專利名稱：乳腺癌細胞C35基因siRNA表達載體的構建以及抗腫瘤治療應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬基因工程領域，具體地說是乳腺癌細胞C35基因SiRNA序列設計、表達載 體的構建及其中抗腫瘤治療中的研究和應用。
背景技術：
傳統(tǒng)的腫瘤治療方法有化療、手術、放療和內分泌治療，給患者帶來了痛苦，不能 從根本上解決抗腫瘤問題。隨著對腫瘤細胞生長、增殖、凋亡的分子機制研究的深入，現(xiàn)代 腫瘤的治療已進入生物治療時代，靶向性治療腫瘤已成為可能。近年來基因阻斷技術在基 因功能研究中有很大進展，臨床治療研究也顯示了良好的前景，為我們設計抗腫瘤治療方 案提供了可借鑒的技術手段。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是最近幾年來發(fā)現(xiàn)和發(fā)展起來的新興基因 阻斷技術。自RNAi現(xiàn)象報道以來，科學家對其作用機制進行了大量研究，目前認為涉及包 括RnaseIII內切酶Dicer等多步驟過程，最終產(chǎn)生有活性的21 23nt小干擾RNA(short interfering RNA, siRNA)，介導與其互補同源mRNA序列的特異性見解。其作用具有高效、 特異的特點，比反義寡核苷酸抑制目的基因的效果更好。從目前的研究報道來看，RNAi技 術主要用于基因功能和抗腫瘤研究，具有良好的效果。國內外有關RNAi抗腫瘤的相關報道有很多，但是運用RNAi阻斷技術設計針對C35 基因不同編碼區(qū)的siRNA序列，進一步構建C35siRNA表達載體，至今未見國內外報道。同 時在體外實驗轉染細胞后運用RT-PCR技術檢測抑制后基因表達的情況；此外在體外轉染 實驗中細胞模型中運用Western Blot對C35siRNA特異抑制C35蛋白進行了研究，并運用 MTT、TUNEL和ArmexinV/PI流式細胞分析法實驗證實C35siRNA具有較強抑制乳腺癌細胞 生長的作用，亦未見報道。因此，本技術的理論意義和實際意義都將是十分重大的。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為了設計針對C35不同靶基因區(qū)siRNA序列，并以pTZU6+l為表 達載體，構建一系列siRNA重組體，在體外實驗中系統(tǒng)研究其抑制C35表達的作用，為進一 步在體內抗腫瘤打下了良好的實驗基礎。本發(fā)明包括兩對C35siRNA序列的設計。本發(fā)明包括獨特的莖環(huán)結構C35siRNA的設計，即正向和方向重復19nt單鏈DNA 通過中間折疊結構的間隔，同時設計在一條核苷酸鏈上。本發(fā)明包括C35siRNA表達載體pSIRNAC35_l和pSIRNAC35_2的構建。本發(fā)明包括在體外實驗轉染細胞后運用RT-PCR技術檢測抑制后基因表達的情況。本發(fā)明包括體外轉染實驗中細胞模型中運用Western Blot對C35siRNA特異抑制 C35蛋白進行了研究。
本發(fā)明包括體外轉染試驗中運用MTT、TUNEL和Armexin V/PI流式細胞分析法技 術對乳腺癌細胞的增殖和凋亡進行了研究。
本發(fā)明所構建的C35siRNA表達載體經(jīng)酶切鑒定、序列測定表明構建成功，在體外 轉染的細胞模型中，通過RT-PCR和Western Blot實驗均證實C35蛋白產(chǎn)物的表達受到明 顯抑制，通過MTT、TUNEL和ArmexinV/PI流式細胞分析法實驗證實乳腺癌細胞的生長受到 明顯抑制，腫瘤細胞發(fā)生凋亡，能較為明顯地證實C35siRNA具有抑制乳腺癌細胞中C35基 因的表達和腫瘤細胞的生長的作用。本發(fā)明所述的C35siRNA表達載體可作為一種新型抗腫瘤基因治療藥物，運用到 臨床治療中?？梢詫⑺龅腃35siRNA作為基因藥物直接進行裸DNA注射，導入機體的腫瘤 組織內；或利用金包被DNA槍轟擊法，將構建好的表達載體質粒DNA包被在金微粒子表而， 用基因槍使包被DNA的金微粒子高速穿入腫瘤組織細胞；或作為主要活性組分，添加適用 的藥用輔料，制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明提供了兩種靶向C35基因序列的SiRNA表達載體，在構建針對C35基因 的siRNA表達載體時，根據(jù)siRNA的設計原則，分別選擇C35蛋白編碼區(qū)259nt-278nt，編 碼區(qū)282nt-300nt的核苷酸序列，設計相應的siRNA ；用BLAST軟件進行同源分析證實為 C35高度保守序列后，化學合成單鏈寡核苷酸；體外經(jīng)退火形成雙鏈DNA，與真核表達載體 PTZU6+1連接，酶切鑒定和序列測定分析表明成功構建了兩種靶向C35基因序列的siRNA表 達載體。本發(fā)明人所設計的兩對C35siRNA序列為(1)序列C35編碼區(qū)259nt-278nt位核苷酸上游序列5，-TCTGAAGATCTCATTGAGGCCATCTTCGATGGCCTCAATGAGATCTTTTT-3，下游序列5，-CTAGAAAAAAGATCTCATTGAGGCCATCCGAAGATGGCCTCAATGAGATTC-3，(2)序列C35編碼區(qū)282nt-300nt位核苷酸上游序列5，-TCGAGGAGCCAGTAATGGAGAAACTTCGGTTTCTCCATTACTGGCTCTTTTT-3，下游序列5，-CTAGAAAAAGAGCCAGTAATGGAGAAACCGAAGTTTCTCCATTACTGGCTCC-3，上述C35基因序列的siRNA表達載體含有兩對序列中的一對。所述(1)的序列作用于C35編碼區(qū)259nt-278nt位核苷酸AGATCTCATTGAGGCCATC， 所述(2)序列作用于C35編碼區(qū)282nt-300nt位核苷酸GAGCCAGTAATGGAGAAAC。上述設計的任何一條siRNA序列能形成發(fā)夾結構的RNA，即同一條siRNA序列包含 了 siRNA折疊體的兩條互補鏈。從5’端開始先為siRNA作用鏈序列，(即對相應目的基因 序列的互補序列)，長度為19nt，中間以4nt的TTCG間隔形成發(fā)夾結構，最后為siRNA作用 鏈的反向重復序列。本發(fā)明所述的C35 siRNA表達載體構建，采用了 pTZTO+Ι表達載體，該載體含 RNApolIII啟動子U6，能介導C35siRNA在體內的正確轉錄并根據(jù)目的序列的TTTTT末端適 時終止，尤其適合靶基因C35siRNA在體內表達的需要?？朔艘酝鵶iRNA體外合成耗時、 昂貴的缺點，使siRNA在功能基因和抗腫瘤基因治療上的研究領域更為廣闊。本發(fā)明還提供了重組質粒與空載體的酶切鑒定方法，以及通過簡單的酶切反應快 速篩選重組菌落的方法。因為含C35siRNA的pTZL6+l載體僅比空質粒多52bp，通過DNA電 泳比較分子量大小來篩選重組子顯然較為困難。本發(fā)明人根據(jù)PTZU6+1帶有Sal I與XbaI酶切位點，同時Xho I與Sal I識別的DNA序列相同，Xho I酶切后的粘端與Sal I酶切 位點匹配的特征，在設計每一條siRNA序列時，分別在5’端加入Xho 1、3’端加入Xba I識 別序列，并與PTZU6+1的Sal I與Xba I酶切片段連接，含C35siRNA的重組載體Sal I和 Xho I酶切位點均丟失，不能被上述酶酶切，因此，通過簡單的酶切反應就可以快速篩選重 組菌落。本發(fā)明人對所述C35 siRNA表達載體進行了大量的測試和應用研究工作包括所述表達載體通過陽離子脂質體介轉感染乳腺癌細胞T47D后，采用RT-PCR 法檢測C35基因抑制前后的變化，通過RT-PCR對腫瘤不同靶區(qū)siRNA特異抑制基因表達進 行深入、細致研究。 包括采用C35的抗體對C35siRNA轉染細胞表達C35蛋白進行Western Blot檢測， 為C35siRNA體外抑制C35蛋白的表達提供實時、直觀的證據(jù)。包括體外轉染試驗中運用MTT、TUNEL和ArmexinV/PI流式細胞分析法技術對乳腺 癌細胞的增殖和凋亡進行了研究。本發(fā)明所構建的C35siRNA表達載體經(jīng)酶切鑒定、序列測定表明構建成功，在體外 轉染的細胞模型中，通過RT-PCR和Western Blot實驗均證實C35蛋白產(chǎn)物的表達受到明 顯抑制，通過MTT、TUNEL和Armexin V/PI流式細胞分析法實驗證實乳腺癌細胞的生長受到 明顯抑制，腫瘤細胞發(fā)生凋亡，能較為明顯地證實C35siRNA具有抑制乳腺癌細胞中C35基 因的表達和腫瘤細胞的生長的作用，可以直接用作抗腫瘤基因藥物或用于制備抗腫瘤的藥 物。
圖1 含獨特莖環(huán)結構的C35siRNA設計2 :psiRNA-C35表達載體的構建示意3 重組載體psiRNA_C35雙酶切鑒定圖其中1·psiRNA-C35-l 2. Sail 單酶切的 psiRNA_C35_l 3.雙酶切 EcoR I 和 HindIII 的 psiRNA_C35_l 4. Marker 5..雙酶切 EcoR I 和 HindIII 的 pTZU6+l 6. Sail 單酶切的 PTZU6+1 7. pTZU6+l 8. psiRNA_C35_2 9. Sail 單酶切的 psiRNA_C35_2 10.雙酶切 EcoR I 和 HindIII 的 psiRNA_C35_2 11. Marker
將重組的質粒載體psiRNA-C35-l和psiRNA-C35_2送交測序公司測序，測序結果如下 psiRNA-C35-l
CGAAACACCGTCGAGAGATCTCATTGAGGCCATCTTCGGATGGCCTCAATGAGATCTTTTTTCTAGAGCGGA CTTCGGTCCGCTTTTTACTAGGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGG AAAAC
psiRNA-C35-2
TCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTCGAGGAGCCAGTAATGGAGAAACTTCGGTTTC TCCATTACTGGCTCTTTTTCTAGAGCGGACTTCGGTCCGCTTTTTACTAGGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACT GGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATC
通過酶切鑒定和測序結果表明，psiRNA-C35重組載體構建成功，命名為psiRNA-C35_l 和 psiRNA-C35-2。圖4和圖5 半定量RT-PCR檢測轉染psiRNA-C35的T47D細胞C35mRNA的表達抑制情 況，其中
圖4為C35和β -actin半定量RT-PCR電泳圖，圖中 1. Maker 2. psiRNA_C35_l 3. psiRNA_C35_2 4. pTZU6+l 5.脂質 圖5為半定量RT-PCR抑制C35mRNA轉錄的效果，圖中 1.脂質體 2. pTZU6+l 3. psiRNA-C35-l 4psiRNA_C35_2
瓊脂糖凝膠電泳結果表明，八組泳道中內源基因β-actin基因擴增片段條帶的亮 度相似，說明各組中模板量相似，而擴張的目的基因情況存在明顯差異。其中轉染質粒 PTZU6+1、psiRNA-C35-l和psiRNA-C35_2組的相對抑制率分別是轉染對照組 (脂質體組) 的 95. 3%、40%和 28. 4%。
圖6和圖7 :ffestern-blot檢測轉染psiRNA_C35的T47D細胞C35蛋白的表達抑制情 況，其中
圖6為Westernblot分析轉染siRNA后C35蛋白的變化，圖中 1.月旨質體 2.pTZU6+l 3. psiRNA-C35-l 4. psiRNA_C35_2 圖7為Westernblot檢測轉染細胞C35蛋白的表達效果，圖中 1.脂質體 2. pTZU6+l 3. psiRNA-C35-l 4psiRNA_C35_2
利用Western Blot檢測轉染siRNA后T47D細胞中C35蛋白質表達情況，結果顯 示，只轉染脂質體組和pTZTO+Ι的C35蛋白雜交帶要強于重組質粒psiRNA-C35-l和 psiRNA-C35-2，進一步證實了構建的重組質粒對于C35有抑制作用。應用圖像系統(tǒng)分析結 果，以轉染脂質體組的蛋白帶為標準，其它組與之比較，轉染質粒PTZU6+1、psiRNA-C35-l 和psiRNA-C35-2組的相對抑制率分別是轉染對照組(脂質體組)的94. 9%、29. 6%和 32. 2%
圖8為MTT檢測轉染psiRNA-C35的T47D細胞的生長增殖情況，圖中 1.月旨質體 2.pTZU6+l 3. psiRNA-C35-l 4. psiRNA_C35_2 縱坐標增值率(％ )72h細胞
實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析顯示，經(jīng)PSIC35轉染后的乳腺癌T47D細胞生長受到顯著抑制，抑制 率達83%。
圖9 =TUNEL檢測轉染psiRNA-C35的T47D細胞的凋亡樣形態(tài)，其中 圖9a 200倍視野下，轉染pTZU6+l空載體的T47D細胞(陰性對照) 圖9b 400倍視野下，轉染pTZU6+l空載體的T47D細胞(陰性對照) 圖9c 200倍視野下，轉染脂質體的T47D細胞(陰性對照) 圖9d 400倍視野下，轉染脂質體的T47D細胞(陰性對照) 圖9e 200倍視野下，轉染psiC35-l的T47D細胞 圖9f 400倍視野下，轉染psiC35-l的T47D細胞 圖9g 200倍視野下，轉染psiC35-2的T47D細胞 圖9h 400倍視野下，轉染psiC35-2的T47D細胞
200倍和400倍指不同的視野，轉染pTZTO+Ι空質粒和脂質體的細胞為陰性對照，細胞 狀態(tài)正常，胞核無凋亡特征性著染；經(jīng)PSIC35-1和pSIC352轉染的細胞中，較多細胞出現(xiàn)了 核中有棕黃色著染，細胞呈典型的凋亡形態(tài)學改變，即表現(xiàn)為變小、變圓、核固縮。圖10 :AnnexinV/PI流式細胞分析法檢測轉染psiRNA-C35的T47D細胞的凋亡，檢測細 胞數(shù)量為IO6個細胞，培養(yǎng)時間為72h，其中
圖IOa 未經(jīng)處 理的T47D細胞(為系統(tǒng)對照)
只有細胞，沒加任何試劑。細胞正常。
Region Number % gated X—mean HPX-CV
Bl 41 0. 78 3. 3 0. 5
B2 1 0.02 24.6 0. 2
B3 5196 99.14 3.1 8.6
B4 3 0.06 15.0 0. 3
圖IOb 只加PI的T47D細胞(為系統(tǒng)陰性對照)
Bl 372 11.90 3.5 0.5
B2 4 0. 13 11. 2 0.3
B3 2751 87.98 3. 2 4. 1
B4 0 0.00 0.0 0.0
圖IOc 只加ArmexinV的T47D細胞(為實驗組陰性對照)
細胞+ArmexinV為實驗組陰性對照，正常細胞的凋亡率為19. 2%。
Bl 9 0. 16 3.6 2.1
B2 0 0.00 0.0 0.0
B3 4412 80.64 3.4 2. 3
B4 1050 19.19 116.9 0.2
圖IOd 轉染脂質體的T47D細胞，加ArmexinV和PI (為實驗組陰性對照)
只轉染脂質體的細胞，凋亡率為18. 5%。
Bl 250 3. 19 5.5 0.4
B2 376 4. 79 60.6 0.6
B3 6143 78. 30 3.6 7. 7
B4 1076 13. 72 100.8 0.9
圖IOe 轉染pTZU6+l空載體的T47D細胞，加ArmexinV和PI (為實驗組陰性對照)
只轉染PTZU6+1空質粒的細胞，凋亡率為21.6%。
Region Number % gated X-mean HPX CV
Bl 143 2. 26 4.8 0.6
B2 419 6.61 90.6 0.2
B3 4825 76. 15 3. 51 8. 2
B4 949 14. 98 137. 2 0. 2
圖 IOf 轉染 psiC35-l 的 T47D 細胞，加 AnnexinV 和 PI
轉染pSIC35-l的細胞+AnnexinV和PI，細胞凋亡率為33.7%。
Bl 252 2. 52 4.8 0. 3
B2 777 7.78 118.3 0.2
B3 6373 63.81 3.7 7.2
B4 2586 25.89 201.6 0. 3圖 IOg 轉染 psiC352 的 T47D 細胞，加 AnnexinV 和 PI
轉染pSIC35-2的細胞+AnnexinV+PI 細胞凋亡率為33. 7%。
Bl 121 1.64 5.11.0
B2 540 7. 33 121. 5 0. 1
B3 3937 53.45 3.9 9.0
B4 2768 37. 58 194. 7 0. 具體實施例方式本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達到本發(fā)明根據(jù)siRNA的設計原則，分別選擇C35蛋白編碼區(qū)259nt-278nt，編碼 區(qū)282nt-300nt的核苷酸序列，設計相應的siRNA，用BLAST軟件進行同源分析證實為 C35高度保守序列后，化學合成單鏈寡核苷酸，體外經(jīng)退火形成雙鏈DNA，與真核表達載體 PTZU6+1連接，酶切鑒定和序列測定分析表明成功構建了兩種靶向C35基因序列的siRNA 表達載體。上述表達載體通過陽離子脂質體介導轉染乳腺癌細胞T47D后，采用RT-PCR和 Western Blot實驗均證實C35siRNA具有較強抑制腫瘤細胞中C35基因表達的作用。通過 MTT,TUNEL和Armexin V/PI流式細胞分析法實驗證實乳腺癌細胞的凋亡，能較為明顯地抑 制乳腺癌細胞中C35基因的表達和腫瘤細胞的生長。具體實施方案如下
1. C35siRNA序列的設計與合成根據(jù)siRNA設計原則，分別選擇C35核心編碼區(qū)259nt_278nt，282nt_300nt的核 苷9178序列，設計下列相應的siRNA序列。C35 編碼區(qū) 259nt-278ntsiRNA上游序列5，-TCTGAAGATCTCATTGAGGCCATCTTGGGATGGCCTCAATGAGATCTTTTT-3，下游序列5，-CTAGAAAAAAGATCTCATTGAGGCCATCCGAAGATGGCCTCAATGAGATTC-3，C35 編碼區(qū) 282nt_300nt上游序列5，-TCGAGGAGCCAGTAATGGAGAAACTTCGGTTTCTCCATTACTGGCTCTTTTT-3下游序列5，-CTAGAAAAAGAGCCAGTAATGGAGAAACCGAAGTTTCTCCATTACTGGCTCC-3，上述序列用BLAST軟件進行同源分析證實為C35高度保守后，采用化學合成方法 合成單鏈寡核苷酸。2. DNA片段退火變?yōu)殡p鏈取等量100mmol/L的DNA合成片段，在退火緩沖液(lOOmmol/LNaCl)中于95°C保 溫5min后，緩慢降至室溫，然后用DNA純化試劑盒進行純化。3.構建PSIC35表達載體將純化的DNA片段分別與Sal I和Xba I雙酶切的轉錄載體pTZU6+l進行連接， 轉化DH5 α大腸桿菌，經(jīng)Amp抗性篩選，用Sal I或HindIII和EcoR I酶切鑒定，分別篩選 出含目的基因的陽性克隆，并進行序列分析加以確定。4. pSIC35體外對C35表達的抑制作用將兩種pSIC35按一定的比例轉染T47D細胞，同時設pSI對照。轉染后48h收集 細胞，采用以下手段證明PSIC35體外對C35表達具有明顯抑制作用①RT-PCR方法=Trizol試劑提取經(jīng)pSIC35轉染的T47D細胞(轉染后培養(yǎng)48h)總RNA，以lug總RNA起始逆轉錄反應，PCR擴增C35基因，同時以內源β -actin基因為對 照物，經(jīng)35次循環(huán)擴增后，瓊脂糖凝膠電泳，觀察轉染后細胞C35基因水平的變化。 RT-PCR體系引物序列第一對內源對照β -actin基因的引物，上引物 5，-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3，，下引物5，-CTCCT TAATGTCACGCACGATTTC-3，；第二對是被 抑制的目的基因的引物，即C35基因的引物5，-CGGAATTCATGAGCGGGGAGCCGG-3，和5，-CGG GATCCTCACAGGATGACGCGGGAGGA-3，。結果顯示，C35siRNA對C35基因的表達有明顯的抑制作 用。②Western Blot方法經(jīng)pSIC35轉染的T47D細胞培養(yǎng)48h后，裂解得到蛋白樣 品，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳(濃縮膠濃度5%，分離膠 濃度12% )后，根據(jù)蛋白Marker中分子量的位置，切去不需要部分，用C35抗體和內參進 行蛋白質免疫印跡實驗，用Chemilucent ECLDetection System-Trial化學發(fā)光劑處理后， 應用FUJIFILMLAS-4000/LAS-4000mini檢測系統(tǒng)，觀察經(jīng)轉染后C35蛋白的表達變化情況。 結果顯示，C35siRNA明顯抑制了 C35蛋白的表達，且具有高度的序列特異性。③MTT法檢測細胞增殖實驗T47D細胞接種到96孔板內，經(jīng)pSIC35轉染后培養(yǎng) 68h，加入MTT，設一調零孔。4h后，倒掉培養(yǎng)液，加入DMSO，570nm/630nm酶標儀檢測轉染后 T47D細胞的增殖情況有何變化。實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析顯示，經(jīng)PSIC35轉染后的乳腺癌T47D 細胞生長收到顯著抑制，證明C35siRNA可抑制乳腺癌細胞的增殖。④TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡實驗T47D細胞接種到24孔板內，經(jīng)pSIC35轉染 后培養(yǎng)72h，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，經(jīng)熒光標記液標記，綠色熒光顯示凋亡細胞，在熒光顯 微鏡下計數(shù)凋亡細胞；之后用converter-POD處理標本后，經(jīng)DAB底物反應，再經(jīng)復染、固定 后，用光學顯微鏡進行計數(shù)(200 500個細胞)并拍照。TUNEL法檢測顯示，經(jīng)pSIC35轉 染的細胞中，較多細胞出現(xiàn)了核中有棕黃色著染，細胞呈典型的凋亡形態(tài)學改變，即表現(xiàn)為 變小、變圓、核固縮；而正常細胞的胞核不著染的現(xiàn)象，證明C35siRNA可誘導乳腺癌細胞的 凋亡。⑤AnnexinV/PI流式細胞分析法T47D細胞經(jīng)轉染后72h，用IXbindingbuffer 重懸細胞，使其溶液終濃度為IO7細胞/ml。轉移IOOul的細胞液到1.5ml流式管里。設置 陰性對照只加Armexin V和只加PI，其余各標本同時各加入5ul的Armexin V和PI。輕柔 地混勻，黑暗中室溫放置15min。每管內加入400ulIXbinding buffer，Ih內用流式細胞儀 檢測凋亡細胞數(shù)目。實驗結果顯示，經(jīng)PSIC35轉染后的乳腺癌T47D細胞比正常細胞凋亡 率增加15%，C35siRNA具有明顯抑制腫瘤細胞生長、促進細胞凋亡的效果。在本發(fā)明中，運用分子生物學和細胞生物學相關技術，設計了兩對C35基 因的siRNA序列并構建了 PSIC35表達載體，在進一步的體外實驗中，運用RT-PCR、 Western-Blot、MTT、TUNEL和AnnexinV/PI流式細胞分析法等實驗技術初步顯示了其具有 明顯、特異的抗乳腺腫瘤效應。本發(fā)明的優(yōu)點在于(1).本發(fā)明設計了獨特的、具有莖環(huán)結構的C35siRNA，即同一條siRNA序列包含 了 siRNA折疊體的兩條互補鏈。從5’端開始先為siRNA作用鏈序列(即對應目的基因序 列的互補序列)，長度為19nt，中間以4nt的TTCG間隔形成發(fā)夾結構，最后為siRNA作用鏈 的反向重復序列。
(2)本發(fā)明采用了 pTZTO+1表達載體，該載體含RNApolIII啟動子TO，能介導 C35siRNA在體內的正確轉錄并根據(jù)目的序列的TTTTT末端適時終止，尤其適合靶基因 C35siRNA在體內表達的需要，克服了以往siRNA體外合成耗時、昂貴的缺點，使siRNA在功 能基因和抗腫瘤基因治療上的研究領域更為廣闊。 (3).上述表達載體轉染T47D細胞，采用RT-PCR法檢測C35基因抑制前后的變化， 通過RT-PCR對腫瘤不同靶區(qū)siRNA特異抑制基因表達，進行深入、細致研究。(4).采用C35的抗體對C35siRNA轉染細胞表達C35蛋白進行WesternBlot檢測， 為C35siRNA體外抑制C35蛋白的表達提供實時、直觀的證據(jù)。(5)采用MTT、TUNEL和Annexin V/PI流式細胞分析法實驗檢測經(jīng)C35siRNA轉染 細胞的凋亡情況，為乳腺癌T47D細胞的體外增殖抑制和促進腫瘤細胞凋亡提供證據(jù)。
權利要求
一種構建兩種靶向C35基因序列的siRNA表達載體，其特征在于在構建針對C35基因的siRNA表達載體時，根據(jù)siRNA的設計原則，分別選擇C35蛋白編碼區(qū)259nt 278nt，編碼區(qū)282nt 300nt的核苷酸序列，設計相應的siRNA；用BLAST軟件進行同源分析證實為C35高度保守序列后，化學合成單鏈寡核苷酸；體外經(jīng)退火形成雙鏈DNA，與真核表達載體pTZU6+1連接，酶切鑒定和序列測定分析表明成功構建了兩種靶向C35基因序列的siRNA表達載體。
2.如權利要求1所述的C35siRNA表達載體，其特征在于設計的兩對C35siRNA序列為C35 編碼區(qū) 259nt-278ntsiRNA上游序列5 ’ -TCTGAAGATCTCATTGAGGCCATCTTCGATGGCCTCAATGAGATCTTTTT-3 ’下游序列5 ’ -CTAGAAAAAAGATCTCATTGAGGCCATCCGAAGATGGCCTCAATGAGATTC-3 ’C35 編碼區(qū) 282nt-300nt上游序列5’ -TCGAGGAGCCAGTAATGGAGAAACTTCGGTTTCTCCATTACTGGCTCTTTTT-3’下游序列5’ -CTAGAAAAAGAGCCAGTAATGGAGAAACCGAAGTTTCTCCATTACTGGCTCC-3’
3.如權利要求1或2所述的C35siRNA表達載體，其特征在于設計的任何一條siRNA序 列能形成發(fā)夾結構的RNA，即同一條siRNA序列包含了 siRNA折疊體的兩條互補鏈。從5’ 端開始先為siRNA作用鏈序列，長度為19nt，中間以4nt的TTCG間隔形成發(fā)夾結構，最后為 siRNA作用鏈的反向重復序列。
4.如權利要求1所述的C35siRNA表達載體的構建方法，其特征在于采用了pTZTO+Ι表 達載體，該載體含RNApolIII啟動子TO，能介導C35siRNA在體內的正確轉錄并根據(jù)目的序 列的TTTTT末端適時終止，尤其適合靶基因C35siRNA在體內表達的需要。
5.如權利要求1所述的C35siRNA表達載體的構建方法，其特征還在于通過酶切反應， 快速鑒定重組質粒與空載體和快速篩選重組菌落的方法。
6.如權利要求1所述的C35siRNA表達載體的應用研究，其特征在于所述表達載體轉 染T47D細胞，采用RT-PCR法檢測C35基因抑制前后的變化，通過RT-PCR對腫瘤不同靶區(qū) siRNA特異抑制基因表達進行深入、細致研究。
7.如權利要求1所述的C35siRNA表達載體的應用研究，其特征在于采用C35的抗體對 C35siRNA轉染細胞表達C35蛋白進行Western Blot檢測，為C35siRNA體外抑制C35蛋白 的表達提供實時、直觀的證據(jù)。
8.如權利要求1所述的C35siRNA表達載體的應用研究，其特征還在于通過MTT、TUNEL 和ArmexinV/PI流式細胞分析法，實驗證實經(jīng)C35siRNA轉染的乳腺癌細胞的增殖受到明顯 抑制、腫瘤細胞發(fā)生凋亡，證明C35siRNA能較為明顯地抑制乳腺癌細胞中C35基因的表達 和腫瘤細胞的生長。
9.如權利要求1所述的C35siRNA表達載體的應用，其特征在于所述的C35siRNA能特 異性的抑制C35基因的表達，明顯抑制乳腺癌細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡，可作為一種 新型抗腫瘤基因治療手段運用到臨床治療中。
10.如權利要求1所述的C35siRNA表達載體的應用，其特征在于將所述的C35siRNA作 為藥物直接進行裸DNA注射，導入機體的腫瘤組織內；或利用金包被DNA槍轟擊法，將構建 好的表達載體質粒DNA包被在金微粒子表面，用基因槍使包被DNA的金微粒子高速穿入腫 瘤組織細胞；或作為主要活性組分，添加制藥用輔料，制備抗腫瘤藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程技術領域，具體地說是乳腺癌細胞C35基因siRNA序列的設計，表達載體的構建及其在抗腫瘤治療中的應用。本發(fā)明根據(jù)siRNA的設計原則，分別選擇C35蛋白編碼區(qū)259nt-278nt，編碼區(qū)282nt-300nt的核苷酸序列，設計相應的siRNA，用BLAST軟件進行同源分析證實為C35高度保守序列后，化學合成單鏈寡核苷酸，體外經(jīng)退火形成雙鏈DNA，與真核表達載體pTZU6+1連接，酶切鑒定和序列測定分析表明成功構建了兩種靶向C35基因序列的siRNA表達載體。上述表達載體通過陽離子脂質體介導轉染乳腺癌細胞T47D后，采用RT-PCR和Western Blot實驗以及MTT、TUNEL利Annexin V/PI流式細胞分析法實驗均證實C35siRNA具有較強抑制乳腺癌細胞生長的作用，可以在制備抗腫瘤的藥物中應用。
文檔編號A61P15/14GK101967495SQ200910013679
公開日2011年2月9日 申請日期2009年1月23日 優(yōu)先權日2009年1月23日
發(fā)明者劉俏俏, 尹昆, 朱嵩, 譚效忠, 趙桂華, 閆歌 申請人:山東省寄生蟲病防治研究院