專利名稱：永生的單能的豬picm-19h和picm-19b干細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及永生化的衍生的豬干細(xì)胞系PICM-19H，其能排它地分化成表達(dá)肝細(xì)胞 功能的肝細(xì)胞，所述肝細(xì)胞功能例如，可誘導(dǎo)的酶活性，諸如細(xì)胞色素P450(CYP450)活性； 還涉及永生化的衍生的豬干細(xì)胞系PICM-19B，其能排它地分化成表達(dá)膽管細(xì)胞功能的膽管 細(xì)胞并形成底外側(cè)極化的細(xì)胞的完整的(匯合的)細(xì)胞單層；還涉及包含PICM-19H細(xì)胞 或PICM-19B細(xì)胞或二者的生物人工肝裝置，在生物人工肝裝置或支持物中使用PICM-19H 和/或PICM-19B干細(xì)胞系來減輕肝功能障礙的方法，在篩選實(shí)驗(yàn)中使用PICM-19H和/或 PICM-19B干細(xì)胞系來檢測抑制或促進(jìn)肝中外源物代謝所涉及的酶活性的化合物或新化學(xué) 實(shí)體和/或來檢測由于肝中外源物和/或內(nèi)源底物的代謝而產(chǎn)生細(xì)胞毒性、肝毒性或肝功 能障礙的化合物或新化學(xué)實(shí)體的方法；和包含PICM-19H細(xì)胞和/或PICM-19B細(xì)胞的篩選 實(shí)驗(yàn)試劑盒。
背景技術(shù)：
目前處于開發(fā)中的生物人工肝裝置的生物組分需要具有體內(nèi)樣的肝細(xì)胞功能 的細(xì)胞系(Strain 和 Neuberger. 2002. Science 295 1005-1009 ；ChamuIeau 等人，2005. Metab. Brain Dis. 20 :327-335)。人或動物起源的腫瘤衍生的細(xì)胞系的肝功能毫無例外 地在它們的肝臟功能上有所缺陷，據(jù)推測是因?yàn)樗鼈內(nèi)鄙僬５姆只筒皇芸氐纳L特 征(Nyberg 等人，1994. Ann. Surg. 220(1) :59-67 ；Wang 等人，1998. Cell Transplant 7 459-468 ；Kobayashi 等 A, 2003a. J. Artif. Organs. 6 :236-244 ；Kobayashi 等人，2003b. Keio J. Med. 52 :151-157 ；Rodriguez-Antona φ A,2002. Xenobiotica 32 :505-520 ； Filippi等人，2004. J. Hepatol. 41 :599-605)。盡管用永生化的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染的新細(xì)胞系正 處于開發(fā)和試驗(yàn)中，并不能確保這些細(xì)胞系不會遭受類似原因產(chǎn)生的類似問題(Hoekstra 禾口 Chamuleau. 2002. Int. J. Artif. Organs. 25 :182-191 ；Kobayashi 等人，2003b，同 上)。迄今為止，大部分臨床上試驗(yàn)的生物人工肝裝置已經(jīng)使用新鮮的或冷凍的豬肝細(xì) 胞作為該裝置中的細(xì)胞組分(Hoekstra和Chamuleau，同上；Demetriou等人，2004. Ann. Surg. 239(5) :660-670)。盡管使用這些“肝-采集的”肝細(xì)胞已經(jīng)在患者支持物中取得 了一些功效(Demetriou等人，同上)，它們作為生物人工肝裝置的細(xì)胞組分也有所缺陷， 這是因?yàn)椴杉母渭?xì)胞在生物人工肝裝置中迅速死亡，另外，所述細(xì)胞會受到患者的形成 的抗體和補(bǔ)體因子的攻擊，且另外，這樣的細(xì)胞制備物是可變的，因此，是潛在地不安全的 細(xì)胞來源(Rodriguez-Antona等人，同上；Filippi等人，同上；Di Nicuolo等人2005. Xenotransplantation 2 :286-292)?，F(xiàn)在，為了研究肝細(xì)胞和肝細(xì)胞功能的任何不良反應(yīng)而在體外進(jìn)行的新的藥理學(xué) 和化學(xué)藥劑的大部分試驗(yàn)，是用原代肝細(xì)胞培養(yǎng)物、肝細(xì)胞細(xì)胞系或從肝組織或細(xì)胞衍生 出的微粒體制備物來進(jìn)行的(Bertz 和 Granneman. 1997. Clin. Pharmaokinet. 32 :210-258 ；Yan 禾口 Caldwell. 2001. Curr. Top. Med. Chem. 1 :403-425 ；Vermeir 等人 2005. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 1 :75-90)。微粒體制備物盡管可用于有些評估，但是不能用于評估和 預(yù)測細(xì)胞酶誘導(dǎo)或轉(zhuǎn)運(yùn)過程(Shimada 等人，1994. J. Pharmacol. Exp. Ther. 270 :414-423 ； Gomez-Lechon等人，2004. Curr. Drug Metab. 5 :443-462)。新鮮的原代肝細(xì)胞培養(yǎng)物可以 提供肝細(xì)胞功能的體外模型，且可以從多個物種制備，包括從特定疾病狀態(tài)動物模型制備 (Guillouzo, Α. 1998.Environ. Health Perspect. 106(Suppl. 2) :511-532 ；Ulrichova 等 Λ, 2001. Toxicol. Lett. 125 :125-132 ；Gomez-Lechon 等人，同上)。但是，即使優(yōu)良品質(zhì)的 肝細(xì)胞制備物在它們的體外生長和存活也受到限制，因此需要從來源肝組織連續(xù)獲取新的 月干細(xì)胞(Guillouzo,同上；Hoekstra 禾口 Chamuleau，同上；Rodri guez—Antona 等人，同上)。 優(yōu)良品質(zhì)的人肝組織經(jīng)常短缺，且必須總要經(jīng)過處理，如同潛在地感染性的(Guillouzo， 同上；Hoekstra和Chamuleau，同上)。動物源肝組織可以以穩(wěn)定的量得到，且通常沒有 傳染病危險(xiǎn)，但是盡管如此，由于動物至動物遺傳變異、動物健康、營養(yǎng)狀況和應(yīng)激水平 和可能最重要的細(xì)胞培養(yǎng)人員的制備肝細(xì)胞細(xì)胞懸浮液的技能，仍可能存在再現(xiàn)性問題 (Guillouzo,同上；DiNicuolo 等人，同上)。為了解決這些問題，已經(jīng)使用了基于連續(xù)生長的(即，在功能上是永生的)肝細(xì) 胞細(xì)胞系的肝細(xì)胞模型。不幸的是，人或其它動物的永生的肝細(xì)胞細(xì)胞系在功能上有所 缺陷，這是由于它們固有的不衰退生長特性和缺乏正常分化，因此它們是測量正常肝細(xì) 胞代謝(尤其是I和II期酶反應(yīng)和細(xì)胞運(yùn)輸性質(zhì)，它們被用作估計(jì)體內(nèi)毒物動力學(xué)和 藥代動力學(xué)的基礎(chǔ))的差的模型系統(tǒng)(Guillouzo,同上；Hoekstra和Chamuleau,同上； Wilkening等人，2003. Drug Metab. Dispos. 31 :1035-1042 ；Yan和Caldwell，同上；Chandra 和Brouwer. 2004. Pharm. Res. (NY) 21 :719-735)。因而，需要用于預(yù)測體內(nèi)肝生物轉(zhuǎn)化和毒 性的改良的體外模型，以實(shí)現(xiàn)新化學(xué)實(shí)體的更快的生物學(xué)評估，并減少有爭論的且昂貴的 云力物試驗(yàn)(Bertz 禾口 Granneman，同上；Guillouzo,同上；Yan 禾口 Caldwell，同上；Chandra 禾口 Brouwer,同上)。鑒于上面討論的體外肝細(xì)胞模型的限制，普遍接受的是，表現(xiàn)出無限生長且仍然 正常分化的細(xì)胞系(例如，肝干細(xì)胞系)會為基于細(xì)胞的體外生物人工肝輔助裝置提供最 好的生物組分。出于類似的原因，具有這些特征的肝干細(xì)胞系也是進(jìn)行新化學(xué)實(shí)體的藥理 學(xué)和毒理學(xué)評估并實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的且可重復(fù)的評估的最好體外模型。在本文中，我們描述了滿足這些要求的本發(fā)明的豬肝干細(xì)胞系PICM-19H和 PICM-19B,即ARS-PICM-19細(xì)胞系的2種衍生細(xì)胞系。ARS-PICM-19親代細(xì)胞系和包含它 們的人工肝裝置已經(jīng)分別在美國專利號5，532，156和美國專利號5，866，420中受到專利保 護(hù)，它們通過引用以其整體并入本文。一種衍生的細(xì)胞系PICM-19H細(xì)胞系能分化成肝細(xì) 胞，且不再表現(xiàn)出分化并自我構(gòu)成多細(xì)胞膽小管的能力。另一種細(xì)胞系PICM-19B看起來自 發(fā)地源自膽管分化細(xì)胞，但是產(chǎn)生在親代ARS-PICM-19細(xì)胞系群體中未看到的獨(dú)特的細(xì)胞 表型，即形成穹頂?shù)臉O化的上皮。

發(fā)明內(nèi)容
我們已經(jīng)衍生出了 (1)僅分化成功能性肝細(xì)胞的單能豬肝干細(xì)胞系PICM-19H細(xì) 胞系，其源自能分化成肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的雙能干細(xì)胞系，并將PICM-19H細(xì)胞確定為細(xì)胞系，且通過下述項(xiàng)目證實(shí)它分化成肝細(xì)胞它的形態(tài)學(xué)、可誘導(dǎo)的CYP450活性、血清蛋白生 成、低Y-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶(GGT)活性、氨清除能力和尿素生成能力，和(2)僅分化成功能 性膽管細(xì)胞(膽管上皮細(xì)胞)的單能豬肝干細(xì)胞系PICM-19B細(xì)胞系，其源自能分化成肝細(xì) 胞和膽管細(xì)胞的雙能干細(xì)胞系，并將PICM-19B細(xì)胞確定為細(xì)胞系，并表明，所述細(xì)胞在培 養(yǎng)物中形成匯合的(完整的)細(xì)胞單層，是表現(xiàn)出基底膜流體運(yùn)輸?shù)牡淄鈧?cè)極化的細(xì)胞，具 有高GGT活性且具有極大減少的血清蛋白生成。根據(jù)該發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的一個目的是提供永生化的衍生的豬干細(xì)胞系，其能排它地 分化成表達(dá)肝細(xì)胞功能(即參與外源物代謝的可誘導(dǎo)的酶活性)的肝細(xì)胞。本發(fā)明的另一個目的是提供單能的PICM-19H干細(xì)胞系，其中主要酶活性是 CYP450活性，包括CYP1A1、CYP1A2或CYP3A活性。PICM-19H細(xì)胞的其它特征是低水平的 GGT活性、血清蛋白生產(chǎn)、尿素生產(chǎn)和清除氨的能力。本發(fā)明的再一個目的是提供單能的PICM-19H干細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系保藏為 ATCC PTA-9174。本發(fā)明的還一個目的是提供單能的豬干細(xì)胞系，其僅分化成表達(dá)膽管功能(即向 量流體運(yùn)輸)的膽管上皮細(xì)胞。本發(fā)明的又一個目的是提供PICM-19B干細(xì)胞系，其形成表現(xiàn)出基底膜流體運(yùn)輸 的底外側(cè)極化的細(xì)胞的匯合細(xì)胞單層，且具有高GGT活性、低CYP450活性且無血清蛋白生 成。本發(fā)明的又再一個目的是提供單能的PICM-19B干細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系保藏 為 ATCC PTA-9173,本發(fā)明的一個目的是提供培養(yǎng)PICM-19H和PICM-19B干細(xì)胞的方法，其中使用或 不使用飼養(yǎng)細(xì)胞。本發(fā)明的一個目的是提供在無血清條件下培養(yǎng)PICM-19H和PICM-19B干細(xì)胞的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供在篩選實(shí)驗(yàn)中使用單能的PICM-19H和PICM-19B干細(xì) 胞系來檢測化合物的方法，所述化合物抑制或促進(jìn)肝中外源物代謝所涉及的酶活性，或者 抑制或促進(jìn)編碼肝中外源物代謝所涉及的酶的基因的表達(dá)。本發(fā)明的另一個目的是提供在篩選實(shí)驗(yàn)中使用單能的PICM-19H和PICM-19B干細(xì) 胞系來檢測由于外源物和/或內(nèi)源底物的代謝而產(chǎn)生細(xì)胞毒性的化合物的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供在篩選實(shí)驗(yàn)中使用單能的PICM-19H和PICM-19B干細(xì) 胞系來檢測由于外源物和/或內(nèi)源底物的代謝而產(chǎn)生致癌力的化合物的方法。本發(fā)明的又一個目的是提供在篩選實(shí)驗(yàn)中使用單能的PICM-19H和PICM-19B干細(xì) 胞系來檢測由于外源物和/或內(nèi)源底物的代謝而產(chǎn)生致突變性的化合物的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供在篩選實(shí)驗(yàn)中使用單能的PICM-19H和PICM-19B干細(xì) 胞系來檢測由于外源物和/或內(nèi)源底物的代謝而產(chǎn)生肝毒性的化合物的方法。本發(fā)明的還一個目的是提供在篩選實(shí)驗(yàn)中使用單能的PICM-19H和PICM-19B干細(xì) 胞系來檢測產(chǎn)生肝功能障礙的化合物的方法。本發(fā)明的又一個目的是提供在生物人工肝裝置(諸如中空纖維生物反應(yīng)器)中使 用單能的PICM-19H和PICM-19B干細(xì)胞系來體外處理需要這種處理的個體的體液(諸如全血、血漿和等滲灌洗-腹膜液)以減輕肝功能障礙的方法。本發(fā)明的再又一個目的是提供使用單能的PICM-19H和PICM-19B干細(xì)胞系培養(yǎng)物 來處理需要這種處理的個體的體液(諸如全血、血漿和腹膜液)以減輕肝功能障礙的方法， 所述培養(yǎng)物粘附在微珠上、粘附在無機(jī)或有機(jī)多孔支持物上、粘附在中空纖維上或包裹在 基于水凝膠的支持物中。從下面的描述將容易地明白本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)。


本美國專利或申請文件含有至少一幅彩色繪制的圖。在請求并支付必要的費(fèi)用 后，含有彩圖的該專利或?qū)＠暾埞_文本的復(fù)制件將由美國專利和商標(biāo)局提供。圖1顯示了在200X放大率時與傳代后3周后的PICM-19H細(xì)胞培養(yǎng)物(圖1B)相 比較的傳代后3-4周后的親代ARS-PICM-19細(xì)胞培養(yǎng)物(圖1A)的相位差顯微照片。圖2描述了由1 6分流比傳代的第66代的PICM-19H生長曲線。圖3A-F顯示了獨(dú)立PICM肝干細(xì)胞系(B、D和F)和經(jīng)歷向形成穹頂?shù)纳掀ぜ?xì)胞的 表型轉(zhuǎn)化的親代ARS-PICM-19 (A、C和E)豬肝干細(xì)胞系的相位差顯微照片QOOx)。在A-C 和B-D中顯示了原代事件。注意到，PICM細(xì)胞沿著軸線(B中的箭頭)對稱地排列成致密 填充的圓柱形態(tài)，所述軸線是細(xì)胞之間的腔空隙(lumenal space)。所述腔空隙裝滿了黑色 物質(zhì)，其在A中具有黃色(箭頭)。圖C和D描述了早期擴(kuò)增，彎曲的箭頭指示早期穹頂形 成，且C中的箭頭指示集落擴(kuò)增(colonial expansion)的邊緣。在圖E中，PICM-19B細(xì)胞 已經(jīng)扁平化并擴(kuò)散，小穹頂正在開始(雙箭頭)。在圖F中，PICM變體細(xì)胞已經(jīng)充分繁殖， 正在扁平化，且大穹頂已經(jīng)出現(xiàn)在單層中(箭頭)。條棒 50 μ m。圖4描述了由1 12分流比傳代的第64代的PICM-19B生長曲線。圖5A顯示了在6000X放大率的PICM-19H細(xì)胞的透射電子顯微照片，所述細(xì)胞排 列成單層，位于大STO飼養(yǎng)細(xì)胞的上面。圖5B顯示了出現(xiàn)在PICM-19H細(xì)胞之間的膽小管 (c)，其具有有關(guān)的緊密連接部(箭頭)。另外，注意到STO飼養(yǎng)細(xì)胞在PICM-19H細(xì)胞的上 面和下面(放大率33，800X)。圖5C表明，在PICM-19H細(xì)胞中出現(xiàn)了一些液體空泡(L)(放 大率60, 000X)。圖6顯示了 PICM-19H細(xì)胞的透射電子顯微照片，其突出了在細(xì)胞內(nèi)存在的廣泛的 高爾基復(fù)合體(G)、糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)和許多線粒體(M)(放大率60，000X)。圖7顯示了 PICM-19H細(xì)胞的透射電子顯微照片，它顯示了什么作為糖原玫板 (GLY)的較差固定的區(qū)域的殘留物而出現(xiàn)。另外，注意到膠原纖維(Col)層(推測由鄰 近的STO飼養(yǎng)細(xì)胞生成)和板層狀嵴特有地穿過PICM-19H細(xì)胞的線粒體(M)(放大率 94，500X)。圖8A顯示了 PICM-19B樣細(xì)胞的透射電子顯微照片，圖8A顯示出由緊密連接部 ⑴和有關(guān)的橋粒樣連接部(d)連接到一起的2個細(xì)胞的頂(面向培養(yǎng)基)表面。另外，在 圖8A中注意到剛好低于頂膜的分泌小泡(箭頭)，它們是含有粘蛋白的小泡的特征，其具有 離心地定位的凝結(jié)的小球(雙箭頭)(放大率48，000X)。圖8B顯示了生長在STO飼養(yǎng)層 和它的膠原纖維基質(zhì)上面的2個PICM-19B細(xì)胞。注意到在細(xì)胞頂膜處的微絨毛、側(cè)向細(xì)胞 膜指狀突起和典型的齒狀的或少見地鈍齒形的細(xì)胞核(放大率6，000X)。圖8C表明粘著帶型連接部可以在細(xì)胞之間變得穩(wěn)健，尤其是在單層區(qū)域，在這里通過在它們的基底膜下 的流體運(yùn)輸和積累而形成穹頂(放大率60，000X)。圖9顯示了 PICM-19B樣細(xì)胞的透射電子顯微照片。具有微絨毛(箭頭)和纖毛 基體(雙箭頭)的細(xì)胞的頂表面。注意到多糖包被的染色，其也保留有沉淀的染色劑(箭 頭)(放大率:120, 000X) ο圖10顯示了 PICM-19B樣細(xì)胞的底部的透射電子顯微照片，顯示出含有許多平行 的棱晶形板的微體(箭頭)。所述微體看起來具有具有雙膜樣線粒體。類晶體陣列可以是 過氧化物酶體的擬核，或可能是溶酶體內(nèi)的凝結(jié)。注意到低于細(xì)胞底部的稀疏的基板(雙 箭頭)(N =細(xì)胞核；放大率J40，000X)。圖11顯示了 PICM-19B樣細(xì)胞的透射電子顯微照片。注意到具有基質(zhì)顆粒(箭頭) 的長線粒體和發(fā)育良好的高爾基體(G)，它們常見于細(xì)胞核(N)周圍(放大率48，000X)。圖12顯示了針對GGT活性的組織化學(xué)染色的PICM-19H細(xì)胞單層的相位差顯微照 片。箭頭指示PICM-19H細(xì)胞之間的膽小管，顯示了 GGT活性的陽性染色(紅色)。圖13顯示了針對GGT活性的組織化學(xué)染色的親代ARS_PICM_19肝干細(xì)胞培養(yǎng)物 的明視野(圖13A)和相位差(圖13B)顯微照片。圖13A顯示了 PICM-19B樣變體細(xì)胞的單 層擴(kuò)增(大箭頭)，因?yàn)樗鼈冮L出并超過膽管上皮細(xì)胞(形成膽管的；小箭頭)和肝細(xì)胞樣 細(xì)胞(具有小管的立方細(xì)胞的單層片；箭頭)的親代表型。注意到這2種親代的或常見的 分化表型從未接近匯合，如本文指出的，這是因?yàn)樗鼈冊诎l(fā)生該現(xiàn)象之前在末端分化良好。 相反，變體PICM-19B樣細(xì)胞會繼續(xù)生長，直到達(dá)到如圖1 所示的匯合。(A)中的條棒是 95 μ m, (B)中的條棒是 50 μ m。圖14描述了通過EROD試驗(yàn)測得的PICM-19細(xì)胞系中的3-甲基膽蒽誘導(dǎo)的CYP450 活性。未誘導(dǎo)的CYP450值低于檢測限，未顯示。ND=不可測出。圖15顯示了培養(yǎng)幾乎匯合的PICM-19H細(xì)胞(圖15A)或PICM-19B細(xì)胞(圖15B) 單層48h的無血清培養(yǎng)基樣品的二維聚丙烯酰胺凝膠。用膠態(tài)考馬斯藍(lán)將凝膠染色，并指 出一些血清蛋白，它們通過MALDI-T0F和LC-MS來鑒別(也參見表2)。圖16描述了向測試的3種PICM-19細(xì)胞系的培養(yǎng)物的細(xì)胞培養(yǎng)基中不加入(對 照)和加入12μπι01 NH4Cl時的氨清除和尿素生成。在每個條棒上面的值是被細(xì)胞轉(zhuǎn)化成 尿素氮的加入的NH4Cl氮的百分比。圖17描述了用苯巴比妥、利福平和3-甲基膽蒽(3-MC)在PICM-19H細(xì)胞中誘導(dǎo)多 個CYP450亞型。將培養(yǎng)物暴露于等效體積的PBS、在完全培養(yǎng)基中的DMSO (0. 1 %終濃度)、 ImM苯已比妥(ΡΗΒ)、50μΜ利福平(Rif)或5μΜ 3_MC。4 后，將培養(yǎng)基替換為特異性的 酶底物培養(yǎng)基，測定特異性的CYP(ER0D、MROD, MFCD和BFCD)的活性。將新鮮的培養(yǎng)物(η =3)用于每個CYP450分析，值是3個獨(dú)立試驗(yàn)的平均值士SEM。圖18描述了在對照和利福平-誘導(dǎo)的PICM-19H細(xì)胞中的睪酮代謝物的測定。將 培養(yǎng)物暴露于50μΜ Rif或0. 1%DMS0 48小時，然后與睪酮一起溫育lh。通過定量LC-MS， 測定6-β羥基-睪酮(6 β ΟΗΤ)、2_ α羥基睪酮QaOH Τ)和2_β羥基睪酮O β OH Τ)的 濃度。值是在一式三份培養(yǎng)物中進(jìn)行的3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士SEM。圖19顯示了 STO(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞細(xì)胞系)細(xì)胞、成年豬肝細(xì)胞(ΑΡΗ)、 PICM-19H細(xì)胞和人肝細(xì)胞瘤衍生的!fepG2-C3A細(xì)胞中CYP450活性的對比。將一式三份培養(yǎng)物暴露于0. 1 % DMSO (對照)禾Π 50 μ M Rif或5 μ M 3-MC 48小時，并分別測定BFCD和 EROD活性。值是3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士SEM。ND ；不可測出。圖20顯示了成年豬肝細(xì)胞(APH)、PICM_19H細(xì)胞和H印G2C3A細(xì)胞中II期代謝的 分析。用和不用葡糖醛酸糖苷酶/芳基硫酸酯酶混合液溫育培養(yǎng)基樣品，測定誘導(dǎo)的 EROD和BFCD活性。測定了熒光產(chǎn)物(試鹵靈或7-HCF)，并將混合液釋放的產(chǎn)物的量報(bào)告 為總量的百分比。值是在一式三份培養(yǎng)物中進(jìn)行的3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士SEM。ND;不 可測出。圖21描述了 PICM-19H細(xì)胞中黃曲霉毒素Bl的生物活化。在96-孔微量培養(yǎng)板 中培養(yǎng)的0. 1% DMSO處理過的(對照)和3-MC誘導(dǎo)的PICM-19H細(xì)胞中，測定黃曲霉毒素 Bl的毒性。加入黃曲霉毒素Bl后，通過每個孔中的WST-I活性測定生存力。對于每種條 件，將每種濃度的黃曲霉毒素加入10個孔中。通過非線性回歸分析合并的響應(yīng)曲線；DMSO 和3-MC處理過的培養(yǎng)物的指數(shù)模型R2值分別是0. 967和0. 998。圖22顯示了在PICM-19H細(xì)胞中醋氨酚的毒性測定。通過在96-孔微量培養(yǎng)板中 培養(yǎng)的PICM-19H細(xì)胞中的WST-I活性，測定醋氨酚的毒性。制備9個獨(dú)立的劑量響應(yīng)曲線， 并使用S形響應(yīng)曲線模型通過非線性回歸進(jìn)行分析。圖23Α和2!3Β顯示了在3D-中空纖維生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的PICM-19H細(xì)胞。圖23Α 顯示了單個中空纖維，其在灌注培養(yǎng)14天后用4%多聚甲醛固定化，然后用Hoechst核特異 性的熒光染料染色；放大率100Χ。圖2 顯示了單個中空纖維(正如在圖23A中)，其具 有分離的PICM-19H單層部分(箭頭)，且STO飼養(yǎng)細(xì)胞位于PICM-19H細(xì)胞下面，并粘附到 中空纖維表面上(單個STO細(xì)胞核用箭頭指示)，放大率100X。圖24A和24B顯示了在有STO-GFP細(xì)胞(表達(dá)綠熒光蛋白GFP的STO飼養(yǎng)細(xì)胞)存 在下在微珠上生長的PICM-19H細(xì)胞。首先使STO-GFP細(xì)胞粘附到珠子上；然后將PICM-19H 細(xì)胞加入培養(yǎng)物。圖24A描述了被藍(lán)光(用于激發(fā)GFP熒光)激發(fā)的STO細(xì)胞。圖24B顯 示了所有細(xì)胞(ST0和PICM-19H)的熒光細(xì)胞核，因?yàn)樽贤夤鈺ぐl(fā)培養(yǎng)物染上的Hoescht 核染劑(淺藍(lán)色核熒光)。對比圖24B和24A可以鑒別出STO和PICM-19H細(xì)胞。圖25顯示了在球狀體培養(yǎng)物中生長的PICM-19H細(xì)胞，即培養(yǎng)原代豬肝細(xì)胞的普 通方法。在懸浮培養(yǎng)物中培養(yǎng)PICM-19H球狀體2周，然后如顯示的重新附著到STO飼養(yǎng)細(xì) 胞的單層上。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的目的是提供會表現(xiàn)出無限生長但是仍然正常分化的單能豬肝干細(xì)胞 系PICM-19H，和提供會形成具有底外側(cè)細(xì)胞極化和基底膜流體運(yùn)輸活性的完整單層的 PICM-19B ；提供含有PICM-19H細(xì)胞系、PICM-19B細(xì)胞系或二者的生物人工肝裝置，和提供 用于估測體內(nèi)毒物動力學(xué)和藥代動力學(xué)的包含所述細(xì)胞系的快速篩選實(shí)驗(yàn)。已經(jīng)表征了 PICM-19H和PICM-19B細(xì)胞系的I期和II期代謝功能；PICM-19H和PICM-19B細(xì)胞系可以 用于評估細(xì)胞酶誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)運(yùn)過程。已經(jīng)從植入前豬胚泡的全能胚胎干細(xì)胞(即上胚層細(xì)胞)的體外培養(yǎng)物衍生出了 ARS-PICM-19細(xì)胞系，即本發(fā)明的單能的PICM-19H和PICM-19B細(xì)胞系的雙能親代系，且剛 好是從豬胚胎干細(xì)胞自發(fā)分化的特異性細(xì)胞類型的許多細(xì)胞系之一(Talbot等人，1993. InVitroCell. Dev. Biol. 29A :543-554 ；Talbot 等人，1994a. In Vitro Cell. Dev. Biol. 30A 843-850)。在它們的傳代史的早期，觀察到親代ARS-PICM-19細(xì)胞會形成胎兒肝細(xì)胞樣 細(xì)胞的單層以及細(xì)胞自我構(gòu)造成由膽管上皮細(xì)胞樣細(xì)胞組成的多細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)的區(qū)域。 ARS-PICM-19肝細(xì)胞具有胎豬肝細(xì)胞的特有形態(tài)，即立方細(xì)胞，其具有通過緊密連接部和橋 粒連接到一起的位于中央的細(xì)胞核，以在細(xì)胞之間形成小管結(jié)構(gòu)(Talbot等人，1994b. In Vitro Cell. Dev. Biol. 30A :851-858)。ARS_PICM_19細(xì)胞可以單細(xì)胞克隆，而不喪失分化和 分裂潛力。發(fā)現(xiàn)了 ARS-PICM-19培養(yǎng)物具有可誘導(dǎo)的CYP450活性(肝細(xì)胞的標(biāo)志)和高 GGT活性(膽管上皮細(xì)胞的標(biāo)志)(Talbot等人，1996a. Exp. Cell Res. 225-22-34)。它們也 與白蛋白和其它肝特異性的蛋白一起表達(dá)甲胎蛋白(Talbot等人，1994a, 1996a,同上)。胎 豬肝組織(Talbot等人，1994b，同上)和成年豬肝組織(Talbot和Caperna. 1998. In Vitro Cell. Dev. Biol. 34A :785-798 ；未公開的數(shù)據(jù))的培養(yǎng)產(chǎn)生了在它們的分化潛力、形態(tài)學(xué)和 蛋白/酶表達(dá)方面非常類似于ARS-PICM-19細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。也證實(shí)了 ARS-PICM-19 小管對分泌素和cAMP誘導(dǎo)物的體內(nèi)樣響應(yīng)，即以體內(nèi)樣動力學(xué)從底外側(cè)向頂運(yùn)輸培養(yǎng)液 (Talbot 等人，2002. Cells Tissues Organs 171:99-116)。ARS-PICM-19 向膽管上皮分化 的標(biāo)志是獨(dú)特的體外細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)變化，即自我構(gòu)造成柱狀上皮的有功能的多細(xì)胞管狀 結(jié)構(gòu)(Talbot等人，199 ，1996a，2002，同上)。這些體外生產(chǎn)的膽小管非常類似于從胎兒 和成年豬肝組織的培養(yǎng)物體外生產(chǎn)的相似膽小管(Talbot等人，1994b，1998，同上)。因而， 已經(jīng)證實(shí)ARS-PICM-19細(xì)胞在功能上是永生的(Talbot等人，1994a,同上)，且具有實(shí)質(zhì)肝 細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的特征CTalbot等人，1994a，1996a，同上)。這是ARS-PICM-19細(xì)胞中 最直接的表現(xiàn)，所述細(xì)胞自發(fā)地停止細(xì)胞分裂(每次傳代后約10天)，并分化成至少2個顯 著不同的形態(tài)學(xué)表型，一個類似于肝細(xì)胞，另一個自我構(gòu)成多細(xì)胞的有功能的小管，其行為 象體內(nèi)膽管(Talbot等人，1994a, 1996a, 2002，同上)。PICM-19H和PICM-19B是從上述ARS-PICM-19細(xì)胞系衍生出的2種不同的單能細(xì) 胞系。PICM-19H單能細(xì)胞系能分化成肝細(xì)胞，且不再表現(xiàn)出分化和自我構(gòu)成多細(xì)胞膽小管 的能力。另一種細(xì)胞系PICM-19B看起來已經(jīng)自發(fā)地源自親代ARS-PICM-19細(xì)胞的膽管分 化細(xì)胞組分，且是在親代ARS-PICM-19細(xì)胞群體中通常未看到的獨(dú)特的分化的表型，即形 成穹頂?shù)牡淄鈧?cè)極化的上皮。描述了這些形態(tài)學(xué)上不同的細(xì)胞系的分離(參見實(shí)施例1)。 評價(jià)了衍生的細(xì)胞系，以評估它們保留肝細(xì)胞或膽管上皮細(xì)胞細(xì)胞功能的程度。具體地，由 于親代ARS-PICM-19細(xì)胞系的細(xì)胞可以分化成肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞(膽管上皮細(xì)胞)，評價(jià)了 這些具體衍生細(xì)胞系的細(xì)胞的性質(zhì)，以確定它們在其細(xì)胞功能上是否或多或少地是肝細(xì)胞 樣的，以及它們中的任一種是否具有新的獨(dú)特的細(xì)胞特征，所述特征會增強(qiáng)它們在生物人 工肝裝置和/或體外快速肝毒性試驗(yàn)中的實(shí)用性。如上所述，肝細(xì)胞系的一種具體用途是用作體外生物人工肝裝置的生物組分。生 物人工肝在離體“生物反應(yīng)器”中含有活細(xì)胞(通常是肝細(xì)胞或肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)的佐細(xì)胞 的某種組合)，患者的血液或血漿被泵入所述“生物反應(yīng)器”，以在體外循環(huán)環(huán)路中與細(xì)胞相 互作用(Sussman 禾口 Kelly. 1995. Scientific American 2 :68-77 ；Strain 禾口 Neuberger, 同上；Sen 和 Williams. 2003. kminars in Liver Disease23(3) :283-294)。急性肝衰竭 的治療需要這樣的裝置，這是因?yàn)槌烁我浦惨酝?，目前沒有可利用的降低與該病癥有關(guān) 的高死亡率的有效治療選擇(Sussman和Kelly，同上；Strain和Neuberger，同上；Sen和Williams，同上)。因而，本發(fā)明的PICM-19H和PICM-19B衍生的肝細(xì)胞系是用于生物人工肝裝置的 候選物，因?yàn)樗鼈兙哂杏郎膯文芨杉?xì)胞的特別特性。也就是說，PICM-19H細(xì)胞僅分化成 肝細(xì)胞，且不分化成膽小管。因而，在肝細(xì)胞功能是第一需要且不需要膽汁運(yùn)輸和調(diào)節(jié)功 能的那些情況下，與親代ARS-PICM-19細(xì)胞可以提供的肝細(xì)胞功能相比，PICM-19H可以為 急性肝衰竭的治療提供更好的肝細(xì)胞功能(Sussman和Kelly，同上Jtrain和Neuberger， 同上；Sen和Williams，同上)。類似地，PICM-19H細(xì)胞系為進(jìn)行新化學(xué)實(shí)體的生物學(xué)評估 的篩選實(shí)驗(yàn)提供了優(yōu)良模型?？烧T導(dǎo)的CYP450活性是肝細(xì)胞的標(biāo)志。所示的數(shù)據(jù)解釋了 PICM-19H細(xì)胞系的可誘導(dǎo)的CYP450活性的特異性，且包括與以前關(guān)于親代ARS-PICM-19細(xì) 胞系描述的數(shù)據(jù)(Talbot等人，1996a，同上)的對比，從而證實(shí)了 PICM-19H細(xì)胞系用于體 外毒性試驗(yàn)的實(shí)用性。也闡述了 PICM-19H用于生物人工肝裝置的潛在用途。使PICM-19H細(xì)胞比親代ARS_PICM_19細(xì)胞系更有利地用于生物人工肝裝置的特 性是，PICM-19H細(xì)胞保留了關(guān)鍵的肝細(xì)胞功能，它們是非致瘤性的，且在體外表現(xiàn)出正常的 分化，它們可以維持在生物人工肝裝置的生物反應(yīng)器中相對長的時間段，它們的表型穩(wěn)定 性(即，在約450次群體倍增的多代培養(yǎng)后不會自發(fā)出現(xiàn)PICM-19B樣細(xì)胞)，從而可以確定 并常規(guī)地評估無病原體狀態(tài)，且可以為了增強(qiáng)功能而將它們遺傳工程化。2種PICM-19衍生物具有對比特征，以不同的方式使各自更適合用作生物人工肝 裝置的細(xì)胞組分。PICM-19H細(xì)胞在所有度量中表現(xiàn)得更加“肝細(xì)胞樣”；包括細(xì)胞和集落形 態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)特征、血清蛋白生成和代謝酶功能。數(shù)據(jù)表明，PICM-19H細(xì)胞在CYP450活 性、尿素生成和氨清除的關(guān)鍵肝功能方面是優(yōu)越的。但是，因?yàn)镻ICM-19B細(xì)胞會生長至更 大的細(xì)胞密度，且也表現(xiàn)出這些關(guān)鍵的代謝功能(盡管在較低的水平)，PICM-19B細(xì)胞也 是用于生物人工肝裝置的良好選擇，特別在向量(即，底外側(cè)的)運(yùn)輸是生物人工肝裝置的 生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)特性的情況下。另外，PICM-19B相對缺少血清蛋白分泌也是有益的，因 為人類患者的血液不會暴露于如此多的外來抗原(取決于生物人工肝裝置中的透析膜的 分子量截止值)。PICM-19B的頂至基底細(xì)胞膜極化會提供一個優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗C實(shí)了定向運(yùn) 輸(即，穹頂形成)可以潛在地將毒素從人類患者的血漿運(yùn)出到外部廢物流環(huán)路中，只要 PICM-19B細(xì)胞適當(dāng)?shù)貥?gòu)建在生物人工肝裝置的透析膜上。在任意情況下且作為總結(jié)，本文 所示的數(shù)據(jù)指示用于生物人工肝裝置的PICM-19H和PICM-19B細(xì)胞系的增強(qiáng)的功能。2種單能細(xì)胞系的可用性會提供設(shè)計(jì)和靶向生物反應(yīng)器的內(nèi)容物以適合患者的特 定功能需要的獨(dú)特機(jī)會。細(xì)胞系PICM-19H和PICM-19B中的每一種都可以在生物反應(yīng)器中 單獨(dú)培養(yǎng)，或它們二者可以一起接種進(jìn)生物反應(yīng)器中，產(chǎn)生操縱各自的細(xì)胞數(shù)的機(jī)會，即根 據(jù)患者需要的功能以不同比例接種。已經(jīng)提出，豬細(xì)胞可用于肝代謝功能的體外建模，并用作生物人工肝裝置的細(xì)胞 組分，這是由于它們的人肝細(xì)胞代謝相似性(Donato等人，1999. J. Hepatol. 31 =542-549)。 在本研究中，我們關(guān)于重要的CYP450活性(CYP1A、2和3A)的存在和誘導(dǎo)已經(jīng)表征了 PICM-19H細(xì)胞系。另外，使用試驗(yàn)底物證實(shí)了 II期綴合的程度是顯著的，且與成年豬肝細(xì) 胞相當(dāng)。證實(shí)了已知的肝毒素醋氨酚和黃曲霉毒素Bl以劑量依賴性的方式被代謝。這些數(shù) 據(jù)，與PICM-19H細(xì)胞系的其它被證實(shí)的肝分化功能和穩(wěn)健的培養(yǎng)特征一起，指示PICM-19H 細(xì)胞可以提供生物人工肝裝置的細(xì)胞組分，并也為肝細(xì)胞體外毒理學(xué)試驗(yàn)提供了改良的模型系統(tǒng)。CYP450包括具有外來物(即活有機(jī)體的身體以外的化學(xué)物質(zhì))的肝特異性代謝 所涉及的關(guān)鍵酶活性的細(xì)胞酶家族。外來物包括天然存在的化合物、藥物、環(huán)境因素、致癌 物、殺蟲劑等。從外源物的代謝所涉及的分布和功能的觀點(diǎn)看，CYP450代表最重要的一類 酶。CYP450 是大量酶蛋白的通用名；CYPlAl、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、 CYP2C19、CYP3A(尤其是CYP3A4)是人肝中外源物的代謝所涉及的CYP450酶家族的已知成 員O另外，已知大量外來物代謝酶在特定條件下被誘導(dǎo)。眾所周知的誘導(dǎo)物的實(shí)例包 括多環(huán)芳族化合物，諸如誘導(dǎo)CYPlAl和CYP1A2表達(dá)的苯并[A]芘、苯并蒽、3-甲基膽蒽 和二噁英；誘導(dǎo)CYP2B(例如，CYP2B6)的苯巴比妥和苯巴比通；和誘導(dǎo)CYP3A的利福平、 地塞米松、苯妥英和保泰松(C. G. Gibson 等人，1995. New Metabolomics ofXenobiotics, Kodansha Ltd. , Tokyo, Japan)。試驗(yàn)化合物(新的化學(xué)實(shí)體和外來物)包括，例如，肽、蛋白、非肽化合物、合成的 化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細(xì)胞提取物、植物提取物、動物組織提取物和血漿。因而，它們包括天然 存在的化合物、藥物、環(huán)境因素(environmental agent)、致癌物、殺蟲劑、除草劑等。這些化 合物可以是新的化合物或普遍已知的化合物。具體地，可以用試驗(yàn)化合物處理本發(fā)明的PICM-19H或PICM-19B細(xì)胞，并與未處理 的對照PICM-19培養(yǎng)物進(jìn)行對比，從而用永生的PICM-19H或PICM-19B細(xì)胞中的諸如下述 項(xiàng)中的變化來評價(jià)試驗(yàn)化合物的治療/預(yù)防效應(yīng)(1)肝中外源物的代謝所涉及的酶活性， 或⑵編碼肝中外源物的代謝所涉及的酶的基因的表達(dá)(活化)。使用本發(fā)明的篩選方法鑒別為安全的試驗(yàn)治療化合物可以用作與肝中外源物的 代謝異常有關(guān)的疾病(例如，肝功能不全)的低毒性的安全的治療劑/預(yù)防劑或其它藥物， 這是因?yàn)樗鼘@些疾病的治療/預(yù)防效應(yīng)。通過所述篩選方法得到的化合物可以已經(jīng)形成鹽。所述鹽可以用生理上可接受的 酸(例如，無機(jī)酸、有機(jī)酸)、堿(例如，堿金屬)等形成的鹽來例證，優(yōu)選生理上可接受的酸 加成鹽。這樣的鹽包括，例如，與無機(jī)酸(例如，氫氯酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)形成的鹽，和 與有機(jī)酸(例如，醋酸、甲酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、 苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的鹽?？梢匀缦路治龃x外源物和/或內(nèi)源底物的酶的活性的增進(jìn)例如，通過將試驗(yàn) 物暴露于細(xì)胞，并檢測代謝外源物和/或內(nèi)源底物的酶的活性的增加、所述酶的量的增加 和/或編碼所述酶的基因的轉(zhuǎn)錄量的增加。具體地，這可能通過檢測PICM-19H或PICM-19B 細(xì)胞中CYP450酶活性的升高、CYP450蛋白含量的增加或CYP450mRNA的增加來實(shí)現(xiàn)。有用 的檢測方法包括普遍已知的技術(shù)，諸如與不同類型的CYP450相對應(yīng)的酶活性的測定、與不 同的CYP450蛋白相對應(yīng)的蛋白印跡技術(shù)、與不同類型的CYP450mRNA相對應(yīng)的RNA雜交技 術(shù)和CYP450特異性的RT-PCR方法?？梢匀缦聹y定由于外源物和/或內(nèi)源底物的代謝引起的肝毒性通過將試驗(yàn)物暴 露于PICM-19H或PICM-19B細(xì)胞，并觀察或測量得到的細(xì)胞毒性，或通過將試驗(yàn)物暴露于 PICM-19細(xì)胞，并隨后將被細(xì)胞改變的試驗(yàn)物施用給另一種肝細(xì)胞或其它靶細(xì)胞類型，并觀 察由此在靶細(xì)胞中造成的變化。
在布達(dá)佩斯條約下，于2008年4月24日，已經(jīng)將在實(shí)施例2和3中得到的 PICM-19H和PICM-19B單能細(xì)胞系分別保藏為細(xì)胞系A(chǔ)TCC PTA-9174和ATCC PTA-9173，保 藏在位于 10801 UniversityBoulevard, Manassas, VA 20110，USA 的美國典型培養(yǎng)物保藏 中心(American Type Culture Collection) (ATCC)。已經(jīng)在確保在本專利申請未決期間可由專利和商標(biāo)局的官員在37 CFR 1.14和35 USC 122下決定批準(zhǔn)的人員得到培養(yǎng)物的條件下，保藏主題培養(yǎng)物。在提交主題申請的副本 或它的子申請的國家，根據(jù)外國專利法的要求可得到保藏物。但是，應(yīng)當(dāng)理解保藏物的可用 性并不構(gòu)成實(shí)踐主題發(fā)明的許可，所述實(shí)踐會破壞政府行為授予的專利權(quán)。此外，根據(jù)微生物保藏布達(dá)佩斯條約的條款，保存主題培養(yǎng)物保藏物并可由公眾 得到，即，在最近一次請求提供保藏物樣品后至少5年的時間段內(nèi)盡一切必要小心地保藏 它們，且在任何情況下，在保藏日之后至少30 (三十)年的時間段或可能造成公開所述培養(yǎng) 物的任何專利的可實(shí)施期間，保持它們存活且不受污染。保藏人承擔(dān)下述責(zé)任由于保藏物 的條件，當(dāng)保藏機(jī)構(gòu)不能應(yīng)請求提供樣品時，更換保藏物。在公開它們的專利授權(quán)后，將不 可取消地去除對主題培養(yǎng)物保藏物的公眾可用性的所有限制。實(shí)施例現(xiàn)在已經(jīng)一般地描述了本發(fā)明，參考某些具體實(shí)施例將更好地理解本發(fā)明，所述 實(shí)施例包括在本文中，僅用于進(jìn)一步解釋本發(fā)明，且無意限制由權(quán)利要求書界定的本發(fā)明 的范圍。實(shí)施例1用于干細(xì)胞培養(yǎng)和篩選實(shí)驗(yàn)的試劑在25cm2組織培養(yǎng)瓶(T25 ；Greiner，F(xiàn)rickenhausen，德國)中培養(yǎng)所有細(xì)胞。胎牛 血清(FBS)和添加鐵的小牛血清購自Hyclone，LoganUT。包括不含Ca++和Mg++的Dulbecco 氏磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA(0.025%胰蛋白酶、0.43mM EDTA)、抗生 素、非必需氨基酸和L-谷氨酰胺的細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自InVitrogen，Gaithersburg, MD。在 受輻照的STO小鼠成纖維細(xì)胞O^RL 1503，美國典型培養(yǎng)物保藏中心，R0ckville，MD)飼養(yǎng) 細(xì)胞層上培養(yǎng)PICM-19H細(xì)胞。通過將STO細(xì)胞懸浮液暴露于8千拉德、輻射，并以6xl04 細(xì)胞/cm2涂布細(xì)胞，制備飼養(yǎng)層。通過每6-7天重新添加10 % DMEM維持STO飼養(yǎng)層。 PICM-19培養(yǎng)物的生長和分化培養(yǎng)基是如Talbot和Paape (1996. Methods in Cell Science 18 :315-327)所述的低葡萄糖DMEM和添加了 10% FBS、2_巰基乙醇和核苷的199培養(yǎng)基的 50 50混合物。傳代后，每2-3天用新鮮培養(yǎng)基重新飼養(yǎng)PICM-19培養(yǎng)物。培養(yǎng)物常規(guī)地 維持在37°C和3-4% CO2氣氛中。從ATCC (馬納薩斯，VA ；CRL-10741)得到H印G2C3A人肝胚細(xì)胞瘤細(xì)胞。在添加了 10% FBSUmM丙酮酸鈉、非必需氨基酸和抗生素的最低必需培養(yǎng)基(MEM)中亞匯合地傳代 細(xì)胞，并在37°C、5% CO2中培養(yǎng)。在第3至12代之間，進(jìn)行使用H印G2C3A細(xì)胞的所有實(shí)驗(yàn)。除非指出，包括黃曲霉毒素Bl、3-甲基膽蒽(3-MC)、利福平(rif)、試鹵靈、苯巴比 妥(PHB)、7_甲氧基試鹵靈(7-MRF)、7_乙氧基試鹵靈(7ERF)和二甲基亞砜(DMSO)在內(nèi)的 所有化學(xué)試劑都從Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO得到。7_甲氧基_4_(三氟甲基) 香豆素(7MFC)和7-芐氧基-4-(三氟甲基)香豆素(7BFC)來自BD Gentest,ffoburn,MA0在該研究中對豬(n = 3)的管理和處理得到了美國農(nóng)業(yè)部動物管理和使用委員 會(Institutional Animal Care and Use Committee of theU. S. Department of Agriculture)的批準(zhǔn)。通過電擊，將雜交豬( 45kg)震暈，并放血。通過以前所述的2 步膠原酶消化操作(Caperna 等人，1985. J. Anim. Sci. 61 :1576-1586 ；Fernandez-Fi gares 等人，2004. Domest. Anim. Endocrinol. 27 125-140)，從左側(cè)肝葉的一部分制備成年豬肝細(xì) 胞。將肝細(xì)胞G.5xl06細(xì)胞)接種進(jìn)用豬尾膠原預(yù)包被的T25燒瓶，并如前所述進(jìn)行培養(yǎng) (Caperna 等人，2005. Domest. Anim. Endocrinol. 29 :582-592)。簡而言之，最初將細(xì)胞維持 在含有胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(ITS ；Sigma)和10% FBS的William氏E培養(yǎng)基中。3h粘 附階段后，洗滌燒瓶以取出未粘附的和未存活的細(xì)胞，并將含有5% FBS和ITS的William 氏E培養(yǎng)基加入每個燒瓶。次日，洗滌燒瓶2次，并將培養(yǎng)基更換為10%DMEM/199。在細(xì) 胞分離和開始培養(yǎng)后約72h，結(jié)束所有實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例2PICM-19H干細(xì)胞系的建立從親代ARS-PICM-19細(xì)胞的T25大量培養(yǎng)物(即約100萬細(xì)胞)建立PICM-19H 細(xì)胞系，在第37代對其進(jìn)行低體溫選擇(33-34°C )約3周。從度過溫度選擇的約50-100 個細(xì)胞衍生出PICM-19H細(xì)胞系。擴(kuò)增成大量培養(yǎng)物后，通過在37_38°C培養(yǎng)，觀察到PICM-19H細(xì)胞系在標(biāo)準(zhǔn)的或 升高的PH培養(yǎng)條件下不會自我構(gòu)成多細(xì)胞膽小管，后者是親代ARS-PICM-19群體的特性 (圖IA和B ；Talbot等人，2002，同上)。相位差顯微鏡檢查顯示，PICM-19H細(xì)胞通常是立 方細(xì)胞，具有清楚的位于中央的細(xì)胞核(圖1B)。象親代ARS-PICM-19細(xì)胞一樣，胎兒肝細(xì) 胞樣的PICM-19H細(xì)胞生長成一片小單層集落，其位于ST0(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞細(xì)胞系) 飼養(yǎng)細(xì)胞之中，但是不象僅達(dá)到約50%匯合的親代細(xì)胞那樣，PICM-19H細(xì)胞在終末分化之 前達(dá)到約85%匯合，且接觸抑制顯著減慢了它們的生長(圖IB和圖2)。為了保持大多數(shù)培養(yǎng)物的細(xì)胞周期，至少每2周傳代PICM-19H培養(yǎng)物是必要的， 親代ARS-PICM-19細(xì)胞也是如此。以1 3至1 10分流比將PICM-19H亞群傳代幾年， 至約P175的目前傳代水平。在它們的傳代歷史中，在不同的時間冷凍保藏PICM-19H細(xì)胞。實(shí)施例3PICM-19B干細(xì)胞系的建立從親代PICM-19細(xì)胞的自發(fā)產(chǎn)生的形態(tài)學(xué)變體開發(fā)出了 PICM-19B細(xì)胞系，所述變 體以低頻率在約第35代培養(yǎng)物中出現(xiàn)(圖3 ；Talbot等人，1994a,同上)。通過該變體細(xì)胞 類型的單個集落的微量移液管介導(dǎo)的集落克隆建立PICM-19B細(xì)胞系。當(dāng)從細(xì)胞的冷凍原 種開始時，在親代PICM-19細(xì)胞的不同傳代水平出現(xiàn)了獨(dú)立的、自發(fā)形成的“PICM-19B樣” 生長暈。PICM-19B細(xì)胞的出現(xiàn)和許多類似的獨(dú)立出現(xiàn)的發(fā)現(xiàn)，表明該形態(tài)學(xué)變體看起來源 自分化并形成膽小管的PICM-19細(xì)胞，而不是源自形成肝細(xì)胞樣細(xì)胞的單層片的PICM-19 細(xì)胞(Talbot等人，1994a,同上)。為了更清楚地解釋這一點(diǎn)，圖3B、C和D說明了該變體 從另一個獨(dú)立的、上胚層-衍生的豬肝細(xì)胞系的起源。首先在親代PICM-19培養(yǎng)物中將“ 19B”表型的出現(xiàn)鑒別為緊密堆積出現(xiàn)的且繞著 中心點(diǎn)或線對稱地堆成柱狀細(xì)胞的細(xì)胞集落(圖3A和B)。所述中心點(diǎn)或線是3維空間，其 通常充滿了在相位差顯微鏡觀察下經(jīng)常具有微黃色的物質(zhì)(圖3A)。隨著細(xì)胞繼續(xù)它們的 生長暈幾周，它們形成細(xì)胞單層，其生長在STO飼養(yǎng)細(xì)胞的上面，或隨著集落擴(kuò)大而“壓倒(bull-doze) ”在集落周圍的飼養(yǎng)細(xì)胞(圖3C和D)。不象親代ARS-PICM-19肝細(xì)胞樣單層， 19B變體細(xì)胞單層不具有在細(xì)胞之間的小管連接。相反，PICM-19B細(xì)胞通過緊密連接部相 連，并顯示出頂?shù)?底外側(cè)的形態(tài)學(xué)極性(圖8)。所述單層經(jīng)常形成穹頂(圖3E和F)，指 示頂至基底的流體運(yùn)輸。另外，在19B變體細(xì)胞單層的某些區(qū)域，特別是存在穹頂?shù)牡胤剑?細(xì)胞至細(xì)胞的聯(lián)合具有典型的“棘細(xì)胞”形態(tài)學(xué)(圖3F)，類似于其中大量橋粒連接將鄰近 細(xì)胞聯(lián)接起來的皮膚上皮(Alberts等人，1994. Molecular Biology of the Cell，第二版， GarlandPublishing，紐約，第 789 和 954-955 頁)。不同于親代ARS-PICM-19細(xì)胞系的終末分化且自我構(gòu)建膽小管細(xì)胞，19B變體細(xì) 胞生長至100%匯合，導(dǎo)致約2. 61xl05細(xì)胞/cm2的終細(xì)胞密度(圖4)。親代ARS-PICM-19 細(xì)胞在終末分化之前從未達(dá)到超過60-75%匯合(Talbot等人，199 ，2002，同上)。另外， 盡管它們具有底外側(cè)極化的單層特征，發(fā)現(xiàn)在胰蛋白酶-EDTA處理后，19B變體細(xì)胞比親代 ARS-PICM-19細(xì)胞更容易彼此離解。以1 5至1 10分流比傳代PICM-19B細(xì)胞系直到 第89代，大于1年的時間段。在它們的傳代歷史中，在不同的時間冷凍保藏PICM-19B細(xì)胞。實(shí)施例4細(xì)胞生長試驗(yàn)通過在傳代后3周時間內(nèi)以2-4天間隔計(jì)數(shù)每個T25燒瓶的總細(xì)胞的增加，測定 了分別在第66和64代的PICM-19H和PICM-19B細(xì)胞生長。在每個時間間隔計(jì)數(shù)一式兩份 T25燒瓶。通過胰蛋白酶-EDTA離解，產(chǎn)生每個燒瓶的內(nèi)容物的單細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞懸 浮于10% DMEM中至2ml總體積，用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過平均16個血球計(jì)數(shù)器正方形(Imm2) 的計(jì)數(shù)，確定每個T25燒瓶的細(xì)胞總數(shù)。在生長試驗(yàn)開始時PICM-19H和PICM-19B細(xì)胞的 數(shù)目的輸入未確定，但是PICM-19H是1 6分流比，PICM-19B是1 12分流比，各自來自 幾乎匯合的儲用培養(yǎng)物。類似地，從沒有接受任何PICM細(xì)胞輸入的飼養(yǎng)細(xì)胞T25燒瓶平行 組，計(jì)數(shù)度過胰蛋白酶/EDTA離解的STO飼養(yǎng)細(xì)胞。PICM-19H細(xì)胞的生長曲線指示傳代后3_5天的延遲期、具有約4 倍增時間的對 數(shù)生長期和分化驅(qū)動的平臺期，在所述平臺期中，每個T25燒瓶達(dá)到的最終細(xì)胞數(shù)是幾乎 400萬細(xì)胞或約1. 49xl05細(xì)胞/cm2 (圖2)。PICM-19B變體細(xì)胞生長至100%匯合，導(dǎo)致約2. 61xl05細(xì)胞/cm2的最終細(xì)胞密 度。對數(shù)生長期中的19B的倍增時間是約48-7池(圖4)。實(shí)施例5超微結(jié)構(gòu)分析；透射電子顯微鏡檢查如前所述(Talbot等人，1998，同上；Talbot 等人，2000. Tissue andCell 32 9-27)，在JFE Enterprises，Brookeville，MD的輔助下，進(jìn)行透射電子顯微鏡檢查(TEM)樣 品制備和顯微照相術(shù)。在從傳代后6周(對于PICM-19H)和傳代后8周(對于已經(jīng)在親代 ARS-PICM-19培養(yǎng)物中自發(fā)形成的PICM-19B樣細(xì)胞)的T25燒瓶培養(yǎng)物加工成的樣品上進(jìn) 行超微結(jié)構(gòu)分析。PICM-19H細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征類似于在親代ARS_PICM_19培養(yǎng)物的肝細(xì)胞樣細(xì) 胞中觀察到的那些(Talbot等人，1996a,同上)?？赡苁歉渭?xì)胞的主要定義的超微結(jié)構(gòu)特征 是，專門的細(xì)胞至細(xì)胞聯(lián)合，其發(fā)生在肝細(xì)胞之間以形成膽小管(Wanson等人，1977. J. Cell Biol. 74 :858-877)。PICM-19H細(xì)胞通過廣泛的質(zhì)膜折疊彼此緊密結(jié)合，所述質(zhì)膜折疊沿著它們的側(cè)表面互相交叉(圖5A)，且經(jīng)常發(fā)現(xiàn)夾在STO飼養(yǎng)細(xì)胞之間(圖5B)。在鄰近的 PICM-19H細(xì)胞的側(cè)頂表面處(即，面向膽小管空間的腔)發(fā)現(xiàn)了極化的上皮細(xì)胞的典型的 連接結(jié)構(gòu)(圖5B)。這些緊密連接樣的聯(lián)合建立了膽小管的不可滲透的邊界，其存在于鄰 近的PICM-19H細(xì)胞之間，如以前已經(jīng)通過釕紅染色所證實(shí)的(Talbot等人，1996a,同上)。 膽小管表面具有許多微絨毛，它們伸出到小管空間中(圖5B)。由PICM-19H形成的膽小管類似于在人胚胎、小豬和嚙齒動物肝的薄切片 中體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的那些(Enzan 等人，1974. Acta Pathol. Jap. 24 :427-447 ;Singh 和 Shahidi. 1987. Ultrastructure of Piglet Liver 見Swine in Biomedical Research, ME. Tumbleson(Ed)，Volume 1，PlenumPress，紐約，第 84 頁；Wanson 等人，同上)，并且，與 親代細(xì)胞一樣，對加入的分泌素或胰高血糖素是有響應(yīng)的，即它們表現(xiàn)出流體進(jìn)入小管的 穿過細(xì)胞的運(yùn)動(未顯示；Talbot等人，2002，同上)。細(xì)胞的核是橢圓形的，且經(jīng)常表現(xiàn)出單個的深內(nèi)陷(圖5A)。糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)在 細(xì)胞中尤其好地呈現(xiàn)，且常見于廣泛的堆疊中，后者圍繞著細(xì)胞的一些線粒體(圖6)。但 是，RER潴泡相對塌陷，指示它們含有相對微小的分泌物。盡管其它PICM-19H和PICM-19B 超微結(jié)構(gòu)特征是肝細(xì)胞或膽管上皮所特有的，在兩種細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的以長板狀潴泡排列的 廣泛的RER卻不是。該特征最象在人胎兒肝的成肝細(xì)胞中報(bào)道的特征，在后者中，存在具有 長潴泡的RER的廣泛的多個帶狀(multi-zonal)集中區(qū)。相反，發(fā)現(xiàn)胎兒和成年膽管上皮細(xì) 胞具有非常少的且短的管狀 RER(Enzan 等人，1974. Acta Pathol. Jap. 24 :427-447. ；Ishii 等人，1989. Physiol. Rev. 69 :708-764 ；Phillips等人，1987.見:The Liver :An Atlas and Text of Ultrastructural Pathology，Phillips 等人，編，Raven Press，紐約，第 1_；35 頁。 在PICM-19H和PICM-19B細(xì)胞的對比中，該特征不明顯，因此，象親代ARS-PICM-19細(xì)胞一 樣，它可能指示衍生的細(xì)胞系都根本不同于體內(nèi)胎兒肝細(xì)胞(因?yàn)轶w外環(huán)境)，或它們?nèi)匀?顯示出與成肝細(xì)胞(其在合適的環(huán)境下可以“成熟”)類似的過渡形態(tài)學(xué)。光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)看起來也存在于所述細(xì)胞中，但是難以確定地與高爾基復(fù)合體區(qū)分 開。常見于核上位置的高爾基復(fù)合體發(fā)育良好且眾多(圖6)。線粒體在縱切面中伸長 (2-3 μ m長)，且在橫切面中是橢圓形(0. 2-0. 3 μ m直徑)(圖6)。它們的板層狀嵴特征性 地橫貫線粒體，且密電子顆粒有時存在于它們的基質(zhì)中。許多過氧化物酶體樣細(xì)胞器也遍 布于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，盡管沒有證實(shí)它們作為過氧化物酶體的鑒別。在PICM-19H細(xì)胞中經(jīng) 常觀察到細(xì)胞質(zhì)的相對“空的”區(qū)域，其中存在殘余的糖原樣顆粒(圖7)。推測它們是糖原 儲存的區(qū)域，不充分的糖原玫板固定作用會導(dǎo)致它們大部分消失。最后，在檢查的PICM-19H 細(xì)胞中沒有觀察到單纖毛。PICM-19B細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)顯示了肝膽上皮(膽管上皮細(xì)胞)或膽囊上皮的更典 型的特征。不同于PICM-19H細(xì)胞，PICM-19B細(xì)胞形互相交叉細(xì)胞的單層，其具有清楚的基 底/頂極化，但是沒有小管形成，即細(xì)胞以具有緊密連接部的連續(xù)上皮片層排列，如通過穹 頂形成所證實(shí)的(圖1和8B)。中等的、均勻高度(0. 4-0. 6 μ m)的微絨毛存在于細(xì)胞的頂 表面上(圖8A和8C)。微絨毛具有特別清楚的內(nèi)部肌動蛋白絲，它們深入到下面的細(xì)胞質(zhì) 中，然后連接粘著帶肌動蛋白絲，后者與頂細(xì)胞質(zhì)表面平行。緊密連接部元件和橋粒將細(xì)胞 在它們的頂和側(cè)聯(lián)合處連接到一起，且指間隙細(xì)胞質(zhì)折疊也是側(cè)細(xì)胞表面所常見的(圖8A 和8C)。所述細(xì)胞也具有眾多且發(fā)育良好的核周高爾基體，且在細(xì)胞核和頂細(xì)胞膜之間的細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)常觀察到分泌小泡(圖9和8A)。在電子密度方面，分泌小泡的內(nèi)容物通常類似 于周圍細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)容物或比后者更深，且是膽囊上皮的含有粘蛋白(muscin)的小泡的特 征(Gilloteaux 等人，1997. Microsc. Res. Tech. 38 :643-659)，它們經(jīng)常含有離心地定位的 稠密小球(圖8A)。所述細(xì)胞顯示出纖毛，盡管罕見，而因此所述細(xì)胞可能是單纖毛的(圖 9)。在PICM-19H超薄切片的電子顯微鏡檢查中沒有觀察到纖毛，但是在PICM-19B細(xì) 胞的頂表面上觀察到，大部分可能是單纖毛。在人成肝細(xì)胞或小豬肝細(xì)胞中尚未發(fā)現(xiàn)纖毛 (Enzan等人，同上；Singh和Siahidi，同上)。相反，證實(shí)了單纖毛的存在是胎兒人、新生豬 和成年大鼠膽管上皮細(xì)胞(Enzan等人，同上；Ishii等人，同上；Singh和Siahidi，同上) 或膽囊上皮細(xì)胞(Nakanuma等人，1997. Microsc. Res. Tech. 39 :71-84)的特有特征。因此， 在PICM-19H細(xì)胞和PICM-19B細(xì)胞上分別缺少和存在單纖毛，與PICM-19H細(xì)胞在表型上更 是肝細(xì)胞樣和PICM-19B細(xì)胞更是膽管樣或膽囊上皮樣相一致。類似于過氧化物酶體的膜結(jié)合的小體在PICM-19B細(xì)胞中為數(shù)眾多，且有些在它 們的內(nèi)部具有棱晶形平行板樣的結(jié)構(gòu)(圖10)。另外，具有板層狀嵴的線粒體為數(shù)眾多，且 有時被發(fā)現(xiàn)含有一個或多個顆粒，所述顆粒明顯地隨機(jī)分布于它們的基質(zhì)中(圖11)。在 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了光滑和糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)，盡管前者難以與存在的許多高爾基復(fù)合體區(qū)分開 (圖11)。RER有時出現(xiàn)在廣泛的堆疊中，盡管它們的潴泡相對塌陷，指示它們含有相對微小 的分泌物。如在PICM-19H培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的，在STO飼養(yǎng)細(xì)胞和PICM-19B細(xì)胞之間明顯存 在膠原纖維基質(zhì)，推測已經(jīng)由STO成纖維細(xì)胞生成。但是，不同于PICM-19H培養(yǎng)物，STO飼 養(yǎng)細(xì)胞大部分位于PICM-19B細(xì)胞單層的下面(圖8B)。最后，在PICM-19B細(xì)胞的基底膜的 下面可以辨別出薄的基板(圖10)。實(shí)施例6γ -谷氨?；D(zhuǎn)肽酶(GGT)活性和CYP450含量的測定將PICM-19H和PICM-19B細(xì)胞的T25培養(yǎng)物在傳代后培養(yǎng)約3周，刮下并收獲培養(yǎng) 物，用于全細(xì)胞勻漿和微粒體。在收獲之前2天，將培養(yǎng)物暴露于美替拉酮，以刺激CYP450 表達(dá)。如前所述(Talbot等人，1996，同上)，從一組3個燒瓶測定CYP450含量和GGT活性。在測定之前已經(jīng)暴露于美替拉酮48h的PICM-19H和PICM-19B細(xì)胞的微粒體級 分中存在CYP450(表1)。相反，在沒有暴露于美替拉酮的PICM-19細(xì)胞培養(yǎng)物勻漿中不可 檢出CYP450(數(shù)據(jù)未顯示)。在相同條件下培養(yǎng)的并用美替拉酮處理過的STO飼養(yǎng)細(xì)胞的 粗勻漿和微粒體級分不具有可檢測的CYP450含量。因?yàn)榕cSTO細(xì)胞有關(guān)的微粒體蛋白代 表收獲的總微粒體蛋白中的超過1/3，PICM-19H和PICM-19B細(xì)胞中CYP450的實(shí)際比含量 (nmol/mg/蛋白)大于報(bào)道值。還將PICM-19B CYP450含量與新鮮收獲的豬肝細(xì)胞進(jìn)行對 比(表1)，結(jié)果表明，該細(xì)胞系含有新鮮收獲的成年豬肝細(xì)胞的CYP450的約1/6。通過組織化學(xué)染色，在PICM-19H和PICM-19B細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了 GGT活性。PICM-19H GGT活性在PICM-19H單層中可見的膽小管中特異性地表達(dá)(圖12)，而在PICM-19B細(xì)胞 中，GGT染色擴(kuò)散，且與所有細(xì)胞結(jié)合(圖13)。還在培養(yǎng)了 3-4周的PICM-19H和-19B細(xì) 胞的勻漿中測量了 GGT活性(表1)。在PICM-19B細(xì)胞中的總GGT活性明顯高于在新鮮收 獲的豬肝細(xì)胞或PICM-19H細(xì)胞的勻漿中發(fā)現(xiàn)的活性(表1)。當(dāng)在與PICM-19細(xì)胞相同的 條件下單獨(dú)培養(yǎng)時，STO飼養(yǎng)細(xì)胞勻漿表現(xiàn)出非常低的或沒有GGT活性(未報(bào)道)。報(bào)道的PICM-19中的GGT特異性活性、總GGT因此被低估，因?yàn)榧s2/5的細(xì)胞培養(yǎng)物勻漿蛋白是 源自STO飼養(yǎng)細(xì)胞的。PICM-19B細(xì)胞的GGT活性是新鮮收獲的豬肝細(xì)胞制備物的84倍。 PICM-19B細(xì)胞的GGT活性是PICM-19H細(xì)胞的約6倍(表1)。
表1. PICM-19H、PICM-19B和成年豬肝細(xì)胞中的CYP450水平和GGT活性
CYP450GGT
細(xì)胞類型(pmol/mg ■體蛋白)(m單位/mg蛋白) PICM-19H PICM-19B 成年豬肝細(xì)胞 (新鮮制備的)
*136 土 35 (n=3) *#BD (n=2) 617 ± 47 (n=4)
51.2 士 1.7 (n=9) 311.9 土 9·4 (η=9) 3.7 土 0.4 (η=4)*加入美替拉酮后48小時#BD:低于檢測GGT在膽管上皮中高表達(dá)，且被視作該細(xì)胞類型的良好標(biāo)志物(Tanaka，Μ. 1974. Acta. Path. Jpn. M :651-665 ; Ishi i等人，同上)。以前，通過組織化學(xué)染色證實(shí)了親代 ARS-PICM-19細(xì)胞具有GGT活性，其局限在它們的膽小管的質(zhì)膜中，如已經(jīng)在原代肝細(xì)胞 培養(yǎng)物中所發(fā)現(xiàn)的(Meister 等人，1976.見The Enzymes of BiologicalMembranes, Martinosi, Α.(編)，Plenum，紐約，第 315-347 頁；Talbot 等人，1996a，同上)。如本文所 證實(shí)的，PICM-19H細(xì)胞具有類似的表達(dá)模式(圖12)。相對比，PICM-19B細(xì)胞具有更穩(wěn)健的GGT表達(dá)(表1)和當(dāng)用顯微鏡觀察時看起 來到處存在的GGT表達(dá)。這種全細(xì)胞表面組織化學(xué)GGT染色可能源自與PICM-19B細(xì)胞的 頂膜有關(guān)的GGT表達(dá)，后者在方向上與顯微圖像的焦面平行。大多數(shù)PICM-19H細(xì)胞看起來 缺少GGT染色，因?yàn)榫窒拊谀懶」?，且可能它不局限在所有膽小管，也因?yàn)樾」茉赑ICM-19H 單層內(nèi)構(gòu)成離散的側(cè)面至側(cè)面的極化。GGT的這種極性分布指示了肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞 的專門化頂區(qū)域中酶的運(yùn)輸功能(Meister等人，同上)。PICM-19B的增強(qiáng)的GGT表達(dá)和相 反地在PICM-19H中發(fā)現(xiàn)的相對低的表達(dá)，也是更膽管樣或膽囊上皮樣表型(對于PICM-19B 細(xì)胞)和更肝細(xì)胞樣表型(對于PICM-19H細(xì)胞)的指示。實(shí)施例7CYP450ER0D 活性試驗(yàn)用在培養(yǎng)基中的5μ M 3-甲基膽蒽(3-MC)預(yù)溫育PICM-19H和PICM-19B細(xì)胞的 3個幾乎匯合的Τ25燒瓶培養(yǎng)物48h，以誘導(dǎo)CYPAl活性。通過EROD試驗(yàn)，即通過7-乙氧 基試鹵靈(7-ERF)向高熒光產(chǎn)物試鹵靈的轉(zhuǎn)化，測量PICM-19H細(xì)胞、PICM-19B細(xì)胞、親代 ARS-PICM-19細(xì)胞和單獨(dú)的STO飼養(yǎng)細(xì)胞中的3-MC誘導(dǎo)的CYP450活性(圖14)。如Donato 和同事(1993. Anal. Biochem. 213 :29-33)所述，將細(xì)胞暴露于培養(yǎng)基199培養(yǎng)基30min，后 者含有Hank氏鹽，不含有L-谷氨酰胺或碳酸氫鈉，且含有7-ERF (8 μ Μ)、雙香豆素(10 μ Μ) 和牛血清白蛋白。收獲培養(yǎng)基，并在有和沒有β -葡糖醛酸糖苷酶/芳基硫酸酯酶(Roche Applied Science^Marmhein，德國)存在下，測定熒光產(chǎn)物試鹵靈的濃度，以測定可能的綴合反應(yīng)的程度。所有試劑都來自Sigma-AldrichGt.LouisJO)，并將活性表示為用和不用 3-MC制備的培養(yǎng)物中每30min/mg細(xì)胞蛋白形成的pmol產(chǎn)物。還測定了僅STO飼養(yǎng)細(xì)胞的 T25燒瓶，作為它們在PICM-19培養(yǎng)物中的存在的對照。以約^cl(fpmol/30min/mg細(xì)胞蛋白的速率，PICM-19H細(xì)胞將7-ERF轉(zhuǎn)化成試鹵 靈。在PICM-19B細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了誘導(dǎo)的EROD活性，但是它的水平與在PICM-19H細(xì)胞中測 得的相比降低了約50%。ARS-PICM-19親代細(xì)胞僅具有比PICM-19B細(xì)胞有限的更高的試 鹵靈生成速率。STO飼養(yǎng)細(xì)胞沒有顯示出可檢測的CYP450活性。當(dāng)沒有通過暴露于3-MC 進(jìn)行誘導(dǎo)時，所有PICM-19細(xì)胞培養(yǎng)物中的EROD活性都低于檢測水平(未顯示)。當(dāng)暴露于3-MC48h時，PICM-19H細(xì)胞表現(xiàn)出比PICM-19B細(xì)胞和親代ARS_PICM_19 細(xì)胞更高的可誘導(dǎo)的CYP450含量。類似地，通過7-ER向試鹵靈的轉(zhuǎn)化測得的CYP450活 性，在PICM-19H細(xì)胞中也更高(圖14)。PICM-19H細(xì)胞中誘導(dǎo)相對大量的CYP450的能力 與肝表型相一致(Murray 等人，1987. Gastroenterology 93 :141-147 ；Brill 等人，1993. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 204 =261-269)，而在PICM-19B細(xì)胞中看到的更低的量指示該細(xì)胞 傾向于膽管上皮細(xì)胞特有的表型(Sirica，A. E. 1992. Progress in Liver Diseases 10: 63-87 ；Alpini ^Α 1994. The Biology of Biliary Epithelia.見The Liver :Biology and Pathobiology, Arias 等)κ (編)，Raven Press, 第 623-653 M ；Talbot 等)κ, 1998，同上)。在親代ARS-PICM-19細(xì)胞系中，以前提出CYP450水平可能取決于交替分化的 表型的相對比例和程度，即肝細(xì)胞單層分化的細(xì)胞具有比分化成膽小管的PICM-19細(xì)胞更 高的CYP450活性(Talbot等人，1996a，同上)。因而，與相同細(xì)胞數(shù)目的親代ARS-PICM-19 細(xì)胞系相比，PICM-19H細(xì)胞系中膽小管分化表型的缺失可以提高這些培養(yǎng)物的總CYP450 活性，因?yàn)闆]有PICM-19H細(xì)胞分化形成膽小管，后者與肝細(xì)胞相比大量缺少CYP450活性 (Sirica,同上；Alpini 等人，同上；Talbot 等人，1998，同上)。實(shí)施例8條件培養(yǎng)基的二維電泳分析；蛋白的質(zhì)譜分析如前所述(Talbot等人，1996，同上)，將PICM-19H或PICM-19B細(xì)胞接種進(jìn)T25 燒瓶并培養(yǎng)。在傳代后約2周取出培養(yǎng)基，用無血清的DMEM培養(yǎng)基沖洗燒瓶4次以去除 FBS相關(guān)的蛋白，并在無血清的DMEM中培養(yǎng)燒瓶48h。收集條件培養(yǎng)基(CM)，并通過 在 500xg離心15min沉淀細(xì)胞碎片。如前所述(Talbot等人，2007. In Vitro Cell dev. Biol. Anim. 43 :72-86)，通過等電點(diǎn)聚焦?jié)饪s和分離CM的蛋白。也如前所述(Talbot等 人，2007，同上)，在10%聚丙烯酰胺凝膠(8x10cm)上進(jìn)行二維分離。通過膠態(tài)考馬斯藍(lán) g-250 (Gradipure ；Life Therapeutics，F(xiàn)renchs Forest，Australia)染色，使凝膠中 的蛋白顯影，并使用激光密度測定法(PDSI，GE Healthcare)掃描凝膠。類似地分析來自單 獨(dú)的STO飼養(yǎng)細(xì)胞的CM，作為它們在PICM-19培養(yǎng)物中的存在和FBS相關(guān)的蛋白的對照。使用標(biāo)準(zhǔn)的吸管頭從二維凝膠切下蛋白斑點(diǎn)，并如前所述(Talbot等人，2007，同 上)處理凝膠“栓”。使用運(yùn)行在陽離子反射器模式的Voyager DE-STR MALDI-TOF質(zhì)譜 儀(Applied Biosystems, Framingham, ΜΑ)分析胰蛋白酶處理過的肽，并用運(yùn)行在20Hz的 337nm氮激光器的75射擊獲取波譜。使用在m/z 842. 51和2，211. 10的胰蛋白酶自溶峰作 為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品來校正波譜。由PICM-19H細(xì)胞4 調(diào)節(jié)的無血清培養(yǎng)基的分析表明，該細(xì)胞系正在分泌一系列蛋白，類似于在胎豬血清中發(fā)現(xiàn)的那些(圖15A)。在單獨(dú)的STO飼養(yǎng)細(xì)胞中沒有看到分泌 (未顯示；Talbot 等人，1994，2000a, 2005，同上)。通過 MALDI-T0F 和 LC-MS/MS 質(zhì)譜法鑒 別出了幾個蛋白斑點(diǎn)。鑒別的血清蛋白包括α-2-HS-糖蛋白前體(胎球蛋白-A)、轉(zhuǎn)甲狀 腺素蛋白、白蛋白、甲胎蛋白(AFP)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、載脂蛋白-Al和視黃醇結(jié)合蛋白(圖15A和 表2)?？捡R斯藍(lán)總蛋白染色表明，轉(zhuǎn)鐵蛋白、AFP、α-1-抗-胰蛋白酶和胎球蛋白-A是最 豐富地分泌的蛋白。表2.通過MALDI-TOF和LC-MS/MS在PICM-19H細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中鑒別出的血清蛋白
斑點(diǎn)
編號MWPI1769186.932471645.543685805.474384245.5 5157926346693665.927303125.388211425.69208855.8310277466.59
蛋白ID
鏈A,猜血清g蛋白 α-Ι-Μ蚤白酶丨拷J 甲臉蛋白丨豬]
α-2-HS-糖蛋白(麻球蛋白-A) 轉(zhuǎn)甲;yum素蛋白(前白蛋白)丨諸] 白蛋白丨拷J 栽脂蛋白A-I 視黃酵結(jié)M白(Rbp) α-l-酸賊蛋白
肽SCMO預(yù)期值NCBIID方法1723%1196.10E-07gi|18655907Maldi Tof720%840.0018gi|975230Maldi Tof1014%1004.90E-05gi|47523700Maldi Tof412%268gi|231467MS/MS658%380gi|975233MS/MS1526%1523.50E-10gi|833798Maldi Tof1654%2204.90E-17gi|164359Maldi Tof211%88gi|2914422MS/MS527%690.068gi|164302Maldi Tof837%1051.80E-05gi|1705760Maldi Tof
MW:預(yù)測的分子量;PI:預(yù)測的等電點(diǎn)；肽匹配的肽的數(shù)目；SC:序列度蓋的百分比;MO: MOWSE評分；預(yù)期值 預(yù)期單獨(dú)偶然發(fā)生的具有相等或更好的評分的匹配的數(shù)目(http://www.matrixscience.com); NCBI:登錄號;ID方法:質(zhì)譜法 鑒別方法。最佳匹配的指定的蛋白給出了已經(jīng)鑒別出的它的物種和它的登錄號.
〔0122
〔0127〕 PICM-19B Os . , Siwimm^lfeim -Al ^siwf mm Si ( M 15s。
21
Oz 102099463 A
^SM^ 100/
因而，在2種衍生的PICM-19細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的最顯著的差異可能是它們的血清 蛋白生成。肝細(xì)胞的血清蛋白生成是僅被一種其它細(xì)胞類型所共有的定義特征，所述 細(xì)胞類型是早期哺乳動物胚胎的胚胎外內(nèi)臟內(nèi)胚層細(xì)胞(Junqueira等人，1992. Basic Histology, Appleton 和 Lange，Norwalk, CT,第 406 頁；Talbot 等人，2007，同上)。因此， PICM-19H細(xì)胞系保留了該肝細(xì)胞功能(如在親代ARS-PICM-19細(xì)胞系中所發(fā)現(xiàn)的；Talbot 等人，1994a,同上)，且在PICM-19B細(xì)胞系中極大降低，PICM-19H細(xì)胞系是肝細(xì)胞樣的，而 PICM-19B細(xì)胞系則不是。實(shí)施例9氨清除和尿素生成試驗(yàn)將PICM-19H或PICM-19B的3個幾乎匯合的T25燒瓶培養(yǎng)物暴露于無谷氨酰胺的 Williams-Ε培養(yǎng)基72h，后者添加了 10% FBS、ImM鳥氨酸、胰高血糖素(lOOng/ml)、2_巰基 乙醇(0. ImM)、HEPES(25mM)和抗生素。然后將細(xì)胞暴露于相同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基48h，后者添加 了 12 μ mol氯化銨(終濃度=2mM)。收集培養(yǎng)基，并在2000xg離心以去除細(xì)胞碎片，并在分 析之前在_80°C冷凍。使用為用于微孔板讀數(shù)器而改良的商業(yè)試劑盒(Pointe Scientific, Inc.，Canton，MI，USA)，采用分光光度計(jì)測定實(shí)驗(yàn)(48h)和起始(Ttl)培養(yǎng)基樣品的氨含量。 在不含氨的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。也測定了僅STO飼養(yǎng)細(xì)胞的T25燒瓶，以對照它 們在PICM-19培養(yǎng)物中的存在。PICM-19H細(xì)胞能在約24h內(nèi)徹底地清除加入T25培養(yǎng)物的細(xì)胞培養(yǎng)基中的氨(圖 16)。ARS-PICM-19親代和PICM-19B細(xì)胞也幾乎能做到(圖16)。所有PICM-19細(xì)胞系從 加入的氨生成尿素，其中PICM-19H將36%的加入的氨氮轉(zhuǎn)化成尿素氮，PICM-19親代和 PICM-19B分別達(dá)到35%禾Π 30%轉(zhuǎn)化。2個PICM-19衍生細(xì)胞系之間的明顯差異是它們的尿素總生成量。按照在特異性 活性基礎(chǔ)上生成的尿素的絕對量，PICM-19H的生成量超過PICM-19B的2倍(圖16)。單獨(dú)的 STO飼養(yǎng)細(xì)胞既不能清除加入的氨，也不能生成尿素(圖16)。在氮轉(zhuǎn)化百分比的基礎(chǔ)上響 應(yīng)于加入2mM氨的尿素生成沒有在細(xì)胞系之間表現(xiàn)出顯著不同。這表明，從氨生成尿素的 代謝機(jī)制在PICM-19B細(xì)胞中是完整的，但是它以更低的總速率運(yùn)行。由于普遍接受的是， 膽管上皮不會生成尿素，且這是肝細(xì)胞的功能(Triebwasser和Freedland. 1977. Biochem. Biophys. Res. Commun.76 1159-1165 ；Jungermann 禾口 Katz,1989. Physiol.Rev.69 708-764 ；Sirica,同上；VanEyken 和 Desmet. 1993. Bile Duct Cells.見Molecular and Cell Biologyof the Liver, LeBouton, A. V.(編)，CRC Press, Baton Raton, Forida,第 475-524頁；Alpini等人，同上)，該發(fā)現(xiàn)沒有支持PICM-19B細(xì)胞作為膽管或膽囊上皮的分 類。可能象膽“橢圓形細(xì)胞”或推定的兼性肝干細(xì)胞一樣(Newsome等人，2004. Curr. Top. Dev. Biol. 61 :1-28 ；Sigal 等人，1992. Am. J. Physiol. 263 :G139_148)，PICM-19B 細(xì)胞表現(xiàn) 出橫跨肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的功能的可塑性。實(shí)施例10CYP450PICM-19H細(xì)胞的誘導(dǎo)；誘導(dǎo)的I期和II期活性的測定在PICM-19H細(xì)胞中研究了幾種CYP450酶活性，以測定重要的CYP450亞型的存在 和可誘導(dǎo)性質(zhì)。將無熒光的底物加入到PICM-19H細(xì)胞的培養(yǎng)物中(圖17)，其作為未誘導(dǎo) 的對照(含有PBS或0. 1 % DMS0)或誘導(dǎo)的培養(yǎng)物，后者如在實(shí)施例7中和下文所述，分別用5μΜ 3-MC、50yM利福平(rif)或ImM苯巴比妥(PHB)溫育48h，以誘導(dǎo)CYP4501A、3A和 2。將利福平和3-MC儲液溶于DMSO (0. 1 %終濃度)中，并將PHB溶于PBS中，在生長培養(yǎng)基 中稀釋至上述終濃度；按照指示進(jìn)行溶劑誘導(dǎo)對照。用PBS洗滌細(xì)胞，并加入適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)物 培養(yǎng)基48h，然后試驗(yàn)。在傳代后培養(yǎng)3周的PICM-19H細(xì)胞的T25培養(yǎng)物中評估CYP450活性。分別在原 代培養(yǎng)3天后和傳代后1周或接近匯合時，測試APH或H印G2C3A細(xì)胞的T25培養(yǎng)物。用誘 導(dǎo)劑3-MC、利福平、PHB或DMSO(作為載體對照)處理細(xì)胞培養(yǎng)物48h。開始誘導(dǎo)后，洗滌細(xì) 胞，并添加CYP1A1、CYP1A2、CYP2或CYP3A的無熒光底物(分別是7_ERF、7_MRF、MFC和BFC)。 最終的溫育條件基本上如Donato等人所述(1993，同上；2004. Drug Metab. Dispos. 32 699-706)，使完整細(xì)胞代謝底物30min (對于7-MRF和7-ERF)和60min (對于MFC和BFC)。收 集培養(yǎng)基樣品，離心以去除細(xì)胞碎片(14，OOOxgJmin)，并在分析前在-80°C冷凍。將培養(yǎng) 基樣品的等分部分加入到96孔平板中，并測定熒光產(chǎn)物的濃度(Donato等人，1993，2004， 同上)。簡而言之，在有或沒有β-葡糖醛酸糖苷酶/芳基硫酸酯酶(15FiShman/120Roy 單位/ml，R0Che AppliedSciences)的情況下，在37°C在pH 4. 5醋酸鹽緩沖液中溫育樣品 2h，以釋放通過硫酸酯化或葡萄苷酸化II期綴合反應(yīng)已經(jīng)綴合的任何熒光反應(yīng)產(chǎn)物。與實(shí) 驗(yàn)培養(yǎng)基樣品同樣地處理標(biāo)準(zhǔn)曲線包含的試鹵靈或7-HFC。在HTS 7000平板讀數(shù)器中測定 熒光；試鹵靈和7-HFC的激發(fā)/發(fā)射濾光片對分別是530/590和410/510。為了測定相對 綴合活性，還直接測定了熒光，沒有首先在葡糖醛酸糖苷酶/芳基硫酸酯酶中溫育。由 于試鹵靈和7-HFC的綴合形式是無熒光的，直接和間接熒光測量之間的差異代表已經(jīng)被綴 合酶修飾的產(chǎn)物的量。在用NaOH溶解TCA沉淀的物質(zhì)后，通過改良的Lowry方法(Nerurkar等人， 1981. Quantification of selected Intracellular and SecretedHydrolases of Macrophages.見Manual of Macrophage Methodology. Herscowitz 等人(Marcel Dekker, Inc.編，紐約，NY，第M9-247頁)測定通過超聲處理制備的細(xì)胞勻漿中的蛋白。牛血清白 蛋白(A6003，Sigma)用作標(biāo)準(zhǔn)品。CYP450 CYP IA活性。在本文中定義為甲氧基試鹵靈_0_脫甲基酶(MROD)活性 的CYP1A2活性，主要負(fù)責(zé)將環(huán)境致癌物(例如，多環(huán)芳香烴)代謝成它們的致癌的DNA結(jié) 合形式(Shimizu 等人，2000. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97 :779-782)。MROD 活性在未誘導(dǎo) 的PICM-19H培養(yǎng)物中和在與PHB和Rif —起溫育的那些中較低，而在暴露于3-MC的那些 中，測得5. 5倍誘導(dǎo)的活性(圖17)。在本文中定義為乙氧基試鹵靈-0-脫乙基酶(EROD) 活性的CYPlAl活性負(fù)責(zé)代謝環(huán)境致癌物，在肝中高度表達(dá)，且占人肝CYP450含量的 13% (Shimada等人，同上)。EROD活性在未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中和在與Rif—起溫育的那些中較低， 而與PHB和3-MC 一起溫育分別導(dǎo)致7和198倍活性增加(圖17)。CYP450CYP2活性。通過加入PHB誘導(dǎo)的并通過無熒光的MFC向熒光化合物7-HFC 的轉(zhuǎn)化定量的特異性活性，可歸因于CYP2超家族的幾個成員。在本文中稱作甲氧基三氟甲 基香豆素脫甲基酶(MF⑶)的CYP2亞型的活性由某些外源物和巴比妥酸鹽家族藥物的成員 誘導(dǎo)。在PICM19H細(xì)胞中，PHB、Rif和3-MC同樣地誘導(dǎo)MFCD活性(圖17)。CYP450CYP3A活性。在人類中，CYP3A4負(fù)責(zé)被CYP代謝的所有藥物的約50 % (Bertz和Grarmeman，1997)。除了它在外源物代謝中的作用以外，CYP3A4在幾種內(nèi)源類固醇激素的生物合成中也是重要的，且據(jù)報(bào)道，其占總?cè)烁蜟YP的約30-40% (Shimada等人， 同上)。無熒光的底物7-芐氧基-4-三氟甲基香豆素(7-BFC)向熒光化合物7-羥基4-三 氟甲基-香豆素(7-HFC)的轉(zhuǎn)化被用于定量地測量脫芐基(BTOD)活性。用Rif和PHB誘 導(dǎo)BFCD導(dǎo)致與未誘導(dǎo)的對照相比活性增加約50%，而3-MC孵育與5. 8倍的誘導(dǎo)有關(guān)(圖 17)。實(shí)施例11睪酮代謝物的液相色譜法-質(zhì)譜法睪酮被幾種CYP450同工酶羥基化，產(chǎn)生不同的代謝物衍生物(Watanabe等人， 1997. J. Mass Spectrom Soc. Jpn. 45 :367-375 ;Donato 等人，1999，同上)。用 0. 1 % DMSO 或50uM財(cái)￡處理？扣11-19!1細(xì)胞4811，然后暴露于25(^11睪酮(Sigma) lh。通過乙腈沉淀 (1 1 八在冰上，151^11)，然后在10，000秘離心，從樣品去除蛋白。在隊(duì)下在37°C干燥 上清液，然后以1 2的起始培養(yǎng)基上清液，重新懸浮于1 1乙醇MAF溶液(25%甲 醇、75% 2mM 醋酸銨、0. 05% 甲酸)。使用 Alliance 2695 分離模型(Waters，Beverly, ΜΑ) 分離樣品，其中使用Symmetry C18柱(3. 5 μ m，2. 1x100mm，具有2. IxlOmm保護(hù)柱，其含有 相同的填料(Waters))。起始流動相是40%溶劑A^nM醋酸銨、0. 05%甲酸)和60%溶劑 B (甲醇)。從O至IOmin運(yùn)行線性梯度，達(dá)到100%溶劑B，保持;3min，流速OJmLmirT1。使 用在正模式的配有電噴射電離源的Ultima API-US, Quadrupole-Time of Flight(Q-TOF) 質(zhì)譜儀(Waters)，以表征分離的代謝物。毛細(xì)管電壓是2. 60kV(T)，碰撞能量10eV，錐電壓 35V,來源和去溶劑化溫度分別是120和350°C。錐和去溶劑化氣流分別是40和SOOLh—1。從 Steraloids, Inc. (Newport,RI)得到睪酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)品。基于并行運(yùn)行的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算化 合物的濃度，累加離子化的親本和2個片段的峰面積。使用LC/MS分析來鑒別和定量對照和Rif處理過的PICM-19H培養(yǎng)物中的3種睪 酮代謝物(6 β 0ΗΤ,2 α OHT和2 β 0ΗΤ)(圖18)。生成每種代謝物的未誘導(dǎo)的活性水平相對 較低(< 0. 08umol/mg蛋白/小時)，而Rif誘導(dǎo)與分別與6 β 0ΗΤ,2 α OHT和2 β OHT的生 成速率的14. 7,8. 3和11倍增加有關(guān)(圖18)。盡管未誘導(dǎo)的PICM-19H培養(yǎng)物中的睪酮代謝是可忽略的，Rif處理與羥基化代謝 物形成的大于10倍誘導(dǎo)有關(guān)。如在PICM-19H細(xì)胞中證實(shí)的，也已經(jīng)證實(shí)了豬肝微粒體和新 鮮的豬肝細(xì)胞會生成6 β-羥基化，作為主要的羥基化物質(zhì)(Donato等人，1999)。PICM-19H 細(xì)胞中2 α -和2 β -羥基化活性的相對高的誘導(dǎo)也是顯然的。令人感興趣地，與Rif —起 溫育的PICM-19H細(xì)胞代謝的天然底物(睪酮)比人工底物MFC和BFC大2_3個數(shù)量級，表 明Rif實(shí)際上能夠相對于基線水平誘導(dǎo)高水平的CYP3A活性。實(shí)施例12EROD和BCFD活性與其它肝細(xì)胞類型的對比制備了成年豬肝細(xì)胞(APH)和H印G2C3A細(xì)胞的單層培養(yǎng)物，并在分別用3_MC和 Rif誘導(dǎo)4 后，將EROD和BCFD活性與PICM-19H培養(yǎng)物進(jìn)行對比。另外，我們還通過評 價(jià)在用β-葡糖醛酸糖苷酶/芳基硫酸酯酶處理之前和之后觀察到的熒光活性的程度，對 比了不同細(xì)胞培養(yǎng)物之間的II期活性的相對量。如預(yù)期的，APH的原代培養(yǎng)物表現(xiàn)出高水 平的可誘導(dǎo)的EROD和BTOD活性(圖19)。PICM-19H細(xì)胞中的最大誘導(dǎo)的EROD和BTOD活 性分別是APH中的30 %和43 %，而在H印G2C3A細(xì)胞中，EROD活性是APH的7 %，且BFCD活性是不可檢測的。也評價(jià)了 STO細(xì)胞的EROD和BTOD (圖19)和其它CYP450活性，且在所 有情況下，已經(jīng)證實(shí)不存在可檢測的活性(未顯示)?？傊瑢τ赑ICM-19H和APH而言，綴 合或II期活性了類似于基于試鹵靈和香豆素的底物(分別是> 50%和> 95%綴合)(圖 20)。CYP450限于在H印G2C3A細(xì)胞中的EROD活性，且僅20%的試鹵靈被測得為綴合形式。PICM-19H細(xì)胞中的特異性底物代謝的誘導(dǎo)包括EROD、MROD、MTOD和BTOD ；這最少 分別與CYPlAl、CYP1A2、CYP2和CYP3A活性相關(guān)聯(lián)。3-MC在使用的濃度誘導(dǎo)了所有這些特 異性的活性。相反，PHB誘導(dǎo)了 ER0D，且在更低的程度上誘導(dǎo)了 BTOD和MTOD活性。證實(shí)了 利福平會特異性地誘導(dǎo)MFCD和BFCD以及睪酮羥基化活性。在本研究中，用3-MC和Rif分別誘導(dǎo)了 EROD和BTOD，并在新鮮制備的ΑΡΗ、確切 表征的人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系、HepG2C3A和PICM-19Η細(xì)胞之間對比了活性。與在APH細(xì)胞中發(fā) 現(xiàn)的誘導(dǎo)的CYP450活性相比，PICM-19H具有約30%和43%的EROD和BFCD活性。相反， 這些活性在H印G2C3A細(xì)胞中較低至不存在。這些結(jié)果不是令人意外的。首先，與APH相 比，PICM-19H培養(yǎng)物是肝細(xì)胞的“原初”群體，因?yàn)樗鼈儧]有持續(xù)地暴露于眾多化學(xué)實(shí)體，而 APH細(xì)胞在完整豬肝的體內(nèi)環(huán)境暴露于它們。其次，H印G2C3A細(xì)胞被普遍認(rèn)為在某些分化 的肝細(xì)胞功能方面是有缺陷的(Nyberg等人，1994 ；Rodri guez-Antona等人，2002)，且C3A 衍生細(xì)胞系看起來具有這些缺點(diǎn)，至少在可誘導(dǎo)的CYP450方面。這樣的分化功能的相當(dāng)缺 乏很可能源自下述事實(shí)，即!fepG2細(xì)胞(不同于PICM-19H細(xì)胞)是源自腫瘤組織的，且在 幾個生長和分化特征方面是異常的。例如，傳代后10-14天，PICM-19H細(xì)胞停止分裂，且在 培養(yǎng)3周之前，在可以達(dá)到匯合之前已經(jīng)終末分化。相反，!fepG2C3A細(xì)胞顯得繼續(xù)分裂，甚 至在達(dá)到匯合之后(數(shù)據(jù)未顯示)。II期反應(yīng)由負(fù)責(zé)外源物的解毒的胞質(zhì)酶介導(dǎo)，所述解毒通過綴合水溶性的化學(xué)部 分來實(shí)現(xiàn)，從而為身體對不同化學(xué)實(shí)體的消除提供關(guān)鍵功能。利用基于香豆素和試鹵靈的 底物，PICM-19H細(xì)胞表現(xiàn)出II期綴合反應(yīng)，其與原代APH細(xì)胞的那些相當(dāng)。我們的標(biāo)準(zhǔn)方 法采用了組合的水解酶制備物，即β -葡糖醛酸糖苷酶/芳基硫酸酯酶，所以不能容易地確 定哪種特異性活性導(dǎo)致綴合的產(chǎn)物的降解，因?yàn)橐呀?jīng)證實(shí)，硫酸酯化和葡萄苷酸化活性在 豬肝組織中是有功能的(Diaz和Squires. 2003. Xenobiotica 33:485-498)。這沒有排除 形成其它形式的II期綴合的可能性，所述其它形式諸如谷胱甘肽添加或?；磻?yīng)，它們在 本研究中沒有測量。實(shí)施例13細(xì)胞生存試驗(yàn)使用WST-I 細(xì)胞增殖試劑(Roche Applied Sciences，Mannhein，德國)測試了細(xì) 胞向化學(xué)試劑暴露的毒性效應(yīng)。該方法測量完整細(xì)胞中線粒體酶將四唑鹽向甲JJf的轉(zhuǎn)化。 與對照相比，甲It染料生成的減少可以與活細(xì)胞的減少相關(guān)聯(lián)(Ishiyama等人，同上)。使用添加了 2% FCS的Williams E (不含有酚紅)制備WST-I儲用試劑的1 10 稀釋液。將稀釋的試劑加給細(xì)胞，并在37°C溫育30min。將細(xì)胞處理過的試劑的樣品轉(zhuǎn)移 至干凈的96孔平板，用dH20稀釋，并在平板讀數(shù)器(HTS7000，Perkin Elmer, Norwalk, CT) 中在450nm讀數(shù)。測量在620nm的背景，然后從450nm結(jié)果減去。將結(jié)果與未處理的對照 進(jìn)行對比。實(shí)施例14
PICM-19H細(xì)胞對已知的肝毒素的代謝黃曲霉毒素Bl是確定地記載的霉菌毒素和可疑的肝致癌物，其被幾種CYP450代 謝,產(chǎn)生顯著毒性的代謝物(Kamdem等人，2006. Chem. Res. Toxicol. 19 :577-586)。在生長 在96孔平板中的PICM-19H細(xì)胞中，通過WST-I活力測得，黃曲霉毒素Bl的50%致死濃度 (LC50)是約40 μ M(圖21。用3-MCCYP450的誘導(dǎo)與LC50的顯著降低(1. 1 μ Μ)有關(guān)。因而， 3-MC處理增加了黃曲霉毒素Bl的毒性，證實(shí)了參與該毒素的生物活化的CYP的誘導(dǎo)。為了測定醋氨酚在PICM-19H細(xì)胞中的相對毒性，將制備并維持在96孔平板中的 培養(yǎng)物暴露于0. 78至IOOmM的不同濃度的藥物Mh。通過WST-I試驗(yàn)測定PICM-19H細(xì)胞 的存活力。10個獨(dú)立測定的回歸分析表明醋氨酚的LC5tl是12. 65士0. 75mM(圖22)。肝CYP450系統(tǒng)與吸收的外源物的解毒以及內(nèi)源分子(包括膽固醇和有關(guān)的甾 類)的代謝有關(guān)。另外，CYP450酶可以將藥物代謝成更有活性的形式，且有時代謝成毒性形 式。例如，在用醋氨酚處理肝細(xì)胞后劑量依賴性的細(xì)胞毒性源自響應(yīng)性地產(chǎn)生活性氧的細(xì) 胞，并由此在肝細(xì)胞中造成細(xì)胞毒性效應(yīng)(Michael等人，1999. H印atology 30:186-195)。 測得醋氨酚對PICM-19H細(xì)胞的LC5tl是約13mM。該LC5tl和劑量響應(yīng)數(shù)據(jù)與以前公開的從 人或嚙齒動物原代肝細(xì)胞培養(yǎng)物得到的實(shí)驗(yàn)值類似(Wang等人，2002. J. Toxicol. Sci. 27 229-237 ；Alien等人，2005. Toxicol. Sci. 84 :110-119)。另外，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，醋氨酚毒性在 谷胱甘肽耗盡的PICM-19H細(xì)胞(丁硫氨酸-亞砜亞胺處理)中提高，進(jìn)一步證實(shí)了與主要 的醋氨酚代謝有關(guān)的代謝機(jī)制的存在(數(shù)據(jù)未顯示)。另外，黃曲霉毒素Bl在PICM-19H 細(xì)胞中的毒性生物活化證實(shí)了它們的肝CYP450代謝。與CYPlA-和3A有關(guān)的活性增強(qiáng) 了黃曲霉毒素 Bl 的細(xì)胞毒性(Gallagher 等人，1996. ^Toxicol. Applied Pharmacol. 141 595-606)，且用3-MC預(yù)處理PICM-19H細(xì)胞，通過這些和可能的其它的CYP450的誘導(dǎo)，導(dǎo)致 黃曲霉毒素Bl毒性的增強(qiáng)作用。實(shí)施例15沒有飼養(yǎng)細(xì)胞的PICM-19H細(xì)胞培養(yǎng)開發(fā)了獨(dú)立于飼養(yǎng)細(xì)胞的PICM-19H細(xì)胞培養(yǎng)。已經(jīng)通過用聚合的牛膠原I型預(yù) 包被組織培養(yǎng)瓶，替換了 STO飼養(yǎng)細(xì)胞。將燒瓶干燥，然后在4-8°C儲存?zhèn)溆?。目前使用?膠原的濃度是 0. 15mg/ml，在 PICM-19 完全培養(yǎng)基(10% DMEM/199+ ；Talbot 和 Paape)中； 但是，可以使用不同濃度的膠原。也可以得到其它物種(例如，人類)的膠原。其它類型 的膠原也可以常規(guī)地用于包被，例如，膠原IV?；A(chǔ)培養(yǎng)基是10% DMEM高葡萄糖，其已經(jīng) 用STO飼養(yǎng)細(xì)胞調(diào)節(jié)6天。在調(diào)節(jié)期結(jié)束時，將等量的培養(yǎng)基199培養(yǎng)基(Talbot等人， 1996，同上)加入STO條件培養(yǎng)基(CM)，且還加入2-巰基乙醇、IOOx核苷混合物和胎牛血 清，使CM達(dá)到與10% DMEM/199+相同(Talbot和I^aape，同上)。另外，將下述生長因子 加入基礎(chǔ)CM培養(yǎng)基(a) ITS液體培養(yǎng)基添加物-胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒IOOx(No. 13146， Sigma Chem. Co.，St. Louis，M0)，(b)肝細(xì)胞生長因子(HGF) _50ng/ml (eBioscience，Sigma， Becton-Dickinson 和 R&D Systems)，(c)胰島素樣生長因子-1 (IGF-I) _25ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN)，和(d) IGF 結(jié)合蛋白 _4 (IGFBP-4) _50ng/ml (R&D Systems, Minneapolis，MN)?，F(xiàn)在通過暴露于胰蛋白酶-EDTA傳代獨(dú)立于飼養(yǎng)細(xì)胞的PICM-19H培養(yǎng) 物(Talbot等人，199 ，同上)；但是，也可以通過暴露于膠原酶來傳代細(xì)胞。在傳代之間， 每2-3天給培養(yǎng)物重新飼喂新鮮的完全培養(yǎng)基。
實(shí)施例16PICM-19H和PICM-19B在中空生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)使用中空纖維生物反應(yīng)器筒，單獨(dú)地或作為組合的培養(yǎng)物培養(yǎng)PICM-19H和 PICM-19B細(xì)胞。在有和沒有STO飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下，接種細(xì)胞，且PICM細(xì)胞接種物由分化的 細(xì)胞或未分化的細(xì)胞組成。使用的中空纖維生物反應(yīng)器具有不同的設(shè)計(jì)，包括但不限于含 有集成的氧合纖維的那些(Stem Cell Systems，德國柏林)。在分化的或未分化的狀態(tài)接種 細(xì)胞，并使用由(但不限于)不同供應(yīng)商提供的方案進(jìn)行培養(yǎng)，所述供應(yīng)商例如FiberCell， Inc. Frederick Maryland, USA。在中空纖維培養(yǎng)中培養(yǎng)和維持細(xì)胞的方案包括但不限于， 連續(xù)再循環(huán)、灌注和分批補(bǔ)料(fed-batch)模式。使用的中空纖維裝置沒有涂層，或在加入 PICM-19H和/或PICM-19B細(xì)胞之前預(yù)處理，所述預(yù)處理通過加入增強(qiáng)STO飼養(yǎng)細(xì)胞(如果 使用的話)和/或PICM-19H和/或PICM-19B細(xì)胞的粘附的物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)，所述物質(zhì)例如但 不限于不同形式和濃度的膠原。以每天間隔取出樣品，并檢查殘余葡萄糖和氨水平以及白 蛋白生成。生物反應(yīng)器運(yùn)行的結(jié)果如圖23A和2 所示。實(shí)施例17在微載體珠上或包裹的PICM-19H和PICM-19B的培養(yǎng)使用微載體珠或包裹進(jìn)水凝膠中，單獨(dú)地或作為組合的培養(yǎng)物培養(yǎng)PICM-19H和 PICM-19B細(xì)胞。在有和沒有STO飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下，接種細(xì)胞，且PICM細(xì)胞接種物由分化 的細(xì)胞或未分化的細(xì)胞組成。使用的微載體珠具有不同的設(shè)計(jì)，包括但不限于含有生物活 性物質(zhì)和/或表面內(nèi)陷的那些(SoloHill Engineering Ann Arbor,MI USA)。在分化的或 未分化的狀態(tài)接種細(xì)胞，并使用由(但不限于)不同供應(yīng)商提供的方案進(jìn)行培養(yǎng)，所述方 案例如由GE Healthcare Piscataway, NJ USA提供的那些。在微載體珠上培養(yǎng)和維持細(xì) 胞的方案包括但不限于，批式、灌注和分批補(bǔ)料模式。使用的微載體珠沒有涂層，或在加入 PICM-19H和/或PICM-19B細(xì)胞之前預(yù)處理，所述預(yù)處理通過加入增強(qiáng)STO飼養(yǎng)細(xì)胞(如果 使用的話)和/或PICM-19H和/或PICM-19B細(xì)胞的粘附的物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)，所述物質(zhì)例如但 不限于不同形式和濃度的膠原。以每天間隔取出樣品，并檢查殘余葡萄糖和氨水平以及白 蛋白生成。微載體和運(yùn)行的結(jié)果如圖24A和24B所示。用于細(xì)胞包裹的水凝膠具有不同的設(shè)計(jì)，包括但不限于含有藻酸鹽的那些，加入 或不加入諸如膠原的生物活性物質(zhì)。在分化的或未分化的狀態(tài)包裹細(xì)胞，并使用標(biāo)準(zhǔn)的懸 浮細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)，或注射進(jìn)中空纖維生物反應(yīng)器的毛細(xì)管外空間中。實(shí)施例18作為球狀體的PICM-19H的培養(yǎng)用于建立PICM-19H細(xì)胞的球狀體培養(yǎng)物的方法。通過在37°C用lmg/ml的在細(xì) 胞培養(yǎng)基或含有鈣的生理鹽溶液(例如但不限于DMEM或Hank氏緩沖鹽水溶液)中制備的 膠原酶(例如但不限于膠原酶II)處理PICM-19H培養(yǎng)物15-30min，從組織培養(yǎng)塑料器具 中釋放PICM-19H細(xì)胞。膠原酶處理會分解培養(yǎng)物內(nèi)的由STO飼養(yǎng)細(xì)胞生成的膠原纖維，且 STO細(xì)胞和PICM-19H細(xì)胞收縮得彼此離開，PICM-19H細(xì)胞形成細(xì)胞小球。通過劇烈攪動 培養(yǎng)瓶，或通過用某種類型的無菌細(xì)胞刮器刮下培養(yǎng)物，最終使球化的PICM-19H集落脫離 塑料基質(zhì)。使PICM-19H細(xì)胞的球(初生的球狀體)懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)基中，并進(jìn)行低速離心 (例如100-200xg，5-10min)，取出在得到的細(xì)胞沉淀物上面的上清液，并拋棄，從而去除膠原酶。將初生的PICM-19H球狀體的沉淀物重新懸浮于新鮮的完全培養(yǎng)基(例如但不限于 10% DMEM/199 ；Talbot和I^aape，1996)，并在輕柔攪拌下培養(yǎng)，所述攪拌通過使用但不限于 搖擺或定軌振蕩器來實(shí)現(xiàn)，使得初生的PICM-19H球狀體不重新粘附到在培養(yǎng)瓶中位于它 們下面的塑料器具上或塑料器具/飼養(yǎng)細(xì)胞基質(zhì)上。每2-3天給球狀體培養(yǎng)物供應(yīng)新鮮培 養(yǎng)基。通過該方法可以使球狀體生長和維持至少2周，如在圖25中所證實(shí)的。在本說明書中提及的所有出版物和專利，都通過參考引用并入本文中，其程度如 同具體地且單個地說明每篇單獨(dú)的出版物或?qū)＠ㄟ^參考引用并入本文。為了解釋和描述本發(fā)明的目的，已經(jīng)呈現(xiàn)了前述描述和某些代表性的實(shí)施方案和 本發(fā)明的細(xì)節(jié)。無意窮盡或?qū)⒈景l(fā)明限制為所公開的具體形式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會明白， 其中可以做出修改和變動而不脫離本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種分離的、永生的、單能的豬干細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系的細(xì)胞能排它地分化成肝 細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的干細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞表現(xiàn)出PICM-19H細(xì)胞的所有鑒別特征，所述 特征是可誘導(dǎo)的CYP450活性、血清蛋白生成、低Y-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶(GGT)活性、氨清除 能力和尿素生成能力。
3.權(quán)利要求2的干細(xì)胞系，其中所述干細(xì)胞系是保藏為ATCCPTA-9174的永生的、單能 的PICM-19H干細(xì)胞系。
4.一種分離的、永生的、單能的豬干細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系的細(xì)胞能排它地分化成表 達(dá)膽管上皮細(xì)胞功能的功能性膽管細(xì)胞。
5.權(quán)利要求4的干細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞表現(xiàn)出PICM-19B細(xì)胞的所有鑒別特征，所述 特征是，所述細(xì)胞是底外側(cè)極化的細(xì)胞，該細(xì)胞表現(xiàn)出基底膜流體運(yùn)輸、高GGT活性和血清 蛋白生成的缺乏。
6.權(quán)利要求2的干細(xì)胞系，其中所述干細(xì)胞系是保藏為ATCCPTA-9173的永生的、單能 的PICM-19B干細(xì)胞系。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求4的細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞的培養(yǎng)物進(jìn)一步包含飼養(yǎng)細(xì)胞。
8.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求4的細(xì)胞系的細(xì)胞，所述細(xì)胞粘附在 微珠上。
9.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求4的細(xì)胞系的細(xì)胞，所述細(xì)胞包裹在藻酸鹽微膠囊中。
10.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求4的細(xì)胞系的細(xì)胞，所述細(xì)胞粘附 在單個中空纖維上和之間。
11.一種生物人工肝裝置，其包含分離的、永生的、單能的豬干細(xì)胞系的細(xì)胞和所述細(xì) 胞的支持物，其中所述細(xì)胞系的細(xì)胞能排它地分化成肝細(xì)胞。
12.—種生物人工肝裝置，其包含分離的、永生的、單能的豬干細(xì)胞系的細(xì)胞和所述細(xì) 胞的支持物，其中所述細(xì)胞系的細(xì)胞能排它地分化成表達(dá)膽管上皮細(xì)胞功能的功能性膽管 細(xì)胞。
13.—種生物人工肝裝置，其包含分離的、永生的、單能的豬干細(xì)胞系的細(xì)胞，其中所述 細(xì)胞系的細(xì)胞能排它地分化成肝細(xì)胞，和包含分離的、永生的、單能的豬干細(xì)胞系的細(xì)胞， 其中所述細(xì)胞系的細(xì)胞能排它地分化成表達(dá)膽管上皮細(xì)胞功能的功能性膽管細(xì)胞，以及包 含所述細(xì)胞的支持物。
14.權(quán)利要求11、12和13中任一項(xiàng)的生物人工肝裝置，其中所述支持物包含單個中空 纖維、微珠或藻酸鹽微膠囊的集合。
15.使用權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的細(xì)胞系作為生物人工肝裝置的方法，其中所述細(xì)胞 能為需要功能性肝細(xì)胞的患者起肝細(xì)胞的功能。
16.使用權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的細(xì)胞系作為生物人工肝裝置的方法，其中所述細(xì)胞 能為需要功能性膽管上皮細(xì)胞的患者起表達(dá)膽管上皮細(xì)胞功能的功能性膽管細(xì)胞的功能。
17.一起使用權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的細(xì)胞系和權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的細(xì)胞系作為 生物人工肝裝置的方法，其中所述細(xì)胞能為需要功能性的肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的患者起肝細(xì)胞和表達(dá)膽管上皮細(xì)胞功能的功能性膽管細(xì)胞的功能。
18.使用組合物作為生物人工肝裝置處理諸如全血、血漿和腹膜液的體液的方法，所述 組合物包含權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的細(xì)胞系的細(xì)胞，所述細(xì)胞粘附在微珠上、粘附在無機(jī) 或有機(jī)多孔支持物上、粘附在單個中空纖維上或包裹在基于水凝膠的支持物中，其中所述 細(xì)胞能為需要功能性肝細(xì)胞的患者起肝細(xì)胞的功能。
19.使用組合物作為生物人工肝裝置處理諸如全血、血漿和腹膜液的體液的方法，所述 組合物包含權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的細(xì)胞系的細(xì)胞，所述細(xì)胞粘附在微珠上、粘附在無機(jī) 或有機(jī)多孔支持物上、粘附在單個中空纖維上或包裹在基于水凝膠的支持物中，其中所述 細(xì)胞能為需要功能性膽管上皮細(xì)胞的患者起表達(dá)膽管上皮細(xì)胞功能的功能性膽管細(xì)胞的 功能。
20.一起使用權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的細(xì)胞系和權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的細(xì)胞系作為 生物人工肝裝置處理諸如全血、血漿和腹膜液的體液的方法，所述細(xì)胞粘附在微珠上、粘附 在無機(jī)或有機(jī)多孔支持物上、粘附在單個中空纖維上或包裹在基于水凝膠的支持物中，其 中所述細(xì)胞能為需要功能性肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的患者起肝細(xì)胞和表達(dá)膽管上皮細(xì)胞 功能的功能性膽管細(xì)胞的功能。
21.使用權(quán)利要求1和4的細(xì)胞系篩選化合物或新的化學(xué)實(shí)體的方法，所述化合物或新 的化學(xué)實(shí)體抑制或促進(jìn)肝中外源物代謝所涉及的酶活性。
22.使用權(quán)利要求1和4的細(xì)胞系篩選化合物或新的化學(xué)實(shí)體的方法，所述化合物或新 的化學(xué)實(shí)體由于肝中外源物和/或內(nèi)源底物的代謝而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。
23.使用權(quán)利要求1和4的細(xì)胞系篩選化合物或新的化學(xué)實(shí)體的方法，所述化合物或新 的化學(xué)實(shí)體由于肝中外源物和/或內(nèi)源底物的代謝而產(chǎn)生肝毒性。
24.使用權(quán)利要求1和4的細(xì)胞系篩選化合物或新的化學(xué)實(shí)體的方法，所述化合物或新 的化學(xué)實(shí)體由于肝中外源物和/或內(nèi)源底物的代謝而產(chǎn)生肝功能障礙。
25.—種篩選測定試劑盒，其包含PICM-19H細(xì)胞、PICM-19B細(xì)胞或二者。
全文摘要
從雙能的ARS-PICM-19豬肝干細(xì)胞系衍生了2種細(xì)胞系PICM-19H和PICM-19B，并評估了它們在人工肝裝置中的潛在應(yīng)用。本研究包括培養(yǎng)物的生長速率和細(xì)胞密度的評估、形態(tài)學(xué)特征和肝細(xì)胞解毒功能，所述肝細(xì)胞解毒功能即可誘導(dǎo)的CYP450活性、氨清除和尿素生成。PICM-19H細(xì)胞含有眾多的線粒體、高爾基體、光滑和糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、泡囊體和偶見的脂質(zhì)液泡。PICM-19H細(xì)胞在無谷氨酰胺的培養(yǎng)基中表現(xiàn)出可誘導(dǎo)的CYP450活性、清除氨并生成尿素。PICM-19B單層的超微結(jié)構(gòu)分析表明，大致上立方的細(xì)胞表現(xiàn)出基底-頂極化，并通過緊密連接部樣的復(fù)合物連接起來。其它超微結(jié)構(gòu)特征類似于PICM-19H細(xì)胞的那些，只是它們具有眾多類似于粘液液泡的細(xì)胞體。PICM-19B細(xì)胞具有相對高水平的GGT活性，但是保留一些可誘導(dǎo)的CYP450活性和一些氨清除和尿素合成能力。這些數(shù)據(jù)表明，兩種細(xì)胞系在一起或單獨(dú)地可以用作人工肝裝置的細(xì)胞基質(zhì)。需要肝的體外模型來替換動物模型，用于快速評估藥物生物轉(zhuǎn)化和毒性。單能的豬干細(xì)胞系PICM-19H會排它地分化成肝細(xì)胞，且可以被誘導(dǎo)表達(dá)CYP450酶。這些細(xì)胞具有在其它肝細(xì)胞系中缺少的與外來物I期和II期代謝有關(guān)的許多活性。還將PICM-19H細(xì)胞系與腫瘤衍生的人HepG2 C3A細(xì)胞系和成年豬肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)物進(jìn)行了對比。結(jié)果證實(shí)了PICM-19H細(xì)胞在藥物生物轉(zhuǎn)化和毒性試驗(yàn)中的應(yīng)用潛力，并進(jìn)一步支持了它們在人工肝裝置技術(shù)中的應(yīng)用。
文檔編號C12N5/074GK102099463SQ200980128322
公開日2011年6月15日 申請日期2009年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月23日
發(fā)明者尼爾·C·塔爾博特, 托馬斯·J·卡佩爾納, 瑞安·威拉德 申請人:美國農(nóng)業(yè)部