專利名稱：：診斷和治療癌癥的方法和用于其中的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及癌癥的診斷，為此的組合物及治療癌癥的治療方法。
背景技術(shù)：
：在歐洲和美國，癌癥是繼心臟病之后第二主要的死亡原因。癌癥的特征表現(xiàn)為失控的細胞生長，從而導(dǎo)致對正常組織的局部侵入或異常生長的全身性擴散。特定類型的癌癥或癌癥發(fā)展的特定階段可能涉及兩個元素?；铙w中發(fā)揮功能的各種組織的細胞分裂或生長通常以有序和可控的方式發(fā)生。這是通過精細的生長調(diào)控機制完成的，其中包括接觸，發(fā)出信號及鄰近細胞間的其他通訊。在機能組織中，刺激型或抑制型生長信號通常在細胞間進行交換。當沒有刺激信號時，細胞通常不進行分裂，而當抑制信號占主導(dǎo)地位時，細胞將停止分裂。然而，在癌細胞中，這種發(fā)出信號或通訊是有缺陷的或完全被破壞。因此細胞將持續(xù)分裂；侵入鄰近結(jié)構(gòu)中，并脫離原來的腫瘤塊，在機體的其他部位形成新的生長點。其后轉(zhuǎn)為惡性的過程稱為轉(zhuǎn)移。癌癥通常是指惡性腫瘤而非良性腫瘤。良性腫瘤細胞與正常的周圍細胞是一樣的。這些類型的腫瘤幾乎總是包裹在纖維囊中，不具有轉(zhuǎn)移到機體其他部分的能力。這些腫瘤影響局部器官但并不會損傷它們；它們通常保持很小，多年后也不會產(chǎn)生癥狀。只有當腫瘤長的太大而干擾其他器官時才有治療的必要。相反，惡性腫瘤比良性腫瘤生長的更快；它們滲入并破壞局部組織。一些惡性腫瘤可以通過血液或淋巴系統(tǒng)擴散到全身。惡性腫瘤的不可預(yù)測及失控生長，使其非常危險，而且在很多情況下是致命的。這些腫瘤在形態(tài)上是原組織的非典型形態(tài)，而且不被包裹。惡性腫瘤通常會在手術(shù)切除后復(fù)發(fā)。因此，治療通常針對的是惡性癌癥或惡性腫瘤，發(fā)明一種癌癥形成早期征候的敏感標志物及鑒定與之相關(guān)的有效的生長抑制劑是非常重要的。轉(zhuǎn)移過程是一個幾個連續(xù)步驟均必須成功完成的級聯(lián)過程。第一步包括癌癥細胞從原始腫瘤中脫離，隨后降解并侵入到細胞外基質(zhì)(ECM)及周圍組織中。一旦腫瘤細胞成功地滲入并在淋巴和/或血管系統(tǒng)中存活，它們將由于物理限制(如毛細血管的大小)而俘獲一個次級位點，其生長能力由細胞與器官環(huán)境(如化學(xué)因子激活)的分子間相互作用決定。最后，需要血管供應(yīng)的補充而形成肉眼可見的轉(zhuǎn)移瘤(Chambers,A.F.，等，Nat.Rev,Cancer2(2002)563-572;Welch,D.R.，Clin.Exp.Metastasis15(1997)272-306)。根據(jù)轉(zhuǎn)移中所涉及的大量不同的細胞和分子過程,轉(zhuǎn)移的細胞通常表現(xiàn)出大范圍有助于其轉(zhuǎn)移能力的基因改變。這包括致癌基因的激活，金屬蛋白酶和活動因子的補充，以及多種粘著分子的表達和/或功能性的改變(Hunter,K.W.，等，CancerRes.61(2001)8866-8872;Skubitz，A.P.，CancerTreat,Res.107(2002)305-329)。此外，已描述了8個己知作為轉(zhuǎn)移抑制子的基因(Steeg，P.S.，Nat.Rev.Cancer3(2003)55-63)。盡管對本領(lǐng)域的了解在逐步提高，但許多參與轉(zhuǎn)移過程的關(guān)鍵遺傳和生化事件仍然需要確定。WO02/08288描述了分泌的和跨膜多肽及其編碼核酸。圖130所示的是SMAGP的多肽序列
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明概述令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，編碼多肽SMAGP(小細胞粘附糖蛋白)的核酸在腫瘤細胞，特別是在轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞中過量表達，而在正常細胞中的表達是非常低的。因此，SMAGP是一種有價值的新型靶位點，用于診斷和治療癌癥，優(yōu)選的診斷和治療結(jié)腸癌，肺癌，胰腺癌和乳腺癌以及轉(zhuǎn)移瘤，優(yōu)5選地為肝臟中的轉(zhuǎn)移瘤。另外，SMAGP在腫瘤發(fā)展的早期和晚期發(fā)展階段表現(xiàn)出不同的定位，因此也是一種有價值的用于區(qū)分腫瘤階段的工具。因此本發(fā)明提供了一種確定在患者中癌癥相關(guān)的SMAGP存在的方法，包括(i)從懷疑包含腫瘤細胞或其部分的患者中獲得生物樣品；(ii)檢測樣品中編碼SMAGP的核酸的量或SMAGP多肽的量；和(iii)將所述核酸或多肽的量與預(yù)先測定的表明在所述細胞中癌癥相關(guān)的SMAGP表達或存在的校準線的標準值進行比較，從而確定所述患者中癌癥相關(guān)的SMGAP的表達或存在。本發(fā)明進一步提供了一種包含上述方法檢測患者中存在或不存在癌癥的方法。另外，本發(fā)明提供了一種檢測患者的組織或體液待測樣品是否含有腫瘤細胞或來源于腫瘤細胞的方法，其中使用了待測樣品和第二個來源于同一個體或同一種族不同個體的非腫瘤細胞的樣品，該方法包括以下步驟(a)將每個樣品在嚴謹雜交條件下與核酸探針進行溫育，所述核酸探針選自由下述核酸序列組成的組(0SEQIDNO:l的核酸序列，或其片段；(ii)與(i)中的任何核酸序列互補的核酸序列；(iii)在嚴謹條件下與(i)中的序列雜交的核酸序列；禾口(W)在嚴謹條件下與(ii)中的序列雜交的核酸序列；和(b)測定每份樣品與所述探針雜交的大約量，和(c)將待測樣品雜交的大約量與所述第二個樣品雜交的大約量進行比較，從而鑒定待測樣品是否比所述第二個樣品含有更大量的特定核酸或核酸混合物。本發(fā)明還包括一種檢測腫瘤的方法，包括a)將懷疑患有癌癥的患者樣品與核酸探針進行溫育，所述樣品選自體液，細胞或所述細胞的細胞提取物或細胞培養(yǎng)物上清組成的組，由此所述樣品含有核酸，所述核酸探針選自由下述核酸組成的組(i)SEQIDN0:1所示的核酸或與所述序列互補的核酸，禾口(ii)與(i)中核酸之一雜交的核酸，和b)對雜交進行檢測，優(yōu)選地通過樣品核酸和/或核酸探針的另外的結(jié)合配偶體或通過X-射線放射顯影進行檢測。c)將所述核酸雜交的量與預(yù)先測定的表明所述樣品中癌癥相關(guān)的SMAGP表達的校準線的標準值進行比較，從而確定所述患者是否患有癌癥o所述癌癥優(yōu)選地是結(jié)腸癌，肺癌，胰腺癌或乳腺癌。優(yōu)選地，通過與SMAGP核酸或多肽結(jié)合的結(jié)合試劑進行檢測。更優(yōu)選地，結(jié)合試劑是指在嚴謹條件下與SMAGP核酸雜交的探針或抗體，優(yōu)選地是與SMAGP多肽，優(yōu)選細胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體。所有這些方法也可以通過使用抗體來實現(xiàn)，其中SMAGP多肽通過抗體與多肽之間的相互作用進行檢測。本發(fā)明還提供一種監(jiān)測患者中癌癥，特別是轉(zhuǎn)移性癌癥進程的方法。在該方法中，在至少兩個不同的時間點及時檢測癌癥患者的生物樣品(例如體液，如血液，細胞裂解物或RNA樣品的反轉(zhuǎn)錄物)中SMAGP核酸或多肽的量并進行比較。根據(jù)量的改變，可以推測出所述癌癥的進程信息。特別是轉(zhuǎn)移的形成導(dǎo)致SMAGP的產(chǎn)生增加，例如mRNA的表達。本發(fā)明進一步包括診斷試劑盒，其含有一種或多種在使用樣品的診斷試驗中用于與SMAGP核酸雜交的寡核苷酸探針或引物或抗體，所述樣品獲自患有或懷疑患有癌癥的患者。本發(fā)明進一步包括治療有效量的抗SMAGP多肽的抗體在治療癌癥，優(yōu)選地治療轉(zhuǎn)移性癌癥中的應(yīng)用。優(yōu)選地，對胰腺腫瘤局部給藥該抗體。本發(fā)明進一步包括與多肽SMAGP結(jié)合的抗體在生產(chǎn)用于抑制腫瘤細胞的增殖和/或侵入潛力的組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明進一步包括依照本發(fā)明的抗體的應(yīng)用，其中在體外對細胞培養(yǎng)物給藥該組合物。本發(fā)明進一步包括依照本發(fā)明的抗體的應(yīng)用，其中組合物是一種藥物組合物，其中將所述藥物組合物對患有腫瘤，特別是轉(zhuǎn)移性腫瘤的哺乳動物受試者進行給藥。在本發(fā)明另外的實施方案中，以治療有效劑量對患者給藥抗SMAGP多肽的抗體，從而治療癌癥和/或預(yù)防和/或抑制癌癥引起的轉(zhuǎn)移。7發(fā)明詳述SMAGP基因表現(xiàn)出與人的腫瘤細胞系轉(zhuǎn)移潛能及與腫瘤細胞，特別是結(jié)腸癌，乳腺癌和胰腺癌明確的關(guān)系。編碼的蛋白是一種小的跨膜糖蛋白，它在進化中是非常保守的。用對SMAGP特異的抗體的免疫組化分析表明，該蛋白位于正常上皮結(jié)構(gòu)質(zhì)膜的側(cè)面。在腫瘤發(fā)展過程中，SMAGP的表達水平及定位或者是保守的，或者是與紊亂的上皮結(jié)構(gòu)相關(guān)的改變。據(jù)推測，SMAGP通過其C末端尾與蛋白4.1及MAGUK蛋白相互作用，以控制細胞骨架裝配和信號傳導(dǎo)途徑，從而在細胞與細胞的粘附中起作用。此處所用的術(shù)語"SMAGP"是指編碼序列為SEQIDN0:2的多肽的核酸，優(yōu)選地是SEQIDNO:l的DNA序列和相關(guān)的mRNA序列以及SEQIDNO:2的編碼多肽。由于SMAGP是一種跨膜受體蛋白，因此該多肽在診斷方面是非常令人感興趣的，優(yōu)選地是作為與SMAGP多肽胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體的表位。因此，優(yōu)選的是使核酸樣品和探針針對該區(qū)域，特別是針對其中與其他基因和多肽同源性較低的部分。SMAGP是一種由97個氨基酸組成并具有III型信號錨定序列的跨膜蛋白。SMAGP多肽包括34個氨基酸(aal-34)的胞外結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域(aa35-55)及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(aa56-97)，參見圖7。貫穿本申請所用的短語"核酸或蛋白"是指具有SMAGP活性的核酸或多肽，當通過重組DNA技術(shù)進行生產(chǎn)時，其實質(zhì)上相對于細胞物質(zhì)或培養(yǎng)基來說是游離的，或當進行化學(xué)合成時，其實質(zhì)上相對于化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)是游離的。這種核酸優(yōu)選地是不含有衍生該核酸的生物中天然側(cè)接該核酸的序列(即位于核酸5'和3'端的序列)。此處所用的"SMAGP核酸探針和引物"是指用于通過雜交方法來檢測SMAGP核酸的核酸片段。雜交技術(shù)及條件對本領(lǐng)域中的熟練人員是已知的。例如這種雜交條件如下中度嚴謹條件，其包括用5xSSC，0.5%SDS，1.Ommol/1EDTA，pH8.0的溶液洗滌，接著在50-6(TC5xSSC過夜雜交，用含有0.1%SDS的2xSSC室溫洗滌40分鐘，之后用O.lxSSC，0.1%SDS在5(TC洗滌40分鐘，并更換一次新鮮溶液。作為高度嚴謹雜交條件，也可能使用更高的溫度進行雜交(例如在65-7(TC)。核酸探針及引物通常由至少約50個連續(xù)位置的SMAGP核酸片段，最優(yōu)選的是200—8300個核苷酸組成。探針和引物的優(yōu)化可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)來進行。例如可使用在(http:〃www-genome.wi.mit.edu/genome一software/other/primer3.html)中可獲得的軟件設(shè)計這種探針和引物。對于高選擇性，優(yōu)選地是使用相對低的鹽和/或高的溫度條件，例如鹽濃度從約0.02mol/l到約0.15mo1/1，溫度從約50。C到約7(TC。在診斷檢測中，可使用特異探針和引物鑒定SMAGP多肽。通常該方法包括通過擴增方法，例如PCR方法擴增樣品中的靶序列。定量檢測可通過PCR技術(shù)來完成，優(yōu)選地是通過使用例如RocheDiagnosticsGmbH,DE公司的LightCycler②進行定量RT-PCR。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，檢測前對樣品的編碼核酸進行擴增，例如通過己知的PCR技術(shù)進行擴增。在核酸診斷領(lǐng)域通常使用的是衍生的(標記的)核酸探針。該探針與來源于結(jié)合在載體上的樣品的變性DNA，RNA或RT-DNA進行接觸，在該過程中，根據(jù)核酸探針的長度，組成及得到的預(yù)期雜合子的熔解溫度，其使得標記的DNA或RNA與同源DNA或RNA結(jié)合，來選擇溫度，離子強度，pH和其他緩沖液條件(雜交也參見Wahl，G.M.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76(1979)3683-3687)。合適的載體是基于硝酸纖維素(例如Schleicher和SchUll，BA85，AmershamHybond，C.)的膜或載體物質(zhì)，粉末狀加固的或結(jié)合的硝酸纖維素，或用各種官能基團(例如硝基)衍生的尼龍膜(例如Schleicher和Schtlll，Nytran;NEN，GeneScreen;AmershamHybondM,;PallBiodyne)。為了檢測待測樣品中是否含有腫瘤細胞，應(yīng)對與靶核酸或核酸雜交的的大約核酸量進行測定。雖然本發(fā)明包括了定量測定方法，但雜交的大約量不需要定量測定。典型地，例如，雜交的大約量通過對雜交檢測的視覺觀察而進行定量確定。例如，如果用凝膠來分離樣品中與靶核酸雜交的標記核酸，則可視覺檢査得到的條帶。當對來源于同一種族而無腫瘤細胞的個體中分離的核酸進行雜交時，使用相同的操作流程。通過比較待測樣品中雜交的大約量與無腫瘤細胞的樣品中雜交的大約量來判斷待測樣品中是否含有比無腫瘤細胞的樣品中更大量的靶核酸或核酸。根據(jù)本發(fā)明的另一種方法，不需要使用第二個樣品。為了檢測SMAGP基因的表達是否上調(diào)，將SMAGPmRNA水平與細胞中標準基因(管家基因(參見，例如Shaper，N丄.，等，J,MammaryGlandBiol.Neoplasia3(1998)315-324;Wu，Y.Y.，和Rees,J丄.，ActaDerm.Venereol.80(2000)2-3))的mRNA水平進行比較，優(yōu)選地通過RT-PCR實現(xiàn)。如按照本發(fā)明所示，SMAGP核酸在腫瘤樣品中比無腫瘤細胞樣品中的表達量更大。因此含腫瘤細胞的待測樣品將比無腫瘤細胞的樣品具有更大量的SMAGP核酸。為了鑒定待測樣品為含有上調(diào)的SMAGP核酸，即其中細胞是腫瘤細胞或是乳腺癌腫瘤細胞，優(yōu)選地是待測樣品中SMAGP核酸的大約量比無腫瘤細胞的樣品中的大約量高很多。例如，具有上調(diào)的SMAGP基因的待測樣品可能比無腫瘤細胞的樣品的SMAGP基因的量高大約5—大約60倍。探針與核酸的雜交方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是已知的，并在例如，WO89/06698，EP-A0200362，US2,915,082，EP-A0063879，EP匿A0173251，EP-A0128018中所述。然后，通過在充分洗滌及飽和以防止非特異結(jié)合后，將載體與抗體或抗體片段溫育來檢測雜交DNA或RNA?？贵w或抗體片段針對雜交過程中摻入到核酸探針的物質(zhì)?？贵w依次被標記。然而，也可以使用直接標記的DNA。與抗體溫育后，再次進行洗滌，以只檢測特異結(jié)合的抗體偶聯(lián)物。然后，根據(jù)已知方法，通過抗體或抗體片段的標記進行檢測。例如，可以如下進行表達的檢測一與固定的整個細胞及固定的組織涂片進行原位雜交，一克隆雜交(細胞)和蝕斑雜交(噬菌體和病毒)，一Southem雜交(DNA檢測)，一Northern雜交(RNA檢測)，一血清型分析(例如，通過slot-blot分析血清中細胞類型)，一擴增后(例如，PCR技術(shù))。因此，依照本發(fā)明的核酸在腫瘤診斷和表征中是有價值的標志物。根據(jù)本發(fā)明，SMAGP表達的抑制物(例如抗體或反義核苷酸)可用于在體內(nèi)抑制腫瘤進程。本發(fā)明進一步提供鑒定和分離SMAGP拮抗物或SMAGP表達的抑制物(例如抗體或反義核苷酸)的方法。這種拮抗物或抑制物可用于在體內(nèi)抑制腫瘤進程及造成腫瘤細胞大量凋亡。根據(jù)本發(fā)明，提供了鑒定和分離在治療癌癥過程中具有效能的SMAGP拮抗物的方法。這些方法包括調(diào)控依照本發(fā)明的多肽表達的方法，鑒定與依照本發(fā)明的蛋白選擇性結(jié)合的SMAGP拮抗物的方法，及鑒定可調(diào)控所述多肽活性的SMAGP拮抗物的方法。這些方法進一步包括調(diào)控，優(yōu)選地抑制SMAGP基因轉(zhuǎn)錄成mRNA的方法。這些方法可以體外或體內(nèi)進行，并且可利用和建立本發(fā)明的細胞系和轉(zhuǎn)基因動物模型。SMAGP拮抗物定義為一種降低或抑制SMAGP，一種多肽的生物活性和/或抑制SMAGP基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的物質(zhì)或化合物。一般來說，SMAGP拮抗物的篩選程序包括將候選物質(zhì)與其中在適于測定SMAGP活性的條件下由SMAGP表達介導(dǎo)侵入的宿主細胞接觸?？赏ㄟ^幾種方法測定SMAGP活性。典型地，通過改變細胞生理性，例如增加運動性或體外侵入性，或通過改變分化狀態(tài)，或通過改變細胞代謝從而導(dǎo)致增殖的提高，活化是明顯的?？赏ㄟ^重組方法或合成方法生產(chǎn)SMAGP多肽。當在原核生物中通過重組方法進行生產(chǎn)時，得到的是非糖基化的SMAGP多肽。借助于本發(fā)明所提供的核酸序列，可以在任何理想的細胞(例如除人細胞以外，還在其他哺乳動物的細胞中)的基因組中尋找SMAGP基因或其變異體，從而鑒定這些并分離編碼SMAGP蛋白的基因。該過程及合適的雜交條件對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是已知的，并描述在例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork,USA，禾口Hames，B.D.，Higgins，S.G.，NucleicAcidHybridisation:APracticalApproach(1985)IRLPress,Oxford,英國。既然是這樣，在這些出版物中所述的標準操作通常用于實驗。借助于編碼SMAGP多肽的核酸，可以可再生的方式和大量的方式獲得依照本發(fā)明的多肽。對于原核或真核生物中的表達，例如原核宿主細胞或真核宿主細胞，根據(jù)本領(lǐng)域熟練人員熟知的方法將核酸插入到合適表達載體中。這種表達載體優(yōu)選地含有可調(diào)控的/可誘導(dǎo)的啟動子。然后將這些重組載體導(dǎo)入到合適的宿主細胞中進行表達，例如大腸桿菌作為原核宿主細胞或釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，畸胎癌細胞系PA-1，scli9117(Bmtner，R.,等，Mol.Cell.Biol.il(1991)3573-3583)，昆蟲細胞，CHO或COS細胞作為真核宿主細胞，在允許異源基因表達的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞。根據(jù)已知方法將蛋白從宿主細胞或宿主細胞的培養(yǎng)液上清液中分離出來。這類方法描述在例如AusubelI.，F(xiàn)rederickM.，CurrentProtocolsinMol.Biol.(1992)，JohnWiley禾口Sons，NewYork中。如果在細胞培養(yǎng)物中不是以可溶形式存在，則還需要進行體外蛋白再活化。SMAGP多肽或其片段在重組產(chǎn)生后可通過已知的蛋白純化技術(shù)，包括免疫沉淀，凝膠過濾，離子交換層析，層析聚焦，等電聚焦，選擇性沉淀，電泳等進行親和層析而純化，并可用于產(chǎn)生抗SMAGP的抗體。本發(fā)明進一步包括適于表達SMAGP的重組表達載體，用該表達載體轉(zhuǎn)染的重組宿主細胞，以及重組產(chǎn)生SMAGP基因編碼的蛋白的方法。可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法生產(chǎn)抗SMAGP的抗體。例如，利用含有全長多肽或其片段的多肽可以產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體。例如，從SMAGP衍生的合適多肽包括氨基酸83-97。得到的抗體可通過標準技術(shù)，例如酶聯(lián)免疫吸附測定來篩選其與SMAGP結(jié)合的能力。例如，在Mole，"EpitopeMapping"，In:MethodsinMolecularBiology,巻10，Manson(編輯)，105-116頁，TheHumanaPress，Inc.，1992;Price"ProductionandCharacterizationofSyntheticPeptide-DerivedAntibodies"，In:MonoclonalAntibodies:Production，Engineering,禾QClinicalApplication,Ritter禾BLadyman(編輯)，60-84頁，CambridgeUniversityPress,1995;Morris(編輯)，EpitopeMappingProtocols25，HumanePress,Inc.,1996;禾口Coligan等(編輯)，CurrentProtocolsinImmunology,9.3.1-9.3.5頁和9.4.1-9.4.11頁，JohnWiley&Sons,1997中描述了鑒定抗原表位和生產(chǎn)抗體的方法。根據(jù)本發(fā)明有用的，特別是用于治療目的的抗體可通過降低腫瘤細胞增殖和侵入潛能而進行鑒定。基于此目標，將腫瘤細胞或腫瘤細胞系，優(yōu)選地為細胞系SUIT-2007，用抗SMAGP的抗體進行處理，然后用細胞增殖試劑WST-1(—種四唑鹽試劑，RocheDiagnosticsGmbH，DE)和Matrigel侵入檢測法(BDSBiosciences,www.bdbiosciences.com)測定其增殖和侵入潛能?？筍MAGP抗體可衍生自任何動物物種，或是嵌合的或是人源化的抗體。特別優(yōu)選地是人抗體。例如，人單克隆抗體可從構(gòu)建的應(yīng)答于抗原刺激而產(chǎn)生特異的人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得。在該技術(shù)中，將人的重鏈和輕鏈基因座元件導(dǎo)入到源自包含靶向破壞的內(nèi)源重鏈和輕鏈基因座的胚胎干細胞系的小鼠株系中。轉(zhuǎn)基因小鼠可以合成針對人抗原特異的人抗體，該小鼠可用于生產(chǎn)分泌人抗體的雜交瘤。從轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得人抗體的方法描述在例如Green，L丄.，等，Nat.Genet.7(1994)13-21;Lonberg，N.，等，Nature368(1994)856-859;和Taylor，L.D.，等，Int.Immun.6(1994)579-591。可通過多種成熟的技術(shù)從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化單克隆抗體。這些分離技術(shù)包括用蛋白A-瓊脂糖親和層析，大小排阻層析及離子交換層析(參見，例如，Coligan在2.7.1-2.7.12頁及2.9.1-2.9.3頁;Baines等，"PurificationofImmunoglobulinG(IgG)，，，In:MethodsinMolecularBiology,巻10，79-104頁，TheHumanaPress，Inc.,1992)。根據(jù)本發(fā)明，該抗體可用于免疫測定。通過將生物樣品與抗體接觸，然后將生物樣品與結(jié)合抗體的可檢測的標記分子接觸可以進行檢測?？贵w可與抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素(或生物素)偶聯(lián)，可檢測的標記分子可包括生物素(或抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素)。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，該基本技術(shù)的很多變型都是眾所周知的。備選地，抗體可與可檢測的標記偶聯(lián)，形成免疫偶聯(lián)物。合適的可檢測標記物包括例如放射性同位素，熒光標記，化學(xué)發(fā)光標記，酶標記，生物發(fā)光標記或膠體金。對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，制備和檢測這些可檢測標記的免疫偶聯(lián)物的方法是熟知的，并在下面進行詳細描述。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的抗體可用于治療腫瘤患者，特別是轉(zhuǎn)移性腫瘤患者。這種使用含抗SMAGP抗體的藥物組合物進行治療的方法其優(yōu)勢可在體內(nèi)胰腺腫瘤模型中得到證實。該模型由Alves，F(xiàn).，等，Pancreas23(2001)227-235描述。該體內(nèi)模型包括重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中的導(dǎo)管腺癌同位移植模型。合適的人結(jié)腸腺癌模型KM12由Morikawa，K.，等，CancerRes.48(1988)6863-6871描述。SCID小鼠中的轉(zhuǎn)移細胞系KM12SM和KM12L4A同位移植產(chǎn)生腫瘤和形成轉(zhuǎn)移。基于皮下注射的NIH-H460細胞系的人肺腫瘤模型由Corti，C.，等，J.CancerRes.Clin.Oncol.122(1996)154-160描述。NIH-H460細胞系由肺巨細胞癌衍生，并在皮下注射到無胸腺小鼠中后在肺部產(chǎn)生轉(zhuǎn)移瘤。合適的乳腺癌模型是基于來源于導(dǎo)致腫瘤和轉(zhuǎn)移形成的乳腺癌細胞系MDA-MB-435的同位(在裸鼠)移植腫瘤(John，C.M.，等，Clin.CancerRes.9(2003)2374-2383)。一般來說，抗SMAGP抗體的給藥劑量根據(jù)多種因素，例如受試者年齡，體重，身高，性別，常規(guī)的醫(yī)療條件及以前病史而改變。作為一個示例，可以低蛋白劑量例如每劑量為20到100毫克30蛋白，給藥一次或重復(fù)給藥來給藥抗SMAGP抗體組合物。備選地，可以每劑量30-卯毫克蛋白，或每劑量40-80毫克蛋白，或每劑量50-70毫克蛋白的劑量來給藥抗體。優(yōu)選地，通過局部導(dǎo)管通過靜脈，肌內(nèi)灌輸對受試者給藥抗體組分，優(yōu)選地是直接針對或臨近胰腺器官?？梢酝ㄟ^持續(xù)灌輸或通過單個或多個藥丸進行給藥?？筛鶕?jù)己知方法配制含抗SMAGP抗體的藥物組合物，以制備藥學(xué)上有用的組合物，從而將治療性蛋白與藥用載體形成混合物。如果接受的患者可耐受它的給藥，則認為該組合物是"藥用載體"。無菌磷酸鹽緩沖的鹽水是一種藥用的載體的實例。其他合適的載體對本領(lǐng)域中的技術(shù)人員來說是已知的，例如參見Gennaro(編輯)，Remington'sPharmaceuticalSciences,第19版，MackPublishingCompany,1995。為了達到治療目的，對患者給藥治療有效量的抗SMAGP抗體和藥用載體。如果給藥劑量是生理上有效的，則認為抗體和藥用載體的組合是以"治療有效量"給藥的。優(yōu)選地，以液態(tài)可注射或可灌注形式提供含抗SMAGP抗體的藥物組合物。以下提供的實施例，參考文獻，序列表和附圖用于幫助理解本發(fā)明，其真正范圍列于后附的權(quán)利要求中。應(yīng)理解在不偏離本發(fā)明精神的情況下可對闡述的程序進行修改。附圖簡述圖l大鼠和人具有不同轉(zhuǎn)移潛能的等基因腺癌細胞系體系中SMAGPmRNA表達的NorthemBlot分析。每個泳道的瓊脂糖甲醛膠上樣IOUg總RNA。通過溴化乙啶染色28S和18S核糖體RNA估測等量上樣的總RNA。每個細胞系均顯示出非轉(zhuǎn)移(-)，低轉(zhuǎn)移(±)或高轉(zhuǎn)移(+)潛能。(A)等基因大鼠胰腺腺癌細胞系BSp73-AS和BSp73-ASML。(B)等基因大鼠前列腺腺癌細胞系G，AT-l,AT-3，AT-6，MAT-Lu和MAT-LyLu。(C)等基因大鼠乳腺腺癌細胞系MTPa，MTC，MTLn2和MTLn3。(D)等基因人胰腺腺癌細胞系S2-028和S2-007。(E)等基因人結(jié)腸腺癌細胞系KM12C，KM12SM和KM12L4。(F)等基因人結(jié)腸腺癌細胞系HCT116和HCT116-c15.5。在所有體系中，SMAGPmRNA的高水平表達與具有轉(zhuǎn)移潛能的癌細胞相關(guān)。圖2SMAGP的免疫表征。用N-糖苷酶F(PNGaseF)，唾液酸酶和O-糖苷酶進行酶法去糖基化反應(yīng)前后，SMAGP與MTLn3(泳道c-f)和HCT116-cl5.5細胞(泳道g-k)的蛋白提取物進行WesternBlot分析。N-糖基化的運鐵蛋白，oc-酸和核糖核酸酶B糖蛋白作為N-糖苷酶F處理(泳道a-b)的陽性對照。SMAGP通過加入唾液酸和O-糖基化進行翻譯后修飾。圖3人正常組織中SMAGPmRNA表達的NorthemBlot分析。每個泳道上樣20ug總RNA。用18SRNA探針的膜雜交作為上樣對照。在幾乎所有被研究的組織中均觀察到SMAGP由弱到強的表達。圖4人正常組織和癌組織中SMAGP表達的免疫組化分析。A-D:分別為正常乳腺，子宮內(nèi)膜，結(jié)腸和肝(膽道)組織。SMAGP主要位于上皮細胞的質(zhì)膜側(cè)面。E-H:來自結(jié)腸癌患者的腫瘤樣品。E和G:為原發(fā)腫瘤，F(xiàn)和H:肝臟轉(zhuǎn)移瘤。C:來自同一個患者的正常結(jié)腸組織。分化良好的腫瘤(E和F)表現(xiàn)出SMAGP的強表達，位于質(zhì)膜上的蛋白是或多或少保守的。相反，未分化的腫瘤與蛋白的細胞質(zhì)定位(G和H)相關(guān)，而且SMAGP表達降低(H)。放大倍數(shù)A-D放大200倍；E-H放大100倍。圖5在人胰腺組織中檢測hSMAGPmRNA表達。圖6通過實時定量RT-PCR測定人結(jié)腸組織中hSMAGPmRNA的表達。結(jié)果表示為歸一化的hSMAGPmRNA表達水平。正常樣品，原發(fā)腫15瘤和轉(zhuǎn)移瘤樣品分別以白色，陰影線和點線表示。來源于同一個患者的樣品一起配對。N為正常結(jié)腸；Ta為DukeAstadium結(jié)腸癌；Tb為DukeBstadium結(jié)腸癌；Tc為DukeCstadium結(jié)腸癌；Td為DukeDstadium結(jié)腸癌；M為肝臟轉(zhuǎn)移瘤；NL為正常肝組織。圖7SMAGP的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。具體實施例方式實施例1細胞培養(yǎng)在轉(zhuǎn)移行為具有顯著差異的等基因腫瘤細胞系的有效性為轉(zhuǎn)移過程的研究提供了良好的模式。為了此目的，使用了大鼠腫瘤細胞體系BSp73，它包括兩個穩(wěn)定的由一系列自發(fā)的大鼠胰腺腫瘤移植而得到的變異體非轉(zhuǎn)移性BSp73-AS變異體和轉(zhuǎn)移性BSp73-ASML變異體(Matzku，S.，等，InvasionMetastasis3(1983)109-123)。先前的研究已證實它構(gòu)成一個合適的細胞模型以鑒定轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。為了鑒定與轉(zhuǎn)移表型相關(guān)的表面分子，產(chǎn)生了抗轉(zhuǎn)移BSp73-ASML細胞系的膜蛋白的單克隆抗體，并鑒定了僅存在于轉(zhuǎn)移變異體表面的四種蛋白(CD44v，D6.1A，C4.4A禾口EGP314)。通過幾種非轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子證明它們參與轉(zhuǎn)移過程?；虻谋磉_足以賦予轉(zhuǎn)移潛能或促進轉(zhuǎn)移級聯(lián)過程的各個步驟(Claas，C.，等，J.Cell.Biol.141(1998)267-280;Gunthert，U.，等，Cell65(1991)13-24;Rosel，M.，等，Oncogene17(1998)1989-2002;和Wurfel，J.，等，Oncogene18(1999)2323-2334)。另外，在許多人類癌癥中，CD44v的失控表達與較差的預(yù)后相關(guān)。大鼠胰腺腺癌細胞系BSp73-AS和BSp73-ASML由Matzku，S.，等，InvasionMetastasis3(1983)109-123所描述。大鼠前列腺腺癌細胞系G，AT-1，AT-3，AT-6，MAT-Lu和MAT-LyLu(Isaacs,J.T.，等，Prostate9(1986)261-281)購自歐洲動物細胞保藏中心(ECACC，Salisbury,UK)。人結(jié)腸腺癌細胞系KM12C，KM12SM和KM12L4由Morikawa，K.，等，CancerRes.48(1988)6863-6871所描述。人結(jié)腸腺癌細胞系HCT11616由Brattain，M.G.，等，CancerRes.41(1981)1751-1756所描述。HCT116-cl5.5是從來源于肺轉(zhuǎn)移瘤的HCT116體內(nèi)分離而得到的，并鑒定為具有高轉(zhuǎn)移性。以上所述的細胞系在補加0^胎牛血清和2mML-谷氨酸的無抗生素的RPMI1640中進行培養(yǎng)。大鼠乳腺腺癌細胞系MTPa，MTC，MTLn2和MTLn3由Neri，A.，等，J.Natl.CancerInst.68(1982)507-517所描述，并在補加100/^胎牛血清的MEM-cx中培養(yǎng)。人胰腺腺癌細胞系S2-028和S2-007由Taniguchi，S.，等，Clin.Exp.Metastasis10(1992)259-266所描述，并在補加10X胎牛血清和2mML-谷氨酸的D-MEM中進行培養(yǎng)。所有細胞系均無支原體污染。實施例2NorthernBlotting用RNeasymidikit(Qiagen，Hilden，德國)從冷凍細胞中分離總RNA。IOUg總RNA在變性l^瓊脂糖甲醛膠中進行大小分離，并點樣(NorthernMaxblottingkits,Ambion)到尼龍膜(BrightStar-PlusTM，Ambion，Austin,USA)上。紫外交聯(lián)(UVStratalinker2400，Stratagene，LaJolla，USA)后，用[a-32p]dATP標記的cDNA(Tarb6，N.，等，AnticancerRes.22(2002)2015-2027)雜交斑點。通過溴化乙啶對核糖體RNA的染色證實瓊脂糖甲醛膠上等量上樣的總RNA。通過使用商品化的人總RNAblots(NorthernTerritory,Invitrogen，Huntsville，USA)測定人正常組織中SMAGPmRNA的表達。每泳道上樣20ug總RNA，并通過18SRNA的定量來檢查等量的上樣量。如上述進行印跡。通過RT-PCR制備大鼠及人SMAGPmRNA的cDNA探針，所用引物對分別如下B1(TTGTGGTATCCAGCCTCCA)(SEQIDNO:3)/B2(GGCTCCAACACTGAGACACTG)(SEQIDNO:4)及HI05(ACAAAGGCAGCTACGTCACC)(SEQIDNO:5)/106(CTTTCTCCATGTCCCTGGTC)(SEQIDNO:6)。得到的探針分別對應(yīng)于大鼠及人SMAGPmRNA3'UTR的290bp和295bp區(qū)域。實施例3RACE-PCR用SMARTRACEcDNA擴增試劑盒(Clontech，PaloAlto，USA)通過RACE-PCR獲得全長的rSMAGPcDNA序列。根據(jù)制造商的說明書，將lugBSp73-ASML細胞系總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。5'和3'非翻譯區(qū)分別用Clontech通用引物和rSMAGP序列特異引物B140(5，-GATGAAGTACTCTTCCTTCTCTTTGC-3，)(SEQIDNO:7)及B139(5'-AAGGGGAGCCCAGCGCCATCCTCCAG-3，)(SEQIDNO:8)通過PCR進行擴增。將PCR產(chǎn)物克隆至UpCR⑧4-TOPO載體(Invitrogen)上，并用ABIPRISM310測序儀(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,USA)進行測序。實施例4抗體禾口WesternBlotting兔抗SMAGP的多克隆抗體由EurogentechS.A.(Herstal，比利時)公司生產(chǎn)。將對應(yīng)于hSMAGP(SEQIDNO:2)殘基83-97的合成肽ESDLAKGSEKEEYFI偶聯(lián)到KLH(匙孔血藍蛋白)上，并注射到兔中。將抗該合成肽的免疫反應(yīng)血清進行親和純化。單克隆兔抗體根據(jù)Spieker-Polet，H.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)9348-9352進行生產(chǎn)。對于WestemBlotting,用含蛋白酶抑制劑混合物(完全無EDTA的蛋白酶抑制劑，RocheDiagnostics,Mannheim,Germany)的RIPA緩沖液(50mMTris-ClpH7.5，150mMNaCl，l%NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS)提取蛋白。用NuPAGE⑧的12XBis-Tris膠(Invitrogen,Carlsbad,USA)及NuPAGE⑧MES的SDS電泳緩沖液(Invitrogen)在還原條件下進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。當凝膠半干后，印跡到硝酸纖維素膜并在加入5%脫脂奶粉(Merck,Darmstadt,Germany)的TBS緩沖液(100mMTris-Cl，pH7.5，150mMNaCl)中進行封閉。在與稀釋1:5000作為第一抗體的兔抗SMAGP溫育后，將膜在含有0.1%Tween20的TBS緩沖液中進行洗滌，然后與偶聯(lián)辣根過氧化物酶的抗兔作為第二抗體(RocheDiagnostics)進行溫育，并再次進行洗滌。通過增強的化學(xué)發(fā)光(Lumi-lightPUJSWesternBlotting底物，RocheDiagnosticsGmbH,Germany)進行抗體檢測。實施例5去糖基化檢測100ug或更少的100'C變性5分鐘的總細胞裂解物在反應(yīng)緩沖液(0.05mM磷酸鈉，pH7)和變性緩沖液(2%SDS，1MJ3-巰基乙醇)中進行酶促去糖基化實驗。然后向溶液中加入TritonX-100至終濃度10X。在總體積50u1的溶液中分別加入N-糖苷酶F(PNGaseF)，唾液酸酶和O-糖苷酶(Sigma，Steinheim，Germany)至終濃度分別為lOOU/ml，100mU/ml和25mU/ml。樣品在37'C溫育3小時。人運鐵蛋白，oc-酸和核糖核酸酶B糖蛋白作為PNGaseF活性的陽性對照，在還原條件下進行SDS-PAGE分析，并通過考馬斯藍染色進行顯色。去糖基化反應(yīng)后，通過與兔抗SMAGP抗體的WesternBlotting分析SMAGP。實施例6免疫組化分析在磷酸鹽緩沖的福爾馬林(4%)中固定組織。用過氧化物酶-抗過氧化物酶體系(DAKO，Carpinteria，CA)對石蠟包埋的組織切片進行免疫組化分析，如前所述(R6gnier，C.H.，等，J.Biol.Chem.270(1995)25715-25721)。所用抗SMAGP抗體稀釋1:1000。實施例7大鼠及人癌細胞系中與轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)的SMAGPmRNA的表達在一組具有不同轉(zhuǎn)移潛能的等基因腫瘤細胞系中分析SMAGPmRNA的表達。首先在大鼠胰腺，前列腺和乳腺腫瘤細胞系體系中(圖lA-C)分析表達。在非轉(zhuǎn)移性細胞系BSp73-AS，G和MTPa中沒有檢測到rSMAGPmRNA或者其水平很低。相反，發(fā)現(xiàn)在所有轉(zhuǎn)移性細胞系(B5p73-ASML,AT-1，AT-3，AT-6,MAT-Lu，MAT-LyLu，MTLn2和MTLn3)中，除了弱轉(zhuǎn)移性MTC細胞系之外，其表達均很強。圖1D-F所示的是在一個乳腺癌和兩個結(jié)腸人等基因腫瘤細胞體系中hSMAGPmRNA的表達。注意到相對于非轉(zhuǎn)移或低轉(zhuǎn)移性細胞(S2-028，KM12C和HCT116)來說，高轉(zhuǎn)移性細胞(S2-007，KM12SM，KM12L4和HCT116-c15.5)中hSMAGPmRNA是過量表達的。因此SMAGP在人和大鼠細胞系體系中的表達與它們的轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)。實施例8SMAGP蛋白的翻譯后修飾為了進一步表征SMAGP蛋白，制備了抗相應(yīng)于hSMAGPC末端部分最后15個殘基的合成肽的多克隆抗體，該最后15個殘基在大鼠和人SMAGP中的保守性為80X。為了驗證預(yù)期的SMAGP蛋白的翻譯，在還原條件下對大鼠(MTLn3)和人(HCT116-c15.5)腫瘤細胞的蛋白提取物進行WestemBlot分析。觀察到分別相應(yīng)于SMAGP約23和25kDa的條帶(圖2中泳道c和g)。這表明該表達蛋白的大小比預(yù)計分子量約增加2倍。由于SMAGP—級序列中含有幾個推測的糖基化位點，因此對通過N-糖苷酶F(PNGaseF)，唾液酸酶和O-糖苷酶進行去糖基化后的蛋白提取物進行同樣的WestemBlot分析，以確定SMAGP是否被翻譯后修飾。PNGaseF處理(圖2泳道d和h)對表觀分子量(MW)沒有影響，這表明SMAGP不是N-糖基化的。唾液酸酶處理(圖l泳道e和i)導(dǎo)致一個小條帶發(fā)生遷移，提示SMAGP被唾液酸修飾。另外用O-糖苷酶處理(圖2泳道f和j)導(dǎo)致表觀分子量顯著遷移，這與存在O-糖基化位點是一致的。最后，單獨用O-糖苷酶處理(圖2泳道k)對SMAGP的MW沒有影響，這表明有唾液酸連接到O-連接的寡糖上，己知這可以抑制O-糖苷酶的作用(Fukuda，M.，等，J.Biol.Chem.262(1987)11952-11957)。N-糖基化的運鐵蛋白，a-酸和核糖核酸酶B糖蛋白作為PNGaseF處理的陽性對照(圖2泳道a和b)。實施例9在人正常組織中SMAGP的表達和亞細胞定位通過NorthemBlot分析，在一組正常人組織中估測SMAGP的分布(圖3)。SMAGPmRNA的表達是相對普遍存在的，在胎盤中檢測到最高的表達水平。在食管，結(jié)腸和脂肪組織中也檢測到強烈的表達。因此，通過抗SMAGP抗體在正常結(jié)腸，乳腺，肺和膽道組織中進行的免疫組化實驗表明SMAGP蛋白在所有器官中都是強烈表達的(圖4，A-D)。SMAGP的表達限制在以形成立體細胞形態(tài)的細胞-細胞粘附為特征的極化上皮結(jié)構(gòu)中。在細胞中，該蛋白主要定位在質(zhì)膜上。另外，在整個質(zhì)膜上未觀察到SMAGP,其僅定位于細胞-細胞上皮連接處的側(cè)面膜區(qū)域?；c和頂點的膜側(cè)面均沒有SMAGP。在細胞質(zhì)中也觀察到較弱的染色。實施例10在人結(jié)腸原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤中SMAGP的表達及亞細胞定位在來源于結(jié)腸癌患者的原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤中檢測SMAGP。圖4所示的是來源于同一個患者組織所獲得的免疫組化染色的例子(C，正常結(jié)腸；E和G，原發(fā)腫瘤；F和H，肝轉(zhuǎn)移瘤)。在原發(fā)腫瘤中，SMAGP的表達可保持相當高的水平(E)或表現(xiàn)出減弱的表達(G)。此外，在某些情況下，SMAGP亞細胞定位是部分保守的(E)，而在另外的情況下，SMAGP不再限定于質(zhì)膜上，而是或多或少存在于細胞質(zhì)中(G)。在肝轉(zhuǎn)移瘤中也獲得了類似結(jié)果(F和H)。因此，對于一個給定的患者，在原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤中可觀察到各種SMAGP表型，甚至這些表型根據(jù)區(qū)域可共存于同一個腫瘤中(F)。有趣的是，在所有被研究的原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤中，SMAGP蛋白表達的強烈水平和細胞膜定位均與一種保守的上皮結(jié)構(gòu)相關(guān)(E和F相對于G和H)。對來源于乳腺癌和肺癌患者的原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤中也觀察到同樣結(jié)果。實施例11在人胰腺組織中檢測hSMAGPmRNA的表達在10個人胰腺癌(圖5，藍線)和5個人正常胰腺組織(圖5，白線)通過定量RT-PCR(TaqmanTechnology)評估了hSMAGPmRNA的表達。另外也在人胰腺腫瘤細胞系CapanI中測定了hSMAGP的表達。相對于在正常胰腺組織中所達到的hSMAGP表達的最高值來說，在5個癌樣品中觀察到過量表達，其倍數(shù)的變化表示在相應(yīng)線條上面的括號中。Taqman分析方案用PE公司的試劑迸行PCR:4u1SybrGreen緩沖液，4.8lUMgCl2，3.2uldNTPs,0.2ulUNG，0.2u1AmplitaqGold,4ul引物混合物，1u1cDNA,22.6u1H20所用PCR反應(yīng)條件如下起始步驟2min50。C，10min95。C，40個循環(huán)15sec95。C，lmin60。C為了檢測每個cDNA各自基因的表達，進行兩個PCR反應(yīng)(雙檢測)。同時，使用相同的cDNA用xsl3進行PCR。ABI序列檢測程序表明每個PCR的CT值。對各自基因，將各個cDNA的CT值進行平均(即，兩次測定的平均值。而對xsl3而言，每個cDNA只有一個值)。然后從上述平均值推測每個cDNA的xsl3值。僅健康cDNA的差異形成一個平均值。慢性胰腺炎，胰腺癌和健康胰腺cDNA的差異除以該平均值。然后，以基數(shù)2的次冪的方式表示這些商(因為在PCR中，產(chǎn)物在每個反應(yīng)中加倍)。然后這些值的倒數(shù)即代表各個cDNA相對于健康cDNA的表達。實施例12在人結(jié)腸組織中檢測hSMAGPmRNA的表達首先在結(jié)腸癌患者的人組織樣品中檢測與腫瘤擴散相關(guān)的hSMAGP表達的臨床病理學(xué)意義。通過定量RT-PCR(Light-Cyclertechnology)在9個正常結(jié)腸樣品，9個結(jié)腸原發(fā)腫瘤樣品(具有己知的Duke，sstadium)和9個肝轉(zhuǎn)移瘤樣品中評估m(xù)RNA的表達(圖6)。正常和原發(fā)腫瘤樣品來自同一個患者，而肝轉(zhuǎn)移瘤來自不同患者。相對于正常結(jié)腸來說，獨立于Dukes階段，在所有配對的腫瘤中均觀察到強烈的過量表達。此外，在轉(zhuǎn)移瘤中SMAGPmRNA水平比9個原發(fā)腫瘤樣品中的其中6個(75%的病歷)所達到的數(shù)值高。以4個正常肝組織樣品作為肝中hSMAGP表達的對照，證明hSMAGP在轉(zhuǎn)移瘤中的高水平表達不是由器官的環(huán)境引起的。這22些結(jié)果證實，相對于正常結(jié)腸粘膜來說，hSMAGPmRNA在人結(jié)腸腫瘤中是過量表達的，而且表明，相對于原發(fā)腫瘤來說，有75%的病歷在肝轉(zhuǎn)移瘤中的表達量增加。通過RNeasy試劑盒(Qiagen)提取的總RNA在用寡聚dT和AMV反轉(zhuǎn)錄酶(RocheDiagnostics)進行第一鏈cDNA合成前用DNaseI(Quiagen)進行處理。然后用含有raDNA聚合酶和rgoDNA聚合酶(RocheDiagnostics)的特定酶混合物進行聚合酶鏈反應(yīng)。使用冷凍結(jié)腸組織樣品中提取的總RNA進行定量RT-PCR。DNaseI處理后，總RNA(lPg)用隨機六堿基序列和AMV反轉(zhuǎn)錄酶(RocheDiagnostics)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。根據(jù)hSMAGP序列，設(shè)計兩個基因特異引物(H103:5，-AGAAGATGGAGCCAGCACAG-3,)(SEQIDNO-'9)和(HI04:5，-ATCTGGACGATGGCACTGG-3，)(SEQIDNO:10)。這些引物位于兩個不同外顯子上，以避免基因組DNA的污染。通過LightCycler系統(tǒng)和DNAMasterSYBRGreenI試劑盒(RocheDiagnostics)進行PCR反應(yīng)的實時監(jiān)測。優(yōu)化后，在終體積20ul的PCR反應(yīng)混合物中，包括4mMMgCl2，0.4iaM的每種引物，21cDNA溶液和2u1SYBRGreenI。每個實驗重復(fù)進行兩次。用一系列稀釋(1:10，1:50和1:80)的人結(jié)腸腺癌細胞系KM12SMcDNA產(chǎn)生靶基因hSMAGP和內(nèi)源性參考18SRNA的校準曲線。對于每個樣品，從校準曲線上測定耙基因和內(nèi)源性參考RNA的相對量。樣品中hSMAGPmRNA的表達水平通過對每個樣品將hSMAGPmRNA的量除以18SRNA的量而進行歸一化。實施例13SMAGP表達對大鼠轉(zhuǎn)移形成的影響用SMAGP或單獨用載體(模擬轉(zhuǎn)染)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染大鼠胰腺腺癌的低轉(zhuǎn)移性變異體——BSp73AS細胞。篩選到兩個模擬轉(zhuǎn)染克隆和四個克隆，其在SMAGP表達強度方面略有不同。這些克隆和未轉(zhuǎn)染的BSp73AS及BSP73ASML細胞進行腹膜內(nèi)注射或足內(nèi)注射BDX大鼠(原始株系)，以控制轉(zhuǎn)染的BSp73AS細胞轉(zhuǎn)移能力的潛在增加。由于兩個模擬轉(zhuǎn)染克隆和四個SMAGP轉(zhuǎn)染克隆的生長行為并沒有顯著不同，因此將來自這兩個模擬轉(zhuǎn)染克隆和四個SMAGP轉(zhuǎn)染克隆的數(shù)據(jù)進行合并(表l)。進行腹膜內(nèi)施用后，BSp73AS和BSp73AS-模擬細胞在腹腔內(nèi)專有地形成大的節(jié)結(jié)，BSp73AS和BSp73AS-模擬移植大鼠的平均存活時間為20天。而接受BSp73ASML細胞的大鼠的平均存活時間為40天。腫瘤在腹腔中長成栗粒狀形式，而且所有的大鼠均死于肺部形成的栗粒狀轉(zhuǎn)移。在12個接受SMAGP-轉(zhuǎn)染的BSp73AS細胞的大鼠中，6個在腹腔中發(fā)展為大的節(jié)結(jié)(類似于注射BSp73AS細胞的大鼠)，而另外6個表現(xiàn)為在腹腔中栗粒狀腫瘤的生長。4個大鼠具有肝轉(zhuǎn)移瘤，而2個大鼠分別在腎和卵巢中發(fā)展為轉(zhuǎn)移瘤。在2個大鼠中，膈膜被腫瘤大量滲透。沒有大鼠表現(xiàn)出肺轉(zhuǎn)移瘤。這些結(jié)果證實轉(zhuǎn)移潛能的增加(表1A)。為了驗證該發(fā)現(xiàn)，足內(nèi)注射腫瘤細胞，這樣可使轉(zhuǎn)移過程更容易被追蹤。當在足內(nèi)施用后而不切除腫瘤時，所有的大鼠均在腿彎部的引流淋巴結(jié)處發(fā)展為轉(zhuǎn)移瘤，但只有接受BSp73ASML(5/5)的大鼠和接受SMAGP轉(zhuǎn)染的BSp73AS細胞(4/5)的大鼠在遠處(旁主動脈，腹股溝和腋窩處)的淋巴結(jié)發(fā)展為轉(zhuǎn)移瘤。另夕卜，只有接受BSp73ASML(5/5)的大鼠和接受SMAGP轉(zhuǎn)染的BSp73AS細胞(5/5)的大鼠發(fā)展為肺部轉(zhuǎn)移瘤。BSp73ASML細胞發(fā)展為栗粒狀轉(zhuǎn)移瘤，而SMAGP轉(zhuǎn)染的BSp73AS細胞發(fā)展為大的節(jié)結(jié)。該發(fā)現(xiàn)明確證實表達SMAGP的腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力增加(表1B)。為了估測建立轉(zhuǎn)移所需的時間，將腫瘤細胞進行足內(nèi)注射，而且在28天后將腫瘤和引流淋巴結(jié)一起切除。表1C所示的數(shù)據(jù)僅涉及那些沒有由于引流淋巴結(jié)的不完全切除而導(dǎo)致局部復(fù)發(fā)的動物(2只具有BSp73AS的大鼠，4只具有模擬轉(zhuǎn)染的BSp73AS細胞的大鼠和l只具有SMAGP轉(zhuǎn)染的BSp73AS細胞的大鼠)。在治療的切除大鼠中，0/5具有BSp73ASML-，3/3具有BSp73A-，6/6具有模擬轉(zhuǎn)染的BSp73AS-和9/14具有SMAGP轉(zhuǎn)染的BSp73AS的大鼠存活。因此，轉(zhuǎn)移的建立過程在SMAGP轉(zhuǎn)染的BSp73AS中比在BSp73ASML細胞中更慢得多，但不同于未轉(zhuǎn)染的和模擬轉(zhuǎn)染的BSp73AS細胞，在施用腫瘤細胞后28天，36X大鼠SMAGP轉(zhuǎn)染的BSp73AS細胞已遷移到引流淋巴結(jié)之外。表lSMAGP轉(zhuǎn)染的BSp73AS細胞的轉(zhuǎn)移生長A.腹膜內(nèi)施用后的生長<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>節(jié)結(jié))c.足內(nèi)施用和切除后的生長腫瘤系鼠的數(shù)量b長期存活轉(zhuǎn)移瘤遠處淋巴結(jié)a肺其它器官BSp73AS33/3(100%)nacrmBSp73AS-模擬66/6(100%)narmnaBSp73AS-SMAGP149/14(64%)5/6陽性(+-+++)5/6大節(jié)結(jié)(3->20)1/6小節(jié)結(jié)(3)2/6腎上腺BSp73ASML50/5(0%)5/5陽性(+++)5/5栗粒狀無a表示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤被判斷為+:。0.3-0.5，++:0>0.5-1.0，+++:0>1.0;b表示在引流淋巴結(jié)發(fā)展為局部復(fù)發(fā)的大鼠的數(shù)量被排除在外；ena:未施用。實施例14體內(nèi)轉(zhuǎn)移檢測從德國Sulzfdd的Jackson實驗室獲得BDX大鼠。用于實驗的雌性大鼠為8-12周齡。它們一次性接受5X1()S個腫瘤細胞的腹膜內(nèi)(i.p.)注射或后腳墊處的皮下注射(i.f.p)。如所述，i.f.p.施用后通過后腳的切斷手術(shù)切除腫瘤。簡而言之，通過Rompun/Ketanest將大鼠麻醉。用柳葉刀(skalpell)在關(guān)節(jié)下約5cm處通過環(huán)狀切割除去皮膚?？p合(sueing)動脈并除去引流淋巴結(jié)后，切除腱，并通過關(guān)節(jié)切斷術(shù)除去后腳。用皮膚覆蓋傷口并進行縫合。通過i.p.施用后進行腹部觸診或i.f.p.施用后測定腫瘤直徑及引流淋巴結(jié)的直徑，每周對腫瘤的生長檢測2次。當可觸知的腫瘤塊達到平均直徑為2.5cm或當大鼠變得惡病質(zhì)或貧血(可通過眼睛和耳朵的顏色來估測)或短促呼吸時，將它們麻醉并殺死。對大鼠進行尸檢并對所有器官檢測轉(zhuǎn)26移瘤的存在。參考文獻Alves,F.，etal.，Pancreas23(2001)227-235AusubelI.，F(xiàn)rederickM.，CurrentProtocolsinMol.Biol.(1992)，JohnWileyandSons,NewYorkBainesetal.，"PurificationofImmunoglobulinG(IgG)"，In:MethodsinMolecularBiology,Vol.10,pages79-104，TheHumanaPress,Inc.,1992Brattain，M.G.，etal.，CancerRes.41(1981)1751-1756Biittner，R.，etal.,Mol.Cell.Biol.11(1991)3573-3583Chambers,A.F.,etal.,Nat.Rev.Cancer2(2002)563-572Claas,C.，etal.,J.Cell.Biol.141(1998)267-280Coliganetal.(eds.)，CurrentProtocolsinImmunology,pp.9.3.1-9.3.5andpp.9.4.1-9.4.11,JohnWiley&Sons,1997Corti,C,，etal.，.CancerRes.Clin.Oncol.122(1996)154-160EP-A0063879EP-A0128018EP-A0173251EP-A0200362Fukuda,M.，etal.,J.Biol.Chem.262(1987)11952-11957Gennaro(ed.)，Remington'sPharmaceuticalSciences,19thedition,MackPublishingCompany,1995Green,L丄.，etal.，Nat.Genet.7(1994)13-21Gunthert,U.,etal.,Cell65(1991)13-24Hames，B.D.,Higgins,S.G.，NucleicAcidHybridisation-APracticalApproach(1985)IRLPress,Oxford,EnglandHunter,K.W.，etal.,CancerRes.61(2001)8866-8872Isaacs,J.T.，etal.,Prostate9(1986)261-281John，C.M.，eta.，Clin.CancerRes.9(2003)2374-2383Lonberg,N.,etal"Nature368(1994)856-859Matzku,S.，etal"InvasionMetastasis3(1983)109-123Mole,"EpitopeMapping",In:MethodsinMolecularBiology,Vol.10，Manson(ed.)，pages105-116,TheHumanaPress,Inc.，1992Morikawa,K.，etal.，CancerRes.48(1988)6863-6871Morris(ed.),EpitopeMappingProtocols25，HumanePress,Inc.,1996Neri，A.，etal.，J.Natl.CancerInst.68(1982)507-517Price,"ProductionandCharacterizationofSyntheticPeptide-DerivedAntibodies",In:MonoclonalAntibodies:Production,Engineering,andClinicalApplication,RitterandLadyman(eds.)，pp.60-84,CambridgeUniversityPress,1995R6gnier，C.H.，etal.，J.Biol.Chem.270(1995)25715-25721Rosel，M,，etal"Oncogene17(1998)1989-2002Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,USAShaper,N丄.，etal"J.MammaryGlandBiol.Neoplasia3(1998)315-324Skubitz,A.P.,CancerTreat.Res.107(2002)305-329Spieker-Polet，H.，etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)9348-9352Steeg，P.S.，Nat.Rev.Cancer3(2003)55-63Taniguchi,S.，etal"Clin.Exp.Metastasis10(1992)259-266Tarb6，N.,etal"AnticancerRes.22(2002)2015-2027Taylor,L.D.,etal.,Int.Immun.6(1994)579-591US2，915，082Wahl，G.M.，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76(1979)3683-3687Welch,D.R.，Clin.Exp.Metastasis15(1997)272-306WO02/08288一WO89/06698Wu,Y.Y.,andRees，J丄.，ActaDerm.Venereol.80(2000)2-3Wurfel,J.，etal.,Oncogene18(1999)2323-2334序列表〈110〉霍夫曼一拉羅奇有限公司<120〉診斷和治療癌癥的方法和用于其中的組合物〈130〉21863〈150〉EP03016586.4<151〉2003-07-28〈160〉10〈170〉Patentlnversion3.2〈210〉1〈211〉291〈212〉畫〈213〉人<220>〈221>CDS<222〉(1)..(291)<■〉1atgaacaacctaccggccacaccttctcctgaagaactgatgaccacg48MetAsnAsnLeuProAlaThrProSerProGluGluLeuMetThrThr151015ccggtttttcaggcccctgagacaatgtecccacaagetgaagaggcc96ProValPheGinAlaProGluThrMetSerProGinAlaGluGluAla202530ageacagcaetcattgcagttgttataaccgtggtgttccttaccctg144SerThrAlaLeulieAlaValVallieThrValValPheLeuThrLeu354045etcteagtggtgaccttgatettcttttacctgtacaagaataaaggc192LeuSerValValThrLeuliePhePheTyrLeuTyrLysAsnLysGly50556029agetacgtcacctatgagSerTyrValThrTyrGlu6570cagatggagactgacteaGinMetGluThrAspSer85ateliecctgcagaaggggagcccProAlaGluGlyGluPro75gccaagggcEiamgsg犯gAlaLysGlyLysGluLys90agegccateetc240SerAlalieLeu80gaagagtacttc288GluGluTyrPhe95291〈210〉2〈211>97〈212〉PRT〈213>人〈400〉2MetAsnAsn1ProValPheSerThrAla35LeuSerVal50SerTyrVal65GinMetGlulieLeuProAlaThr5GinAlaProGlu20UulieAlaValValThrLeulie55ThrTyrGluPro70ThrAspSerAlaProSerProGlu10ThrMetSerPro25VallieThrVal40PhePheTyrLeuAlaGluGlyGlu75LysGlyLysGlu8590GluLeuMetThrThr15GinAlaGluGluAla30ValPheLeuThrLeu45TyrLysAsnLysGly60ProSerAlalieLeu80LysGluGluTyrPhe95〈210〉3〈211〉19〈212〉DNA〈213〉人工〈220〉〈223>引物B1〈400〉3ttgtggtatccagcctcca19<210〉4〈211〉21〈212〉腿〈213〉人工〈220〉〈223〉引物B2〈400〉4ggctccaacactgagacactg21<210〉5<211>20<212>腿〈213〉人工〈220〉〈223〉引物H105<400〉5acaaaggcagctacgtcacc20〈210〉6<211〉20〈212〉DNA〈213〉人工〈220〉<223〉引物106〈400〉6ctttctccatgtccctggtc20〈210〉7<211〉26〈212〉DNA〈213〉人工〈220〉〈223>引物B140<400>7gatgaagtactcttccttctctttgc26〈210〉8<211〉26<212>DNA<213〉人工〈220〉〈223〉引物B139<400〉8aaggggagcccagcgccatcctccag26<210〉9<211〉20<212〉DNA〈213〉人工〈220〉〈223〉引物H103<400>9agaagatggagccagcacag2032〈210〉10〈211〉19〈212〉■〈213〉人工〈220〉〈223〉引物H104〈400〉10a/tctggacgatggcactgg19權(quán)利要求1.一種確定患者中與轉(zhuǎn)移相關(guān)的SMAGP存在的方法，其包含(i)在來自懷疑含有腫瘤細胞或其部分的患者的生物樣品中，檢測編碼SMAGP的核酸的量或多肽SMAGP的量；和(iii)將所述核酸或多肽的量與預(yù)先測定的表明在所述細胞中轉(zhuǎn)移相關(guān)的SMAGP表達或存在的校準線的標準值進行比較，從而確定所述患者中轉(zhuǎn)移相關(guān)的SMAGP的表達或存在。2.—種確定患者的組織或體液的待測樣品是否包含具有轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細胞或來源于轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞的方法，其中使用了待測樣品和第二種來源于同一個體或同一種族不同個體的非腫瘤細胞的樣品，該方法包含以下步驟(a)將每個各自樣品在嚴謹雜交條件下與核酸探針進行溫育，所述核酸探針選自由下述核酸序列組成的組(i)SEQIDNO:5的核酸序列，或(ii)SEQIDNO:6的核酸序列，或(iii)SEQIDNO:9的核酸序列，或(iv)SEQIDNO:IO的核酸序列，和(b)測定每個各自樣品與所述探針雜交的大約量，和(c)將待測樣品的大約雜交量與所述第二種樣品的大約雜交量進行比較，以鑒定所述待測樣品是否比所述第二種樣品含有更大量的特異核酸或核酸混合物。3.—種檢測轉(zhuǎn)移瘤的方法，其包含a)將懷疑患有轉(zhuǎn)移瘤的患者樣品與核酸探針進行溫育，所述樣品選自由體液、細胞或所述細胞的細胞提取物或細胞培養(yǎng)物上清組成的組，由此所述樣品包含核酸，所述核酸探針選自由下列組成的組(i)SEQIDNO:5的核酸序列，或(ii)SEQIDNO:6的核酸序列，或(iii)SEQIDNO:9的核酸序列，或(iv)SEQIDNO:IO的核酸序列，禾口b)檢測雜交，優(yōu)選地通過所述樣品核酸和/或所述核酸探針的另外的結(jié)合配偶體或通過X-射線放射顯影進行檢測；c)將所述核酸雜交的量與預(yù)先測定的表明在所述樣品中轉(zhuǎn)移瘤相關(guān)的SMAGP表達的校準線的標準值進行比較，從而確定所述患者是否患有轉(zhuǎn)移瘤。全文摘要本發(fā)明涉及癌癥的診斷，為此的組合物及治療癌癥的治療方法。本發(fā)明提供診斷和治療癌癥的方法和用于其中的組合物。多核苷酸和多肽SMAGP是腫瘤特異的。因此SMAGP的診斷對腫瘤診斷是有價值的。除了其診斷價值外，抗SMAGP的抗體也可作為治療性試劑用于治療腫瘤。文檔編號C12N15/09GK101649351SQ20091016456公開日2010年2月17日申請日期2004年7月28日優(yōu)先權(quán)日2003年7月28日發(fā)明者烏爾里?！の旱吕?內(nèi)斯林·塔貝爾德圣·阿杜安,瑪麗-克里斯蒂娜·里奧申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司