專利名稱：：一個調控果實成熟和品質的基因及其編碼產物與應用的制作方法一個調控果實成熟和品質的基因及其編碼產物與應用[
技術領域：
]本發(fā)明涉及香蕉谷氨酸脫羧酶基因(glutamatedecarboxylasegene,Ma(L4Z^)序列的獲得、表達分析和體外調控基因表達調節(jié)香蕉果實成熟和品質。谷氨酸脫羧酶(Glutamatedecarboxylase,GAD)廣泛存在于原核和真核生物中，是一個胞內酶，主要存在于細胞質中，與磷酸吡哆醛輔因子結合催化谷氨酸轉化為GABA和C02。在植物中GAD的C末端具有一個特殊的與鈣調蛋白(CaM)結合的區(qū)域，能夠與CaM結合增加酶活力(Chenetal.1994)。植物在應對許多不同的刺激時，比如，機械損傷、冷刺激、熱刺激、組織缺氧、植物激素刺激等，GAD被細胞內的H+或Ca^水平的增加而激活，GABA會大量積累。GABA積累在PH調控、N儲存、植物發(fā)育、果實成熟、植物防御等生理過程中起著重要作用(Bownetal.1997;Gallegoetal.1995)。GAD基因已經在擬南芥、矮牽牛、水稻、番茄、煙草等植物中被克隆，結果表明該基因可能是多基因家族編碼的，并且普遍存在于植物各組織中，其表達變化在植物發(fā)育、外界刺激及果實成熟等不同的生理過程中呈現(xiàn)出表達差異。GAD基因的表達與果實成熟及乙烯生物合成也有關系，Kathiresan等(Kathiresan1997)研究了向日葵中GAD與乙烯產生的關系，外源GABA處理向日葵子葉12小時，導致乙烯產生率增加了14倍。其調控過程是，外源GABA促進了內源GABA的合成，從而促進了ACC合成酶mRNA和ACC含量的積累，以及ACC氧化酶mRNA和體外ACC氧化酶活力的增加，并證明了GABA并不是乙烯生物合成的前體，即GABA可能并不是通過代謝途徑參與乙烯生物合成。推測外源GABA促進內源GABA合成的可能過程是GABA首先促進了GAD基因的表達，增加了GAD酶活性，從而促進了內源GABA的合成。GABA促進乙烯生物合成主要是通過誘導ACC合成酶轉錄的增強。Gallego等(Gallegoetal.1995)從番茄果實cDNA文庫中獲得一個GADcDNA全長，組織特異性表達分析表明，該基因在根、莖、葉等組織中表達量非常低，在果實中表達量較高。果實釆后成熟不同階段表達分析表明該基因在正常成熟和rin突變3體中表達量都在采后果實第一次發(fā)生顏色變化時最高；正常成熟果實中該基因在表達量達到峰值后立即下降，而rin突變體中該基因表達一直維持在較高水平。我們(Jinetal.2008)利用cDNA微陣列和RT-PCR分析研究香蕉采后乙烯生物合成啟動時(采后10d)基因的差異表達，表明香蕉谷氨酸脫羧酶基因明顯上調表達，是16個上調表達基因中表達量最大的一個。總結上述研究結果在乙烯生物合成及果實成熟過程中，GAD催化谷氨酸轉化為GABA，GABA可能通過代謝途徑參與有機酸的降解，PH調控，N的代謝從而導致成熟相關的生理變化；GABA也可能作為信號分子調控果實成熟過程中乙烯生物合成。因此，GAD基因的開發(fā)利用，將有助于更加深入了解香蕉果實采后成熟機理，建立更加安全廉價的果實采后保鮮新方法。為了深入研究香蕉果實采后成熟機理，建立安全廉價有效果實保鮮新技術，提高果實的商品價值，分離與果實成熟相關基因并鑒定它們的功能十分必要，通過對這類基因功能研究及調控，將對提高果實采后品質，培育耐儲藏新品種具有重要意義。本發(fā)明提供的技術方案為構建香蕉果實采后O天、2天抑制縮減文庫，獲得一個與GAD基因同源性較高的差異表達谷氨酸脫羧酶同源的cDNA序列，RACE技術擴增該基因全長序列(#sW/y)。熒光定量PCR方法研究在正常成熟、乙烯誘導成熟和1-MCP(l-methylcyclopropene)抑制成熟的條件下，ifeW"7在香蕉果實采后不同成熟階段的表達情況。通過體外誘導、抑制ifeWZV的表達，研究果實成熟特性及品質。1.香蕉果實采后2天抑制差減文庫構建及分析采用熱硼酸法法提取香蕉采后0天和2天果實總RNA，電泳檢測RNA質量，質量檢測完蓽后貯于-76。C備用。按照Clontech公司的PCR-SelectTMcDNASubstractionKit,Advantage2PCRKit產品使用說明進行縮減雜交。抑制縮減雜交產物經與pGEM-TEasyVecter連接，轉化E.co"DH5a,構建抑制差減文庫。獲得文庫獨立克隆測序、分析。2.香蕉谷氨酸脫羧酶基因全長序列克隆根據SSH獲得的基因片段和NCBI的比對結果可知，該基因片段3'端已經含有TAA終止密碼子。用PrimerPremier5設計一條5'-RACE引物，以本研究室構建的香蕉果實cDNA文庫為模板，PCR擴增5'端序列。將擴增序列與已有的3'端序列拼接獲得基因的全長序列。3.熒光定量研究MaGADl與果實采后成熟的關系-采后香蕉果實分設乙烯處理、l-MCP處理和正常成熟3組，提取3組中不同成熟階段的果實總RNA反轉錄cDNA，熒光定量研究3中不同處理條件下Ma04ZW表達與成熟的關系。4.MaGADl誘導劑Y-氨基丁酸(GABA)和抑制劑氨氧乙酸(AOAA)處理果實，研究體外調控基因表達對果實成熟和品質的影響將采后的香蕉果實按照一定濃度用Y-氨基丁酸(GABA)和氨氧乙酸(AOAA)分別處理，觀察處理果實成熟變化，測定果實成熟相關的生理指標，分析通過采后體外調控Ma04/W的表達對果實成熟和品質的影響。1.成功構建香蕉果實采后0天和2天的抑制縮減文庫用差減PCR產物，以T/A克隆法構建質粒載體文庫，差減文庫包括312個白色克隆，克隆飽滿清晰。應用PCR方法對差減文庫的312個克隆進行篩選，獲得302個重組子，插入片段集中在300bp-50(Jbp之間，符合抑制縮減文庫的要求。2.成功克隆香蕉谷氨酸脫羧酶基因全長序列對獲得的抑制縮減文庫中302個重組測序分析，有2個與其他生物子谷氨酸脫羧酶基因具有較高同源性，進一步分析顯示這兩個香蕉谷氮酸脫羧酶基因片段屬于同一個基因。根據獲得的香蕉谷氨酸脫羧酶基因片段設計5'端PCR引物，克隆5'端序列，與原有序列拼接后利用生物信息學軟件分析，具有完整的閱讀框架，為一個完整基因命名為Mfl04i^，包含一個1500bp的完整開放閱讀框(序列l(wèi))，編碼499個氨基酸殘基的多肽(序列2)。與水稻(NM—001068533)、大麥(AK248209)、擬南芥(NM—121739)和玉米(AY103733)有較高的一致性，分別為82%、80%、80%、78%。GenBank查找未見報道。3.M"04a/在香蕉果實采后被乙烯誘導表達，并可調節(jié)成熟乙烯生物合成在正常成熟和乙烯誘導成熟的條件下，Ma04Z)7在成熟乙烯生物合成啟動時被顯著誘導，其表達量快速達到最大值，并誘導了隨后乙烯的大量增加使其達到峰值；在l-MCP抑制成熟條件下，內源乙烯的釋放量和MaGXZ)/的相對表達量在香蕉采后儲藏時期一直維持在較低的水平(圖1)。所以，MflG^Di的表達既受乙烯誘導又促進乙烯的生物合成，與香蕉果實采后乙烯生物合成及果實成熟密切相關。4.M"Oi07誘導劑和抑制劑顯著促進和抑制該基因的表達，進而影響果實的成熟過程和品質研究結果證明，GABA和AOAA分別能誘導和抑制香蕉果實成熟，通過生理學分析顯示這種影響改變了果實顏色、硬度、芳香物質、可溶性總糖和淀粉含5量等。證實對Ma04D7表達的調控可以調節(jié)果實品質(圖2、圖3)。進一步研究顯示，Ma04Z)7調控果實成熟是通過調控Ma4GW基因的表達來實現(xiàn)的，而Ma^CW是香蕉果實采后成熟過程中啟動成熟乙烯生物合成的關鍵酶基因。因此，我們推測香蕉MaGXD7是香蕉果實采后成熟過程中成熟乙烯生物合成的上游調節(jié)者，它通過調控Ma4GS7的表達控制果實的成熟過程和品質形成。圖1:1-MCP處理和乙烯處理條件下，利用熒光定量PCR分析MaGADl在香蕉釆后不同時期的表達。圖2:GABA和A0AA處理對香蕉果實采后成熟的影響圖3:GABA和AOAA處理對采后香蕉果實硬度、淀粉、可溶性總糖的影響。[具體實施方式下面結合實施方式對本發(fā)明進行詳細說明1、材料來源巴西香蕉(MJ^4Graw;Cavendish)果實，釆自中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所實驗基地。2、方法(1)香威果實采后2天抑制差減文庫構建及分析參照Ching-YiWan和TheaA.Wilkins(1994)的熱硼酸法提取香蕉果實RNA。按照PCR-SelectcDNASubstractionKit,Advantage2PCRKit產品使用說明進行0天和2天果實RNA抑制縮減雜交。抑制縮減雜交產物經與pGEM-TEasyVecter連接，轉化E.co7i'DH5a。采用PCR的方法對重組子進行鑒定，PCR鑒定采用試劑盒提供的引物NestedPCR引物1:5，-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，NestedPCR引物2R:5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，以待測質粒為模板，在Biometra型PCR儀上進行PCR反應。反應條件為94。C變性5.0分鐘；94。C45秒，68°C1.0分鐘，72°Cl.O分鐘，擴增35個循環(huán)；72。C延伸7.0分鐘。然后取5.(HUPCR反應液進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，5v/cm恒壓條件下電泳30分鐘后，于紫外燈下觀察重組子插入片段大小。將插入有目的片段的重組子測序、分析。(2)香蕉谷氨酸脫羧酶基因全長序列克隆根據SSH獲得的基因片段和NCBI的比對結果可知，該基因片段3，端已經已含有TAA終止密碼子。用PrimerPremier5設計一條5'-RACE引物5，-TATGCGAACCCGAAACTCCCAAAG-3，，交由上海生物工程有限公司合成。以我研究室構建的香蕉果實cDNA文庫為模板，PCR另一個引物為cDNA文庫的接頭引物ptr5，5'-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3，；。在0.2mL離心管中依次加入eDNA文庫庫液l.OpL10XBuffer(含2.5mMMg2+)2.5pLdNTP(dA/G/C/TTP:10mMeach)0單ptr5，(10pM)l單BR1695'-RACE(10pM)l單Taq聚合酶(5u/pL)0.3^LddH20_18舉總體積25.0pL以下列PCR反應條件進行PCR反應:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結果擴增到一段1042bp,含有ATG起始密碼子。根據抑制縮減文庫中序列及5'-RACE所獲得的序列序列拼接后設計2條引物從香蕉果實cDNA文庫中克隆該基因cDNA全長。PCR及測序結果顯示，該基因cDNAORF為1500bp。(3)熒光定量研究Mfl04Z)7與果實采后成熟的關系提取乙烯處理、1-MCP處理和采后正常成熟香蕉不同成熟期的果實總RNA反轉錄cDNA用作熒光定量PCR的模板。用NCBI的保守結構域分析軟件分析AfoOiW、M-""/W2個基因的保守結構，確保所設計引物的擴增片段位于非保守區(qū);然后根據熒光定量PCR的引物設計原則，用primerpremier5設計弓l物。MaGAD1上游引物5，-GTCGTCCCCAAGAAGAGCGTCAA-3，；MaGADl下游引物5，-ATCGCCAAACCATAACTAAACCACA-3，。Ma-actinl上游引物5'-CGAGGCTCAATCAAAGA濕3'Ma-actin1下游引物5'-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3'在Stratagene的Mx3000P儀器上進行熒光定量PCR。在0.2mL的PCR反應管中加入SYBRPremixExTaq(2X)(TAKARA)12.5pL、RoxreferenceDyeII(50X)(TAKARA)0.5pL、5pM的一對引物各0.75|uL，cDNA樣品lpL，然后用水補足至25pL。每個樣品既要用于擴增目的基因又要擴增內參基因Ma-actinl，各個基因的擴增都做三個重復。按照94"C預變性3min，94。C變性7s，55。C退火15s,72。C延伸20s，共40個循環(huán)的反應程序進行擴增(四個基因的反應程序是一致的)，并于每個循環(huán)的延伸階段采集熒光信號。反應結束后做94'C一55t:的融解曲線分析。熒光定量PCR結果證明，MaGADl表達受乙烯誘導、1-MCP抑制，在香蕉果實采后成熟過程中起著調控乙烯生物合成、果實成熟的作用。(4)Ma04/)/誘導劑GABA和抑制劑AOAA處理果實對成熟期和品質的影響將采收的果實切割成單蕉指，用0.1%次氯酸鈉進行表面消毒10min，同時把果實頂部的干花抹掉，放置一個晚上晾干，隨機選取成熟度較為一致的香蕉果實分成3個處理正常成熟、GABA處理、AOAA處理。每個處理選取30—40個果實，每3個果實裝進一^保鮮盒中。正常成熟的果實置于22t:恒溫條件下成熟。觀察^同處理對香蕉果實采后成熟時期的影響，測定不同處理條件下香蕉果實硬度、可溶性總糖。果實淀粉含量。結果顯示GABA處理明顯能縮短達到每個成熟度的時間，促進成熟；AOAA處理明顯能延長達到每個成熟度的時間，延緩成熟。并通過調控采后香蕉果實成熟度、硬度、可溶性總糖和淀粉含量等生理變化調控果實成熟過程。SEQUENCELISTING<110>中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所農業(yè)部熱帶作物生物技術重點開放實驗室中國熱帶農業(yè)科學院?？趯嶒炚窘?，志強徐，碧玉胡，偉劉，菊華張，建斌賈，彩紅ii,光蘭<120>—個調控果實成熟和品質的基因及其編碼產物與應用<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>1500<212>DNA<213>香蕉(Musaacuminata)<220><221>'gene<222>(1)..(1500)<400>1atgactctctcggcggtagcatcggatgccgatgattcggtcgcttatacattcgcttcg60cgatscgttcgcgaggctcttccccggttcaggatsccggagcsgtcgstcccc33gg3t120gcggcgtaccagstcstcsscgacgsgctgatgctcgscggg33cccgcggttgaatctg180gcgtcgttcgtgscgscgtggstggsgccgaacaagaactacgtcgacatggacgagtacgt333t3tgstsgcccsccttttcsstgccgttggaaotgtgggttcctcagaagcaatctggcsgsac333己g333ggcsgsggsgasggcasiatgttcaggtttgctgggagaaatttgtgasgttgsa3g3gggat3ttatgtaatggsgastacgatstgtgttgctgccatcttggttaagcttctaaatgatctcctgacagaaatacatgtcgatgctgcaagtgggggattttgggacttfccggctccctcaggtgaagagcgtttatgctggagtsggttgggttgtctggattttccatattaattatcttggtgcagatggatctagtc3g3tc3ttgc3C3gtsct3cagaaat3tcstggsassctgtatgg3c3atacsgsgscattcgacattgtgtccaaggat33gg3csgcggc3￡LgteiC￡icggtcttcgscatcgttcdbgcgtaLC3ccatgcctgccgacatcagggaggacttcagtcggagtctggcgttg3cagacttggasaaccggtggacgasagagaacccggacggcggcggcgccgtcgtcgagatcgccagatactggaagcgattggtggsgtgcgstcgcctcatcatggcggccgtc240cccgtcaccsccgaLgctccsgsatcgctgc300ccaattggggaagacgaaacggctgttggs3603tgcttgc3ggacttgcsttc33g3gg333420ccttacgsc333cccssc3ttgttaccggt480gcaaggtattttgaagttgaactgasagaa540gatcctgccaaggcagtsgaaatggttgat600ggttc33ctctc3ctgg3g3gtttgssgst660aai333cc3agaaeictgggtgggaicacaccc720atagcgcctttcctctatcctgaactagag780ataaatgtcagcggccscasatatggcttg8403gg3ac333g3ggsttt3cctgaisgsgctt900caacctaccttcactctcaacttttctaaa960cagtttatacgcttgggctttgagggtttc1020gcc33ggtgttgssggcgggC3tcgsgggg1080gtgggtgtgccgctcgtggcattctcactc1140gtatcggagaccttgaggaggttcggatgg1200gcsgagcstgttgcggtgctccgcgtggtg1260gagcgcctcgtgacggacatcaagaaggtg1320gccacc3tg3tcscccaitgtcaaagccgag1380ccc3agaag3gcgtC33gcagacgcacgag1440gatcgtaiagssgaiccsgcggcgtttgctga150010<210>2<211>499<212>PRT<213>香蕉(Musaacuminata)<220><221>PRT<222>一l)..(499)<400>2MetThrLeuThrPheAlsProGluGin35GluLeuMet50ThrThrTrp65AsnLysAsnGinAsnArgGlyGluAsp115MalieMet130ArgLysAla145AlaAsnValGluLeuLysAlaLysAla一-195lieLeuGly210AsnAspLeu225lieHisValSerSer20SerL<euMetTyrCys100GluLeuGluGinAla5ArglieAspGluVal85ValThrAlaGluValTyrProGlyPro70AspAsnAlaGlyLys150ValCys165GluValLys180ValGluMetSerThrLeuAlaValLysAsn55GluMetMetValLeu135ProTrpLeuValThr215LysLeuThrGlu230AspAlaAlaSerSerArgAsp40ProCysAsplieGly120AlaTyrGluLysAsp200GlyAsnGlyAspGlu25AlaArgAspGluAla105ValPheAspLysGlu185GluGluGinGlyMa10AlaAla!LeuArgTyr90HisGlyL>ysLysPhe170GlyAsnPheGluPheAspLeuTyrAsnLeu75ProLeuThrArgAspProGin!Leu60lieValPheValLys140ProAsn155AlaArgTyrTyrThr工leSerArglie45AlaMetThrAsnGly125TrplieTyrValCys205ValGluAsp220ThrGlyTrp235lieAlaProValPhe30lieSerAlaThrAla110SerGinValPheMet190ValEysAspPheAla15ArgAsnPheAlaGlu95ProSerAsnThrTyrlieAspValVal80LeulieGluLysGly160GluVal175AspProAlaAlaLeuLeuThrPro240LeuTyrProGluLeuValSerGly275ValTrpArg290AsnTyrLeu305GlySerSerPheGluGlyValLeviLys355LysAspVal370LysTyrThr385lieValProLeuArgValLeuValThr435ThrLysAla450GlyGly>Gly465GlulieAlaGlyValCys245GluTrpAspPhe260HisLysTyrGlyAsnLysGluAsp295GlyAlaAspGin310GinlielieAla325PheArgAsnlie340AlaGlylieGluGlyValProValPheAsp390ThrArgLeu265LeuVal280LeuProProThrGinTyr250ProTyrGluPheTyr330AsnMetGlu345GlyThrGlu360LeuValAlaPhe375ValSerGluThrAlaTyr405Vallie420AsplieArgLysThrMetlieAlaValVal470ArgTyrTrp485MetProAlaGluAspPhe425LysValLeu440ThrHisVal455ProEysLysLysArgLeuAsp410SerThrLysSecVal490GinValLysAlaGluThr315GinCysThrSerLeu395AlaGlyVal285Leulie300LeuAsnPhelieMetAspPheAsp365LeuLys380Arg.ArgGluHisSerLeu255SerlieAsn270GlyTrpValPheHis工lePheSerLys320ArgLeuGly335AsnAlaLys350lieValSerAspSerGlyPheValArgSerLeuAla430AspLeuGluAsn445AlaGluGluAsn460ValLysGinThr475AspArgLysLysGlyTrp400AlaVal415GluArgArgTrpProAspHisGlu480ThrSer4951權利要求1.一個調控果實成熟和品質的基因及其編碼產物與應用，其特征在于具有序列表<400>1項下的序列。2.序列表<400>1項下的序列限定的蛋白質，具有序列表<400>2項下的氨基酸殘基序列或將序列的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列表<400>2項下的氨基酸殘基序列相同活性的由序列衍生的蛋白質。3.y-氨基丁酸(GABA)和氨氧乙酸(AOAA)處理香蕉采后果實，可誘導和抑制權利要求1中的序列所編碼基因表達，進而影響果實成熟過程、果實的硬度、可溶性總糖和淀粉含量等的變化，有效調控果實采后成熟和品質。全文摘要本發(fā)明涉及一個調控果實成熟和品質的基因及其編碼產物與應用，公開了一個與香蕉果實采后成熟過程有關的基因MaGAD1是下列核苷酸序列之一1)序列表中<400>1項下的DNA序列；2)與序列表中<400>1項下限定的蛋白質，具有序列表中<400>2項下的氨基酸殘基序列或將虛列的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列表中<400>2項下的氨基酸殘基序列相同活性的由序列衍生的蛋白質。該基因可被γ-氨基丁酸(GABA)和氨氧乙酸(AOAA)分別誘導和抑制表達，從而調控采后香蕉果實成熟度、硬度、可溶性總糖和淀粉含量等的變化。該基因的應用對于建立香蕉采后果實成熟調控新技術和培育優(yōu)良品種具有重要的理論及實際意義。文檔編號C12N15/60GK101643742SQ20091016493公開日2010年2月10日申請日期2009年7月24日優(yōu)先權日2009年7月24日公開號200910164935.發(fā)明者劉菊華,張建斌,徐碧玉,偉胡,譚光蘭,賈彩紅,金志強申請人:中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所;農業(yè)部熱帶作物生物技術重點開放實驗室;中國熱帶農業(yè)科學院海口實驗站