檢測與 CRYl-I基因的共轉(zhuǎn)化。當(dāng)在不同吐根堿濃度的培養(yǎng)基上檢測時，共轉(zhuǎn)化菌株僅對吐根堿表 現(xiàn)出低水平的抗性(通常在5和25 μ g/ml之間變化)，這與衣藻核基因組中的轉(zhuǎn)基因弱表 達(dá)一致。一株這樣的共轉(zhuǎn)化菌株Elow47 (在低濃度抗吐根堿，菌株號47)被選擇并經(jīng)受紫 外線誘導(dǎo)的誘變(圖1A)。該策略背后的基本原理是遺傳失活衣藻(Chlaymdomonas)中運(yùn) 行的轉(zhuǎn)基因沉默機(jī)制會釋放疑為對CRYl-I基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用，因此促進(jìn)在高得多的吐 根堿濃度上生長。就抗60 μ g/ml吐根堿抗性對誘變細(xì)胞群(6 X IO8誘變細(xì)胞)的選擇確實(shí) 產(chǎn)生了在高抗生素濃度存在的情況下生長的克隆。為了在單個克隆中確定吐根堿抗性水平 并鑒定那些表現(xiàn)出最強(qiáng)抗性的克隆，使用在60 μ g/ml吐根堿存在的情況下于初始選擇平 板上顯示清楚生長的22個克隆在含不同濃度吐根堿的培養(yǎng)基上進(jìn)行點(diǎn)滴測試(drop tes) (圖1A、B，數(shù)據(jù)未顯示)。這些實(shí)驗(yàn)揭示了菌株之間的抗生素抗性水平的實(shí)質(zhì)差異，表明不 同菌株可能攜帶導(dǎo)致提高的吐根堿抗性的不同突變。實(shí)施例3 鑒定有效表達(dá)轉(zhuǎn)基因的菌株。除了敲除疑似轉(zhuǎn)基因沉默機(jī)制之外，幾種可選擇的突變類型也可能是造成耐受高 濃度吐根堿的藻類克隆出現(xiàn)的原因。這些突變類型包括獲得內(nèi)源RPS14基因中賦予吐根堿 抗性的點(diǎn)突變或允許更高表達(dá)的CRYl-I DNA序列組件中的突變(例如，增強(qiáng)啟動子強(qiáng)度、 mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率的突變)。然而，這些非期望的突變體類型可以容易地與需要的類 型區(qū)別，因?yàn)樗鼈儾粫幱跓o關(guān)轉(zhuǎn)基因高表達(dá)的狀態(tài)。因此，我們檢測5個表現(xiàn)最高水平 吐根堿抗性的選擇菌株(隨后稱為UVM4、UVM9、UVM11、UVM12和UVM13 ；圖1B)的高水平表 達(dá)其它轉(zhuǎn)基因的潛能。為此，我們構(gòu)建了含有最普通熒光報告基因GFP的轉(zhuǎn)化載體。為了 排除UVM菌株轉(zhuǎn)基因表達(dá)能力受驅(qū)動CRYl-I基因的啟動子的限制的可能性，GFP編碼區(qū) 被放置于表達(dá)信號的控制之下，該表達(dá)信號與在Elow47中驅(qū)動CRYl-I選擇標(biāo)記基因的表 達(dá)信號不同(參見材料和方法；圖2A)。因?yàn)橥庠椿蛟谝略逯械谋磉_(dá)被認(rèn)為依賴于密碼 子使用，我們使用了合成的GFP基因，其序列被調(diào)整以適合藻類核基因組中的密碼子使用 (Fuhrmann et al. ，1999)。我們構(gòu)建了 GFP表達(dá)載體(pJR38 ；圖2A)，其含有巴龍霉素抗性基因APHVIII (Sizova et al.，2001)。所有 5 個候選菌株(UVM4、UVM9、UVM11、UVM12 禾口 UVM13) 均用PJR38轉(zhuǎn)化，并且，每個構(gòu)建物隨機(jī)挑選17到20個抗巴龍霉素克隆并用單克隆抗GFP 抗體通過蛋白質(zhì)印跡法分析GFP表達(dá)(圖2B ；表1)。對于三個檢測的菌株UVM9、UVMl2和 UVM13，沒有單個GFP積累克隆被鑒定(圖2B ；表1)，這與揭示外源基因在衣藻中表達(dá)有很 大難度的大量早期工作相一致(例如，F(xiàn)uhrmann et al.，1999 ；Schroda et al. ,2000) 然 而，兩個菌株UVM4和UVMll產(chǎn)生了以高頻率表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)化體。17個分析的抗巴龍霉素 UVM4克隆中的9個和18個抗抗生素UVMll克隆中的9個高水平表達(dá)GFP (圖2B ；表1)。這 試驗(yàn)性表明菌株UVM4和UVMll可以代表這樣的突變體，即，在其中外遺傳轉(zhuǎn)基因失活機(jī)制 已經(jīng)被敲除。然而，如果確實(shí)是這種情況，應(yīng)該可以預(yù)期100%的成功轉(zhuǎn)化的克隆表達(dá)GFP。 我們因此對確定為什么接近一半的UVM4和UVMll轉(zhuǎn)化體并沒有表現(xiàn)出可檢測的GFP表達(dá) 感興趣(表1)。兩種可選的假設(shè)可以潛在地解釋這個發(fā)現(xiàn)(i)不同的外遺傳效應(yīng)，如位置 效應(yīng)、在這些克隆中被阻止的轉(zhuǎn)基因表達(dá)；或(ii)這些克隆在它們的核基因組中并不含有 完整的GFP DNA序列組件。因?yàn)槌晒D(zhuǎn)化的克隆僅通過它們對巴龍霉素的抗性(由APHVIII 基因賦予；圖2A)被選擇，不能保證GFP DNA序列組件被共同整合到所有抗抗生素克隆中。 為了測試完整GFP DNA序列組件的整合，使用對驅(qū)動GFP DNA序列組件的啟動子的5’端特 異的引物組合以及擴(kuò)增APHVIII基因3’端(其直接位于GFP下游；圖2A)的第二引物組合 進(jìn)行PCR試驗(yàn)。如果兩個引物組合均產(chǎn)生了 PCR產(chǎn)物，我們就假定完整的GFPDNA序列組件 被整合到基因組中了。有趣地是，所有那些并不顯示可檢測的GFP表達(dá)的UVM4和UVMll轉(zhuǎn) 化體在這些PCR試驗(yàn)中為陰性，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈ν暾腉FPDNA序列組件。因此，所有含有轉(zhuǎn) 基因轉(zhuǎn)化體也高水平表達(dá)該轉(zhuǎn)基因，這表明菌株UVM4和UVMll含有已經(jīng)將外遺傳轉(zhuǎn)基因失 活機(jī)制消除的突變。有趣地是，所有18個含有GFP轉(zhuǎn)基因的UVM4和UVMll克隆中的表達(dá) 水平均相當(dāng)高，表明也沒有顯著的位置效應(yīng)在這些菌株中起作用。針對純化的GFP的一系 列稀釋物的外源蛋白積累的定量比(圖2B)揭示轉(zhuǎn)化體中GFP蛋白積累到可溶性總蛋白的 至少0. 2%。據(jù)我們所知，這是通過衣藻中核轉(zhuǎn)化獲得的迄今為止最高的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生適合轉(zhuǎn)基因在其中表達(dá)的真核細(xì)胞的方法，包括(a)將編碼響應(yīng)于選擇試劑的選擇標(biāo)記的核酸導(dǎo)入到細(xì)胞核中，其中所述選擇標(biāo)記的 表達(dá)水平與對所述選擇試劑的表型響應(yīng)水平成正比；(b)在步驟(a)得到的所述細(xì)胞中選擇所述選擇標(biāo)記的表達(dá)可檢測的細(xì)胞；(c)任選地繁殖步驟(b)選擇的所述細(xì)胞；(d)誘變步驟(b)選擇的所述細(xì)胞或步驟(c)繁殖的所述細(xì)胞、或允許步驟(b)選擇的 所述細(xì)胞或步驟(c)繁殖的細(xì)所述胞中出現(xiàn)自發(fā)突變；(e)選擇與步驟(b)得到的所述表達(dá)相比，顯示出所述選擇標(biāo)記表達(dá)增加的細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞，優(yōu)選為真核的藻類細(xì)胞、真菌細(xì) 胞，優(yōu)選為酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述細(xì)胞是衣藻(Chlamydomonas)細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述響應(yīng)是抗性，并且其中所述選擇 標(biāo)記賦予抗性。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述抗性基因是CRYl-I基因。
6.權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的方法，還包括(a)’在步驟(b)之前，將編碼響應(yīng)于選擇試劑的選擇標(biāo)記的核酸導(dǎo)入到所述細(xì)胞中， 所述核酸與步驟(a)中使用的核酸不同；和(b)’用所述選擇試劑選擇對所述選擇標(biāo)記的響應(yīng)，優(yōu)選為在步驟(a)之后和在步驟 (b)之前。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述細(xì)胞對化合物是營養(yǎng)缺陷的，其中所述選擇標(biāo)記 是編碼恢復(fù)對所述化合物原養(yǎng)型的蛋白的營養(yǎng)缺陷型基因，并且，其中步驟(b)’包含在步 驟(a)之后和步驟(b)之前選擇對所述化合物原養(yǎng)型的所述恢復(fù)。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述細(xì)胞是衣藻細(xì)胞，其是對Arg7基因營養(yǎng)缺陷的。
9.權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中誘變通過輻射、化學(xué)誘變或基因誘變實(shí)施。
10.權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)所述的方法，還包括在步驟(e)之后鈍化在步驟(a)中 導(dǎo)入的所述選擇標(biāo)記以及任選地在步驟(a)’中導(dǎo)入的所述選擇標(biāo)記。
11.權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)所述的方法，還包括(f)將編碼目標(biāo)轉(zhuǎn)基因，并且任選地響應(yīng)于選擇試劑的選擇標(biāo)記的核酸導(dǎo)入到步驟 (e)獲得的所述細(xì)胞中；和(g)在所述細(xì)胞中，任選地在所述選擇試劑存在的情況下，分析所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)或者 由所述轉(zhuǎn)基因的所述表達(dá)產(chǎn)物調(diào)節(jié)的化合物。
12.權(quán)利要求11所述的方法，還包括在導(dǎo)入所述轉(zhuǎn)基因之后分析在步驟(f)獲得的所 述細(xì)胞的核中編碼所述轉(zhuǎn)基因的所述核酸分子的完整轉(zhuǎn)錄單位的存在。
13.在由權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的細(xì)胞中生成目標(biāo)化合物的方 法，包括(a)將編碼(i)所述目標(biāo)化合物，其是蛋白質(zhì)或RNA;或者( )合成所述目標(biāo)化合物必需的蛋白質(zhì)和任選地響應(yīng)于選擇試劑的選擇標(biāo)記的核酸導(dǎo)入到所述細(xì)胞中；(b)在所述細(xì)胞中表達(dá)所述蛋白質(zhì)；和(c)分離產(chǎn)生的所述目標(biāo)化合物。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述目標(biāo)化合物是藥物、生物燃料組分、診斷化合物或化學(xué)藥品。
15.真核細(xì)胞，其由權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生。
16.試劑盒，包括(a)由權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)所述的方法可獲得的細(xì)胞，以及任選地在所述細(xì)胞 中蛋白質(zhì)表達(dá)優(yōu)化的載體；或者(b)權(quán)利要求15所述的細(xì)胞。
17.在由權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的所述細(xì)胞中檢測蛋白質(zhì)表達(dá)和 /或定位的方法，包括(a)在所述細(xì)胞中表達(dá)編碼融合到報道分子上的所述蛋白質(zhì)的核酸；或(a)，在所述細(xì)胞中表達(dá)編碼所述蛋白質(zhì)的核酸，所述蛋白質(zhì)是報道分子；和(b)在所述細(xì)胞中檢測所述報道分子的表達(dá)和/或定位。
18.體外檢測在由權(quán)利要求1至12中任意一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的所述細(xì)胞中的蛋白 質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法，包括(a)在所述細(xì)胞中表達(dá)i.編碼含有融合到檢測標(biāo)記上的目標(biāo)(多)肽的融合蛋白的第一核酸；和 .編碼含有融合到不同檢測標(biāo)記上的疑為與所述第一(多)肽相互作用的(多)肽 的融合蛋白的核酸；和(b)檢測兩個檢測標(biāo)記的定位；其中，所述細(xì)胞中兩個檢測標(biāo)記的共定位表明相互作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及在產(chǎn)生適合轉(zhuǎn)基因在其中表達(dá)的真核細(xì)胞的方法，其包括(a)將編碼響應(yīng)于選擇試劑的選擇標(biāo)記的核酸導(dǎo)入到細(xì)胞核中，其中所述選擇標(biāo)記的表達(dá)水平與對所述選擇試劑的表型響應(yīng)水平成正比；(b)在步驟(a)得到的細(xì)胞中選擇所述選擇標(biāo)記的表達(dá)可檢測的細(xì)胞；(c)任選地繁殖步驟(b)所選擇的細(xì)胞；(d)誘變步驟(b)所選擇的細(xì)胞或步驟(c)繁殖的細(xì)胞、或允許步驟(b)所選擇的細(xì)胞或步驟(c)繁殖的細(xì)胞中出現(xiàn)自發(fā)突變；和(e)選擇相比于步驟(b)得到的細(xì)胞的表達(dá)，顯示出所述選擇標(biāo)記表達(dá)增加的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的真核細(xì)胞、在由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細(xì)胞中生成目標(biāo)化合物的方法，其包括(a)將編碼(i)目標(biāo)化合物，其是蛋白質(zhì)或RNA；或(ii)合成所述目標(biāo)化合物的必要蛋白質(zhì)；并且任選地響應(yīng)于選擇試劑的選擇標(biāo)記的核酸導(dǎo)入到所述細(xì)胞中；(b)在細(xì)胞中表達(dá)所述蛋白質(zhì)；和(c)分離產(chǎn)生的目標(biāo)化合物；以及試劑盒，其包括(a)可由本發(fā)明的方法得到的細(xì)胞，以及任選地在所述細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)優(yōu)化的載體；或(b)本發(fā)明的細(xì)胞。
文檔編號C12N15/79GK102099478SQ200980128497
公開日2011年6月15日 申請日期2009年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月23日
發(fā)明者D·卡徹, J·努帕特, R·博克 申請人:馬克思普朗克科學(xué)促進(jìn)會