專利名稱：平行檢測多種上呼吸道病毒的基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種平行檢測多種呼吸道病毒的基因芯片，尤其涉及利用與呼吸道病毒DNA/RNA互補的核苷酸序列的探針以矩陣的形式排列的基因芯片結(jié)多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，用于快速平行檢測并分辨多種呼吸道病毒，屬于基因芯片和診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
急性呼吸道感染是世界范圍內(nèi)的常見病，多發(fā)病，其主要原因是由各種呼吸道病毒引起的，常見的是甲型流感病毒(包括H1，H3，H5亞型)，乙型流感病毒，副流感病毒(包括甲型，乙型，丙型，丁型)，呼吸道融合病毒(包括甲型，乙型)，鼻病毒，腸道病毒，OC43型冠狀病毒，非典型肺炎綜合癥冠狀病毒，229E型冠狀病毒，人類偏肺病毒，肺炎支原體，肺炎衣原體，嗜肺軍團桿菌，腺病毒等。其臨床表現(xiàn)類似，如鼻炎，流涕，鼻塞，咳嗽，輕度咽炎，全身發(fā)熱等癥狀。
目前，檢測以上呼吸道感染主要病毒，國內(nèi)外多采用病毒分離，間接免疫熒光法，酶聯(lián)免疫吸附法，多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，PCR及核酸雜交等多種檢測手段。由于可能的病原體種類很多，而病毒的分離培養(yǎng)不僅周期長而且成本較高，技術(shù)上也比較困難。用免疫學(xué)檢測方法也很難快速確定病原體。而現(xiàn)在流行方法的共同局限性是一次只能檢測一種單一的病毒，而檢測方法的靈敏性不夠高。
近年來，分子生物學(xué)方法，特別是基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的檢測方法在病毒檢測領(lǐng)域得到迅猛的發(fā)展，成為病毒檢測的一項革命性技術(shù)。PCR技術(shù)檢測方法不僅速度快，靈敏度高，而且可以同時擴增多種病毒?；蛐酒菓?yīng)用已知核酸序列作為探針與互補的靶核苷酸序列雜交，通過隨后的信號檢測進行定性與定量分析。基因芯片在一微小的基片表面集成了大量的分子識別探針，能夠在同一時間內(nèi)平行分析大量的基因。而結(jié)合PCR技術(shù)和基因芯片，可以準確快速的鑒別呼吸道感染病原體。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用與呼吸道病毒DNA/RNA互補的核苷酸序列的探針以矩陣的形式排列的基因芯片結(jié)合聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，用于快速平行檢測并分辨多種呼吸道病毒。其優(yōu)勢在于，使用同一反應(yīng)與芯片，可以平行一次檢測20種常見的呼吸道病毒，其操作簡單，快捷，特異性強，靈敏度高。
本發(fā)明的主要目的在于，提供一種具有相近Tm值，涵蓋檢測型別多，對PCR產(chǎn)物進行基因檢測與分型，達到省時省力和檢測精確的目的。
本發(fā)明具有與呼吸道常見病毒DNA/RNA互補的核苷酸序列的探針，其中探針序列選自SEQ ID Nos1-21。為加強探針與基質(zhì)的結(jié)合度，每條探針都經(jīng)過5’末端胺基與多聚polyT修飾。本發(fā)明針對20種感染源設(shè)計了21種探針，各探針有著合理的堿基成分，Tm值相對比較均一，即21種型別探針和對應(yīng)的PCR產(chǎn)物雜交時最適宜的溫度條件基本一致，有利于在同一雜交溫度下的同步性，不會因為溫度的問題而影響雜交的結(jié)果，使檢查的準確性大大增加。
本發(fā)明在RNA和DNA提取后，對于RNA病毒，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后使用有生物素標記的簡并引物，對樣本的DNA/cDNA進行擴增。用于擴增樣本序列的引物，正向有生物素標記，其序列針對不同常見病毒，分別為SEQ ID Nos22-63。選用的引物對各自的擴增型別都有很高的靈敏度，增加了檢測的準確性。
所選用的探針(SEQ ID Nos1-21)與引物(SEQ ID Nos22-63)含有簡并序列，其縮略如下M，A/C；R，A/G；W，A/T；S，C/G；Y， C/T；K，G/T；V， A/C/G；H，A/C/T；D，A/G/T；N，A/C/G/T。



圖1基因芯片上一種基因矩陣的排列情況，顯示基因矩陣中探針與質(zhì)控點的分布。(1，基因芯片；2，探針區(qū)域；3，定位點；4，陽性質(zhì)控點；5，陰性指控點；其他為特異性探針) 圖2基因芯片雜交流程示意圖
具體實施例方式 結(jié)合附圖和具體實施方式
對發(fā)明作進一步說明，但不以任何形式限制本發(fā)明 實施例一膜條基質(zhì)的基因芯片檢測20種呼吸道常見病毒 在此例中，使用邊長為6.0毫米方形尼龍膜為基質(zhì)的基因芯片。探針排列為6x5矩陣，包括21種特異性探針、1種陽性質(zhì)控點探針、1種陰性指控點探針與3個定位點探針。如圖1，矩陣點與點之間間隔為600微米。
所述基因芯片的制備方法，包括如下步驟 (1)探針的制備合成與目標DNA/RNA互補的5’末端經(jīng)過胺基化；選取特異性的針對20種呼吸道病毒。
(2)固定探針將上述探針固定在活化處理好的尼龍膜上，通過探針末端的胺基與活化膜上的羧基形成共價結(jié)合，牢固地將探針固定在膜上。固定之后，將未結(jié)合的膜表面封閉。
基因芯片雜交檢測流程如圖2所示。此例結(jié)合多重聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，將目標DNA以倍數(shù)擴增。引物以生物素標記，擴增后，帶有生物素標記的PCR產(chǎn)物經(jīng)過堿變性，中和后可被相對應(yīng)的固定于基因芯片上的特異性探針所捕獲。雜交完成后，通過過氧化物酶標記的鏈霉親和素及其特異性底物TMB(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)的顯色反應(yīng)得出結(jié)果。對基因芯片結(jié)果進行分析，在短時間內(nèi)給出基因型別資料。
平行檢測多種上呼吸道病毒的基因芯片.ST25SEQUENCE LISTING
<110>港龍生物科技有限公司
<120>平行檢測多種上呼吸道病毒的基因芯片
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ccrgccarha chcccatrtt dcchgt2權(quán)利要求
1.一種具有與目標DNA/RNA互補的核苷酸序列的探針以矩陣形式排列的基因芯片結(jié)合多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，用于快速平行檢測。
2.如權(quán)利要求1所述的平行檢測基因芯片，其特征在于所述的基因芯片可以是以尼龍膜為基質(zhì)，或以硅片為基質(zhì)，或以玻璃片為基質(zhì)，或以塑膠片為基質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1所述的平行檢測基因芯片，其特征在于所述的基因芯片以尼龍膜為基質(zhì)。
4.如權(quán)利要求1所述的平行檢測基因芯片，其特征在于所述的基因芯片含有針對基因分析和分型的特異性探針陣列。
5.如權(quán)利要求1所述的平行檢測基因芯片，其特征在于所述的基因芯片含有針對20種呼吸道常見病毒進行基因分析和分型的特異性探針陣列，其探針序列選自SEQ ID Nos1-21。
6.如權(quán)利要求1所述的平行檢測基因芯片，其特征在于所述的基因芯片含有針對21種呼吸道常見病毒進行基因分析和分型的特異性正反引物，其探針序列選自SEQ ID Nos22-63。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種平行檢測多種呼吸道病毒的基因芯片，尤其涉及利用與呼吸道病毒DNA/RNA互補的核苷酸序列的探針以矩陣的形式排列的基因芯片結(jié)合多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，用于快速平行檢測并分辨20多種呼吸道常見病毒?；蛐酒梢允且阅猃埬?，硅片，玻璃片或塑膠片為基質(zhì)，含有針對基因分型的特異性探針陣列(1，基因芯片；2，探針區(qū)域；3，定位點；4，陽性質(zhì)控點；5，陰性指控點；其他為特異性探針)；本發(fā)明充分結(jié)合了基因芯片一次能同時檢測一份樣品中多個基因的優(yōu)點和多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)特異性強靈敏度高的優(yōu)點，具有平行檢測型別涵蓋面廣。其操作簡單，快捷，特異性強，靈敏度高，結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/70GK101613767SQ20091016497
公開日2009年12月30日 申請日期2009年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月30日
發(fā)明者楊夢甦, 曾志雄, 季晟琳 申請人:港龍生物科技有限公司