專利名稱：：通過包括熱循環(huán)的多重置換擴(kuò)增來擴(kuò)增靶核酸序列的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的示例性實(shí)施方式涉及通過多重置換擴(kuò)增來擴(kuò)增靶核酸序列的方法，更具體而言，涉及包括熱循環(huán)的通過多重置換擴(kuò)增來擴(kuò)增靶核酸序列的方法。
背景技術(shù)：
：已知各種擴(kuò)增核酸的方法。這些方法包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、自主序列復(fù)制(3SR)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、使用QP復(fù)制酶的擴(kuò)增和多重置換擴(kuò)增(MDA)。MDA是基于通過多元引物進(jìn)行的靶核酸序列的鏈置換擴(kuò)增。在MDA中，產(chǎn)生復(fù)制鏈并且在復(fù)制期間，至少一條復(fù)制鏈通過另一復(fù)制鏈的鏈置換復(fù)制而從靶核酸序列上置換下來。對(duì)于MDA而言，可利用的引物可包括與靶序列的一條鏈互補(bǔ)的引物組以及與靶序列的另一條鏈互補(bǔ)的引物組。而且，所述引物可為一組具有隨機(jī)序列的引物。此外，所述引物可為這樣的一組引物，該組中每一引物僅與靶序列的一條鏈雜交。相關(guān)技術(shù)公開了一種擴(kuò)增靶核酸序列的方法，其中該方法包括使一組引物、DNA聚合酶以及靶樣品接觸，并且在促進(jìn)該靶序列的復(fù)制的條件下溫育該靶樣品。該靶樣品未經(jīng)歷變性條件，并且該靶序列的復(fù)制產(chǎn)生復(fù)制鏈，其中在復(fù)制期間，所述復(fù)制鏈中的至少一條通過另一復(fù)制鏈的鏈置換復(fù)制而從該靶序列上置換下來。MDA在基本上恒溫的溫度下進(jìn)行，并且溫育在足以促進(jìn)引物與靶序列的雜交的低溫下進(jìn)行。也就是說，為了促進(jìn)引物的雜交，在低于聚合酶活性最適溫度的溫度下進(jìn)行溫育。結(jié)果，只有在初始的變性和退火階段結(jié)合、并且在相應(yīng)位置處結(jié)合的引物發(fā)生擴(kuò)增，因而可發(fā)生擴(kuò)增偏差，由此降低擴(kuò)增效率。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的示例性實(shí)施方式包括通過多重置換擴(kuò)增(MDA)，包括熱循環(huán)，來擴(kuò)增耙核酸序列的方法。其它各方面有些在隨后的說明中進(jìn)行闡述，有些可從該說明中明晰，或者可通過所介紹的實(shí)施方式的實(shí)踐而獲知。本發(fā)明的示例性實(shí)施方式可包括擴(kuò)增靶核酸序列的方法，其中該方法包括使一組引物、DNA聚合酶以及靶核酸序列在溶液中接觸；和溫育該溶液以復(fù)制該靶核酸序列，其中該靶核酸序列的復(fù)制產(chǎn)生復(fù)制鏈并且在復(fù)制期間，所述復(fù)制鏈中的至少一條通過另一復(fù)制鏈的鏈置換復(fù)制而從該靶序列上置換下來，其中進(jìn)行所述溫育時(shí)，在DNA聚合酶活性最適溫度范圍與促進(jìn)所述引物與該靶序列雜交的溫度范圍之間進(jìn)行熱循環(huán)。圖1的電泳圖像顯示在3(TC或6(TC擴(kuò)增靶序列時(shí)、或者在約3(TC與約6(TC之間進(jìn)行熱循環(huán)時(shí)的擴(kuò)增結(jié)果。圖2顯示靶序列按照?qǐng)D1所示在約3(TC與約6(TC之間進(jìn)行熱循環(huán)時(shí)的擴(kuò)增結(jié)果和使用對(duì)照產(chǎn)物獲得的結(jié)果。具體實(shí)施例方式現(xiàn)在將詳細(xì)提及示例性實(shí)施方式，其實(shí)施例說明于附圖中，其中相同的附圖標(biāo)記始終表示相同的要素。在這方面，當(dāng)前的各實(shí)施方式可具有不同的形式并且不應(yīng)解釋為限于本文中所進(jìn)行的說明。因此，僅在下面通過參照附圖描述這些實(shí)施方式以解釋本說明的各方面。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的擴(kuò)增靶核酸序列的方法包括使一組引物、DNA聚合酶和靶核酸在溶液中接觸。引物可具有約5至約20bp的長(zhǎng)度。解鏈溫度Tm可根據(jù)所使用的引物的長(zhǎng)度和核苷酸組成以及反應(yīng)溶液中的組分(例如陽離子的濃度)而不同。本文中所用術(shù)語"解鏈溫度Tm"是指核酸分子的多份拷貝中一半核酸鏈處于雙鏈狀態(tài)而另一半處于"無規(guī)巻曲"狀態(tài)時(shí)的溫度。例如，當(dāng)引物具有約5至約20bp的長(zhǎng)度并且引物的核苷酸是天然核苷酸時(shí)，Tm可為約1(TC至約8(TC。引物可具有約5至約8bp的長(zhǎng)度。引物可具有約6bp的長(zhǎng)度。除了天然核苷酸之外，引物還可包括修飾的核苷酸。例如，引物可包括至少一個(gè)修飾的核苷酸并且因此是耐核酸酶的，例如是耐外切核酸酶的。修飾的核苷酸可為生物素化核苷酸、熒光標(biāo)記的核苷酸、5_甲基-dCTP、BrdUTP、或5-(3-氨基烯丙基)_2'-脫氧尿苷-5'-三磷酸。引物可包括DNA或RNA引物。而且，引物可用可檢測(cè)的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。引物組可包括多個(gè)引物。引物組可包括與靶核酸的同一條鏈互補(bǔ)的兩個(gè)或更多個(gè)引物，例如，三個(gè)或更多個(gè)引物、或者四個(gè)或更多個(gè)引物、或者五個(gè)或更多個(gè)引物。引物組還可包括至少一個(gè)與靶核酸的另一條鏈互補(bǔ)的引物。引物組可包括多個(gè)引物并且各引物可包括互補(bǔ)部分，其中這些引物的這些互補(bǔ)部分各自與靶核酸的不同部分互補(bǔ)。引物組可包括具有隨機(jī)核苷酸序列的引物。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，引物可以是長(zhǎng)度為5bp、6bp、7bp或8bp的隨機(jī)弓I物、或其混合物。DNA聚合酶活性最適溫度可高于引物與靶序列雜交時(shí)的溫度。詳言之，DNA聚合酶的最適溫度可高于與靶序列雜交的引物變性時(shí)的變性溫度。在這種情況下，"變性溫度"可為約50%或更多的雙鏈變性時(shí)的溫度、約60%或更多的雙鏈變性時(shí)的溫度、約70%或更多的雙鏈變性時(shí)的溫度、約80%或更多的雙鏈變性時(shí)的溫度、或者約90%或更多的雙鏈變性時(shí)的溫度。也就是說，當(dāng)引物鏈和耙序列的雙鏈的一部分例如約10%、約20%、約30%、約40%、或者約50%或更多未變性而保留時(shí)，可通過新引物的退火而改進(jìn)擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，術(shù)語"最適溫度"可根據(jù)條件如反應(yīng)溶液而不同，但在給定的緩沖液條件下所用聚合酶的最適溫度對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。本文中所用術(shù)語"最適溫度范圍"可為最適溫度士1(TC、或最適溫度士5t:、或最適溫度±2.5t:，并且低于在促進(jìn)引物與靶序列雜交的溫度范圍內(nèi)因溫育而復(fù)制的鏈變性時(shí)的變性溫度。術(shù)語"變性溫度"與以上描述的相同。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，除非另外進(jìn)行說明，術(shù)語"雜交溫度"是指通過引物與靶序列之間的雜交而使一半的可雜交位點(diǎn)發(fā)生雜交時(shí)的溫度。雜交溫度可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過實(shí)驗(yàn)或計(jì)算很容易地得出?？赏ㄟ^使用公開于SantaLucia.&Hicks(2004)An皿.Rev.Biophys.Biomol.Struct.，33:415-40中的方法計(jì)算雜交溫度。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，"促進(jìn)引物與靶序列雜交的溫度范圍"可以是促進(jìn)了引物與靶序列之間的雜交的溫度范圍。為此，所述溫度范圍可等于或低于DNA聚合酶的最適溫度-5°C、DNA聚合酶的最適溫度-10°C、或DNA聚合酶的最適溫度_15°C。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，DNA聚合酶的最適溫度范圍可為約3(TC至約75t:，而促進(jìn)引物與靶序列雜交的溫度范圍可為約0t:至約3(rC。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，DNA聚合酶的最適活化溫度范圍可為約3(TC至約75t:，而促進(jìn)引物與靶序列雜交的溫度范圍可為約0t:至約30°C。DNA聚合酶的最適溫度范圍例如(p29DNA聚合酶的最適溫度范圍可為約32°C，外切(_)BstDNA聚合酶的最適溫度范圍可為約65°C，VENT外切DNA聚合酶的最適溫度范圍可為約75"，9°NmDNA聚合酶的最適溫度范圍可為約75t:，Klenow片段的最適溫度范圍可為約37°C，匪LV逆轉(zhuǎn)錄酶的最適溫度范圍可為約42°C。DNA聚合酶為能進(jìn)行鏈置換復(fù)制的聚合酶，其可為(p29DNA聚合酶、TtsDNA聚合酶、M2DNA聚合酶、VENTDNA聚合酶、T5DNA聚合酶、PRD1DNA聚合酶、或BstDNA聚合酶，但不限于此。表1.DNA聚合酶及其特性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>續(xù)表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>匪RT:M-MulV逆轉(zhuǎn)錄酶，ND:未檢測(cè)到KmdNTP和KmDNA各自表示dNTP和DNA的米氏常數(shù)。a:Kunkel等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，4865-4869b:Mattila，P.，Korpela,J.，Tenkanen，T.andPitkanen，K.(1991)，NucleicAcidsRes.，19,4967-4973d:KmDNA由引物-模板復(fù)合物的摩爾數(shù)表示。g:Kong，H.M.，Kucera，R.B.andJack,W.E.，(1993)J.Biol.Chem.，268，1965-1975.k:Polesky，A.H.，Steitz，T.A.，Grindley，N.D.F.andJoyce,CM.(1990)J.Biol.Chem.，265，14579-14591.p:Ricchetti，M.andBuc，H.(1990)EMBOJ.，9，1583—1593x:Southworth，M.W.等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，5281—5285.w:Bebenek，K.，Joyce,CM.，F(xiàn)itzgerald,M.P.andK皿kel，T.A.(1990)J.Biol.Chem.，265，13878-13887.y:引入到RNA或DNA引物中的dNTP的量與使用單鏈M13DNA作為模板時(shí)相比較根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，DNA聚合酶可為(p29DNA聚合酶，并且最適溫度范圍可為約3(TC至約34°C，例如約32°C，并且促進(jìn)雜交時(shí)的溫度可為約4t:至約22°C，例如約20°C。在該情況下，引物可為具有約6bp長(zhǎng)度的隨機(jī)引物或者具有特定序列的引物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，DNA聚合酶可為外切(-)BstDNA聚合酶，最適溫度范圍7可為約46t:至約75t:，例如約65t:，并且促進(jìn)雜交時(shí)的溫度可為約4t:至約35t:，例如約3(TC。在該情況下，引物可為具有約6bp長(zhǎng)度的隨機(jī)引物或者具有特定序列的引物。靶核酸的形式可為選自以下的材料血液、尿、精液、淋巴液、腦脊髓液、羊水、活組織檢查樣品、針抽吸活組織檢查樣品、maycer樣品、腫瘤樣品、組織樣品、細(xì)胞、細(xì)胞碎片、輔助碎片(auxiliarydebris)、以及前述材料中的至少兩種的組合。耙核酸可為包含整個(gè)基因組的樣品或者為整個(gè)基因組本身。引物、DNA聚合酶和靶核酸可在合適的溶液中接觸。所述合適的溶液可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員用于擴(kuò)增核酸序列的聚合酶的類型而有不同。例如，當(dāng)DNA聚合酶為(p29DNA聚合酶時(shí)，所述合適的溶液可為包含約37mMTris-HCl(pH8.0)、約50mMKCl、約10mMMgCljP約5mM(NH4)2S04的溶液。在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的方法中，進(jìn)行接觸可包括或者可不包括這樣的初始操作，該初始操作包括使引物和靶序列變性(例如高溫變性)并進(jìn)行退火。然而，除了該初始操作之外，耙序列可不暴露于使靶序列變性的條件下。如果聚合酶是熱穩(wěn)定的，則可在聚合酶的存在下進(jìn)行變性和退火。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的方法可包括溫育該溶液以復(fù)制靶核酸序列?？稍贒NA聚合酶活性最適溫度范圍與促進(jìn)引物與靶序列雜交的溫度范圍之間進(jìn)行熱循環(huán)時(shí)進(jìn)行溫育。DNA聚合酶的最適溫度范圍和促進(jìn)引物與靶序列雜交的溫度范圍可與以上所描述的相同。熱循環(huán)可包括，在"DNA聚合酶的最適溫度范圍"內(nèi)溫育該溶液一段預(yù)定的時(shí)間，例如，約30秒至約6小時(shí)，并且在"促進(jìn)引物與靶序列雜交的溫度范圍"內(nèi)溫育該溶液一段預(yù)定的時(shí)間，例如約30秒至約3分鐘。詳言之，首先在"促進(jìn)引物與靶序列雜交的溫度范圍"內(nèi)溫育該溶液以使引物相對(duì)于靶序列發(fā)生退火和延伸，然后在"DNA聚合酶的最適溫度范圍"內(nèi)進(jìn)行溫育。然而，相反的情況也是可以的。可在有聚合酶進(jìn)行聚合所用的反應(yīng)組分如dNTP、ATP或鹽存在的條件下進(jìn)行溫育。在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的方法中，可在靶核酸不變性的條件下進(jìn)行溫育。在根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的方法中，耙核酸的復(fù)制產(chǎn)生復(fù)制鏈并且在復(fù)制期間，復(fù)制鏈中的至少一條通過另一復(fù)制鏈的鏈置換復(fù)制而從靶序列上置換下來。如上所述，本發(fā)明實(shí)施方式中所用的DNA聚合酶需要與單一的或合適的鏈置換因子組合并在復(fù)制期間置換雜交鏈。在下文中，將DNA聚合酶稱作鏈置換DNA聚合酶。鏈置換DNA聚合酶可不具有5'—3'外切核酸酶活性。鏈置換是需要的，以便合成靶序列的多份拷貝。如果存在5'—3'外切核酸酶活性，則可毀壞所合成的鏈?？赏ㄟ^鏈置換因子如解旋酶促進(jìn)鏈置換。鏈置換DNA聚合酶可為高度有效的(highlyprocessive)。由于鏈置換，從多重置換拷貝進(jìn)行復(fù)制，這樣的擴(kuò)增方法稱為多重置換擴(kuò)增(MDA)。多重置換擴(kuò)增在本領(lǐng)域中是已知的(參見US6，124，120，將其內(nèi)容全部引入本文作為參考)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，耙核酸序列包括DNA、RNA和PNA。而且，除了天然核苷酸之外，耙核酸序列還包括修飾的核苷酸。靶核酸可為雙鏈或單鏈核酸。將參照以下實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述以上實(shí)施方式。這些實(shí)施例僅用于說明性目的并且不意圖限制本發(fā)明實(shí)施方式的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1:熱循環(huán)對(duì)多重置換擴(kuò)增的影響在本實(shí)施例中，使用外切(-)BstDNA聚合酶(NewEnglandBiolab)作為BstDNA聚合酶。將外切(-)BstDNA聚合酶、六聚體隨機(jī)引物(BioneerCo.，Korea)、以及通過使用血液DNA純化試劑盒(QiagenCo.)純化血液而獲得的人類基因組樣品在BstDNA聚合酶緩沖液(約20mMTris-HCl、約10mM(NH4)2S04J々10mMKC1、約2mMMgS。4、約0.1%TritonX-100、pH約8.8、約25°C)(NewEnglandBiolab)中進(jìn)行接觸，然后在約30。C或約60。C溫育，或者當(dāng)在約3(TC與約6(TC之間進(jìn)行熱循環(huán)時(shí)進(jìn)行溫育。當(dāng)在約3(TC與約6(TC之間進(jìn)行熱循環(huán)時(shí)，是在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)裝置中，在3(TC進(jìn)行約20秒、和在約6(TC進(jìn)行約40秒。已知外切(-)BstDNA聚合酶在約65。C具有最佳活性(Mead，D.A.等，(1991)Biotechniques，11，76_87)。在反應(yīng)完成后，用電泳裝置使所得擴(kuò)增產(chǎn)物在約1%凝膠中電泳，隨后用SYBRGreenI對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行特異性標(biāo)記。然后，所得產(chǎn)物用波長(zhǎng)約480nm的激發(fā)光輻照，并檢測(cè)580nm的發(fā)射光。圖1的電泳圖像顯示在約3(TC或約6(TC擴(kuò)增耙序列時(shí)，或者在約3(TC與約60°C之間進(jìn)行熱循環(huán)時(shí)的擴(kuò)增結(jié)果。如圖l所示，與在3(TC或6(rC進(jìn)行反應(yīng)時(shí)相比，當(dāng)在約3(rC與約6(TC之間進(jìn)行熱循環(huán)時(shí)的短時(shí)間段期間，耙序列擴(kuò)增得更多。在圖1中，M為分子量標(biāo)志物，O.5h、lh、1.5h和2h分別表示0.5小時(shí)、1小時(shí)、1.5小時(shí)和2小時(shí)。圖2顯示熱循環(huán)按照?qǐng)D1所示在約3(TC與約6(TC之間進(jìn)行時(shí)靶序列的擴(kuò)增結(jié)果以及使用對(duì)照樣品所獲得的結(jié)果。該對(duì)照樣品為REPLI-GULTRAKit(QiagenCo.)?，F(xiàn)在將詳細(xì)描述詳細(xì)的反應(yīng)條件。將50ng模板DNA用變性緩沖液和復(fù)性緩沖液各處理2分鐘，然后用IX反應(yīng)緩沖液和IX酶混合物進(jìn)行處理。如圖2所示，與使用對(duì)照產(chǎn)物時(shí)相比，當(dāng)按照本發(fā)明實(shí)施方式的方法在約3(TC與約6(TC之間進(jìn)行熱循環(huán)期間擴(kuò)增靶序列時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物類似于原始的模板。在圖2中，T表示完整的純化的人類基因組，M表示分子量標(biāo)志物，并且0.5h、lh、1.5h和2h分別表示0.5小時(shí)、1小時(shí)、1.5小時(shí)和2小時(shí)。將約50ng模板DNA、約100yM隨機(jī)六聚體引物、約IX熱穩(wěn)定的BstDNA聚合酶緩沖液(約20mMTris-HCl、約10mM(NH4)2S04J々10mMKC1、約2mMMgS。4、約0.1%TritonX-100、約25°C、pH值約為8.8)、以及約10單位BstDNA聚合酶混合，將約3(TC溫育約20秒和約6(TC溫育約40秒的熱循環(huán)反復(fù)進(jìn)行，直至過了上述時(shí)間，即，約0.5小時(shí)、約1小時(shí)、約1.5小時(shí)和約2小時(shí)。如上所述，可基于以下機(jī)理實(shí)現(xiàn)在進(jìn)行熱循環(huán)時(shí)靶序列擴(kuò)增效率的改善。然而，本發(fā)明的實(shí)施方式不限于該機(jī)理。首先，將隨機(jī)六聚體引物、外切(-)BstDNA聚合酶和人類基因組在約6(TC溫育以使一部分人類基因組的序列變性。然而，由于6(TC是高于隨機(jī)六聚體引物的Tm的溫度，因而隨機(jī)六聚體引物不與該靶序列雜交。當(dāng)將溫育溫度降至約3(TC時(shí)，隨機(jī)六聚體引物與該靶序列雜交并延伸。然后，將溫育溫度升至約60°C，延伸的隨機(jī)六聚體引物將部分地變性并且可以不與靶序列分離。當(dāng)將溫育溫度從約6(TC降至約3(TC時(shí)，新的隨機(jī)六聚體引物雜交與已在約6(TC變性的那部分靶序列雜交并延伸。如上所述，由于熱循環(huán)，引物的退火增加并且因而引物的延伸也增加。因此，耙序列的擴(kuò)增效率增加。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的擴(kuò)增靶核酸序列的方法，可有效地?cái)U(kuò)增靶核酸序列。應(yīng)理解，本文中所述示例性實(shí)施方式應(yīng)當(dāng)僅在說明性意義上考慮，而不應(yīng)當(dāng)用于限制目的。各實(shí)施方式中的特征或方面的描述應(yīng)當(dāng)通常認(rèn)為可用于其它實(shí)施方式中的其它類似特征或方面。權(quán)利要求擴(kuò)增靶核酸序列的方法，該方法包括使一組引物、DNA聚合酶以及靶核酸序列在溶液中接觸；和溫育該溶液以復(fù)制該靶核酸序列，其中該靶核酸序列的復(fù)制產(chǎn)生復(fù)制鏈，并且在復(fù)制期間，所述復(fù)制鏈中的至少一條通過另一復(fù)制鏈的鏈置換復(fù)制而從該靶序列上置換下來，其中所述溫育時(shí)在兩個(gè)溫度范圍之間進(jìn)行熱循環(huán)，其中一個(gè)溫度范圍是該DNA聚合酶的活性最適溫度范圍，另一個(gè)溫度范圍是促進(jìn)所述引物與該靶序列雜交的溫度范圍。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述引物包括隨機(jī)核苷酸序列或特定序列。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述引物具有約5至約20bp的長(zhǎng)度。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述引物具有約5至約8bp的長(zhǎng)度。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述引物具有約6bp的長(zhǎng)度。6.權(quán)利要求l的方法，其中該DNA聚合酶的最適溫度高于雜交至該靶序列上的引物發(fā)生變性時(shí)的變性溫度，并且低于在促進(jìn)所述引物與該靶序列雜交的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行溫育期間復(fù)制鏈發(fā)生變性時(shí)的變性溫度。7.權(quán)利要求1的方法，其中該DNA聚合酶的最適溫度范圍為約4(TC至約65°C。8.權(quán)利要求l的方法，其中促進(jìn)所述引物與該靶序列雜交的溫度范圍為約ot:至約35°C。9.權(quán)利要求l的方法，其中該DNA聚合酶包括(p29DNA聚合酶、TtsDNA聚合酶、M2DNA聚合酶、VENT"1DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、PRDlDNA聚合酶、或BstDNA聚合酶。10.權(quán)利要求l的方法，其中該DNA聚合酶包括外切(-)BstDNA聚合酶，該DNA聚合酶的最適溫度范圍為約46t:至約75t:，并且促進(jìn)所述引物與該靶序列雜交的溫度范圍為約4t:至約35°C。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述引物包括具有約6bp長(zhǎng)度的隨機(jī)引物或具有特定序列的引物。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述引物包括至少一種修飾的核苷酸，其中所述引物是耐核酸酶的。13.權(quán)利要求12的方法，其中該修飾的核苷酸包括生物素化核苷酸、熒光標(biāo)記核苷酸、5-甲基-dCTP、BrdUTP、或5-(3-氨基烯丙基)-2'_脫氧尿苷_5'-三磷酸。14.擴(kuò)增靶核酸序列的方法，該方法包括使一組引物、DNA聚合酶以及靶核酸序列在溶液中接觸；禾口溫育該溶液以復(fù)制該靶核酸序列，其中所述溫育時(shí)在該DNA聚合酶的活性最適溫度范圍與另一溫度范圍之間進(jìn)行熱循環(huán)，所述另一溫度范圍是促進(jìn)所述引物與該靶序列雜交的溫度范圍，其中該DNA聚合酶的最適溫度高于雜交至該靶序列上的引物發(fā)生變性時(shí)的變性溫度，并且低于在促進(jìn)所述引物與該靶序列雜交的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行溫育期間復(fù)制鏈發(fā)生變性時(shí)的變性溫度。15.權(quán)利要求14的方法，其中該靶核酸序列的復(fù)制產(chǎn)生復(fù)制鏈，并且在復(fù)制期間，所述復(fù)制鏈中的至少一條通過另一復(fù)制鏈的鏈置換復(fù)制而從該靶序列上置換下來。16.擴(kuò)增靶核酸序列的方法，該方法包括使一組引物、DNA聚合酶以及靶核酸序列在溶液中接觸；禾口溫育該溶液以復(fù)制該靶核酸序列，其中所述溫育時(shí)，在該DNA聚合酶的活性最適溫度范圍與另一溫度范圍之間進(jìn)行熱循環(huán)，所述另一溫度范圍是促進(jìn)所述引物與該靶序列雜交的溫度范圍，其中該DNA聚合酶包括外切(-)BstDNA聚合酶，該DNA聚合酶的最適溫度范圍為約46t:至約75t:，并且促進(jìn)所述引物與該耙序列雜交的溫度范圍為約4t:至約35°C。17.權(quán)利要求16的方法，其中該靶核酸序列的復(fù)制產(chǎn)生復(fù)制鏈，并且在復(fù)制期間，所述復(fù)制鏈中的至少一條通過另一復(fù)制鏈的鏈置換復(fù)制而從該靶序列上置換下來。全文摘要本發(fā)明涉及擴(kuò)增靶核酸序列的方法，該方法包括多重置換擴(kuò)增和熱循環(huán)。根據(jù)該方法，可有效地?cái)U(kuò)增靶核酸序列。文檔編號(hào)C12P19/34GK101705273SQ200910165728公開日2010年5月12日申請(qǐng)日期2009年8月6日優(yōu)先權(quán)日2008年8月8日發(fā)明者李周遠(yuǎn)申請(qǐng)人:三星電子株式會(huì)社