專利名稱：顯示作為除蟲菊酯生物合成酶的活性的蛋白質(zhì)、編碼該蛋白質(zhì)的基因和整合有該基因的載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及顯示作為除蟲菊酯生物合成酶的活性的蛋白質(zhì)、編碼該蛋白質(zhì)的基因和整合有該基因的載體。
背景技術(shù)：
除蟲菊所含的次級(jí)代謝產(chǎn)物除蟲菊酯，具有對(duì)昆蟲顯示優(yōu)異的殺蟲活性、另一方面對(duì)哺乳動(dòng)物毒性低這樣的作為殺蟲成分理想的優(yōu)點(diǎn)，故而在驅(qū)蚊線香、噴霧劑、粉劑等中被廣泛使用。雖然近年隨著合成擬除蟲菊酯驚人發(fā)展，對(duì)除蟲菊酯的需要減少，但是作為來自植物的對(duì)環(huán)境溫和的殺蟲劑原料，現(xiàn)在其利用價(jià)值仍然較高，故而為了廉價(jià)且高效地獲得除蟲菊酯的研究還在繼續(xù)。特別是由于作為合成擬除蟲菊酯的原材料的石油價(jià)格急劇上漲等，上述次級(jí)代謝產(chǎn)物除蟲菊酯的存在價(jià)值重新受到重視。
但是，除蟲菊酯主要從除蟲菊的花部提取，除蟲菊在開花之前的生長(zhǎng)
時(shí)間極長(zhǎng)，約3年。因此，作為使除蟲菊酯生產(chǎn)效率化的方法，除了挑選、育種除蟲菊的除蟲菊酯高生產(chǎn)抹之外，認(rèn)為促進(jìn)同種或異種植物細(xì)胞中的除蟲菊酯生物合成是有效的。
除蟲菊酯具有作為單薛羧酸的菊酸與作為脂肪酸氧化代謝物的除蟲菊醇酮類(醇)以酯鍵結(jié)合的結(jié)構(gòu)(圖3)，人們知道在其生物合成中，菊酸和除蟲菊醇酮類分別通過不同的代謝途徑生物合成，最后在兩者之間形成酯鍵。
作為高效地進(jìn)行上述除蟲菊酯的生物合成的方法，可列舉利用與其生物合成相關(guān)的基因的方法，在利用這些基因進(jìn)行除蟲菊酯生物合成時(shí)，該基因的分離和鑒定是不可缺少的。但是，植物細(xì)胞生產(chǎn)的各種酯化合物，是以羧酸的輔酶A(CoA)硫酯體(酰基CoA、 RCO-S-CoA)和醇(R，-OH)作為底物，通過?；D(zhuǎn)移酶而生物合成的(圖4)，且它們的生物合成例如記載在非專利文獻(xiàn)1和非專利文獻(xiàn)2中。
推測(cè)作為這樣的酰基轉(zhuǎn)移酶，在除蟲菊酯的生物合成中存在以菊酰CoA或擬除蟲菊酰CoA和除蟲菊醇酮類為底物的菊酰/擬除蟲菊?；D(zhuǎn)移酶(除蟲菊酯生物合成酶)(圖5)，但到目前為止沒有作為基于M酸序列的具體構(gòu)成而被分離，更何況對(duì)于編碼基于該氨基,列的蛋白質(zhì)的基因，當(dāng)然也沒有特別探求。
另外，專利文獻(xiàn)1公開了能夠?qū)ψ鳛槌x菊酯的化學(xué)合成的原材料使用的菊基二磷酸生成進(jìn)行催化的菊基二磷酸合酶(synthase)等酶的氨基*列，以及將基于該氨基^列的蛋白質(zhì)編碼化的基因序列，但對(duì)于能夠進(jìn)行上述除蟲菊酯的生物合成的酶自身的氨基酸序列和編碼基于該氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因，并沒有任何公開和暗示。正如由這樣的現(xiàn)有技術(shù)的狀況明確的那樣，對(duì)于特別指定除蟲菊酯的生物合成所涉及的酶，然后闡明編碼該酶蛋白質(zhì)的基因，從而基于基因工程學(xué)上的知識(shí)來進(jìn)行除蟲菊酯的有效生物合成，尚未闡明。
專利文獻(xiàn)l:特表平9-504684
非專利文獻(xiàn)1: R. Kalscheuer and A. Steinbuchel， A novel bifunctionalwax ester synthase/acyl-CoA:diacylglycero1 acyltransferase mediates waxester and triacylglycerol biosynthesis in Acinetobacter calcoaceticus ADP1.丄Biol. Chem. 278:8075-8082 (2003)
^,專禾'文獻(xiàn)2: J. Luo等，Convergent evolution in the BAHD family ofacyl transferases: identification and characterization of anthocyanin acyltransferases from Arabidopsis thaliana. 50:678-695 (2007)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供通過確定與除蟲菊酯的生物合成相關(guān)的酶的氨基酸序列、及其基因的堿基序列，制作整合有該基因的載體、轉(zhuǎn)化體，并將這些制作技術(shù)應(yīng)用于生長(zhǎng)較快的植物，從而高效地生成除蟲菊酯的方法。
在解決上述課題時(shí)，本發(fā)明者們?nèi)缦滤?，以除蟲菊花為原材料，以除蟲菊酯I生成活性為指標(biāo)進(jìn)行蛋白質(zhì)粗分級(jí)，并利用使用疏水性樹脂的分批法來完成粗純化，然后通過利用規(guī)定組合的色鐠法來進(jìn)行純化，從而得到與除蟲菊酯生成相關(guān)的酶蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行該蛋白質(zhì)的內(nèi)部g,列和氨基末端序列分析。使用以通過上述分析而明確的部分氨基酸序列為
基礎(chǔ)制作的簡(jiǎn)并引物，以從除蟲菊花部得到的cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行RACE-PCR，從而擴(kuò)增出序列未知部分的多核苷酸片段。
通過用DNA測(cè)序儀分析擴(kuò)增的多核苷酸片段的堿基序列，從而確定包含圖2所示的序列號(hào)、即序列號(hào)5的堿基序列的除蟲菊酯生物合成酶的全長(zhǎng)基因的堿基序列，以及由該基因編碼的圖l(a)所示的序列、即序列號(hào)l的氨基,列，以這沖羊的確定為基f出，從而完成本發(fā)明。
本發(fā)明采用下述構(gòu)成。
(1) 一種除蟲菊酯生物合成酶，是通過下述操作生成的分子量約40000的蛋白質(zhì)，所述操作是以從除蟲菊花制備的粗酶溶液為原料，使用(lR)-反式菊酰輔酶A ((1R)-trans-Chrysanthemoyl-CoA)和(S)-除蟲菊醇酮((S)-Pyrethrolone)作為檢測(cè)有無除蟲菊酯合成酶活性功能的底物，通過利用硫酸沉淀進(jìn)行的蛋白質(zhì)粗分級(jí)來得到沉淀物，然后對(duì)該沉淀物利用使用疏水性樹脂的分批法來進(jìn)行粗純化，對(duì)上述粗純化所得的酶溶液，依次進(jìn)行利用離子交換色譜法進(jìn)行的純化、利用疏7jC作用色譜法進(jìn)行的純化、通過凝膠過濾進(jìn)行的純化的各工序。
(2) 下述(i)或(ii)的蛋白質(zhì)，是可以從能生成除蟲菊酯的植物體內(nèi)提取的酶，
(i) 包含序列號(hào)1所示的Mi^列的蛋白質(zhì)，
(ii) 包含對(duì)序列號(hào)1所示的M酸序列置換、缺失、插入、和/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的M酸序列、且顯示作為除蟲菊酯生物合成酶的活性的蛋白質(zhì)。
6(3) —種蛋白質(zhì)，是可以從能生成除蟲菊酯的植物體內(nèi)提取的酶，是 包含序列號(hào)2所示的M酸序列的蛋白質(zhì)或包含序列號(hào)3所示的M^ 列的蛋白質(zhì)或包含序列號(hào)4所示的M酸序列的蛋白質(zhì)。
(4) 一種基因，編碼下述(i)或(ii)的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)是可以從能生 成除蟲菊酯的植物體內(nèi)提取的酶，
(i) 包含序列號(hào)1所示的M酸序列的蛋白質(zhì)，
(ii) 包含對(duì)序列號(hào)1所示的M酸序列置換、缺失、插入、和/或添加 1個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列、且顯示作為除蟲菊酯生物合成酶 的活性的蛋白質(zhì)。
(5) 根據(jù)(4)所述的基因，編碼(i)的蛋白質(zhì)，且包含序列號(hào)5所示的堿 基序列。
(6) 根據(jù)(5)所述的基因，含有序列號(hào)5所示的堿基序列的第85位~第 1179位的堿基序列作為開放式閱讀框。
(7) —種基因，編碼包含序列號(hào)2所示的氨基i^列的蛋白質(zhì)、包含 序列號(hào)3所示的M酸序列的蛋白質(zhì)或包含序列號(hào)4所示的氨基酸序列的 蛋白質(zhì)的任一種，所迷蛋白質(zhì)是可以從能生成除蟲菊酯的植物體內(nèi)提取的 酶。
(8) —種栽體，整合有(4) (7)的任一項(xiàng)所迷的基因。 本發(fā)明公開了與除蟲菊酯的生物合成相關(guān)的酶的M酸序列、及其基
因的堿基序列，從而導(dǎo)出可以介由生長(zhǎng)較快的植物來廉價(jià)且有效地生產(chǎn)作 為殺蟲劑原料有用且安全性高的除蟲菊酯的展望，顯示了可以對(duì)殺蟲劑產(chǎn) 業(yè)作出較大貢獻(xiàn)的可能性。


圖1表示本發(fā)明所涉及的除蟲菊酯生物合成酶的氨基酸序列的具體 例，(a)表示從除蟲菊的花得到的酶的典型例，(b)表示相對(duì)于(a)的JL^, 列移動(dòng)性的信號(hào)序列缺失的具體例，(c)、 (d)表示相對(duì)于(a)的序列進(jìn)一步添 加了移動(dòng)性的信號(hào)序列的氨基酸序列(此外，(c)、 (d)的加下劃線部分表示在(a)的序列上添加的部分)。
如實(shí)施方式項(xiàng)中說明的那樣，圖l(a)是表示氨基酸序列1所示的M ^列的圖，圖1(b)是表示M^列2所示的M^列的圖，圖l(c) 是表示序列號(hào)3所示的氨基酸序列的圖，圖l(d)是表示序列號(hào)4所示的氨 基酸序列的圖。
圖2表示編碼基于圖1(a)的氨基i^列的蛋白質(zhì)的基因的序列，是表 示序列號(hào)5所示的g序列的圖。
圖3是具體地表示除蟲菊酯類的結(jié)構(gòu)由菊酸部側(cè)鏈(R,)與除蟲菊醇酮
部側(cè)鏈(R2)構(gòu)成的化學(xué)結(jié)構(gòu)式和一覽表。
圖4是表示植物細(xì)胞中的酯化合物以羧酸的CoA硫酯體(?；鵆oA、 RCO-S-CoA)和醇(R，-OH)為底物通過?；D(zhuǎn)移酶催化來生物合成的化學(xué) 反應(yīng)的通式。
圖5是表示以菊酰轉(zhuǎn)移酶為催化劑的除蟲菊酯生物合成反應(yīng)的具體例 的化學(xué)反應(yīng)式。
圖6表示實(shí)施例1的利用HPLC測(cè)定除蟲菊酯生物合成酶活性的情況 的曲線圖，(a)表示在蛋白質(zhì)生成階段不產(chǎn)生酶活性的情況，(b)表示產(chǎn)生上 述酶活性的情況。
圖7是顯示實(shí)施例1中，從除蟲菊的花制得酶的流程的一覽表。
圖8是實(shí)施例1中為了確認(rèn)制得的除蟲菊酯生物合成酶的純度而明確 分子量特定程度的電泳(SDS-PAGE)照片。
圖9是實(shí)施例1中對(duì)構(gòu)成除蟲菊酯生物合成酶蛋白質(zhì)的氨基酸的各部 分進(jìn)行分析而得的部分氨基酸序列的序列例，(a)是表示^酸序列6所示 的氨基亂亭列的圖，(b)是表示氨基i^列7所示的氨基l亭列的圖，(c) 是表示氨基酸序列8所示的M酸序列的圖。
具體實(shí)施例方式
對(duì)于本發(fā)明中的基于除蟲菊酯生物合成酶的提取分離的氨基酸序列、 及其基因的堿基序列的確定流程的過程、以及整合有基于這樣確定的g序列的基因的載體、進(jìn)而導(dǎo)入有該載體的轉(zhuǎn)化體的應(yīng)用，說明如下，但是
上述(1) (8)的各構(gòu)成并不限于如下的實(shí)施方式，也包括可以從該實(shí)施方式 容易地置換和想到的實(shí)施方式。
在以下(a) (d)的順序的各工序的實(shí)施方式之前，必須確保構(gòu)成除蟲菊 酯生物合成酶的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明者們以從除蟲菊花制備的粗酶溶液為原料，使用(1 R)-反式菊酰 輔酶 A ((1R)-trans-Chrysanthemoyl-CoA)和(S)-除蟲菊醇酮 ((S)-Pyrethrolone)作為檢測(cè)有無除蟲菊酯合成酶活性功能的底物，以除蟲 菊酯I生成活性為指標(biāo)，進(jìn)行該除蟲菊酯生物合成酶的分級(jí)和純化。即， 如上述(l)那樣，按照通過硫酸銨沉淀進(jìn)行蛋白質(zhì)粗分級(jí)、利用使用疏水性 樹脂的分批法進(jìn)行粗純化、通過疏水性色i普法進(jìn)行純化、通過離子交換色 譜法進(jìn)行純化、通過凝膠過濾柱進(jìn)行純化的順序，進(jìn)行分級(jí)、粗純化、純 化，在這些各階段中，對(duì)上述底物進(jìn)行酶反應(yīng)，將可以評(píng)價(jià)為具有除蟲菊 酯合成酶活性的純化級(jí)分分級(jí)了的酶進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果可以確認(rèn) 被認(rèn)為能夠作為酶對(duì)酯化反應(yīng)發(fā)揮作用的分子量約40,000的蛋白質(zhì)的帶 (band)(圖8)。
可以將通過上述帶確認(rèn)而得的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜，從而確保得到 的除蟲菊酯生成酶蛋白質(zhì)。
此外，直至上述帶確認(rèn)的具體工藝，如下述實(shí)施例l所述。
(a) 酶蛋白質(zhì)的部分M酸序列的分析
將如上所述確保的純化酶用胰蛋白酶(蛋白質(zhì)分解酶)消化而片段化成 肽。然后，用HPLC分離消化后的肽片段，將該肽用埃德曼(Edman)法從 氨基末端側(cè)開始1個(gè)殘基1個(gè)殘基地分離分解。
通過用HPLC分析生成的苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物來分析氨基酸殘基。使 用將該反應(yīng)分析重復(fù)自動(dòng)化了的專用分析儀器(肽測(cè)序儀)來進(jìn)行。
這樣，可以獲得構(gòu)成除蟲菊酯生物合成酶蛋白質(zhì)的部分M,列。
(b) 引物的設(shè)計(jì)和全長(zhǎng)cDNA堿基序列的確定
將通過分析而明確的氨基酸序列換成堿基序列，基于該序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并
9引物。
通過使用上述引物(例如，4個(gè)位置的簡(jiǎn)并引物)采用PCR(聚合^反 應(yīng)，Polymerase Chain Reaction),從而確定已知序列;波此之間所夾的未知 堿基序列。
接著，預(yù)先在作為PCR的底物的DNA上添加作為接頭的多核苷酸，
行RACE-PCR,擴(kuò)增包含兩末端的序列的DNA片段，用DNA測(cè)序儀分 析該DNA片段從而確定全堿基序列。
這樣確定的除蟲菊酯生物合成酶的全堿基序列如上述(5)所述，如圖2 的序列、即序列號(hào)5所示。此外，序列號(hào)5的全堿基序列如上述(6)所述， 其特征在于，含有第85位~第1179位的堿基序列作為開放式閱讀框。此 夕卜，序列號(hào)5的全^序列不僅可以通過采用如上所述的PCR來實(shí)現(xiàn)，還 可以通過對(duì)如上所述轉(zhuǎn)印到PVDF膜上的酶蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫篩選法、使用 核酸探針的雜交法等其它基因檢測(cè)法來實(shí)現(xiàn)。
(c)全長(zhǎng)M酸序列的確定
對(duì)應(yīng)于上述序列號(hào)5的堿基序列，來確定由該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨 基酸序列。
通過本發(fā)明確定的除蟲菊酯生物合成酶的氨基酸序列如上述(2)所述， 如圖1的序列、即序列號(hào)1所示。
即使是對(duì)序列號(hào)l所示的g酸序列置換、缺失、插入、和/或添加了 1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列，也可以從含有除蟲菊酯生物合成酶的植 物中通過與序列號(hào)1所示的M酸序列的情況相同的方法和工序來提取， 且只要是顯示作為除蟲菊酯生物合成酶的活性的蛋白質(zhì)，就可以與序列號(hào) 1所示的酶蛋白質(zhì)同樣地發(fā)揮功能，就包含在本發(fā)明的除蟲菊酯生物合成 酶所涉及的蛋白質(zhì)中。進(jìn)而，如上述(3)所述，下述序列的氨基酸也相當(dāng)于 作為本發(fā)明的除蟲菊酯生物合成酵的蛋白質(zhì)。
,圖1(b)所示的序列號(hào)2所表示的序列從序列號(hào)1所示的氨基^ 列中除去移動(dòng)性信號(hào)序列(N末端~第27位的絲氨酸(S)殘基的部分)后的氨
10基酸序列。
.圖l(c)所示的序列號(hào)3所表示的序列在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，添加 到組氨酸標(biāo)簽和接頭序列的C末端側(cè)的氨基酸序列。
-圖1(d)所示的序列號(hào)4所表示的序列在大腸桿菌中作為谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)，添加在GST序列的N末端的氨基* 列。
序列號(hào)2所示M酸序列如下述實(shí)施例1所述，是從除蟲菊的花提取 的，當(dāng)然可以純化。序列號(hào)3和序列號(hào)4所示的M酸序列的酶，是在將 整合有序列號(hào)1所示的氨基酸序列的載體導(dǎo)入大腸桿菌之后，通過在大腸 桿菌內(nèi)表達(dá)而獲得的，但在可以以大腸桿菌為宿主表達(dá)的情況下，即使在 能夠生成除蟲菊酯的植物體內(nèi)，作為除蟲菊酯生物合成酶而實(shí)際地存在的 可能性也極強(qiáng)，在實(shí)際存在的情況下，當(dāng)然可以通過與序列號(hào)2的序列的 ^J^酸相同的方法和工序從上述植物體內(nèi)提取、并純化。
既然不僅是序列號(hào)1所示的M酸序列的蛋白質(zhì)，上述(2)的^# 列所形成的具有作為除蟲菊酯生物合成的活性的蛋白質(zhì)，作為發(fā)揮與該蛋 白質(zhì)相同的功能、且能夠生成的蛋白質(zhì)，也包括在本發(fā)明的技術(shù)概念中， 并成為其對(duì)象，那么本發(fā)明所涉及的基因就不僅是編碼序列號(hào)1所示的氨 基酸序列的上述(4)的基因，編碼上述(2)的蛋白質(zhì)的上述(5)、 (6)的基因也 必然歸于本發(fā)明的技術(shù)概念所包括的范圍。進(jìn)而，編碼上述(3)的包含序列 號(hào)2、 3、 4的^i^酸序列的蛋白質(zhì)的上述(7)的基因也包括在本發(fā)明的技術(shù) 概念中。
基于已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索序列號(hào)1的相似序列，結(jié) 果該序列并不是預(yù)料的已知?；D(zhuǎn)移酶，幾種GDSL基序(motif)脂肪酶與 該^J^酸序列相似。由此認(rèn)為，上述(2)、 (3)的作為除蟲菊酯生物合成酶的 蛋白質(zhì)是GDSL基序脂肪酶的親緣蛋白質(zhì)。
為了確認(rèn)如上述(4)、 (5)、 (6)、 (7)那樣的除蟲菊酯生物合成酶基因的 生物合成活性，例如可以先將這些基因插入載體DNA，然后將其導(dǎo)入大腸 桿菌，在大腸桿菌內(nèi)作為組氨酸標(biāo)簽融合蛋白質(zhì)表達(dá)除蟲菊酯生物合成酶，表達(dá)的除蟲菊酯生物合成酶通過Ni-NTA親和色鐠法來純化，使用(lR)-反 式菊酰CoA和(S)-除蟲菊酮醇作為底物，以除蟲菊酯I生成活性為指標(biāo)， 進(jìn)行活性評(píng)價(jià)。
(d)栽體的生成和導(dǎo)入有該載體的轉(zhuǎn)化體
上述(8)的載體是通過整合上述(4)、 (5)、 (6)、 (7)的任一種基因而生成 的，顯示作為除蟲菊酯生物合成酶的活性。上述載體可以通過用周知的轉(zhuǎn) 化方法導(dǎo)入植物、微生物等宿主使之可以表達(dá)，從而在該宿主中表達(dá)整合 基因或基因片段。
另外，所謂導(dǎo)入有上述(8)的栽體的轉(zhuǎn)化體，是宿主中導(dǎo)入有除蟲菊酯 生物合成相關(guān)基因、或其基因片段的轉(zhuǎn)化體。這里，所謂"導(dǎo)入栽體"， 意味著通過周知的基因工程學(xué)方法將整合在載體內(nèi)的基因?qū)胨拗鲀?nèi)使之 可以表達(dá)。
作為基因的導(dǎo)入方法，可列舉例如，利用衣桿菌的轉(zhuǎn)化法、基因槍法、 微注射法、電穿孔法等，但不特別限制。
在利用農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化法中，將該基因整合到Ti質(zhì)粒載體中，導(dǎo)入農(nóng)桿 菌，然后感染適當(dāng)?shù)闹参?。在基因?qū)氩课恍纬赡[瘤(冠癭)，對(duì)由除菌之 后的冠癭再生而得的大量植物體評(píng)價(jià)活性，挑選除蟲菊酯生物合成酶高表 達(dá)才直物體即可。
這樣的轉(zhuǎn)化體可以在自身的體內(nèi)表達(dá)除蟲菊酯生物合成相關(guān)基因。因 此，如果以植物、藍(lán)藻類、酵母類或大腸桿菌等細(xì)菌類等的細(xì)菌細(xì)胞中的 染色體和/或葉綠體為宿主，制作導(dǎo)入了含有能夠大量表達(dá)的啟動(dòng)子的上述 (8)的載體的轉(zhuǎn)化體，則作為結(jié)果可以大量生產(chǎn)除蟲菊酯生物合成酶。
因?yàn)樯鲜鲚d體是來自除蟲菊的除蟲菊酯生物合成酶的基因(或基因片 段)，所以作為上述轉(zhuǎn)化體中的宿主，優(yōu)選植物的染色體和/或葉綠體，特 別是更優(yōu)選與除蟲菊為同種類的菊科植物的染色體和/或葉綠體。作為這樣 的菊科植物，可以例示萬壽菊、非洲萬壽菊、金盞菊、百曰草等，但并不 限于這些。
上述植物不僅包括完整的植物體，還包括其一部分，例如，葉、種子、
12塊莖、插條等。進(jìn)而，上述植物還包括以預(yù)先經(jīng)轉(zhuǎn)化過的基因重組植物、 其后代為來源的植物組織、原生質(zhì)體、細(xì)胞、愈合組織、器官、植物種子、 胚芽、花粉、卵細(xì)胞、合子等可以繁殖的植物材料(包括花、莖、實(shí)、葉、 根等的植物的一部分)等。
使用上述(2)的蛋白質(zhì)和上述轉(zhuǎn)化體的任一者，可以生產(chǎn)除蟲菊酯，本 發(fā)明提供這樣的除蟲菊酯的生產(chǎn)方法。根據(jù)該方法，介由生長(zhǎng)明顯比除蟲 菊迅速的上述菊科的各植物或其它植物，可以有效且簡(jiǎn)便地生產(chǎn)除蟲菊酉旨， 可以對(duì)要求安全且對(duì)環(huán)境溫和的殺蟲劑的社會(huì)需求做出巨大貢獻(xiàn)。
以下，基于實(shí)施例具體詳細(xì)地說明本發(fā)明的內(nèi)容。 實(shí)施例1
為了進(jìn)行上述(a)的氨基酸序列分析，按照?qǐng)D7所示的流程從除蟲菊的 花純化酶。
對(duì)于詳細(xì)情況如以下iJL明。
純化時(shí)使用的緩沖液的組成
如表1 ~表6所示。表1J
緩沖液A成分濃度(mM)
Tris-HCI pH8.050
EDTA1
DTT5
抗壞血酸鈉100
PMSF2
l表2緩沖液B成分濃度(mM)
Tris-HCl pH8.020
EDTA1
DTT表31
緩沖液c_
成分_ 濃度(mM)
Tris-HCl pH8.0 EDTA DTT NaCl
1表41
緩沖液D
成分_ 濃度(mM)
Tris-HCl p朋.O EDTA DTT NaCl
表5j
緩沖液E 成成分 濃度mM)
Tris-HCl pH8.0 EDTA DTT
(NH"2SO4
l表6
20 5
500
20 5
150
20
5
400緩沖液F
成分濃度 (mM)
Tris-HCI pH8.050
EDTA1
DTT5
抗壞血酸鈉100
(NH4)2S041000
除蟲菊酯合成酶反應(yīng)
在各純化階段進(jìn)行酶反應(yīng)，對(duì)于純化級(jí)分評(píng)價(jià)除蟲菊酯合成酶活性。
反應(yīng)利用下表7所示的反應(yīng)組成在25。C進(jìn)行1小時(shí)。在酶反應(yīng)之后，在反 應(yīng)液中加入200fU己烷，分液而回收有右l4目，將其中的10nl進(jìn)行HPLC分 析。 l表71
除蟲菊酯合成酶反應(yīng)組成
體積(y 1)濃度(mM)
酶溶液20
(1R)-反式菊酰CoA(10mM水溶液)100,5
(S)-除蟲菊醇酮(20mM DMSO溶液)41
250mMTris-HCl(pH7.5), ImM EDTA4050
水126
總體積200
通過HPLC測(cè)定除蟲菊酯合成酶活性
HPLC分析使用SHIMADZU SCL-10A VP(程序裝置)、DGU-14A(脫 氣裝置)、LC-6AD(泵)、CTO-10AS VP(樣品注入裝置、柱恒溫槽)、 SPD-10AV VP(光學(xué)檢測(cè)器)，用CLASS-VP進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。柱使用 IMTAKT制的Cadenza C-18 (0.46 cm^xlO cm),在40。C、流速1 ml/分鐘 的條件下測(cè)定230 nm的吸收。移動(dòng)相使用乙腈:H2 0(65:35)。
將其結(jié)果的一例示于圖6(a) (b)。(a)是在蛋白純化階段未發(fā)現(xiàn)酶活性的 級(jí)分的HPLC分析結(jié)果，(b)是發(fā)現(xiàn)酶活性的級(jí)分的HPLC分析結(jié)果。如 同圖所示，在分級(jí)的溶液中存在酶的情況下，隨著反應(yīng)時(shí)間的經(jīng)過，發(fā)現(xiàn)顯示4.9分鐘的保留時(shí)間的除蟲菊酯I的峰。
4a酶的制備
使用500g除蟲菊的花蕾按照以下流程制備粗酶液。在除蟲菊花蕾中加 入經(jīng)過冰冷卻的1.5L的緩沖液A和聚乙烯吡咯烷酮(緩沖液A的1/10倍 (w/v)量)，用混合器進(jìn)行破碎。將破碎物用重疊成4層的紗布過濾，將濾液 在8000xg、 4。C的條件下離心20分鐘。收集上清液，加入100mL的 DOWEX(lx4 100-200 CI FORM)(厶口7^亍夕乂7)，用攪拌器攪拌10 分鐘，然后在8000xg、 4。C的條件下離心20分鐘。回收上清液，以此作為 粗酶液，進(jìn)一步進(jìn)行純化。
通過;危酸銨沉淀進(jìn)行分級(jí)
將上述制備而得的粗酶液用攪拌器攪拌，同時(shí)一點(diǎn)一點(diǎn)地加入預(yù)先使 用研缽和研杵磨碎的硫酸銨，使之溶解至30%飽和。靜置30分鐘之后， 以8000xg的加速度(g表示重力加速度)在4。C下離心20分鐘?；厥丈锨?， 加入硫酸銨至80%飽和。靜置一夜之后，在8000xg、 4。C的條件下離心20 分鐘，從而得到酶級(jí)分的沉淀物。
利用l吏用疏水性樹脂的分批法進(jìn)行粗純化
將通過上述分級(jí)得到的沉淀物懸浮在緩沖液F中，加入Phenyl Sepharose (苯基瓊脂糖凝膠)(GE Healthcare)，用攪拌器攪拌30分鐘， 然后^f吏用布氏漏斗濾出。將殘留在布氏漏斗中的Phenyl S印harose用 500mL的緩沖液F洗滌，然后使用500mL的緩沖液B洗脫吸附在樹脂上 的蛋白質(zhì)?；厥障疵撘海尤肓蛩徜@至1M，加入20mL的Phenyl S印harose (GE Healthcare),用攪拌器攪拌30分鐘，然后加入Econo-Column柱(Bio Rad)進(jìn)行穩(wěn)定化，然后使用50mL的緩沖液B洗脫吸附在樹脂上的蛋白質(zhì)。 將洗脫液"透析用玻璃紙管，在2L的脫鹽緩沖液中使用攪拌器攪拌的 同時(shí)脫鹽2小時(shí)。然后，交換緩沖液，繼續(xù)脫鹽3小時(shí)。脫鹽后的酶液接 著使用AKTA explorer (GE Healthcare)系統(tǒng)通過柱色鐠法進(jìn)一步進(jìn)行純 化。
通過陰離子交換色語法進(jìn)行純化對(duì)上述利用分批法進(jìn)行粗純化而得的酶液，進(jìn)一步使用Q Sepharose 柱通過陰離子交換色鐠法在以下條件下進(jìn)行酶液的純化。 [表8
通過疏水性色語法進(jìn)行純化
對(duì)上述通過利用陰離子交換色語法進(jìn)行的純化而得的酶液，使用 Phenyl Superose柱通過疏水性色譜法在以下條件下進(jìn)行酶液的純化。 [表9
通過凝膠過濾進(jìn)行純化
對(duì)上述通過利用疏水作用色鐠法進(jìn)行的純化而得的酶液，使用 Superdex75柱，在以下條件下進(jìn)行凝膠過濾。
l表10j___
系統(tǒng) AKTA explorer 10秒
柱 Superdex 75 HR 10/30 (GE Healthcare)
使用緩沖液 緩沖液D
樣品 通過Phenyl Superose純化的活性級(jí)分
流速 0.5mL/分鐘
級(jí)分 0.5mL/管
系統(tǒng) AKTA explorer 10秒
柱 HiPr印TM 16/10 Q FF (GE Healthcare)
泵A 緩沖液B 泵B 緩沖液C 平衡化 (A) 100%
通過Phenyl Sepharose進(jìn)行分批次處理之后的脫鹽之后的酶液
(A) 100% 100mL
(B) 0-100 。/。在400mL中 4mL/分鐘 10mL/管
AKTA explorer 10秒
Phenyl Superose FPLC (GE Healthcare)
緩沖液E
緩沖液B
(A) 100% 10mL
通過陰離子色譜法純化的酶液
(A) 100 %
(B) 0-100 %在20mL中 0.4mL/分鐘
2mL/管
品洗脫速分
樣清洗流級(jí)
化
統(tǒng) A B衡品洗脫速分
系柱泵泵平樣清洗流級(jí)
17將用上述方法純化的酶用SDS-PAGE分離，然后進(jìn)行^l艮染色，從而確 認(rèn)酶純度。其結(jié)果是檢測(cè)得到圖8所示的、分子量約40000的來自除蟲菊 酯合成酶的單一的蛋白質(zhì)帶。 實(shí)施例2
關(guān)于實(shí)施例1所得的除蟲菊酯合成酶的上述(a) (d)的部分氨基酸序 列的分析~全長(zhǎng)氨基酸序列的確定的實(shí)施情況、以及關(guān)于導(dǎo)入了整合有編 碼基于該M酸序列的蛋白質(zhì)的基因的載體的轉(zhuǎn)化體的實(shí)施情況如下。
關(guān)于構(gòu)成除蟲菊酯生物合成酶蛋白質(zhì)的氨基酸的各部分的分析
將實(shí)施例1所得到的蛋白質(zhì)帶從凝膠切下，作為內(nèi)部氨基酸序列分析 用樣品。另外，在SDS-PAGE之后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，通過考馬斯染色 (Coomassie Stain)檢測(cè)帶，然后切下帶的部分，進(jìn)行N末端氨基酸分析。 這一 系列搮作基于周知的方法進(jìn)行。
上述氨基酸分析的結(jié)果是，作為構(gòu)成酶蛋白質(zhì)的部分M酸序列，可 以確認(rèn)圖9(a)、 (b)、 (c)中名"亭列例6、 7、 8所示那樣的序列例。
引物的設(shè)計(jì)、和全長(zhǎng)cDNA堿基序列的確定
以通過氨基酸分析而明確的M酸序列為基礎(chǔ)，按照上述方法，確定 全長(zhǎng)cDNA堿基序列(圖2、序列號(hào)5)、 M^列(圖1:序列號(hào)1)。這一 系列操作中，cDNA制備、PCR、用DNA測(cè)序儀分析堿基序列按照周知的 方法進(jìn)行。
全長(zhǎng)氨基酸序列的確定
通過分析而明確的除蟲菊酯合成酶的N末端^J^酸序列如圖l(b)的序 列、即序列號(hào)2所示，是從序列號(hào)1的g酸序列除去N末端 第27位 的絲氨酸(S)殘基的部分后的序列。而且，如上所迷，除去后產(chǎn)生的序列號(hào) 2所示的Jl^酸序列相當(dāng)于除蟲菊中具有酶活性的蛋白質(zhì)序列，另一方面 被除去的27個(gè)氨基酸殘基是移動(dòng)性信號(hào)序列，發(fā)揮形成適宜的除蟲菊酯生 物合成條件這樣的功能。因此，具有上述27個(gè)氨基酸殘基的圖l(a)的序列、 即序列號(hào)1的氨基酸序列，相當(dāng)于還包括這樣的移動(dòng)性信號(hào)序列的除蟲菊酯生物合成酶。
此外，通過將整合有編碼基于序列號(hào)1的M酸序列的蛋白質(zhì)的基因
的栽體導(dǎo)入大腸桿菌、從而大量表達(dá)而得的包含序列號(hào)3、 4的序列所示的 氨基酸序列的蛋白質(zhì)，具有作為除蟲菊酯生物合成酶的活性，且在能夠生 成除蟲菊酯的植物體內(nèi)存在的可能性極高，對(duì)此，如實(shí)施方式的(c)中所指 出。
載體和轉(zhuǎn)化體的制作
關(guān)于通過導(dǎo)入上述除蟲菊酯合成酶基因來制作載體和轉(zhuǎn)化體的實(shí)施情 況:i口下。
作為可以在本發(fā)明中使用的載體，可列舉一直以來在微生物、植物、 植物細(xì)胞等的轉(zhuǎn)化中使用的載體。而且，根據(jù)已經(jīng)實(shí)施的公知技術(shù)可以充 分預(yù)測(cè)上述載體除了上述全長(zhǎng)基因中編碼上述除蟲菊酯生物合成酶的部 分之外，還可以含有用于表達(dá)現(xiàn)在已知的基因的恒定表達(dá)型或表達(dá)控制型 啟動(dòng)子，使表達(dá)的蛋白質(zhì)易于可溶化、純化的組氨酸標(biāo)簽和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn) 移酶，麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)等融合蛋白質(zhì)，使挑選轉(zhuǎn)化體容易的抗藥性基因， 用于使用農(nóng)桿菌的雙元載體系的復(fù)制起點(diǎn)等。
具體地說，在導(dǎo)入大腸桿菌等微生物時(shí)，可以使用pET載體(Novagen)、 pGEX載體(GE Healthcare)、 pMAL載體(New England Biolab)等。在導(dǎo) 入植物細(xì)胞的情況下，作為適合通過農(nóng)桿菌導(dǎo)入的載體，可以列舉pBI101、 pBI121等。在企圖使用電穿孔法、基因槍法導(dǎo)入植物細(xì)胞的情況下，對(duì)載 體不特別限制。另外，作為上述抗藥性基因，可以列舉氨千青霉素抗性基 因、卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因等。作為上述啟動(dòng)子，可以使用 來自花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子(恒定表達(dá)型)、熱休克誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的啟 動(dòng)子(表達(dá)控制型)。作為復(fù)制起點(diǎn)，可以列舉來自Ti或Ri質(zhì)粒的復(fù)制起 點(diǎn)等，可以充分預(yù)測(cè)，制作這些轉(zhuǎn)化體時(shí)，可以基于已經(jīng)被實(shí)施的周知方 法來進(jìn)4亍。
如果使用大腸桿菌、酵母等微生物來制作上述轉(zhuǎn)化體，可以使用微生 物細(xì)胞系來進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)換。另外，可以通過使用已知能合成實(shí)用以下、少量的除蟲菊酯的非洲萬壽菊、金盞菊、百日草等菊科植物體制作上述轉(zhuǎn)化 體，提高除蟲菊酯合成能力，從而使得比除蟲菊生長(zhǎng)快的植物中的除蟲菊 酯能夠有效地生產(chǎn)，因此在殺蟲劑生產(chǎn)中是有用的。
工業(yè)可利用性
本發(fā)明可以在以擬除蟲菊酯作為殺蟲劑的所有產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域使用，所述領(lǐng) 域具體地說是驅(qū)蚊和蠅的線香、殺蟲劑噴霧器、殺蟲、 口熱蒸散裝置、電 熱墊殺蟲裝置等以擬除蟲菊酯為有效成分的殺蟲用器具和裝置的領(lǐng)域。序列表
<110>人日本除蟲菊株式會(huì)社 <110>學(xué)校法人近畿大學(xué)
<120>顯示作為除蟲菊酯生物合成酶的活性的蛋白質(zhì)、編碼該蛋白質(zhì)的基閑、整合有該基閃的載體、轉(zhuǎn)化 體、利用所述蛋白質(zhì)和所述轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)除蟲菊酯的方法
<160> 8
<170> Patentboy版本3. 41
<210> 1
<2]1> 365
<212〉 PRT <213>除蟲菊
<400> 1
MetAlaValAlaSerSerLysArgGlyAla匕euVal匕euVal Ala
151015
ValLeuCysLeuSer 20LeuProThrGlyCys 25匕euSerSerGin Gin 30
AlaAlaAla匕euPhe 3511 ePheGlyAspSer 40ValPheAspPro Gly 45
AsnAsnAsnHis1 le 50AsnThrHisValAsn 55Phe匕ysAlaAsn Phe 60
TrpProTyrGlyGin 65SerTyrPheSerSer 70ProThrGlyArg Phe 75
SerAspGlyArglie 801 leProAspPhelie 85AlaGluTyrAla Ser 90
LeuPro1 leliePro 95AlaTyrl_euGluPro 100AsnAsnAspPhe Thr 105
HisGlyAlaAsnPhe 110AlaSerAlaGlyAla 115GlyAlaLeulie Ala 120
SerHisAlaGly匕eu 125AlaValGlyLeuGin 130ThrGinLeuHis Tyr 135
PheGlyAspLeuVal 140AspHisTyrArgGin 145Asn匕euGlyAsp 11e 150
匕ysSerArgGinl_eu 155LeuSerAspAlaVal 160Tyr匕euPheSer Cys 165
GlyGlyAsnAspTyr 170GinSerProTyrTyr 175ProTyrThrGin Glu 180
GinTyrValAspI le 185Val1 leGlyAsnMet 190ThrAsnValIle Lys 195
Gly1 leTyrGluLys 200GlyGlyArgLysPhe 205GlyValValAsn Val 210
ProLeu1 leGlyCys 215TrpProGlyMetArg 220AlaLysGinPro Gly 225
AsnAlaCysAsnThr 230GluValAspGluLeu 235ThrArgLeuHis Asn 240
GinAlaPheAlaLys 245ThrLeuGluHisLeu 250GluLysGinLeu Glu 255
21Gly Arg Aia Arg Phe Ala Asn Pro
Phe Met Cys lie Phe Glu Leu Asn
Val Tyr Lys Asn Cys Gly Lys Glu Asp Pro Met Phe Lys Ala Asp Glu
<210> 2 <211> 338 <212> PRT <213>除蟲菊 < 2 Ser Gin
1
Asp Ala Gly Tyr Asp Leu Leu Gly Phe Thr Val Val Gin 匕eu
Pro Asn Arg Ala Phe I le His Asp Ser Gin I le Asn Pro His
Gin Gly Phe Phe Ser Thr Ala Tyr I le Cys Glu l_ys Val Gly Asn
Ala Asn Trp Ser 匕eu His Ser Phe 匕ys Gly Gin Gly Pro Asn Gin
Ala 260 Pro 275 Ser 290 Phe 305 Phe 320 Trp 335 Leu 350 匕eu 365
Ala 5
Asn
20
Pro
35
Asp
50
Pro
65
Gly
80
His
95
Gly
110
Ser
125
Gly
140
Tyr
155
I le
170
Leu
185
Ala
200
Ala
匕ys Ser Gly Gly His Asp Phe
Ala Asn Tyr Gly
Phe l_ys Pro Leu Pro Gly Glu
Leu His Gly Arg
le lie
Ala Ala Asp Arg Asn Val Tyr I le Cys Phe
Asn Gly 匕eu Gin Asp Asp Glu Gly Asn Ala
Asp Tyr Phe Cys Asn Asp Gly
Leu Gly Gly Asp Glu Ser 匕ys
Phe Me Gin lie Pro Phe Leu Val Leu Tyr I le l_ys Gys Thr 匕ys
l le Asn Ser I le Ala Ala Ala Asp 匕eu Gin Val Gly Trp Glu Thr
Ser 265 Phe 280 Gly 295 Asn 310 Leu 325 Met 340 Pro 355
Thr 匕ys Asn Ala Ala Val Ser
Phe
10
Thr
25
Tyr
40
Pro
55
Tyr
70
Ser
85
Val
100
His
115
Ser
130
Ser
145
I le
160
Gly
175
Pro
190
Val
205
Leu
Ala Glu Tyr Thr Ser Thr Thr
Gly His Phe Asp Leu Ala Gly Tyr Asp Pro Gly Arg Gly Asp Glu
lie Gly Asp Glu Arg Gin 匕ys
Asp Val Ser Phe Glu Gly Leu Arg Ala Tyr Asn l_ys Met Glu His
Ser Asn Ser I le Pro Ala Gin Gin Val Tyr Met Phe Arg l_eu Leu
l_eu Glu Cys Tyr Gin Pro Tyr
Asn 270 Ser 285 Gly 300 Phe 315 Phe 330 Tyr 345 Leu 360
Val Phe Pro Ala Asn Gly Thr Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Thr Glu
Phe
15
匕ys
30
Thr
45
Glu
60
Asn
75
Ala
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Gin
105
Leu
120
Leu
135
Tyr
150
Asn
165
Val
180
Lys
195
Arg
210
匕ysGin lie Gly Asp Glu Arg Gin 匕ys
Leu l_eu Glu Cys Tyr Gin Pro Tyr
Glu Gly Asn Arg Ser Ala Gly Arg Phe Phe Phe Ala Tyr Asn Leu Pro
〈210〉 3 <211> 376 <212> PRT 〈213〉除蟲菊 〈400〉 3 Met Ala
1
Val Ala Asn Trp Ser Leu His Ser Phe 匕ys Gly Gin Gly
Leu Ala Asn Pro Asp Pro Gly His Gly Ser Gly Tyr
Val Cys Ala Asn Tyr Gly I le Ala Ala Asp Arg Asn Val Tyr
Ala 匕eu Leu His Gly Arg lie Asn Gly Leu Gin Asp Asp Glu
215 Phe 230 Met 245 Cys 260 I le 275 Phe 290 Glu 305 Leu 320 Asn 335
Ser 5
Ser
20
Phe
35
I le
50
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185
匕ys
200
Val Lys Cys Lys Asp Met Lys Asp
Ser Leu I le Asn Ser I le Ala Ala Ala Asp 匕eu Gin Val Gly
Tyr Asn Gly Glu Pro Phe Ala Glu
匕ys Pro Phe Thr Tyr Pro Tyr Ser Val His Ser Ser I le Gly
Ala Pro Ser Phe Phe Trp Leu Leu
l_ys Ser Gly Gly His Asp Phe
Arg Thr Gly His Phe Asp Leu Ala Gly Tyr Asp Pro Gly Arg
220 Phe 235 Lys 250 Pro 265 匕eu 280 Pro 295 Gly 310 Glu 325
Gly Gly Asp Val Ser Phe Glu Gly Leu Arg Ala Tyr Asn l_ys
Asp Tyr Phe Cys Asn Asp Gly
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Phe
205
匕eu Gly Gly Asp Glu Ser Lys
Leu Leu Val Phe Pro Ala Asn Gly Thr Asn Tyr Pro Thr Gly
Ser Phe Gly Asn Leu Met Pro
Val Ser Phe Lys Thr Glu Asn Ala Gin 匕eu Leu Tyr Asn Val
Thr l_ys Asn Ala Ala Val Ser
匕eu Ser Asp Ala Gly Tyr Asp Leu Leu Gly Phe Thr Val Val
225 Ala 240 Glu 255 Tyr 270 Thr 285 Ser 300 Thr 315 Thr 330
Val Gin Pro Asn Arg Ala Phe I le His Asp Ser Gin I le Asn
Ala
15
Gin
30
Gly
45
Phe
60
Phe
75
Ser
90
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105
Ala
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Cys
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Glu
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匕ys
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210
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G-n
Gly
Arg
Ala
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Phe
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I -e G-y
Cys Asn
Phe Ala
Val Tyr
llys Asn
Cys G一y
Lys G-u
Asp Pro-
Mel: Phe
llys Ala
Asp G-u
〈210〉 4
<2二〉 599
〈212〉 PRT
<213〉窓掛激
〈400〉 4
Mel: ser
1
Pro
His
Phe
Gly
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Gl_j
va-
Asp
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Leu Ser
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Cys
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365
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G-y
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G-y
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Tyr
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Phe
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His
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Mel:155
Asp Pro Met Cys l_eu 170
I le Glu Ala 185
Tyr Ile Ala 200
Gly Asp His 215
Pro Leu Gly 230
Gly Ala Leu 245
Gly Cys Leu 260
Asp Ser Val 275
Val Asn Phe 290
Ser Ser Pro 305
Phe I le Ala 320
Glu Pro Asn 335
Gly Ala Gly 350
Leu Gin Thr 365
Arg Gin Asn 380
Ala Val Tyr 395
Tyr Tyr Pro 410
Asn Met Thr 425
Lys Phe Gly 440
Met Arg Ala 455
Glu Leu Thr 470
160
Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys 175
Pro Gin lie Asp Lys Tyr Leu 190
Pro Leu Gin Gly Trp Gin Ala 205
Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val 220
Pro Glu Phe Met Ala Val Ala 235
l_eu Val Ala Val Leu Cys l_eu 250
Ser Gin Gin Ala Ala Ala Leu 265
Asp Pro Gly Asn Asn Asn His 280
Ala Asn Phe Trp Pro Tyr Gly 295
Gly Arg Phe Ser Asp Gly Arg 310
Tyr Ala Ser Leu Pro lie lie 325
Asp Phe Thr His Gly Ala Asn 340
Leu lie Ala Ser His Ala Gly 355
Leu His Tyr Phe Gly Asp l_eu 370
Gly Asp lie Lys Ser Arg Gin 385
Phe Ser Cys Gly Gly Asn Asp 400
Thr Gin Glu Gin Tyr Val Asp 415
Val lie Lys Gly lie Tyr Glu 430
Val Asn Val Pro Leu Ile Gly 445
Gin Pro Gly Asn Ala Cys Asn 460
Leu His Asn Gin Ala Phe Ala 475
His Leu Glu Lys Gin Leu Glu Gly Phe Val Tyr 485 490
Ala lie Leu Asn Arg Met Lys Asn Pro Ser 505 510 Lys Tyr Gly Phe Lys Glu Gly Glu Ser Ala Cys Cys Gly Ser Gly 515 520 525
Asp Cys Gly Arg lie Lys Glu Phe Gly 535 540
Lys Ser Gly Gin Lys Pro Phe Thr Tyr Pro Tyr Ser Val His Ser Ser I le Gly Pro Val
Arg Lys Gly Gly Arg Thr Gly His Phe Asp Leu Ala Gly Tyr Asp Pro Gly Arg Gly Asp
Asp I le Trp Pro Ser Val Ser Phe Lys Thr Glu Asn Ala Gin Leu 匕eu Tyr Asn Val Lys Arg
Leu Glu
165 Phe Lys
180 l_ys Ser
195 Thr Phe
210 Leu Phe
225 Ser Ser
240 Ser Leu
255 Phe lie
270 Ile Asn
285 Gin Ser
300 lie Me
315 Pro Ala
330 Phe Ala
345 Leu Ala
360 Val Asp
375 l_eu l_eu
390 Tyr Gin
405 11e VaI
420 Lys Gly
435 Cys Trp
450 Thr Glu
465 Lys Thr
柳 Ala Lys
495
Phe Asp Leu Ser Thr 500
Pro Phe Gly Gly Asn Tyr 530Leu Gys Asp Asn Ala 545
Pro Asn Glu l_eu Ala 560
Gly Asp Ser Met Val 575
Glu Gly Lys Pro Ser 590
〈210〉 5
〈211〉 1479
〈212〉瞧
〈213〉除蟲菊
<400> 5
ttaaacgggatgtccaaagwcatttaacttGC3ctagcaagttagagcat50
ttttC3C3CCtcttgatctg3gcac3tataagctatggctgttgC3agca100
gcaawcggggtgctcttgttttggttgctgttttgtgtctttcactacct150
acaggttgcctgagttctcaacaagctgctgC3Ct3ttt3tatttggtga200
ttGggttttGgatcctggta3C33t33CC3C3tC33C3CGcatgttaatt250
ttaaagcgaacttttggccatatggtcaatCCt3GttC3gttC3CC33Ct300
ggtagattctctgatggccgtatcatccctgatttcattgctgagtatgc350
aagtctgcctatcattcctgcgtatctcgagccaaacaatgattttscgc400
atggagcmaactttgcgtcagcaggagccggtgccttgattgcctcccat450
gctggacttgcagttggccttC333G3C33Gt3Catt3Ctttggcgattt500
3gt3g3CC3tt3tCggC3g33ttt3ggtgatattaaatct3ggC3gCt3G550
tatcGgatgctgtctacttgtttagctgtggaggtaacgactaccaaagc600
GCtt3Ct3tGcatatactc33g3gC33t3Cgtggacattgtgattggaaa650
G3tgacta3GgtG3tG33gggaatatacgaaaaaggtggaagaaaatttg700
gggttgtgaatgtcccgcttataggctgttggccgggaatgcgagcaaaa750
caacctggaaatgcttgcasGac3g3ggtcgatgaacttaCt3g3Ct3C3800
caatcaagcatttgcaa33acactagaacatttggagaaacagttggaag850
gctttgtgtatgctaaattcgatctttcaactgccattctcaatagaatg900
3ag33CCCCtcaaaatatggttttaaggaaggcgagagcgcatgttgcgg950
tagtggtccttttggagggaattatgattgtggcagaataaaagagtttg畫
gactatgtgataatgcaactgagtattttttctttgacccttttC3tCCt1050
aatgaattggcgagtcgcc33tttgcagagatgttttgggatggggattc1100
catggtcacaG3gccttaca3tttg333gC3Ctctttg38gggaagccat1150
C33G3383t3tC"tCCC333tgatgagctctaatgtagagcatgttgactc1200
ggttctttctccatgatcg3rccattagcaaaat3ataat3tg3ggtC3C1250
actagcaacataatggaatg3tctt38taatgccatggtcttcttcatga■
ttgttccgtctttttagtttgacttttttatttgatcttgttgaaccgaa1350
tcaagggacttttgatgaccatg3ttcgattcatattctttagttgtcat1400
gttggctttaaaaaactatctacgtatgtcaatgtagcaacttctggtta1450
ttaaaaaaaa3333333331479
Thr Glu Tyr Phe Phe Phe 550
Ser Arg Gin Phe Ala Glu 565
Thr Gin Pro Tyr Asn Leu 580
Thr Lys Tyr Leu Pro Asn 595
Asp Pro Phe His 555
Met Phe Trp Asp 570
l_ys Ala l_eu Phe 585
Asp Glu Leu
<210> 6 <211> 33 〈212〉 PRT 〈213〉除蟲菊 <400〉 6
Ser Gin Gin Ala Ala Ala Leu Phe Me Phe Gly Asp Ser Val Phe1
Asp Pro Gly Asn
Ala Asn Phe
〈210〉 7 〈211〉 7 〈212> PRT 〈213〉除蟲菊 <400〉 7
Gin Asn Leu Gly
<210> 8 <211〉 9 〈212〉 PRT 〈213〉除蟲菊 〈400〉 8
Gin Leu Glu Gly 1
5 10 15
Asn Asn His lie Asn Thr His Val Asn Phe Lys 20 25 30
Asp lie l_ys 5
Phe Val Tyr Ala Lys 5
2權(quán)利要求
1.一種除蟲菊酯生物合成酶，是通過下述操作而生成的分子量約40000的蛋白質(zhì)，所述操作是以從除蟲菊花制備的粗酶溶液為原料，使用(1R)-反式菊酰輔酶A和(S)-除蟲菊醇酮作為檢測(cè)有無除蟲菊酯合成酶活性功能的底物，通過利用硫酸沉淀進(jìn)行的蛋白質(zhì)粗分級(jí)來得到沉淀物，然后對(duì)該沉淀物利用使用疏水性樹脂的分批法來進(jìn)行粗純化，對(duì)上述粗純化所得的酶溶液，依次進(jìn)行利用離子交換色譜法進(jìn)行的純化、利用疏水作用色譜法進(jìn)行的純化、通過凝膠過濾進(jìn)行的純化的各工序。
2. 下述(i)或(ii)的蛋白質(zhì)，是可以從能生成除蟲菊酯的植物體內(nèi)提取的(i) 包含序列號(hào)1所示的M酸序列的蛋白質(zhì)，(ii) 包含對(duì)序列號(hào)1所示的氨基酸序列置換、缺失、插入和/或添加1 個(gè)或多個(gè)氛基酸而得到的氨基酸序列、且顯示作為除蟲菊酯生物合成酶的 活性的蛋白質(zhì)。
3. —種蛋白質(zhì)，是可以從能生成除蟲菊酯的植物體內(nèi)提取的酶，是包 含序列號(hào)2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或包含序列號(hào)3所示的氨基酸序列 的蛋白質(zhì)或包含序列號(hào)4所示的氨基,列的蛋白質(zhì)。
4. 一種基因，是編碼下述(i)或(ii)的蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)是可以 從能生成除蟲菊酯的植物體內(nèi)提取的酶，(i) 包含序列號(hào)1所示的M,列的蛋白質(zhì)，(ii) 包含對(duì)序列號(hào)1所示的M酸序列置換、缺失、插入和/或添加1 個(gè)或多個(gè)氬基酸而得到的氨基酸序列、且顯示作為除蟲菊酯生物合成酶的 活性的蛋白質(zhì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，編碼(i)的蛋白質(zhì)，且包含序列號(hào)5所 示的堿基序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，含有序列號(hào)5所示的堿基序列的第85 位~第1179位的M序列作為開放式閱讀框。
7. —種基因，編碼包含序列號(hào)2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或包含序 列號(hào)3所示的M酸序列的蛋白質(zhì)或包含序列號(hào)4所示的M酸序列的蛋 白質(zhì)的任一種，所述蛋白質(zhì)是可以從能生成除蟲菊酯的植物體內(nèi)提取的酶。
8. —種栽體，整合有權(quán)利要求4~7的任一項(xiàng)所述的基因。
全文摘要
本發(fā)明的課題是提供通過確定與除蟲菊酯的生物合成相關(guān)的酶的氨基酸序列、及其基因的堿基序列，制作整合有該基因的載體、轉(zhuǎn)化體，并將這些制作技術(shù)應(yīng)用于生長(zhǎng)較快的植物，從而高效地生成除蟲菊酯的方法。本發(fā)明提供一種基因，是編碼作為可以從能生成除蟲菊酯的植物體內(nèi)提取的酶的下述(i)或(ii)的蛋白質(zhì)的基因，(i)包含序列號(hào)1所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(ii)包含對(duì)序列號(hào)1所示的氨基酸序列置換、缺失、插入、和/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列、且顯示作為除蟲菊酯生物合成酶的活性的蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N9/20GK101649308SQ20091016539
公開日2010年2月17日 申請(qǐng)日期2009年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月13日
發(fā)明者松田一彥, 菊田幸雄 申請(qǐng)人:學(xué)校法人近畿大學(xué);大日本除蟲菊株式會(huì)社