專利名稱：人工改造的雞新城疫病毒f基因及其重組表達載體和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種cDNA，尤其涉及一種人工改造的雞新城疫病毒E"F,林F基因以及含有該F基因的重組真核表達載體，本發(fā)明還涉及它們作為DNA疫苗在預防或治療雞新城疫疾病中的應用，屬于雞新城疫疾病的防制領域。
背景技術：
新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)屬于副黏病毒科腮腺炎病毒屬，是一種高致病性病毒，對禽類危害較大，是世界公認的兩大重要禽病之一。本病的病死率極高，強毒力毒抹?？梢砸鹨赘须u群100%感染，并造成100%死亡，已經(jīng)遍布世界各地。目前，我國對于雞新城疫主要采用油佐劑滅活疫苗或弱毒活疫苗等傳統(tǒng)疫苗進行免疫預防。滅活疫苗具有保護率高、免疫期長、研制周期短等優(yōu)點，
分，難以用現(xiàn)行的血清學檢測方法進行疫情監(jiān)測，從而影響雞新城疫的流行病學調(diào)查，不利于對疾病的發(fā)生和流行進行控制，而且滅活疫苗的成本高、接種反應大，存在因滅活不全而散毒的危險。常規(guī)弱毒活疫苗也存在散毒問題，某些疫苗林毒性較強，能造成免疫雞群輕微感染以及低日齡雞的發(fā)病，為疾病的流行和毒抹變異埋下安全隱患。因此，有必要探尋新型疫苗以彌補上述不足，而DNA疫苗則為實現(xiàn)這一 目標提供了可能，雞新城疫DNA疫苗的開發(fā)和應用將為防制當前流行的新城疫提供有效的工具和手段。對于DNA疫苗而言，抗原蛋白的表達水平對其免疫原性和保護效力起著十分關鍵的作用。有相當多的文獻報道，免疫原基因密碼子的優(yōu)化可以顯著地改善蛋白的表達效率。Leder等對HPV16L1、 L2的密碼子進行了優(yōu)化，分別用哺乳動物細胞及植物細胞偏愛密碼子取代原有基因的相應密碼子，用合成基因轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞后，使用哺乳動物細胞偏愛密碼子合成的基因蛋白表達水平較原野生型病毒基因增加了 104 105倍。而用植物細胞偏愛密碼合成的基因其蛋白表達水平也至少提高了 100倍。Andre等人工合成人免疫缺陷病I型病毒(HIV) gpl20基因，該基因中原來存在的大多數(shù)密碼子被替換為人體偏好的密碼子，體外試驗表明改造后的基因表達效率比原始基因顯著提高，在動物試驗中合成基因所誘導的抗體滴度和CTL反應顯著高于原始基因。隨后，大量的研究證明用經(jīng)過密碼子優(yōu)化的DNA疫苗接種模型動物，所誘導的免疫應答顯著提高。密碼子優(yōu)化的人免疫缺陷病病毒的gp120、 Gag、 Gag-pol、 Tat、 Rev和Nef基因，用于構建DNA疫苗或重組病毒活載體疫苗后，其特異性細胞和體液免疫反應均獲得了顯著改善，目前幾乎所有的HIV重組疫苗都采用了密碼子優(yōu)化免疫原基因。密碼子優(yōu)化免疫原基因在人的乳頭瘤病毒、犬乳頭瘤病毒、狂犬病病毒以及SARS冠狀病毒DNA疫苗相繼得到應用。密碼子優(yōu)化免疫原基因增強免疫反應的機制不僅僅涉及翻譯過程密碼子移動速度加快，真核生物偏嗜性密碼子優(yōu)化往往導致mRNA中CG含量的大幅度提高，因而徹底改變RNA的二級結構， 一方面有可能增加mRNA的穩(wěn)定性，另 一方面還有可能增加mRNA轉(zhuǎn)錄后從細胞核向細胞漿的轉(zhuǎn)運效率。此外，CG含量的增加還有可能增加CpG的出現(xiàn)頻率，進一步發(fā)揮DNA疫苗本身免疫佐劑的作用。
由于核酸疫苗可誘導機體產(chǎn)生全面的免疫應答，并且對不同亞型的病原體具有交叉防御作用，同時兼?zhèn)浒踩⒖煽?、生產(chǎn)方Y更等優(yōu)點， 故被認為是繼減毒活疫苗、滅活疫苗和基因工程亞單位疫苗之后的第
三代疫苗。但是，DNA疫苗也存在其自身的局限性，目的基因的免疫 原性較弱以及其蛋白表達水平不高嚴重制約了它的發(fā)展。
蛋白的表達水平與其引起的免疫反應直接相關，而編碼氨基酸密 碼子的搖擺性導致了不同物種的細胞在蛋白翻譯過程中具有密碼子 使用的偏嗜性，動物細胞在蛋白翻譯過程中與病毒蛋白M酸密碼子 使用頻率存在著明顯差異?；虻男揎椏梢燥@著地改善蛋白的表達效 率。為了探索解決這一問題的新途徑，提高F基因的表達量從而增強 其免疫原性。
研究表明，NDV F基因密碼子的優(yōu)化可顯著提高F基因表達水 平和新城疫病毒F48E944 DNA疫苗誘導的保護性抗體免疫反應水平，
顯著增強免疫保護效果。因此，通過基因修飾的新城疫病毒F4sE9林
DNA疫苗將有著良好的的應用前景。
原有的NDVF基因在真核細胞中的表達效率不高，需要對其進 行分子改造和修飾，以提高其在真核細胞中的表達效率，以提高NDV F4gE9抹DNA疫苗在雞體內(nèi)的表達水平和免疫保護效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，將新城 疫病毒F站E9林F基因進行分子改造和修飾，提供一種更適合在雞體 細胞中高效表達的新城疫病毒人工F基因。
本發(fā)明首先所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現(xiàn)的 本發(fā)明在不改變原有新城疫病毒F基因(SEQ ID NO. 1)所編碼 的氨基酸序列的前提下，按照雞體內(nèi)密碼子的選擇取向?qū)﹄u新城疫病 毒F4sE9林F基因密碼子進行優(yōu)化,規(guī)避了 一些可能降低表達的序列，得到了 一種新的適合在雞體細胞中高效表達的雞新城疫病毒人工F基因序列。
具體的，本發(fā)明將NDVF4sE9抹F基因ORF的密碼子全部替換為雞體內(nèi)偏嗜的密碼子，在上游引入￡coR V酶切位點和Kozak序列，下游引入力a/ I酶切位點和TGA終止密碼子，并把終止密碼子下游堿基A改為G，得到一種適合在雞體細胞中高效表達的雞新城疫病毒人工F基因，其核苷蔣列為SEQIDNO: 2所示。
優(yōu)化后的F基因(SEQ ID NO: 2 )GC含量由原來優(yōu)化前的44. 28%變?yōu)?5. 46%,大大提高了 F基因中的GC含量；同時，在起始密碼子ATG上游引入了一段影響其起始效率的Kozak序列，并在3'端引入了雞體偏嗜的終止密碼子(TGA),改變了可能影響其翻譯終止效率終止密碼子下游堿基。重新設計合成的基因也去除或改變了 mRM去穩(wěn)定的序列，消除了稀有密碼子，從而使蛋白的生產(chǎn)更有效、更經(jīng)濟。
本發(fā)明所要解決第二個技術問題是提供一種含有SEQ ID N0.2所示核苷酸序列的重組真核表達載體。
本發(fā)明所要解決第二個技術問題是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一種重組真核表達載體，含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本發(fā)明的重組真核表達載體可通過本領域的常規(guī)方法構建而成，即將SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列插入到真核表達載體合適的限制性酶切位點之間，使SEQIDNO: 2所示的核苷酸序列可操作的與真核表達載體相連接并在真核表達載體相關元件的調(diào)控下獲得正確
表達o
作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將SEQIDNO: 2所示的核苷酸序列插入到真核表達載體pVAXl多克隆位點區(qū)的V和力a I限制性酶切位點之間，使該核苦酸序列位于CMF啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組真核表達載體pVAXl-optiF。
本發(fā)明所構建的重組真核表達載體可通過常規(guī)的方法轉(zhuǎn)染宿主
細胞，所述的宿主細胞可為293或COS7細胞，再通過間接免疫熒
光技術和Western-blot技術來鑒定其表達情況，表達出的目的蛋白具
有新城疫病毒天然蛋白的生物學活性和免疫原性。
本發(fā)明所要解決第三個技術問題是大量制備更適于轉(zhuǎn)染雞體細
胞和刺激雞體免疫系統(tǒng)的DNA疫苗。
本發(fā)明所要解決第三個技術問題是通過以下技術方案來實現(xiàn)的 提取含有SEQ ID NO: 2所示的核香酸序列的質(zhì)粒DNA，純化，
即得DNA疫苗。
本發(fā)明優(yōu)選的技術方案的整體描述
應用RT-PCR技術擴增自國內(nèi)來航雞分離的新城疫病毒F4sE9林 基因組。以NDV F48E9抹的基因組cDNA為模版，經(jīng)根據(jù)Genbank 中發(fā)表的新城疫病毒F48E9抹F基因(ID:AY508514)序列設計一對 引物(上游5'垂ATAGATATC ATGGGCCCC AAATCTTCT-3';下 游5'-CTATCTAGAGGCCACTACAAGAATCTGA-3')來擴增野 生型F基因，將F基因克隆到pMD-18T載體中，然后通過酶切和測 序鑒定正確后記為pMD-18T-F。
利用Genestar軟件將NDV 4必9抹F基因的ORF翻譯為氨基酸 序列，根據(jù)密碼子使用頻率表，將F基因的密碼子全部替換為雞體內(nèi) 偏嗜的密碼子，以雞偏嗜密碼子將M酸序列反翻譯為DNA序列； 在上游引入￡coR V酶切位點和Kozak序列，下游引入JS>a/1酶切位 點和雞體偏嗜的終止密碼子TGA,緊接著終止密碼子的下游堿基A 改為G。利用Genestar軟件核查設計的序列，進行氨基酸比對和酶切 位點檢查，合成最終序列(SEQ ID NO: 2 )并克隆到pMD-18T載體
7中，酶切和測序鑒定正確后記為pMD-18T-optiF。
將pMD-18T-F與pMD-18T-optiF分別經(jīng)五coR V和力"/ I酶切處理后回收目的片段，并把回收的目的片段與經(jīng)同樣酶切處理的表達載體pVAXl連接，經(jīng)酶切、鑒定后得到重組質(zhì)粒分別命名為pVAXl-F和pVAXl-optiF,即得到新城疫病毒F基因DNA疫苗。
將pVAXl-F和pVAXl-optiF兩種重組質(zhì)粒分別在脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導下轉(zhuǎn)染COS 7細胞，通過間接免疫熒光和Western-blot技術來檢測重組質(zhì)粒的體外表達情況；經(jīng)間接免疫熒光試驗、SDS變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及Western-blot檢測證明重組質(zhì)粒pVAXl-optiF在體外能正確表達，表達的重組蛋白具有雞新城疫病毒天然蛋白的生物學活性和免疫原性。
在采用間接免疫熒光技術檢測F基因的體外表達時發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pVAXl-optiF的細胞中熒光細胞數(shù)目明顯多于pVAXl-F,這與Western-blot檢測的結果是一致的。體外表達結果表明，密碼子優(yōu)化的F基因在雞體細胞中表達蛋白的水平顯著高于野生型F基因，由于將密碼子改造為雞體嗜好的密碼子后，加快了翻譯過程密碼子移動速度，同時由于GC含量大幅度提高徹底改變了 RNA的二級結構，這不僅增加了 mRNA的穩(wěn)定性，還可能增加mRNA轉(zhuǎn)錄后從細胞核向細胞漿的轉(zhuǎn)運效率，最終使蛋白的表達量大大提高。
本發(fā)明的雞新城疫病毒F站E9林F-DNA疫苗(pVAXl-optiF)能夠在體外瞬時表達細胞COS7高效表達，所表達的重組蛋白具有雞新城疫病毒天然蛋白的生物學活性和免疫原性。將所得到的重組質(zhì)粒(pVAXl-optiF)制成DNA疫苗，免疫雞實驗結果表明，本發(fā)明雞新城疫病毒F48E9林優(yōu)化的F-DNA疫苗能有效誘導機體產(chǎn)生特異性的體液和細胞免疫應答，在免疫劑量為200嗎的條件下使免疫雞獲得100%的抵抗高致病力NDV致死性攻擊的保護，并可有效阻止病毒在 體內(nèi)的增殖，試驗結果說明，本發(fā)明的DNA疫苗能夠有效防治雞新 城疫。
特異性抗體水平與新城疫免疫的保護率高度相關。將兩種質(zhì)粒免 疫雞后發(fā)現(xiàn)pVAXl-optiF免疫雞的特異性抗體產(chǎn)生比較迅速，而且上 升的幅度比較大，從一免后2周開始，誘導產(chǎn)生的抗體水平顯著高于 pVAX1-F免疫雞，而且隨后差距越來越大。由此可見，優(yōu)化的F基因 比野生型F基因表達出了更多的F蛋白，從而誘導產(chǎn)生出更高的特異 性抗體。因此，在動物體內(nèi)免疫原基因蛋白表達量的提高是改善DNA 疫苗免疫效果的重要途徑之一。
淋巴細胞轉(zhuǎn)化率是考察機體細胞免疫狀態(tài)的重要指標之一，本試 驗免疫雞脾淋巴細胞特異性增殖結果顯示，二免后2周，pVAX1-F和 pVAX1-optiF免疫雞后所測的OD"o值分別為0. 3804 ± 0. 0344和 0. 5804 ± 0. 0789, PBS對照組和pVAXl對照組分別為0. 2541 ± 0. 0535 和0. 2664 a ± 0. 0410，兩重組質(zhì)粒免疫組淋巴細胞轉(zhuǎn)化率都顯著高于 對照組，說明DAN免疫質(zhì)粒確實在一定程度上激活了機體的細胞免疫 系統(tǒng)，而pVAXl-optiF免疫雞脾細胞對Con A表現(xiàn)出更明顯的反應性， 說明免疫原基因的密碼子優(yōu)化后誘發(fā)了較強的細胞免疫。CD4+是T淋 巴細胞的一個亞群，是免疫應答的中心細胞。主要識別由MHCII類分 子遞呈的抗原，誘導Th I型細胞因子的分泌，輔助B細胞合成抗體； CD8+ T細胞又稱細胞毒性T淋巴細胞，其主要功能是特異性直接殺傷 靶細胞，它主要識別由MHCI類分子遞呈的抗原短肽，在T淋巴細胞 免疫應答中發(fā)揮重要功能。因此，動物體內(nèi)CD8+ T細胞的含量是評 價動物機體細胞免疫狀況的一個重要指標。
本試驗在對免疫雞外周血淋巴細胞亞群動態(tài)變化的檢測中發(fā)現(xiàn)，用質(zhì)粒pVAXl-optiF免疫雞的CD4+和CD8+ T淋巴細胞百分數(shù)在免疫后27 d均顯著高于pVAXl-F免疫雞的，并且這兩個免疫質(zhì)粒試驗組又顯著高于pVAXl質(zhì)粒免疫對照組和PBS空白對照組，說明構建的質(zhì)粒在動物細胞中得到了表達，激活包括CD8+的CTL， CD4+的Thl細胞及產(chǎn)生IgG2a為主的B淋巴細胞。成熟T細胞表面可表達2種不同類型的T細胞抗原受體(TCR)， 一種是TCR a P ,另 一種是由y鏈和5鏈組成的異二聚體分子tcry 5。外周血中的tcr y§ t細胞僅占成熟t細胞的0. 5% ~ 10°/。， tcr y 5識別病原體表面抗原分子后，增殖分化為效應細胞，釋放細胞毒性效應分子如穿孔素、顆粒酶，表達
Fas/FasL以及分泌IFN-y,最終清除感染細胞和病原微生物。全身性y5 T細胞可以快速被募集并易于活化，它們可以在局部釋放IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-IO、 IFN-7、 GM-CSF、 TNF-cc等多種細胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)，增強機體非特異性免疫防御功能。初免27d后，pVAXl-optiF免疫雞外周血TCRy 5 T細胞百分率比pVAXl-F免疫雞明顯增高(9.1522%± 1. 2547%對6. 3989%± 1.1625%, P<0. 05)，并且這兩個免疫質(zhì)粒試驗組又顯著高于pVAXl質(zhì)粒免疫對照組和PBS空白對照組。當機體在受到病毒感染時，y5 t細胞活化并增殖，活化的y 5t細胞識別并殺傷病毒感染的靶細胞，所以推測pVAXl-optiF免疫雞才幾體內(nèi)含有更多的TCRy 5 T細胞而具有更強的抗病毒能力。
評價一個疫苗的好壞，最關鍵的還是看疫苗對免疫動物的保護效果，本發(fā)明二免后2周分別對所有試驗雞以105 EID5。NDV的F"E9強毒進行滴鼻攻毒后，最終PBS對照組和pVAXl對照組全部死亡，而pVAXl-F組12只存活2只，最終的保護率為16. 7%;而pVAXl-optiF組的最終保護率為100%，達到完全保護。實驗結果表明，采用F基因密碼子的優(yōu)化可顯著提高F基因表達 水平和新城疫病毒F48E9抹DNA疫苗誘導的保護性抗體免疫反應水平， 顯著增強免疫保護效果。
用優(yōu)化的雞新城疫病毒F站E9林F基因的新城疫DNA疫苗，其 效果與傳統(tǒng)疫苗一樣。比起用SPF雞胚或細胞培養(yǎng)物制備的傳統(tǒng) NDV疫苗，DNA疫苗的制備簡單、方便，整個制備過程的經(jīng)濟消耗 也較低，表達產(chǎn)物經(jīng)過粗提即可應用。因此，本發(fā)明新城疫DNA疫 苗與現(xiàn)有的疫苗相比將具有更好的應用前景。
DNA疫苗利用的僅僅是病毒的一段抗原基因，不是完整的病毒 基因組，不具有感染性，是可以在動物細胞中表達抗原性蛋白的的安 全疫苗，不存在散毒的危險。本發(fā)明DNA疫苗將為防制當前流行的 雞新城疫疾病提供有效的工具和手段，并可為防制畜禽其它疾病提供 有效的參考和經(jīng)驗，投入應用后既能有效地防止新城疫流行造成的經(jīng) 濟損失，同時也降低了養(yǎng)殖成本，具有重要的科學意義和應用價值， 并能帶來更好的經(jīng)濟效益和社會效益。
本發(fā)明DNA疫苗的用法與用量用法經(jīng)由大腿肌肉注射。用 量雛雞0.2mL/羽(濃度為lmg/mL),成年雞0.4mL/羽(濃度為 0.5mg/mL )。


圖1 雞新城疫病毒F基因與載體構建圖鐠。
圖2 NDV F片段的PCR結果；1為DNA分子量標準DL2000 (TaKaRa公司);2為超純水為模板PCR對照；3為NDVF基因1.7Kb。
圖3 重組表達載體酶切鑒定結果；1為15000 DNA分子標準； 2和3分別為￡coR V和I消化pVAXl-F與pVAXl-optiF的產(chǎn) 物,目的片段為1.7Kb。
ii圖4重組表達載體體外表達間接免疫熒光鑒定結果。
圖5重組表達載體體外表達Western-blot鑒定結果；1 :蛋白質(zhì)分 子質(zhì)量標準；2和3:pVAXl-F和pVAXl-optiF在COS 7細胞瞬時表達 產(chǎn)物；4: pVAXl空載體轉(zhuǎn)染COS 7細胞對照；5: COS 7空細胞對照。
圖6 DNA疫苗免疫雞和對照雞外周血中和抗體在免疫和攻毒前 后的動態(tài)變化結果。
圖7 DNA疫苗免疫雞和對照雞外周血CD4+T淋巴細胞含量在 免疫和攻毒前后的變化結果。
圖8 DNA疫苗免疫雞和對照雞外周血CD8+T淋巴細胞含量在 免疫和攻毒前后的變化結果。
圖9 DNA疫苗免疫雞和對照雞外周血TCRyS T淋巴細胞含量 在免疫和攻毒前后的變化結果。
圖10 DNA疫苗免疫雞、對照雞及正常未攻毒雞在NDV F48E9 抹病毒攻擊后死亡或7 d后存活雞胃、腸和法氏嚢病理組織學變化。 Al.胃的正常外觀；A2.腸的正常外觀；A3.法氏嚢正常外觀；Bl.腺 胃深層復管腺集合竇內(nèi)有上皮細胞壞死的碎片;B2.腸腺間有大量嗜 酸性粒細胞浸潤；B3.法氏嚢-部分濾泡淋巴細胞壞死減少出現(xiàn)小空 泡，靜脈淤血，間質(zhì)水腫增寬；CI.淺層單管腺間有少量纖維素滲出； C2.腸-輕度淤血；C3.法氏嚢無明顯病理變化；Dl.腺胃淺層單管腺 及固有膜內(nèi)有大量出血；D2.腸絨毛皮細胞壞死脫落，嚴重於血出 血;D3.法氏嚢-淋巴濾泡體積縮小，淋巴細胞大量壞死缺失只剩網(wǎng)狀 纖維支架，小靜脈淤血；El.腺胃-深層復管腺上皮細胞壞死脫落至 集合竇內(nèi)及腺管間；E2.腸-大范圍出血淤血及充血，上皮細胞壞死， 大量淋巴細胞浸潤；E3.法氏嚢-淋巴細胞大量壞死減少，濾泡內(nèi)呈空 泡狀，間質(zhì)水腫增寬；H&E染色；20倍放大。
具體實施例方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點 將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā) 明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本 發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改 或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
1材料和方法 1.1材料
1.1.1質(zhì)粒、細菌、病毒與細胞
質(zhì)粒pVAXl購自invitrogen/^司(Catalog Number: V26020 ); NDVF48E9抹病毒購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(菌種保存號AV1611); DH5 a宿主菌、C0S7細胞均由本實驗室保存。 1.1. 2試劑
限制性內(nèi)切酶5coR V、 Iba2 I和DM分子質(zhì)量標準(DL 2000 和DL 15000 )等均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；脂質(zhì)體 Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen 7>司；RPMI1640和 滅活過濾除菌的胎牛血清購自GIBCO公司。NDV陽性血清由本實驗室 保存；淋巴細胞分離液、MTT試劑盒、FITC標記兔抗雞IgG、 HRP標 記羊抗鼠IgG購自Sigma公司;FITC標記的抗雞CD4+、 CD8+和TCR y 5表面標記的單克隆抗體購自Southernbiotech^^司，蛋白質(zhì)分子質(zhì) 量標準PageRuler Protein Ladder為Fragments公司產(chǎn)品；新城疫 抗體檢測試劑盒購自北京愛德士元亨生物科技有限公司。 1. 1. 3 SPF雞胚和SPF雞
SPF雞胚和SPF雞由哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供，2周齡SPF雞實驗期間飼養(yǎng)于負壓隔離器中。 1.2方法
1. 2. 1 F基因的密碼子優(yōu)化和表達載體構建
將NDV F4sE,林F基因ORF的密碼子全部替換為雞體內(nèi)偏嗜的密 碼子，在上游引入丑coR V酶切位點和Kozak序列，下游引入ZbaJ I 酶切位點和TGA終止密碼子，并把終止密碼子下游堿基A改為G。改 造后的基因人工合成后并克隆到pMD-18T載體中，命名為pMD-18 ToptiF。用￡coR V和J&a] I對pMD-18ToptiF進行雙酶切處理，將 回收的optiF目的片段插入經(jīng)過同樣雙酶切處理的pVAXl真核表達栽 體中,獲得pVAXl-optiF (圖1 )。將NDV F4sE,抹F基因同樣克隆到 pMD-18T載體中(命名為pMD-18TF),經(jīng)過同樣的酶切處理獲得 pVAXl-F真核表達載體。 1. 2. 2重組質(zhì)粒的體外表達與鑒定
將pVAXl、 pVAXl-F和pVAXl-optiF三種質(zhì)粒分別在脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000介導下轉(zhuǎn)染COS 7細胞，具體操作4姿說明書進 行。
在6孔板中轉(zhuǎn)染后72 h的細胞，經(jīng)PBS ( pH7. 4 )洗2次，用中 性甲酪固定15 min后，PBS洗滌2次，加上適量1: 100稀釋的NDV 陽性血清，37。C作用6G min, PBS洗滌3次，每次5 min，然后加入 適量l: 5000稀釋的FITC標記的羊抗雞二抗，37。C作用60 min, PBS 洗滌3次，加入適量堿性甘油，熒光顯微鏡下觀察焚光。
同時將轉(zhuǎn)染后72h后收集的轉(zhuǎn)染細胞，經(jīng)PBS洗1次，在細胞沉 淀中加入適量的lx SDS-PAGE上樣緩沖液混勻，煮沸8 min,利用 12%的SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，采用半干轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)印硝酸纖維膜，5% 的脫脂乳封閉60 min,加入NDV陽性血清作為一抗作用60 min,洗滌3次后，加入IRDye800標記的羊抗雞IgG為二抗，避光作用60 min, 洗滌次3后，采用紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(Odyssey， LI-COR)進行 掃描。
1. 2. 3 SPF雞的免疫
將2周齡SPF雞隨機分為4組，每組18只，前3組分別免疫pVAXl、 pVAX1-F和pVAXl-optiF,采用股四頭肌多點注射，每只雞200 ug， 第4組注射PBS作為空對照； 一免后兩周以相同的劑量加強免疫。一 免后12 d和二免后12 d每組各殺3只雞取脾做淋巴細胞增殖試驗。 加強免疫兩周后以105 EIDs。的F"E9林NDV強毒進行滴鼻攻毒(每組 12只)，每只雞的攻毒劑量為100|iL,攻毒后連續(xù)觀察l4 d計算發(fā) 病率、死亡率。試-瞼期間對雞的體液免疫和細胞免疫狀況進行監(jiān)測。 1. 2. 4免疫雞血清特異性IgG抗體測定(ELISA )
試驗期間每周采集免疫雞血清，用間接ELISA測定血清中抗F蛋 白的抗體效價，具體操作按新城疫抗體檢測試劑盒說明書進行，待測 血清均作1: 100稀釋。
1. 2. 5免疫雞外周血T淋巴細胞亞類的檢測
自第一次免疫后每隔9 d和攻毒后9 d采集外周抗凝血，用淋巴 細胞分離液分離出淋巴細胞，以熒光素標記的抗雞CD4+、 CD8+和TCR Y 5表面標記的單克隆抗體與淋巴細胞作用后，利用流式細胞技術 (BD, FACSCalibur)進行淋巴細胞亞群和TCR T細胞數(shù)量的檢測。
1. 2. 6免疫雞^fr巴細胞增殖試-驗
每次免疫后12 d每組剖殺3只雞，取脾細胞，參照淋巴細胞增 殖試驗MTT試劑盒操作說明書進行淋巴細胞增殖試驗。其主要過程 是無菌取試驗雞脾臟，用銅網(wǎng)(200目)研磨擠壓制成單細胞懸液,用臺盼藍法進行細胞活力測定，計數(shù)；以RPMI1640培養(yǎng)液(含200 IU /青霉素、200 |ig/mL鏈霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺)稀釋至2 x 10'個/mL。取制備的細胞懸液，以每孔80jul加入96孔培養(yǎng)板，每 孔再加入20 |i 1含75 m g/mL ConA的RPMI 1640培養(yǎng)液，每個樣品做 4個重復孔，試驗細胞在C02箱中37。C培養(yǎng)60 h后加MTT,繼續(xù)培養(yǎng) 3h后，小心吸凈每孔內(nèi)的液體，保留底部的沉淀，然后每孔加入MTT SOLVENT溶液100 室溫震蕩15 min。待結晶充分溶解后，測定 每孔0Ds7。，結果以4孔平均值和標準差表示。
1. 2. 7數(shù)據(jù)處理
所有統(tǒng)計分析均采用SPSS17. Q統(tǒng)計軟件，統(tǒng)計學上的差異顯著性 是通過均數(shù)t檢驗來確定的，P<0. 05就被認為是差異顯著。 2實^驗結果
2.1載體的構建及目的基因的體外表達
2. 1. 1人工合成密碼子優(yōu)化的F基因
優(yōu)化后的基因中GC含量由原來優(yōu)化前的44. 28%變?yōu)?5. 46%,優(yōu) 化前后兩個基因的核苷酸同源性為71. 3%。 2. 1. 2載體的構建和鑒定
酶切和測序鑒定結果表明，獲得的真核表達質(zhì)粒pVAXl-F和 pVAXl-optiF與預期的結果一致，經(jīng)EcoRV和Ea2 I雙酶切后都得 到了 U00bp左右的條帶(圖2、圖3)。 2. 1. 3 pVAXl-F和pVAXl-optiF的體外表達
間接免疫熒光結果顯示，在重組質(zhì)粒pVAXl-F和pVAXl-optiF轉(zhuǎn) 染的細胞中均可觀察到特異性熒光，轉(zhuǎn)染pVAXl質(zhì)粒的COS 7細胞和 未轉(zhuǎn)染的COS 7細胞均沒有檢測到熒光信號(圖4) 。 pVAXl-F和 pVAXl-optiF的體外表達結果表明，optiF轉(zhuǎn)染的細胞視野中陽性細胞數(shù)量多于F4sE,林的F基因轉(zhuǎn)染的細胞。
/人Western-blot結果看到，2種重組質(zhì)粒都4全測到了分子量約 為58ku的表達蛋白(圖5 )， optiF的基因表達量要高于F化E9抹的F 基因；而未轉(zhuǎn)染的C0S-7細胞和轉(zhuǎn)染pVAXl的COS 7細胞均沒有檢測 到目的蛋白的表達。 2.2動物試鳥t
2. 2. 1免疫及強毒攻擊前后的IgG抗體變化
圖6的結果顯示，pVAXl-F和pVAX1-optiF免疫后，免疫雞血清 IgG抗體逐漸升高，特別是pVAXl-optiF組的抗體滴度從免疫初時， 特異性抗體滴度上升的幅度就較快， 一免后兩周開始，pVAXl-opUF 組的特異性抗體水平就顯著高于對照組和pVAXl-F組的(P<0. O5)。 而且在二免后兩周IgG抗體滴度迅速提高，pVAXl-F和pVAX1-optiF 二免后2周免疫雞血清IgG抗體ELISA檢測結果0D"。平均值分別為 0. 2838和0. 7624,極顯著高于兩對照組的0. 0805和0. 0924( P<0. 01 )， 而且pVAXl-optiF組免疫雞的特異性抗體水平也才及顯著高于pVAXl-F 組免疫雞的(P<0. 01)。攻毒后pVAXl-optiF組和pVAXl-F組免疫雞 的抗體水平比攻毒前有較大提高，其攻毒后1周免疫雞血清IgG抗體 ELISA檢測結果OD65。平均值分別為0. 9473和1. 0619。 2. 2. 2免疫雞脾淋巴細胞增殖反應
淋巴細胞增殖試驗結果顯示，和對照組pVAXl及PBS相比， PVAXl-optiF和PVAXl-F接種組對ConA均表現(xiàn)出較明顯的反應性， 其中PVAXl-optiF免疫雞脾細胞的增殖反應要比pVAXl-F免疫雞強， 特別是在二免后兩周，PVAXl-optiF免疫雞的脾細胞增殖反應顯著強 于pVAXl-F免疫組的(P<0. 05 )(見表1)
17表1雞免疫后脾淋巴細胞的增殖反應
組別(OD570nm)
一免后2周二免后2周
PBS0.2282a±0.03590.2541a±0.0535
pVAXl0.2292 a±0.03840.2664 a±0.0410
pVAXl-F0.3253b±0.05160.3804b±0.0344
pVAXl-optiF0.3640b±0.04110.5804e±0.0789
注數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗分析，均以X"表示，表中同一列標有不同字母的數(shù)值之間差異顯著(/ <(). 05)
2. 2. 3免疫雞外周血CD4+、 CD8+和TCR T細胞數(shù)量的動態(tài)變化
免疫雞外周血T淋巴細胞亞類的檢測結果顯示初免后9天，所 有接種雞外周血CD4+T淋巴細胞含量(見圖7) 、 CD8+ T淋巴細胞含 量(見圖8)以及TCRy 5 T細胞含量(見圖9)沒有明顯差異；初 免后18天，pVAXl-F和pVAXl-optiF接種組的CD4+、 CD8+及TCRy 5 T淋巴細胞含量都高于對照組，但四組之間都沒有顯著差異；初 免后27 d (即二免后13 d) ， pVAXl-optiF接種雞外周血CD4+、 CD8+ 和TCR y 5 T細胞含量都顯著高于pVAXl-F接種組(P<0. 01),并且 兩重組質(zhì)粒接種雞的這3個指標都顯著高于pVAXl對照組和PBS空白 對照組(P復01)。攻毒后9 d， pVAXl-optiF和pVAXl-F試驗雞外 周血CDf 、CD8+、TCRy 5 T淋巴細胞含量與攻毒前相比有明顯提高， 差異顯著(P<0. 01)。
2. 2. 4試驗雞對NDV F化E9林攻擊的保護作用
二免后2周分別對所有試驗雞以105 EIDs。的F4sE,林NDV強毒進行 滴鼻攻毒。結果顯示，所有的試驗組在攻毒后前3d都沒有出現(xiàn)發(fā)病 雞，攻毒4d后，除pVAXl-optiF組外，所有組都出現(xiàn)了癥狀明顯的 發(fā)病雞。最終PBS對照組和pVAXl對照組全部發(fā)病，并且在攻毒后6d內(nèi)全死亡，pVAXl-F組12只存活2只，最終的保護率為16.7%;而 pVAXl-optiF組的最終保護率為100% (見表2)。
表2 pVAXl-F和pVAXl-optiF免疫雞對NDV F48E9株強毒攻擊的保護作用
組另ij (vaccine)發(fā)病雞數(shù)/總數(shù)死亡雞數(shù)/總數(shù)存活雞數(shù)/總數(shù)
PBS12/1212/120/12
pVAXl12/1212/120/12
pVAXl-F10/1210/122/12
pVAXl-optF0/120/1212/12<110>中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所
<120>人工改造的雞新城疫病毒F基因及其重組表達載體和應用
<130〉 KLPI08078
<160> 2
<170> Patentln version 3.1
<210〉 1
<211〉 1662
<212> DNA
<213> Newcastle disease virus
<400> 1
atgggccccaaatcttctaccaatgtcccagcacctctgatgctgaccgtcaggattgcg60
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<210〉 2
<211〉 1671
〈212〉 DNA
<213〉 artifical sequence
<400> 2ccaccatggggcccaagagcagcaccaacgtgcccgcccc cctgatgctg60
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ctgctgtggc tgggc肪caa caccctgaac cagatgcgta agagatctct a 167權利要求
1、人工改造的雞新城疫病毒F基因，其特征在于其為SEQ IDNO2所示的核苷酸序列。
2、 含有權利要求1所述人工改造的雞新城疫病毒F基因的重組 表達載體。
3、 按照權利要求2所述的重組表達載體，其特征在于所述重 組表達載體是重組真核表達載體。
4、 按照權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于所述重 組真核表達載體是pVAX1-optiF;其中，所述optiF的核苷酸序列為 SEQ ID NO: 2所示。
5、 含有權利要求2-4任何一項所述重組表達載體的宿主細胞。
6、 權利要求1所述人工改造的雞新城疫病毒F基因在制備預防 或治療雞新城疫疾病的DNA疫苗中的用途。
7、 權利要求2-4任何一項所述重組表達載體在制備預防或治療 雞新城疫疾病的DNA疫苗中的用途。
8、 一種治療或預防雞新城疫疾病的疫苗組合物，其特征在于 由有效量的權利要求2-4任何一項所述重組表達載體和藥學上可接 受的佐劑、載體或賦型劑組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人工改造的雞新城疫病毒F基因及其重組表達載體和應用。本發(fā)明將NDV F基因ORF的密碼子全部替換為雞體內(nèi)偏嗜的密碼子，在上游引入EcoR V酶切位點和Kozak序列，下游引入Xbal I酶切位點和TGA終止密碼子，并把終止密碼子下游堿基A改為G，所得到的基因(SEQ ID NO2)能夠在真核細胞中高效表達，其表達效率比野生型F基因表達效率高，所表達的蛋白具有雞新城疫病毒天然蛋白的免疫原性和生物學活性，并能刺激雞體產(chǎn)生比野生型F基因DNA疫苗更加強烈的體液免疫應答和細胞免疫應答，使免疫雞獲得100％的抵抗高致病力新城疫病毒株的致死性攻擊，可有效阻止病毒在體內(nèi)的增殖。
文檔編號C12N15/45GK101629178SQ20091016561
公開日2010年1月20日 申請日期2009年8月6日 優(yōu)先權日2009年8月6日
發(fā)明者曾偉偉, 玫 王, 王云峰, 石星明, 童光志 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所