專利名稱：抗-血管內(nèi)皮生長因子的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及抗-VEGF的抗體，具體地，涉及人源化的抗-VEGF抗體和變異的 抗-VEGF抗體。相關(guān)技術(shù)的描述目前已充分確定，在多種疾病的發(fā)病機(jī)理中涉及血管生成。這包括實(shí)體瘤、眼內(nèi) 新血管綜合癥如增生性視網(wǎng)膜病或年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、和牛皮癬 (Folkman 等人，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 267 10931-10934 ；Klagsbrun 等人，Annu. Rev. Physiol. 53 217-239(1991)；禾口 Garner A, Vascular Diseases In :Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach. Garner A, Klintworth GK 編，2 版，Macel Dekker, NY, pp 1625-1710(1994))。在實(shí)體瘤情況下，新血管生成使得與正常細(xì)胞相比腫瘤細(xì)胞能 夠獲得生長優(yōu)勢和增殖自主性。因此，觀察到腫瘤切片的微血管密度和乳腺癌及數(shù)種其他 腫瘤的病人存活率之間的相關(guān)性(Weidner等人，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(N. Engl. J. Med.) 324 : 1-6(1991) ；Horak 等人，柳葉刀(Lancet) 340 1120-1124 (1992)；和 Macchiarini 等人，柳 葉刀(Lancet) 340 145-146 (1992))。對血管生成的正調(diào)節(jié)物的研究已得到了許多候選物質(zhì)，其中包括aFGF、bFGF、 TGF-α、TNF-β、HGF、TNF-α、血管生成素、IL-8 等(FoIkman 等人和 Klagsbrun 等人)。 目前為止被鑒別出的負(fù)調(diào)節(jié)物包括血小板反應(yīng)蛋白(Good等人，美國科學(xué)院院報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 87 :6624_6628 (1990))、16 千道爾頓的促乳素 N 末端片段(Clapp 等 人，Endocrinology，133 :1292-1299 (1993))、血管抑制素(angiostatin) (0 ‘ Reilly 等 人，細(xì)胞(Cell) 79 =315-328(1994))和內(nèi)皮抑制素(endostatin) (0 ‘ Reilly 等人，細(xì)胞 (Cell)88，277-285(1996))。在過去數(shù)年中所做的工作已確立了血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在調(diào)節(jié)正常和異常 血管生成方面的關(guān)鍵地位(Ferrara等人，Endocr. Rev. 18 :4_25 (1997))。丟失甚至一個 VEGF等位基因會導(dǎo)致胚胎死亡，這一發(fā)現(xiàn)指明了該因子在血管系統(tǒng)發(fā)育和分化過程中所起 的不可替代的作用(Ferrara等人)。此外，還表明VEGF是與腫瘤和眼內(nèi)疾病相關(guān)的新血 管生成的關(guān)鍵介質(zhì)(Ferrara等人)。在受檢查的大多數(shù)人腫瘤中，VEGF mRNA是過度表達(dá) 的(Berkman 等人，臨床研究雜志(J.Clin. Invest.) 91 153-159 (1993) ；Brown 等人，Human Pathol. 26 :86_91(1995) ；Brown 等人，癌癥研究(Cancer Res.) 53 :4727_4735 (1993)； Mattern 等人，Brit. J. Cancer. 73 :931_934 (1996) ；hDvorak 等人，Am. J. Pathol. 146 1029-1039(1995))。而且，在眼睛液體中VEGF濃度，與患糖尿病和其他局部缺血有關(guān)的 視網(wǎng)膜疾病的病人中存在的血管活躍增殖現(xiàn)象是高度相關(guān)的(Aiello等人，新英格蘭醫(yī) 學(xué)雜志(N. Engl. J.Med.) 331 1480-1487 (1994))。此外，最近的研究已表明，在患AMD 的病人中脈絡(luò)膜的新血管膜中存在VEGF(Lopez等人，Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37 855-868(1996))?？?VEGF中和抗體可抑制裸鼠中各種不同人腫瘤細(xì)胞系的生長(Kim等 人，自然(Nature) 362 :841_844 (1993) ；Warren 等人，臨床研究雜志(J. Clin. Invest.) 95 1789-1797(1995) ；Borgstrom 等人，癌癥研究(Cancer Res.) 56 4032-4039 (1996)禾口 Melnyk等人，癌癥研究(Cancer Res.) 56 :921_924 (1996))，并且在缺血性視網(wǎng)膜疾病模型 中也抑制眼內(nèi)的血管生成(Adamis等人，Arch. Ophthalmol. 114 :66_71 (1996))。因此，對于 治療實(shí)體瘤和各種眼內(nèi)新血管疾病，抗-VEGF的單克隆抗體或其他抑制VEGF作用的抑制劑 是有前途的候選物質(zhì)。發(fā)明概述本發(fā)明描述了具有治療前景的有利特性的人源化抗-VEGF抗體和變異的抗-VEGF 抗體，這些特性包括與VEGF的強(qiáng)結(jié)合親和力；在體外抑制VEGF-誘導(dǎo)型內(nèi)皮細(xì)胞增殖的 能力；和在體內(nèi)抑制VEGF-誘導(dǎo)型血管生成的能力。此處優(yōu)選的人源化抗-VEGF抗體或變異的抗-VEGF抗體結(jié)合于人VEGF時的Kd值 不超過約IX 10_8M，更佳地不超過約5X 10_9M。此夕卜，對于在體外抑制VEGF誘導(dǎo)型內(nèi)皮細(xì)胞 增殖，人源化或變異的抗-VEGF抗體的ED50值不超過約5nM。此處特別感興趣的人源化或 變異抗-VEGF抗體，是那些在抗體劑量為5毫克/千克下在A673體內(nèi)腫瘤模型中能抑制至 少50%腫瘤生長的種類。在一實(shí)例中，抗-VEGF抗體具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中重鏈可變區(qū)包括 具有如下氨基酸序列的高變區(qū)⑶RHl (GYX1FTX2YGMN,其中X1是T或D，而X2是N或H ；SEQ ID NO: 128)，CDRH2(WINTYTGEPTYAADFKR ;SEQ ID NO 2)和 CDRH3 (YPXJYGXjHWYFDV，其中 X1是Y或H，而X2是S或T ;SEQ IDNO 129)。例如，重鏈可變區(qū)可包含CDRHl (GYTFTNYGMN ； SEQ ID NO :1)、CDRH2 (WINTYTGEPTYAADFKR ；SEQ ID NO 2)和 CDRH3 (YPHYYGSSHWYFDV ；SEQ ID NO 3)的氨基酸序列。較佳地，3個重鏈高變區(qū)在人構(gòu)架區(qū)域中，例如作為由下式表示的 連續(xù)序列FRl-CDRHl-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4 本發(fā)明還提供了抗-VEGF抗體重鏈可變區(qū)，它具有氨基酸序列EVQLVESGGG LVQPGGSLRL ScaaSGYX1FT X2YGMNffVRQAPGKGLEffVGff INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAYLQMNSLRAED TAVYYCAKYP X3YYGX4SHWYF DVffGQGTLVT VSS(SEQID NO: 125)，其中 X1是T或D ;X2是N或H ;X3是Y或H以及X4是S或Τ。一種特別有用的重鏈可變區(qū)序列是 實(shí)施例1的F(ab)-12人源化抗體的重鏈可變區(qū)，它包含SEQ ID NO 7的重鏈可變區(qū)序列。 這種優(yōu)選的重鏈可變區(qū)序列可與下面優(yōu)選的輕鏈可變區(qū)序列或其他輕鏈可變區(qū)序列組合， 只要這樣產(chǎn)生的抗體能結(jié)合于人VEGF。本發(fā)明還提供了優(yōu)選的輕鏈可變區(qū)序列，它可與上述重鏈可變區(qū)序列或其他重鏈可變區(qū)序列組合，只要這樣產(chǎn)生的抗體能結(jié)合于人VEGF。例如，輕鏈可變區(qū)可包含具有下 列氨基酸序列的高變區(qū)CDRL1 (SASQDISNYLN ；SEQ ID NO 4), CDRL2 (FTSSLHS ；SEQ ID NO 5)和CDRL3(QQYSTVPWT ;SEQ ID NO :6)。較佳地，3個輕鏈高變區(qū)在人構(gòu)架區(qū)域中，例如作 為由下式表示的連續(xù)序列FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4。
在一實(shí)例中，本發(fā)明提供了人源化的抗-VEGF抗體輕鏈可變區(qū)，它具有氨基 酸序列DIQXJQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKPGKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQYSTVPffTFGQ GTKVEIKR(SEQ ID NO 124)，其中 X1 是 M 或L。一種特別有用的輕鏈可變區(qū)序列是實(shí)施例1的F(ab)-12人源化抗體的輕鏈可變區(qū)， 它包含SEQ ID NO 8的輕鏈可變區(qū)序列。本發(fā)明還提供了親代抗-VEGF抗體的變異抗體(該親代抗體宜為人源化或人的 抗-VEGF抗體)，其中變異抗體結(jié)合于人VEGF并且在親代抗-VEGF抗體的重鏈或輕鏈可 變區(qū)的高變區(qū)中包含了氨基酸取代。變異抗體較佳地在抗-VEGF抗體的一個或多個高變 區(qū)中具有一個或多個取代。較佳地，取代位于親代抗體的重鏈可變區(qū)中。例如，氨基酸取 代可以位于重鏈可變區(qū)的⑶RHl和/或⑶RH3。較佳地，在這兩種高變區(qū)中都有取代。這 種“親和力成熟”變異抗體在本文中已表明可比產(chǎn)生它們的親代抗-VEGF抗體更有力地結(jié) 合于人VEGF，即它們的Kd值明顯低于親代抗-VEGF抗體。較佳地，與親代抗-VEGF抗體相 比，變異抗體的在體外抑制VEGF-誘導(dǎo)型內(nèi)皮細(xì)胞增殖的ED50值低至少約10倍，較佳地低 至少約20倍，最佳地低至少約50倍。一種特別優(yōu)選的變異抗體是實(shí)施例3的Y0317變異 抗體，它具有氨基酸序列為GYDFTHYGMN(SEQ ID NO 126)的⑶RHl以及具有氨基酸序列為 YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO 127)的CDRH3。這些高變區(qū)和CDRH2通常位于人構(gòu)架區(qū)，例如 導(dǎo)致重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO: 116的氨基酸序列。這種重鏈可變區(qū)序列可任選地與具有 SEQ ID NO: 124氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)組合，更佳地與具有SEQ ID N0:11氨基酸序列的 輕鏈可變區(qū)組合。
各種形式的抗體被包括在本發(fā)明之中。例如，抗-VEGF抗體可以是全長的抗體(例 如具有完整的人Fc區(qū))，或是抗體片段(如Fab、Fab'或F(ab' )2)。此外，抗體可以用可 檢測的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，固定在固相載體上，和/或偶聯(lián)于異源化合物(如細(xì)胞毒性物質(zhì))?？贵w的診斷和治療用途被包括在內(nèi)。在一種診斷應(yīng)用中，本發(fā)明提供了一種確定 VEGF蛋白是否存在的方法，它包括將懷疑含有VEGF蛋白的樣品暴露于抗-VEGF抗體，然 后測定抗體與樣品的結(jié)合。對于該應(yīng)用，本發(fā)明提供了一試劑盒，它含有抗體和使用抗體來 檢測VEGF蛋白的說明書。本發(fā)明還提供了 分離的編碼該抗體的核酸；含有該核酸的載體，其中該核酸可 任選地操作性連接于被載體所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞所識別的控制序列；含該載體的宿主細(xì)胞； 產(chǎn)生該抗體的方法，它包括培養(yǎng)該宿主細(xì)胞從而表達(dá)核酸，以及任選地從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物 (如從宿主細(xì)胞培養(yǎng)液中)中回收抗體。本發(fā)明還提供了一種組合物，它含抗-VEGF抗體和 藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。用于治療的組合物是滅菌的并且可以是凍干的。本發(fā)明還 提供了治療患腫瘤或視網(wǎng)膜疾病的哺乳動物的方法，它包括將治療有效量的抗-VEGF抗體 施用于哺乳動物。本發(fā)明涉及1. 一種人源化抗-VEGF抗體，它與人VEGF結(jié)合的Kd值不超過約1 X 10_8M。2. 一種人源化抗-VEGF抗體，它與人VEGF結(jié)合的Kd值不超過約5 X 10_9M。3. 一種人源化抗-VEGF抗體，它在體外抑制VEGF誘導(dǎo)型內(nèi)皮細(xì)胞增殖的ED50值 不超過約5nM。4. 一種人源化抗-VEGF抗體，它在體內(nèi)抑制VEGF-誘導(dǎo)型血管生成。
5.如4所述的人源化抗-VEGF抗體，5毫克/千克的該抗體在A673體內(nèi)腫瘤模型 中抑制至少50%腫瘤生長。6.如1所述的人源化抗-VEGF抗體，它具有重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包括具有如 下氨基酸序列的高變區(qū)⑶RHl (GYX1FTX2YGMN,其中X1是T或D，而X2是N或H ；SEQ ID NO 128)，CDRH2 (WINTYTGEPTYAADFKR ；SEQ ID NO 2)和 CDRH3 (YPX1YYGX2SHWYFDV，其中 X1 是 Y 或 H，而 乂2是3 或 T ;SEQ IDNO129)。7.如6所述的人源化抗-VEGF抗體，它包含SEQ ID NO7所述的氨基酸序列。8.如6所述的人源化抗-VEGF抗體，它具有重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包括具有 如下氨基酸序列的高變區(qū)CDRH1 (GYTFTNYGMN ；SEQ IDNO 1)、CDRH2 (WINTYTGEPTYAADFKR ； SEQ ID NO2)和 CDRH3(YPHYYGSSHWYFDV ；SEQ ID NO 3)。9.如1所述的人源化抗-VEGF抗體，它具有輕鏈可變區(qū)，輕鏈可變區(qū)可包含具有下 列氨基酸序列的高變區(qū)CDRL1 (SASQDISNYLN ；SEQ ID NO 4), CDRL2 (FTSSLHS ；SEQ ID NO 5)和 CDRL3(QQYSTVPWT ；SEQ IDNO 6)。10.如9所述的人源化抗-VEGF抗體，它包含SEQ ID NO 8所述的氨基酸序列。11.如1所述的人源化抗-VEGF抗體，它具有的重鏈可變區(qū)包括SEQ IDNO 7的氨 基酸序列，而且它具有的輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO :8的氨基酸序列。12. 一種抗-VEGF抗體輕鏈可變區(qū)，它包括氨基酸序列Diqx1Tqspss lsasvgdrvt itcsasqdis nylnwyqqkpgkapkvliyf tsslhsgvps
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQYSTVPffTFGQ GTKVEIKR(SEQ ID NO : 124)，其中 X1 是 M 或L013. 一種抗-VEGF抗體重鏈可變區(qū)，它包括氨基酸序列EVQLVESGGG LVQPGGSLRL ScaaSGYX1FT X2YGMNffVRQAPGKGLEffVGff INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAYLQMNSLRAED TAVYYCAKYP X3YYGX4SHWYF DVffGQGTLVT VSS(SEQID NO 125)，其中X1是T或D ;X2是N或H ;X3是Y或H以及X4是S或Τ。14. 一種親代抗-VEGF抗體的變異抗體，該變異抗體結(jié)合于人VEGF，而且在該親代 抗體的重鏈可變區(qū)的高變區(qū)中有氨基酸取代。15.如14所述的變異抗體，該親代抗體是人抗體或人源化抗體。16.如14所述的變異抗體，它與人VEGF結(jié)合的Kd值不超過約1 X 10_8Μ。17.如14所述的變異抗體，它與人VEGF結(jié)合的Kd值不超過約5 X 10_9Μ。18.如14所述的變異抗體，該取代位于重鏈可變區(qū)的⑶RHl中。19.如14所述的變異抗體，該取代位于重鏈可變區(qū)的⑶RH3中。20.如14所述的變異抗體，該氨基酸取代位于⑶RHl和⑶RH3兩者中。21.如14所述的變異抗體，它與人VEGF結(jié)合的Kd值小于該親代抗體的Kd值。22.如14所述的變異抗體，它在體外抑制VEGF誘導(dǎo)型內(nèi)皮細(xì)胞增殖的ED50值比 該親代抗體的ED50值低至少10倍。23.如18所述的變異抗體，該CDRHl具有氨基酸序列GYDFTHYGMN(SEQ ID NO 126)。24.如19所述的變異抗體，該CDRH3具有氨基酸序列YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO 127)。
25.如14所述的變異抗體，該重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO 116的氨基酸序列。26.如25所述的變異抗體，該輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO 124的氨基酸序列。27.如26所述的變異抗體，該輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO 115的氨基酸序列。28.如1所述的人源化抗-VEGF抗體，它是全長的抗體。29.如28所述的人源化抗-VEGF抗體，它是人IgG。30.如1所述的人源化抗-VEGF抗體，它是抗體片段。31.如30所述的抗體片段，它是Fab。32. 一種組合物，它含有1所述的人源化抗-VEGF抗體和藥學(xué)上可接受的載體。33. 一種組合物，它含有14所述的變異的人源化抗-VEGF抗體和藥學(xué)上可接受的 載體。34.分離的編碼1所述抗體的核酸。35.含有34所述核酸的載體。36.含有35所述載體的宿主細(xì)胞。37. 一種產(chǎn)生人源化抗-VEGF抗體的方法，它包括培養(yǎng)36所述的宿主細(xì)胞，從而使 核酸被表達(dá)出。38.如37所述的方法，還包括從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收人源化的抗-VEGF抗體。39. 一種在哺乳動物中抑制VEGF誘導(dǎo)型血管生成的方法，它包括將治療有效量的 1所述的人源化抗-VEGF抗體施用于該哺乳動物。40.如39所述的方法，該哺乳動物是人。41.如39所述的方法，該哺乳動物有腫瘤。42.如39所述的方法，該哺乳動物有視網(wǎng)膜疾病。附圖簡述圖IA和IB顯示了 muMAb VEGF A4. 6. 1的重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 9)和輕鏈可變 區(qū)(SEQ ID NO :10)，人源化的F(ab) (F(ab)-12)的重鏈可變區(qū)(SEQ IDNO 7)和輕鏈可變 區(qū)(SEQ ID NO :8)，以及人共有構(gòu)架(重鏈亞組III，humIII(SEQ ID NO 11)；輕鏈κ亞組 I,humK KSEQ ID Ν0:12))。圖IA排列了可變的重鏈區(qū)序列，而圖IB排列的可變的輕鏈區(qū) 序列。星號表示在人源化F(ab)-12和鼠單克隆抗體之間，或F(ab)-12和人構(gòu)架之間的差 另U?；パa(bǔ)決定區(qū)(CDR)用下劃線標(biāo)出。圖2是人源化區(qū)模型的帶狀圖。\區(qū)用棕色表示，而⑶R用黃褐 色表示。殘基L46的側(cè)鏈用黃色表示。Vh區(qū)用紫色表示，而CDR用粉紅色表示。從人的變 為鼠的Vh殘基的側(cè)鏈用黃色表示。圖3顯示了實(shí)施例1的人源化抗-VEGF F(ab)-12對VEGF誘導(dǎo)型有絲分裂的抑 制作用。將衍生自牛腎上腺皮質(zhì)的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，以6X IO3細(xì)胞/孔的密度接種于 6孔板中，如實(shí)施例1所述。按所示濃度加入muMAb VEGF A4. 6. 1或rhuMAb VEGF (IgGl ； F(ab)-12)。在2-3小時后，加入rhVEGF165至終濃度為3ng/ml。在5或6天之后，用胰蛋 白酶處理細(xì)胞并計數(shù)。所示的數(shù)值是兩次測量的平均值。與平均值的變差不超過10%。圖4顯示了實(shí)施例1的人源化抗-VEGF F(ab)-12在體內(nèi)對腫瘤生長的抑制作用。將A673成橫紋肌細(xì)胞瘤細(xì)胞以2X106/鼠的密度注入BLAB/c裸鼠。在腫瘤細(xì)胞接種 開始后24小時，動物每周兩次腹膜內(nèi)注射對照單克隆抗體、muMAbVEGF A4. 6. 1或rhuMAbVEGFdgGl ；F(ab)-12)。對照單克隆抗體的劑量是5mg/kg ；抗-VEGF單克隆抗體的劑量按 指示是0.5或5mg/kg(n= 10)。在注射腫瘤細(xì)胞4周后，動物被安樂死亡，然后取出腫瘤并 稱量。* 用ANOVA比較，與對照組相比有顯著區(qū)別(ρ < 0. 05)。圖5A和5B分別顯示了實(shí)施例2的下列抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的氨基 酸序列鼠抗體A4. 6. 1 (SEQ ID NO 10是Vl而SEQ ID NO 9是Vh)、人源化的A4. 6. 1變異 抗體hu2. 0(SEQ ID NO :13是Vl而SEQ ID NO 14是VH)和人源化的鼠A4. 6. 1變異抗體 hu2. 10 (SEQ ID N0:15 是八而 SEQ ID NO :16 是Vj。序列編號根據(jù)Kabat 等人，Seauences of Proteins of ImmunoloRical Interest, (5th), Public Health Service, NIH, Bethesda, MD(1991)，并且錯配用星號(A4.6. Ivs hu2. 0)或點(diǎn)(hu2. Ovs hu2. 10)表示。變異抗體 hu2.0僅含有鼠抗體的⑶R序列(粗體)，它被移植于人輕鏈κ亞組I共有構(gòu)架(SEQ ID NO 12)和重鏈亞組III共有構(gòu)架(SEQ ID NO 11)上。hu2. 10是用本文所述的噬菌體挑選 試驗(yàn)而獲得的共有人源化克隆。圖6顯示了實(shí)施例2中隨機(jī)誘變所針對的構(gòu)架殘基。圖7顯示了用于在噬菌體上表面展示Fab-pIII融合蛋白的噬菌粒構(gòu)建物。噬菌 粒編碼融合于一部分M13基因III外被蛋白的人源化的A4. 6. 1抗體Fab片段。該融合蛋 白包括Fab，該Fab在重鏈的羧基端處連于單個谷氨酰胺殘基(受到SupE E. coli的琥珀密 碼子的抑制)，然后連于基因III蛋白的C末端區(qū)域(殘基249-406)。轉(zhuǎn)入F+大腸桿菌， 然后用M13K07輔助噬菌體進(jìn)行超感染，這樣產(chǎn)生了噬菌粒顆粒，其中一部分展示出單拷貝 的融合蛋白。圖8A-8F顯示了實(shí)施例3中噬菌體展示抗體在載體phMB4-19_l. 6的雙鏈核苷酸 序列(SEQ ID NO 99)和編碼的氨基酸序列(SEQ ID N0:100)。圖9A和9B顯示了輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列排列圖，被比較的分別 是實(shí)施例3的親和力成熟的抗-VEGF抗體和實(shí)施例1的F (ab)-12 (SEQ IDNO 8和7分別為 輕鏈和重鏈可變區(qū))。⑶R用下劃線標(biāo)出，用L表示輕鏈，用H表示重鏈，并且用1-3編號。 殘基在Vl和中被依次標(biāo)號，這與Kabat的編號方法相反。顯示了模板分子MBl. 6 (SEQ ID N0:101和102分別是輕鏈和重鏈可變區(qū))以及下列變異抗體H2305. 6(SEQ ID NO 103 和104分別是輕鏈和重鏈可變區(qū))、Y0101 (SEQ ID NO 105和106分別是輕鏈和重鏈可變 區(qū))以及Y0192(SEQ ID NO :107和108分別是輕鏈和重鏈可變區(qū))。與F(ab)_12的區(qū)別 用陰影框標(biāo)出。

圖10A和10B顯示了輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列排列圖，被比較的分 別是實(shí)施例3的親和力成熟的抗-VEGF抗體和實(shí)施例1的F(ab)-12(SEQID NO 8和7分 別為輕鏈和重鏈可變區(qū))。⑶R用下劃線標(biāo)出，用L表示輕鏈，用H表示重鏈，并且用1-3 編號。變異抗體被命名為Y0243-1(SEQ ID NO :109和110分別是輕鏈和重鏈可變區(qū))、 Y0238-3 (SEQ ID NO :111 和 112 分別是輕鏈和重鏈可變區(qū))、Y0313-1 (SEQ ID N0:113 禾口 114分別是輕鏈和重鏈可變區(qū))以及Y0317(SEQ ID NO 115和116分別是輕鏈和重鏈可變 區(qū))。與F (ab)-12的區(qū)別用陰影框標(biāo)出。圖11顯示了實(shí)施例3中對變異抗體Y0238-3、Y0192和Y0313-1以及實(shí)施例1的 全長F(ab)-12進(jìn)行HuVEC活性測定的結(jié)果。圖12顯示了實(shí)施例1的全長F(ab)_12(rhuMAb VEGF)、實(shí)施例1的F (ab)-12的Fab片段(rhuFab VEGF)和實(shí)施例3的親和力成熟變異抗體Y0317的Fab片段(rhuFab VEGF (親和力成熟型))對VEGF誘導(dǎo)型有絲分裂的抑制作用。優(yōu)選例的詳細(xì)描述I.定義如本文所用，術(shù)語“人VEGF”指如Leung等人，科學(xué)(Science) 246 1306 (1989)禾口 Houck等人，Mol. Endocrin. 5 =1806(1991)所述的165個氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因 子，以及相關(guān)的121、189和206個氨基酸的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，以及這些生長因子的天 然存在的等位基因的或加工的形式。本發(fā)明提供了抗-VEGF的拮抗性抗體，它能夠抑制VEGF的一種或多種生物活性， 例如其促分裂或血管生成活性。VEGF的拮抗劑通過干擾VEGF與細(xì)胞受體的結(jié)合、通過使 被VEGF激活的細(xì)胞失去功能或被殺滅、或通過干擾VEGF結(jié)合于細(xì)胞受體后血管內(nèi)皮細(xì)胞 的激活過程而起作用。出于本發(fā)明目的，VEGF拮抗劑的所有這些干擾應(yīng)被認(rèn)為是等價的。如本文所用，術(shù)語“VEGF受體”或“VEGFr”指VEGF的細(xì)胞受體，通常是在血管內(nèi) 皮細(xì)胞上的細(xì)胞表面受體，以及保留與hVEGF結(jié)合能力的變異受體。VEGF受體的一個例 子是fms樣酪氨酸激酶(fit)，它是酪氨酸激酶家族的一種跨膜受體(DeVries等人，科學(xué) (Science) 255 :989 (1992) ；Shibuya 等人，Oncogene 5:519(1990))。fit 受體包括一個胞 外結(jié)構(gòu)域、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個具有酪氨酸激酶活性的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域涉及 與VEGF的結(jié)合，而胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域涉及信號傳導(dǎo)。VEGF受體的另一例子是flk-1受體(也被 稱為 KDR) (Matthews 等人，美國科學(xué)院院報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 88 9026(1991)； Terman 等人，Oncogene 6 1677 (1991) ；Terman 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 187 1579 (1992))。VEGF與fit受體的結(jié)合導(dǎo)致形成至少2種高分子量的復(fù)合物，表觀分子量為 205，000和300，000道爾頓。據(jù)信，300, 000道爾頓的復(fù)合物是包含結(jié)合于一個VEGF分子 的2個受體分子的二聚體。除非另外說明，術(shù)語“表位A4. 6. 1”在本文指可與Kim等人，GrowthFactors 7 53(1992)和Kim等人，自然(Nature) 362 =841(1993)所公開的A4. 6. 1抗體結(jié)合的，人VEGF 的區(qū)域。“治療”指治療性處理和預(yù)防性或防御性措施。需要治療者包括已經(jīng)患病以及要預(yù) 防疾病的生物。出于治療目的，“哺乳動物”指任何劃為哺乳動物的動物，包括人、家畜和農(nóng)場動 物，以及動物園動物、運(yùn)動動物和寵物，如狗、馬、貓、牛等。較佳地，此處的哺乳動物為人?！翱贵w(Ab) ”和“免疫球蛋白(Ig) ”是有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白?？贵w表現(xiàn)出對特異抗原的結(jié)合特異性，而免疫球蛋白包括抗體和缺少抗原特異性的抗體樣分子。后一類多 肽可由例如淋巴系統(tǒng)低水平地產(chǎn)生，而由骨髓瘤高水平地產(chǎn)生?！疤烊豢贵w”和“天然免疫球蛋白”是約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個 相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連， 而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈也有規(guī)則間隔的鏈 內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(qū)(Vh)，其后是多個恒定區(qū)。每條輕鏈的一端有可變區(qū) (Vl)，另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個恒定區(qū)相對，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的 可變區(qū)相對。據(jù)信特殊的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面。
術(shù)語“可變”表示抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上有所不同，它形成了各種特定 抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個抗體可變區(qū)中。 它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中被稱為高變區(qū)中的三個片段中。可變區(qū)中較保守的部分稱為 構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包含四個FR區(qū)(分別是FR1、FR2、FR3和 FR4)，它們大致上呈折疊構(gòu)型，由三個高變區(qū)相連。這些高變區(qū)形成連接β折疊結(jié)構(gòu) 的環(huán)并且在某些情況下是β折疊結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈中的高變區(qū)通過FR區(qū)緊密地靠在 一起并與另一鏈的高變區(qū)一起形成了抗體的抗原結(jié)合部位(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunoloRical Interest, (5th 版),PublicHealth Service, National Instistutes of Health，Bethesda，MD (1991)，第 647-669 頁)。恒定區(qū)不直接參與抗體與 抗原的結(jié)合，但是它們表現(xiàn)出不同的效應(yīng)子功能，例如參與抗體的依賴于抗體的細(xì)胞毒性。
如本文所用，術(shù)語“高變區(qū)”指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包括 來自“互補(bǔ)決定區(qū)”即“CDR”的氨基酸殘基(即輕鏈可變區(qū)的殘基24-34(Ll) ,50-56 (L2) 和 89-97 (L3)以及重鏈可變區(qū)的殘基 31-35 (HI)、50-65(H2)和 95-102 (H3) ；Kabat 等人， Sequences of Proteins of ImmunoloRicallnterest, (5th版)，Public Health Service, National Instistutes of Health, Bethesda,MD (1991))和 / 或來自“高變環(huán)，，的殘基(即 輕鏈可變區(qū)的殘基26-32 (Li)、50-52 (L2)和91_96 (L3)以及重鏈可變區(qū)的殘基26-32 (Hl)、 53-55 (H2)和 96-101 (H3) ；Chothia 和 Lesk 等人，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.) 196， 901(1987))?！皹?gòu)架”或“FR”殘基是除了此處所定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變區(qū)殘基。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生了兩個相同的抗原結(jié)合片段(稱為“Fab”片段，每個片 段有單個抗原結(jié)合位點(diǎn))以及一個殘余的“Fe”片段(該名稱反映了其容易結(jié)晶的能力)。 用胃蛋白酶處理產(chǎn)生了一個F(ab' )2片段，該片段有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)，并仍能與抗原交 聯(lián)。“Fv”是最小的抗體片段，它含有全部抗原識別和結(jié)合位點(diǎn)。該區(qū)域由非共價地緊 密結(jié)合的一個重鏈和一個輕鏈可變區(qū)的二聚物組成。在該構(gòu)型中，各可變區(qū)中的三個高變 區(qū)相互作用，在二聚物表面上界定了抗原結(jié)合位點(diǎn)。6個高變區(qū)共同地賦予抗體抗原 結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變區(qū)(或Fv的一半，它只包含對抗原有特異性的三個高 變區(qū))也能識別并結(jié)合抗原，只是其親和力比完整的結(jié)合位點(diǎn)低。Fab片段還含有輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一個恒定區(qū)(CHl)。Fab'片段與Fab片 段的不同之處在于，在重鏈CHl區(qū)的羧基端多幾個殘基(包括來自鉸鏈區(qū)的一個或多個半 胱氨酸)。Fab' -SH在本文表示恒定區(qū)的半胱氨酸殘基攜帶了游離巰基的Fab'。F(ab' )2 抗體片段最初是以Fab'片段對的形式產(chǎn)生的，在其間有鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其它化 學(xué)偶聯(lián)方式也是已知的。脊椎動物抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”，可根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列歸為明顯 不同的兩類(稱為kappa (κ)和IambdaU))中的一類。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的種類。主要有5類 免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些還可進(jìn)一步分成亞類(同種型)，如IgG_l、 IgG-2、IgG-3、IgG4、IgA-l和IgA_2。對應(yīng)于不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、 δ、ε、γ、和μ。不同類免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。術(shù)語“抗體”被最廣義地使用，并且具體地包括單克隆抗體(包括全長的單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、以及抗體片段，只要它們表現(xiàn)出 所需的生物活性即可?！翱贵w片段”包括完整抗體的一部分，通常是完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；二體(diabody)；線性抗體；單鏈抗體 分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”指從一類基本均一抗體獲得的抗體，即該群體中包 含的各抗體是相同的，除少數(shù)可能存在的天然發(fā)生的突變之外。單克隆抗體是高特異性的， 針對單個抗原位點(diǎn)。而且，與常規(guī)的(多克隆)抗體制劑(它通常是包括針對不同的決定 簇(表位)的不同抗體)不同，各單克隆抗體是針對抗原上的單個決定簇。修飾語“單克 隆”表示了抗體的特性-即從基本均一的抗體群中獲得的，而不應(yīng)被解釋成需要用任何特殊 方法來生產(chǎn)抗體。例如，用于本發(fā)明的單克隆抗體可用雜交瘤方法(由Kohler等，Nature， 256 =495(1975)首先提出)制得，或可用重組DNA方法(例如參見美國專利No. 4，816，567) 制得?！皢慰寺】贵w”還可利用例如Clackson等人，自然(Nature) 352 =624-628(1991)禾口 Marks等人，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.) 222 :581_597 (1991)所述的技術(shù)從噬菌體抗體 文庫中分離得到的。單克隆抗體在此特別包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一 部分與某一特定物種的抗體對應(yīng)序列相同或同源，或是屬于特定的抗體類別或亞類，而鏈 的其余部分則與另一物種的抗體對應(yīng)序列相同或同源、或是屬于另一種抗體類別或亞類， 以及這種抗體的片段，只要該片段具有所需的生物活性即可(美國專利No. 4，816，567和 Morrison 等人，美國科學(xué)院院報 81 =6851-6855 (1984))?！叭嗽椿毙问降姆侨?如鼠)抗體是嵌合的抗體，它們含有非人免疫球蛋白的最 小序列。對于大多數(shù)情況，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(受者抗體)，其中受者高變 區(qū)殘基被非人源(供者抗體)(例如有所需特異性、親和力和活性的小鼠、大鼠、兔或非人靈 長動物抗體)的高變區(qū)殘基所代替。在一些情況下，人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基可被 對應(yīng)的非人殘基代替。另外，人源化的抗體可包括既不存在于受者抗體、又不存在于供體 抗體的殘基。這些修飾能進(jìn)一步提高抗體的性能。通常，人源化抗體包含了基本上所有的 (至少一個、通常兩個)可變區(qū)，其中所有或基本上所有的高變區(qū)區(qū)對應(yīng)于非人免疫球蛋白 的高變區(qū)區(qū)，而所有或基本上所有FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的FR區(qū)。人源化抗體最好還包 括免疫球蛋白(通常是人免疫球蛋白)恒定區(qū)(Fe)的至少一部分。更詳細(xì)的情況可參見 Jones 等人，Nature，321 :522_525 (1986) ；Reichmann 等人，Nature, 332 :323_329 (1988)； 和 Presta，Curr.Op. Struct. Biol.，2 :593_596(1992)?！皢捂淔v”或“sFv”抗體片段包含存在于單條多肽鏈內(nèi)的抗體Vh和八區(qū)。一般 說來，F(xiàn)v多肽還包含位于Vh和\區(qū)之間的多肽接頭，使得sFv形成適合抗原結(jié)合所需的 結(jié)構(gòu)。有關(guān)sFv的綜述，可參見Pluckthum的“單克隆抗體的的藥物學(xué)”(Pharmacology of Monoclonal Antibodies)第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 編，Spring-Verlag, New York, PP.269-315(1994)?！岸w(diabody) ”指有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，該片段包含在同一多肽 鏈內(nèi)與輕鏈可變區(qū)(W連接的重鏈可變區(qū)(Vh)。通過使用短至使同一鏈內(nèi)兩功能 區(qū)無法配對的接頭，功能區(qū)被迫與另一鏈的互補(bǔ)區(qū)配對，由此形成兩個抗體結(jié)合位點(diǎn)。例如歐洲專利 404, 097 ；W093/11161 ；禾口 Hoi linger 等在美國科學(xué)院院報 90 =6444-6448(1993) 中對二體有更為全面的論述。術(shù)語“線性抗體”在本申請中指Zapata等人，蛋白質(zhì)工程(Protein Eng.) 8 (10) 1057-1062(1995)中所述的抗體。簡而言之，這些抗體包括一對串聯(lián)的Fd片段 (VH-CH1-VH-CH1)，它們構(gòu)成了一對抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性或單特異性的?！白儺惖摹笨?VEGF抗體指與因在親代抗體序列中插入、缺失和/或取代一個或多 個氨基酸殘基而在氨基酸序列上與“親代”抗-VEGF抗體氨基酸序列有所不同的分子。在 優(yōu)選例中，變異抗體包含位于親代抗體的一個或多個高變區(qū)中的一個或多個氨基酸取代。 例如，變異抗體在親代抗體的一個或多個高變區(qū)中可含有至少一個(例如1-10個，較佳地 2-5個)取代。通常，變異抗體的氨基酸序列與親代抗體的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列(如SEQ IDN0 :7或8)有至少75%，較佳地至少80%，更佳地至少85%，更好地至少90%，最佳地至 少95%的氨基酸序列相同。關(guān)于序列的相同性或同源度，在本文是將序列排列對齊并引入 空隙(如果需要)從而達(dá)到最大的序列相同百分比之后，用候選序列中與親代抗體殘基相 同的氨基酸殘基百分比表示?？贵w序列的N末端、C末端、或內(nèi)部延伸區(qū)、缺失或插入都不 認(rèn)為會影響序列相同性或同源度。變異抗體保留結(jié)合人VEGF的能力，并且較佳地具有優(yōu)于 親代抗體的特性。例如，變異抗體具有更強(qiáng)的結(jié)合親和力，更強(qiáng)的抑制VEGF誘導(dǎo)型內(nèi)皮細(xì) 胞增殖的能力和/或更高的在體內(nèi)抑制VEGF誘導(dǎo)型血管生成的能力。為了分析這些特性， 人們可例如將Fab形式的變異抗體與Fab形式的親代抗體比較，或?qū)⑷L形式的變異抗體 與全長形式的親代抗體比較，因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)抗-VEGF抗體的形式影響其在此處公開的生物活 性測定中的活性。此處特別感興趣的變異抗體是與親代抗體相比生物活性高至少約10倍， 較佳地至少約20倍，更佳地至少約50倍的抗體。“親代”抗體在此是具有用于制備變異抗體的氨基酸序列的抗體。較佳地，親代抗 體具有人構(gòu)架區(qū)，而且具有人抗體恒定區(qū)(如果存在)。例如，親代抗體可以是人源化抗體 或人抗體。“分離的”抗體是經(jīng)鑒定的和分離和/或回收自其天然環(huán)境組份的抗體。其天然環(huán) 境中的污染組份是指會干擾所述抗體的診斷或治療性用途的物質(zhì)，可包括酶、激素和其它 蛋白質(zhì)類或非蛋白質(zhì)類溶質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體純化至(1)經(jīng)Lowry法測定，按重量 計抗體純度高于95%，最好高于99%，(2)其純度足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15 個N末端殘基或內(nèi)部氨基酸序列，或者(3)用Coomassie藍(lán)或最好用銀染色法，經(jīng)還原或非 還原條件下SDS-PAGE測定時達(dá)到均質(zhì)。分離的抗體包括存在于重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體，因 為該抗體天然環(huán)境的至少一種組份是不存在的。但是，通常，分離的抗體是經(jīng)至少一步純化 步驟制備的。術(shù)語“表位標(biāo)記的”在此表示抗-VEGF抗體被融合于“表位標(biāo)記”。表位標(biāo)記 (epitope tag)應(yīng)具有足夠的殘基來形成可產(chǎn)生其對應(yīng)抗體所需的表位，但又短到不至于 影響VEGF抗體的活性。表位標(biāo)記宜具有相當(dāng)?shù)莫?dú)特性，以致針對其的抗體基本上不與其它 表位交叉反應(yīng)。適宜的標(biāo)記多肽一般具有至少6個氨基酸殘基，一般介于約8至50個氨 基酸殘基(以約9至30個殘基為宜)。例子包括flu HA標(biāo)記多肽及其抗體12CA5 (Field 等人，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol. Cell. Biol. )8 =2159-2165 (1988)) ；c_myc標(biāo)記及其抗體 8F9、3C7、6E10、G4、B7 和 9E10 (Evan 等人，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol. Cell. Biol. )5(12)3610-3616(1985)；和單純性皰疹病毒糖蛋白D(gD)標(biāo)記及其抗體(Paborsky等，Protein Engineering 3(6) :547_553 (1990))。在某些例子中，表位標(biāo)記是“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”。如 本文所用，術(shù)語“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”指IgG分子(如IgGp IgG2、1863或1864)的Fc區(qū)的 表位，它負(fù)責(zé)提高IgG分子在體內(nèi)血清半衰期。術(shù)語“細(xì)胞毒劑”在此指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或?qū)е录?xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù) 語包括放射性同位素(例如I131、I125、Y9°、和Re186)、化療劑和毒素(例如來自細(xì)菌、真菌、植 物或動物的酶活毒素或其片段)。“化療劑”是用于治療癌癥的化合物?；焺┌ɡ绨⒚顾?Adriamycin)、 阿霉素(Doxorubicin)、5_氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara_C”)、環(huán)磷酰胺、塞替派、白消胺、 TaxotereWocetaxel)、細(xì)胞毒素、紅豆杉醇、甲氨蝶呤、順氯銨鉬、美法侖、長春堿、博來 霉素、依托泊甙、異環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C、米托蒽醌、長春新堿、長春瑞賓、卡鉬、替尼泊 甙、道諾霉素、洋紅霉素、氨基蝶呤、放線菌素D、絲裂霉素、EsperamicinM參見美國專利 4，675，187)、美法侖以及其它相關(guān)的氮芥。術(shù)語“前藥(prodrug)，，在此指藥學(xué)活性物質(zhì)的前體或衍生形式，其對腫瘤細(xì) 胞的細(xì)胞毒性低于親代藥物，并且能夠被酶激活或轉(zhuǎn)化成較高活性的親代形式。參見 Wilman，“癌癥化療中的前藥”(“Prodrugs in CancerChemotherapy”)，生物化學(xué)協(xié)會學(xué) 報(Biochemical SocietyTransaction) 14, pp. 375-382，第 615 次會議，Belfast (1986) 和Stella等人，“前藥定靶藥物釋放的化學(xué)方法”(“Prodrug :A Chemical Approach to TargetedDrug Delivery，，)，受控藥物釋放(Directed Drug Delivery), Borchardt 等編， pp. 247-267, Humana Press (1985)。本發(fā)明的前藥包括(但不限于)含磷酸鹽的前藥、含硫 代磷酸鹽的前藥、含硫酸鹽的前藥、含肽的前藥、經(jīng)D-氨基酸修飾的前藥、糖基化的前藥、 含日內(nèi)酰胺的前藥、任選地取代的苯氧基乙酰胺的前藥或任選地取代的苯乙酰胺的前藥、 5_氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前藥，它們可以被轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性更高的游離藥物。可以衍 生成為本發(fā)明所用前藥形式的細(xì)胞毒性藥物的例子，包括(但不限于)前文所述的化療劑。詞語“標(biāo)記”在此指直接或間接與抗體偶聯(lián)的可檢測化合物或組合物。標(biāo)記自身 可以被檢測到(例如放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)，或者，如果是酶標(biāo)記，它們可催化化 合物或組合物底物發(fā)生可檢測的化學(xué)轉(zhuǎn)變?！肮滔唷敝副景l(fā)明抗體可吸附于其上的非液態(tài)基質(zhì)。固相的例子在此包括部分或 完全由玻璃(例如可控多孔玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇 和硅氧烷構(gòu)成的固相。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)上下文，固相可能包括測試板的孔；而在其 它實(shí)施方案中，可能是純化柱(例如親和色譜柱)。該術(shù)語還包括分散的顆粒構(gòu)成的不連續(xù) 固相，如美國專利No. 4，275，149中所述的?！爸|(zhì)體”是由各種脂類、磷脂和/或表面活性劑構(gòu)成的，通常被用來向哺乳動物傳 遞藥物(例如本文所述的抗VEGF抗體和任選的化療劑)的小囊泡。脂質(zhì)體的組份通常排 列成雙層結(jié)構(gòu)，與生物膜的脂排列類似?！胺蛛x的，，核酸分子是經(jīng)鑒定的，并且與通常與之相伴存在于該抗體核酸天然來源 中的至少一種污染核酸分子分離的核酸分子。分離的核酸分子不是其天然形式或處于其天 然環(huán)境中。所以，分離的核酸分子與存在于天然細(xì)胞內(nèi)的核酸分子在形式上是不同的。但 是，分離的核酸分子包括正常表達(dá)抗體的細(xì)胞內(nèi)所含的核酸分子，例如，該核酸分子可以位于不同于天然細(xì)胞內(nèi)的某個染色體位置上。術(shù)語“調(diào)控序列”指在特定的宿主微生物內(nèi)表達(dá)與之可操作性連接的編碼序列所 必需的DNA序列。例如，適合原核細(xì)胞的調(diào)控序列包括啟動子、任選的操縱子序列和核糖體 結(jié)合位點(diǎn)。已知，真核細(xì)胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號和加強(qiáng)子。當(dāng)與另外的核酸序列形成功能關(guān)聯(lián)的時，核酸是“操作性相連的”。例如，前序列 (presequense)或分泌性前導(dǎo)序列的DNA是與多肽的DNA操作性相連的，如果它被表達(dá)成參 與多肽分泌的前蛋白原(preprotein)；啟動子或增強(qiáng)子是與編碼序列操作性相連的，如果 它影響序列的轉(zhuǎn)錄；或者，核糖體結(jié)合位點(diǎn)是與編碼序列操作性相連的，如果它的位置能夠 促進(jìn)翻譯。通常，“操作性相連”指相連的DNA序列是毗鄰的，而在分泌性前導(dǎo)序列情況下， 是毗鄰的并處于同一閱讀框下。然而，增強(qiáng)子不必毗鄰。可通過方便的限制性位點(diǎn)處的連 接來實(shí)現(xiàn)相連。如果這樣的位點(diǎn)不存在，則可按常規(guī)實(shí)踐采用合成的寡核苷酸銜接子或接 頭。在本文中，“細(xì)胞” “細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”是互換使用的，而且所有這些名稱都 包括子代。所以，詞語“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括原代細(xì)胞及其衍生的培養(yǎng)物(不論傳 代多少次)。還應(yīng)理解，由于有意或無意的突變，所有子代也許在DNA內(nèi)容上并不精確相同。 它包括了篩選出的，具有與原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞相同功能或生物活性的突變型子代。當(dāng)采用不同 的命名時，可以從上下文中明顯看出。II.發(fā)明的實(shí)施方式下面的實(shí)施例描述了人源化和變異的抗-VEGF抗體的產(chǎn)生方法，這些抗體從治療 角度看具有有益的特性，其中包括(a)與VEGF的強(qiáng)結(jié)合親和力；(b)在體外抑制VEGF-誘 導(dǎo)型內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力；和(c)在體內(nèi)抑制VEGF-誘導(dǎo)型血管生成的能力?？贵w的親和力如下面的實(shí)施例所述進(jìn)行測定。優(yōu)選的人源化或變異的抗體是那些 與人VEGF結(jié)合時Kd值不超過約1 X 10_7M，較佳地不超過1 X 10_8M，最佳地不超過約5 X 10_9M 的抗體。除了與人VEGF具有強(qiáng)結(jié)合親和力的抗體之外，還需要選擇具有其他有利的治療 特性的人源化或變異的抗體。例如，抗體可以是能抑制對VEGF應(yīng)答而導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞生 長的抗體。在一個實(shí)施例中，抗體能夠抑制牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞對幾乎最大有效濃度的 VEGF(3ng/ml)應(yīng)答時的增殖。較佳地，對于在該“內(nèi)皮細(xì)胞生長測定”中抑制VEGF誘導(dǎo)型 的內(nèi)皮細(xì)胞生長，抗體的有效劑量50(ED50)不超過約5nM，較佳地不超過InM，最佳地不超 過0. 5nM,即在這些濃度下抗體能夠在體外抑制50% VEGF誘導(dǎo)型內(nèi)皮細(xì)胞生長。一種優(yōu) 選的“內(nèi)皮細(xì)胞生長測定”包括基本上如實(shí)施例1所述，將衍生自牛腎上腺皮質(zhì)的毛細(xì)血 管內(nèi)皮細(xì)胞，在補(bǔ)充有10%牛血清、2mM谷氨酰胺和抗生素的低葡萄糖Dulbecco氏改良的 Eagle培養(yǎng)基(DMEM) (GIBC0)(生長培養(yǎng)基)中培養(yǎng)。這些內(nèi)皮細(xì)胞，以6X 103細(xì)胞/孔 的密度接種于6孔板中的生長培養(yǎng)基中。以l-5000ng/ml之間的濃度加入親代抗-VEGF抗 體(對照)、人源化的或變異的抗-VEGF抗體。在2-3小時后，加入純化的VEGF至終濃度 為3ng/ml。對于特異性對照，將每種抗體以5000ng/ml的濃度加至內(nèi)皮細(xì)胞，或者單獨(dú)加 入，或者在有2ng/ml bFGF下加入。在5或6天之后，通過暴露于胰蛋白酶而使細(xì)胞解離， 并在Coulter計數(shù)器(CoulterElectronics，Hialeah，F(xiàn)L)上計數(shù)。用四參數(shù)曲線擬合程序 (KaleidaGraph)分析數(shù)據(jù)。
優(yōu)選的人源化或變異的抗-VEGF抗體還可以是具有體內(nèi)抑制腫瘤活性的抗體。 例如，該抗體可抑制人A673成橫紋肌細(xì)胞瘤細(xì)胞或乳房癌MDA-MB-435細(xì)胞在裸鼠中的 生長。對于體內(nèi)腫瘤研究，如實(shí)施例1所述將A673成橫紋肌細(xì)胞瘤細(xì)胞(ATCC ；CRL1598) 或MDA-MB-435細(xì)胞(可從ATCC獲得)在補(bǔ)充有10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺和抗生素的 DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將2X 106腫瘤細(xì)胞(體積200微升)皮下注入6_10周齡雌性 BLAB/c裸鼠的背部。然后，在該測試中用人源化或變異的抗體以及無活性的對照抗體來處 理動物。人源化或變異的抗-VEGF單克隆抗體的劑量是0.5或5mg/kg。在腫瘤細(xì)胞接種開 始后24小時，將每種單克隆抗體以100微升體積進(jìn)行腹膜內(nèi)注射，每周兩次。每周確定腫 瘤大小。在注射腫瘤細(xì)胞4周后，動物被安樂死亡，然后取出腫瘤并稱量。用AN0VA進(jìn)行統(tǒng) 計分析。較佳地，在這種“體內(nèi)腫瘤測定”中5mg/kg劑量的抗體可抑制約50-100%，較佳地 約70-100%，最佳地約80-100%人A673腫瘤細(xì)胞的生長。在優(yōu)選例中，在將治療有效量的抗體施用于病人時，人源化或變異的抗體不會引 發(fā)免疫應(yīng)答。如果引發(fā)了免疫應(yīng)答，則該應(yīng)答較佳地仍使抗體能夠給被治療的病人帶來治 療好處。人源化的或變異的抗體還宜能夠抑制人體中VEGF誘導(dǎo)型血管生成，例如，抑制人 腫瘤生長和/或抑制視網(wǎng)膜疾病中眼內(nèi)的血管生成。優(yōu)選的抗體與本文所述的“表位A4. 6. 1”結(jié)合。為了篩選能結(jié)合于被感興趣抗體結(jié) 合的人VEGF表位的抗體(如阻斷A4. 6. 1抗體與人VEGF結(jié)合的抗體)，可以進(jìn)行常規(guī)的交 叉阻斷測定，例如在 Antibodies, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, Ed Harlow和David Lane (1988)中所述的方法?；蛘撸蛇M(jìn)行表位定位(例如用Champe等 人，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 270 1388-1394 (1995)中所述的方法)，以確定抗體是否 結(jié)合于有關(guān)的表位。本文優(yōu)選例的抗體具有一重鏈可變區(qū)，它包括由下式表示的氨基酸序列FR1_CDR H1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4，其中，“FR1-4”表示 4 個構(gòu)架區(qū)，而“CDRH1-3”表示抗-VEGF 抗體重鏈可變區(qū)的3個高變區(qū)。FR1-4可如下面實(shí)施例那樣衍生自“共有序列”(即一類、亞 類或亞組人免疫球蛋白的重鏈或輕鏈中最常見的氨基酸)，或者可來自某個人抗體構(gòu)架區(qū) 或來自組合的不同構(gòu)架區(qū)序列。許多人抗體構(gòu)架區(qū)序列被收集在例如Kabat等人(同上) 的文獻(xiàn)中。在一個優(yōu)選例中，可變的重鏈FR是由如Kabat等人(同上)編纂的人免疫球蛋 白的共有序列所提供。較佳地，人免疫球蛋白亞組是人重鏈亞組III (如SEQ ID N0:11)。人可變的重鏈FR序列宜在其中具有取代，例如人FR殘基被相應(yīng)的非人殘基取代 (非人殘基指當(dāng)人和非人的序列被排列對齊時，與有關(guān)的殘基具有相同Kabat位置編號的 非人殘基)，但是不一定必須用非人殘基進(jìn)行取代。例如，除了相應(yīng)的非人殘基之外的FR 殘基替換，可以用噬菌體展示法進(jìn)行選擇(參見下面的實(shí)施例2)?？梢员蝗〈拇硇钥?變重鏈FR殘基包括任何一個或多個下列編號的FR殘基37H、49H、67H、69H、71H、73H、75H、 76H、78H、94H (此處采用Kabat的殘基編號法)。較佳地，這些殘基中有至少2個，或至少3 個或至少4個被取代。一種優(yōu)選的FR取代組合是49H、69H、71H、73H、76H、78H和94H。對于重鏈高變區(qū)，較佳地具有如下氨基酸序列CDRH1GYX1X2X3X4YGX5N(SEQ ID NO :117)，其中 是 D、T 或 E，但較佳地是 D 或 T ;X2 是 F、W、或Y，但較佳地是F ；X3是T、Q、G或S，但較佳地是T ;X4是H或N ；而且X5是M或I，但較 佳地是M。CDRH2ffINTXJGEPTYAADFKR(SEQ ID NO :118)，其中 是 Y 或 W，但較佳地是 Y。CDRH3YPX1YX2X3X4X5HWYFDV (SEQ ID NO 119)，其中 是 H 或 Y ;X2 是 Y、R、K、I、T、E、或 W， 但較佳地是Y ；X3是G、N、A、D、Q、E、T、K、或S，但較佳地是G ；X4是S、T、K、Q、N、R、A、E、或 G，但較佳地是S或T ；而且X5是S或G，但較佳地是S。重鏈可變區(qū)可任選地包括FR3中的、在此處被命名為“⑶R7”的序列(參見圖9B 和10B)，其中⑶R7可具有如下氨基酸序列CDR7X1SX2DX3X4X5X6TX7 (SEQ ID NO 120)，其中 是 F、I、V、L 或 A，但較佳地是 F ;X2 是 A、L、V或I，但較佳地是L ;X3是T、V或K，但較佳地是T ;X4是S或W，但較佳地是S ;X5是S 或K，但較佳地是K ;X6是N或S，但較佳地是S ；而X7是V、A、L或I，但較佳地是A。本文優(yōu)選例的抗體具有一輕鏈可變區(qū)，它包括由下式表示的氨基酸序列FR1_CDR L1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4，其中，“FR1-4”表示 4 個構(gòu)架區(qū)，而“CDRL1-3”表示抗-VEGF 抗體輕鏈可變區(qū)的3個高變區(qū)。FR1-4可如下面實(shí)施例那樣衍生自“共有序列”(即一類、 亞類或亞組人免疫球蛋白的重鏈或輕鏈中最常見的氨基酸)，或者可來自某個人抗體構(gòu)架 區(qū)或來自組合的不同構(gòu)架區(qū)序列。在一個優(yōu)選例中，可變的輕鏈FR是由如Kabat等人(同 上)編纂的人免疫球蛋白的共有序列所提供。較佳地，人免疫球蛋白亞組是人k輕鏈亞組 1(如 SEQ ID NO: 12)。人可變的輕鏈FR序列宜在其中具有取代，例如人FR殘基被相應(yīng)的小鼠殘基取代， 但是不一定必須用非人殘基進(jìn)行取代。例如，除了相應(yīng)的非人殘基之外的FR殘基替換，可 以用噬菌體展示法進(jìn)行選擇(參見下面的實(shí)施例2)。可以被取代的代表性可變輕鏈FR殘 基包括任何一個或多個下列編號的FR殘基4L、46L和71L(此處采用Kabat的殘基編號 法)。較佳地，僅46L被取代。在另一實(shí)例中，4L和46L被取代。對于⑶R，較佳地具有如下氨基酸序列CDRL1X1AX2X3X4X5SNYLN(SEQ ID而121)，其中父1是1 或5，但較佳地是5;父2是3或隊(duì) 但較佳地是s ;X3是Q或E，但較佳地是Q ;X4是Q或D，但較佳地是D ；而且X5是I或L，但較 佳地是I。CDRL2FTSSLHS (SEQ ID NO 122)CDRL3QQYSX^PWT (SEQ ID NO 123)，其中 是 T、A 或 N，但較佳地是 T ；而且 X2 是 V 或 T，但較佳地是V。優(yōu)選的人源化抗-VEGF抗體是那些具有實(shí)施例1中F (ab)-12的重鏈和/或輕鏈 可變區(qū)序列的抗體及其變異體，例如親和性成熟形式的變異抗體，其中包括實(shí)施例3中的 變異抗體Y0317、Y0313-1和Y0238-3，并且Y0317是優(yōu)選的變異抗體。產(chǎn)生感興趣的人源化抗-VEGF抗體的方法，將在下面詳細(xì)描述。A.制備抗體在下面實(shí)施例中描述了使非人VEGF抗體人源化以及產(chǎn)生抗-VEGF抗體變異體的 方法。為了使抗-VEGF抗體抗體人源化，制備非人的抗體原料。當(dāng)需要產(chǎn)生變異抗體時，可 制備親代抗體。在下一節(jié)中將描述產(chǎn)生這種非人的抗體原料和親代抗體的代表性技術(shù)。⑴制備抗原用于產(chǎn)生抗體的VEGF抗原可以是例如完整的VEGF或VEGF片段(如含“A4. 6. 1表 位”的VEGF片段)?？捎糜诋a(chǎn)生抗體的其他形式的VEGF，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而 易見的。用于產(chǎn)生抗體的VEGF抗原宜是人VEGF，例如在Leung等人，科學(xué)(Science) 246 1306(1989)和 Houck 等人，Mol.Endocrin.5 :1806(1991)所述的。(ii)多克隆抗體多克隆抗體宜通過多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑在動物體內(nèi) 生成的。可以用例如馬來酰亞氨苯甲?；腔牾啺孵?通過半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥 基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、S0C12或R、= C = NR(其中的R和 R1是不同的烷基)的雙官能劑或衍生劑，將有關(guān)抗原與在待免疫物種中具有免疫原性的蛋 白質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)，后者包括例如匙孔蟲戚血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰 蛋白酶抑制物。用抗原、免疫偶聯(lián)物或衍生物免疫動物，例如將100微克或5微克(分別適合兔或 小鼠)蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物與3倍體積Freimd完全佐劑混合后，在多處皮內(nèi)注射該溶液。一個 月后，通過多處皮下注射1/5至1/10最初劑量的肽或偶聯(lián)物和Freimd完全佐劑，對動物進(jìn) 行加強(qiáng)免疫。7至14天后，對動物放血，分析血清的抗體效價。對動物的加強(qiáng)免疫進(jìn)行至 效價穩(wěn)定為止。較好的是，用相同抗原但與不同蛋白和/或通過不同的交聯(lián)劑偶聯(lián)而成的 偶聯(lián)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。偶聯(lián)物還可以在重組細(xì)胞內(nèi)以融合蛋白的形式制備。而且，凝聚劑 (例如明礬)適合用來加強(qiáng)免疫應(yīng)答。(iii)單克隆抗體單克隆抗體可以用Kohler等人，自然256 =495(1975)首次公開的雜交瘤方法制 得，或者利用重組DNA方法制得(美國專利4，816，567)。在雜交瘤方法中，鼠或其它合適的宿主動物，例如倉鼠或獼猴，如前文所述接受免 疫，以引發(fā)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生特異性結(jié)合免疫所用蛋白的抗體的淋巴細(xì)胞?；蛘撸梢泽w外免 疫淋巴細(xì)胞。然后使用合適的融合劑(例如聚乙二醇)將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成 雜交瘤細(xì)胞(Goding，單克隆抗體理論與實(shí)踐(Monoclonal Antibodies principles and Practic)，pp.59-103(Academic Press,1986))。將如此制得的雜交瘤細(xì)胞接種并培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中最好含有一種 或多種抑制非融合親代骨髓瘤細(xì)胞生長或存活的物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細(xì)胞缺乏次 黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤培養(yǎng)基中一般含有次黃嘌呤、氨 基蝶呤和胸苷這些抑制HGPRT缺陷型細(xì)胞生長的物質(zhì)(HAT培養(yǎng)基)。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些融合效率高、支持選定的抗體生產(chǎn)細(xì)胞穩(wěn)定且高水平地 生產(chǎn)抗體、而且對諸如HAT培養(yǎng)基敏感的細(xì)胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤細(xì)胞 系，例如來自 M0PC-21 和 M. C.-11 鼠腫瘤的(可以從 Salk Institute Cell DistributionCenter, San Diego, California USA 獲得)，和 SP-2 或X63_Ag8_653 細(xì)胞(可由美國典型培 養(yǎng)物保藏中心，RockvillhMaryland USA獲得)。也有用人骨髓瘤細(xì)胞和人-鼠異源骨髓瘤 細(xì)胞系來生產(chǎn)人單克隆抗體的(Kozbor，免疫雜志(J. Immunol.) 133 =3001(1984) ；Brodeur 等，單克隆抗體的生產(chǎn)技術(shù)和應(yīng)用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications),pp.51-63(Marcel Dekker, Inc. , New York,1987)。 對生長有雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液進(jìn)行分析，檢測是否產(chǎn)生針對抗原的單克隆抗體。 較好的是，用免疫沉淀法或例如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)的體外 結(jié)合分析法，來測定由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性。例如，單克隆抗體的結(jié)合親和性可以利用Scatchard分析(Munson等，生物化學(xué)年 刊(Anal. Biochem.) 107 220(1980))來測定。在雜交瘤細(xì)胞經(jīng)鑒定生產(chǎn)了具有所要求的特異性、親和性和/或活性的抗體后， 可以利用有限稀釋程序?qū)⒖寺喛寺』⒗脴?biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)(Goding，單克隆抗體理論 與實(shí)踐(Monoclonal Antibodies :Principles andPractice) pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。就此目的而言，合適的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)液。此外，雜交瘤 細(xì)胞可以以腹水瘤的形式在動物體內(nèi)生長。利用常規(guī)免疫球蛋白純化技術(shù)，例如A蛋白-瓊脂糖柱(protein A-Sepharose)、 羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析或親和性色譜，可從培養(yǎng)液、腹水液或血清中合適地分離 出由亞克隆分泌的單克隆抗體。使用常規(guī)方法，可以方便地分離出編碼單克隆抗體的DNA并進(jìn)行測序(例如，利用 能與編碼單克隆抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞是所 述DNA的優(yōu)選來源。一旦被分離，可以將DNA置于表達(dá)載體中，表達(dá)載體然后被轉(zhuǎn)染到例如 大腸桿菌細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞等原本并不產(chǎn)生免疫球 蛋白的宿主細(xì)胞內(nèi)，從而在重組宿主細(xì)胞內(nèi)獲得生成的單克隆抗體。下面更詳細(xì)地描述抗 體的重組產(chǎn)生法。(iv)人源化和氨基酸序列變異體下面的實(shí)施例1-2描述了使抗-VEGF抗體人源化的程序。在某些例子中，可能需 要產(chǎn)生這些人源化抗體的氨基酸序列變異體，尤其是在需要提高人源化抗體的結(jié)合親和力 或其他生物特性的場合。實(shí)施例3描述了產(chǎn)生具有比親代抗體更高親和力的抗-VEGF抗體 的氨基酸序列變異體的方法?？?VEGF抗體的氨基酸序列變異體可這樣制備將合適的核苷酸變化引入 抗-VEGF抗體的DNA，或通過肽合成。這樣的變異抗體包括例如，在此處實(shí)施例的抗-VEGF 抗體的氨基酸序列中有氨基酸殘基缺失、和/或插入和/或取代?？蛇M(jìn)行缺失、插入和取代 的任何組合，以制備最終的構(gòu)建物，只要該最終構(gòu)建物具有所需的特性。氨基酸改變也可改 變?nèi)嗽椿蜃儺惖目?VEGF抗體的翻譯后加工過程，例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置。一種有用的、確定抗-VEGF抗體中那些殘基或區(qū)域是適合誘變的優(yōu)選位置的方 法，是 Cunningham 禾口 Wells，科學(xué)(Science)，244 1081-1085 (1989)中描述的“丙氨酸掃 描誘變”。在該方法中，確定一個或一組靶殘基(如帶電荷的殘基如arg、asp、his、Iys和 glu)，并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最佳的是丙氨酸或聚丙氨酸)加以替換，以影響氨基 酸與VEGF的相互作用。那些在功能上表現(xiàn)出對替換敏感的氨基酸位置，再通過在置換位點(diǎn)處引入進(jìn)一步的或其他的突變而進(jìn)行結(jié)構(gòu)的精細(xì)研究。這樣，盡管引入氨基酸序列變異的 位點(diǎn)被預(yù)先確定，但是突變本身的性質(zhì)不必被預(yù)先確定。例如，為了優(yōu)化給定位點(diǎn)處突變的 性能，可以對靶密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，然后篩選表達(dá)的抗-VEGF抗體 變異體是否有所需活性。丙氨酸掃描誘變在實(shí)施例3中描述。氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端的融合，長度為一個殘基至含100個或 更多殘基的多肽，還包括在序列內(nèi)插入單個或多個氨基酸殘基。末端插入的例子包括具有 N端甲硫氨酸殘基的抗-VEGF抗體，或融合于表位標(biāo)記的抗體?？?VEGF抗體分子的其他插 入變異體包括將抗-VEGF抗體的N端或C端融合于會導(dǎo)致抗體血清半衰期更長的酶或多 肽(見下面)。另一種變異體是氨基酸置換變異體。這些變異體在抗-VEGF抗體分子中至少有一 個氨基酸殘基被除去并在其位置上插入不同的殘基。置換誘變最感興趣的位置包括高變 區(qū)，但FR改變也在范圍之中。保守性置換示于表1，標(biāo)題是“優(yōu)選的置換”。如果這種置換 導(dǎo)致生物活性的改變，那么可引入更接近的變化即表1中指出的“代表性置換”、或進(jìn)一步 按下面氨基酸類型引入置換，然后篩選產(chǎn)物。表1 對抗體生物性能的基本修飾，可以通過選擇在下列方面的效應(yīng)上差別明顯的置換 而實(shí)現(xiàn)(a)維持取代區(qū)域中多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如折疊或螺旋構(gòu)象，(b)維持靶位置處分 子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈體積。根據(jù)共同的側(cè)鏈特性，天然存在的殘基被分成下列幾 類(1)疏水的正亮氨酸，met, ala, val, leu, ile ；(2)中性親水的:cys, ser, thr ；(3)酸性的asp，glu ；(4)喊個生的:asn, gin, his, lys, arg ；(5)影響鏈取向的殘基gly，pro ；和(6)芳香類的trp，tyr, phe非保守性取代需要用這些類別中一類的某種氨基酸替換另一類的某種氨基酸。在維持人源化或變異的抗-VEGF抗體的正常構(gòu)象中不涉及的任何半胱氨酸殘基 也可被取代，一般是用絲氨酸取代，以改善分子的氧化穩(wěn)定性并防止異常交聯(lián)。相反地，可 以在抗體中添加半胱氨酸鍵以提高穩(wěn)定性(尤其是在抗體是抗體片段(如Fv片段)的情 況下)。一種特別優(yōu)選的置換變異體涉及替換親代抗體(如人源化抗體或人抗體)的一個 或多個高變區(qū)殘基。通常，形成的并選出用于進(jìn)一步開發(fā)的變異抗體應(yīng)與產(chǎn)生它們的親代 抗體相比具有更高的生物活性。一種方便的產(chǎn)生這種置換變異體的方法，是用噬菌體展示 法(見實(shí)施例3)進(jìn)行親和力成熟化。簡而言之，對數(shù)個高變區(qū)位點(diǎn)(如6-7個位點(diǎn))進(jìn)行 突變，從而在每個位點(diǎn)上產(chǎn)生所有可能的氨基酸置換。這樣產(chǎn)生的變異抗體以單價形式在絲狀噬菌體顆粒上展示，即作為在每個顆粒中包裝且融合于M13基因III產(chǎn)物的融合蛋白。 然后按此處所述的那樣，篩選噬菌體展示的變異抗體的生物活性(如結(jié)合親和力)。為了鑒 別用于修飾的候選高變區(qū)位點(diǎn)，可進(jìn)行丙氨酸掃描誘變(見實(shí)施例3)以鑒別出對抗原結(jié)合 有重大貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基。另外或額外的，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)可能是有利 的，以鑒別出抗體和人VEGF之間的接觸點(diǎn)。根據(jù)此處所述的技術(shù)，這些接觸殘基和相鄰殘 基是置換的候選殘基。一旦得到了這些變異體，那么可如本文所述的那樣對一組變異體進(jìn) 行篩選，并選出在一個或多個相關(guān)測試中有優(yōu)異性能的抗體作進(jìn)一步開發(fā)。另一種抗體的氨基酸變異體是是改變抗體的原來的糖基化方式。“改變”指刪去一 個或多個在抗體中發(fā)現(xiàn)的碳水化合物分子(部分)，和/或增加一個或多個在抗體中不存在 的糖基化位點(diǎn)。 抗體的糖基化通常是N-連接的或0-連接的?！癗-連接”指碳水化合物部分連在 天冬酰胺殘基的側(cè)鏈上。天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸這樣的三肽序列，是 將碳水化合物酶連于天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。因 此，在多肽中存在任何一種這樣的三肽便會形成一個潛在的糖基化位點(diǎn)。“0-連接的”糖基 化指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖等糖中的一種被連于羥基氨基酸上，最常見的是絲 氨酸或蘇氨酸，盡管也可使用5-羥基脯氨酸或5-羥基絲氨酸。在抗體中添加糖基化位點(diǎn)，通常可通過改變氨基酸序列從而使其含有一個或多個 上述的三肽序列(對于N-連接的糖基化位點(diǎn)而言)而實(shí)現(xiàn)。還可以通過在原來的抗體中添 加或取代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基而實(shí)現(xiàn)改變(對于N-連接的糖基化位點(diǎn)而言)。編碼抗-VEGF抗體氨基酸序列變異體的核酸分子，可用本領(lǐng)域中已知的各種方法 制備。這些方法包括(但并不限于)從天然來源中分離出(在天然存在的氨基酸序列變 異體的情況下)，或通過對早先制備的變異或非變異的抗-VEGF抗體進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的 (或定點(diǎn))誘變、PCR誘變、和盒式誘變而制備。(ν)人抗體作為人源化的替換形式，可產(chǎn)生人抗體?，F(xiàn)在可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物(如小鼠)， 一旦免疫，它們能夠在沒有內(nèi)源免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下產(chǎn)生所有種類的人抗體。例如， 已有報道，在嵌合的種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失，會導(dǎo)致完全抑 制內(nèi)源抗體的產(chǎn)生。將人種系免疫球蛋白基因陣列(gene array)轉(zhuǎn)入這種種系突變的 小鼠中，會導(dǎo)致在抗原攻擊時產(chǎn)生人抗體。參見例如Jakobovits等人，美國科學(xué)院院報， 90 2551-255(1993)和 Jakobovits 等人，自然362 :255_258 (1993) ；Bruggermann 等人， Year. InImmuno.，7 33(1993)；和美國專利 5，591，669,5, 589，369 和 5，545，807。還可從 噬菌體展示文庫中產(chǎn)生人抗體(Hoogenboom等人，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.)，227 381 [1991] ；Marks 等人，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.)，222 :581 [1991]；和美國專利 5，565，332和5，573，905)。如上所述，人抗體還可在體外用激活的B細(xì)胞來產(chǎn)生(參見美 國專利 5，567，610 和 5，229，275)。(vi)抗體片段在某些例子中，人源化或變異的抗-VEGF抗體是抗體片段。已經(jīng)有了各種方法生 產(chǎn)抗體片段。通常，所述片段是通過用蛋白酶消化完整的抗體而得到的(參見Morimoto 等人，生物化學(xué)和生物物理學(xué)方法雜志(Journal ofBiochemical and BiophysicalMethods) 24 107-117 (1992)和 Brennan 等，科學(xué) 229 :81(1985))。但是，現(xiàn)在，抗體片段 可以直接由重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生。例如，可以直接從大腸桿菌回收Fab' -SH片段，然后化 學(xué)偶合而形成F(ab' )2片段(Carter等，生物技術(shù)10:163-167 (1992))。在另一例子中， F(ab' )2的形成，可通過用亮氨酸拉鏈GCN4來促進(jìn)F(ab' ) 2分子的裝配。根據(jù)另一方法， Fv、Fab或F(ab' )2片段可以從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中直接分離得到。生產(chǎn)抗體片段的其 它方法是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員眾所周知的。(vii)多特異性抗體在某些例子中，產(chǎn)生多特異性(如雙特異性)的人源化或變異的抗-VEGF抗體是 有利的，它們具有針對至少兩個不同表位的結(jié)合特異性。代表性的雙特異性抗體可與VEGF 蛋白的兩個不同表位結(jié)合?；蛘撸筕EGF臂可與能結(jié)合于白細(xì)胞觸發(fā)分子的臂組合，后者 例如T細(xì)胞受體分子(例如CD2或CD3)，或IgG的Fc受體(Fe y R)例如Fc y RI (CD64)、 FcyRII (⑶32)和Fc γ RIII (⑶16)，從而使細(xì)胞防御機(jī)制主要針對VEGF表達(dá)細(xì)胞。雙特異 性抗體還可以用于將細(xì)胞毒劑定位于表達(dá)VEGF的細(xì)胞。所述抗體具有結(jié)合VEGF的臂和結(jié) 合細(xì)胞毒劑(例如皂草素、抗α干擾素、長春花生物堿、蓖麻毒蛋白A鏈、氨甲蝶呤或放射 性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體可以制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab' )2 雙特異性抗體)。根據(jù)另一種制備雙特異性抗體的方法，可對一對抗體分子之間的界面進(jìn)行工程 化，以便使從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面含有抗體恒 定區(qū)的至少一部分Ch3區(qū)。在該方法中，第一抗體分子界面上的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈 被用更大的側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)加以替換。與大側(cè)鏈大小相同或相似的、補(bǔ)償性的 “空穴”可在第二抗體分子的界面上形成，即將大的氨基酸側(cè)鏈用更小的側(cè)鏈(如丙氨酸或 蘇氨酸)加以替換。這樣提供了一種使異二聚體比不需要的終產(chǎn)物(如同二聚體)的產(chǎn)率 更高的機(jī)理。參見1996年9月6日出版的W096/27011。雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“異偶聯(lián)(heteroconjugate)”抗體。例如，異偶聯(lián)體 中的一個抗體可被偶聯(lián)于親和素，而另一抗體被偶聯(lián)于生物素。這種異偶聯(lián)抗體可用任何 方便的交聯(lián)方法制備。合適交聯(lián)劑在本領(lǐng)域中是已知的，并與多種交聯(lián)技術(shù)一起公開于美 國專利 No. 4，676，980 中。文獻(xiàn)中也記載了從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)。例如，雙特異性抗體可用 化學(xué)連接方法制備。Brerman等，Science 229 81(1985)描述了一種方法，其中完整的抗體 被蛋白酶解切斷，產(chǎn)生F(ab' )2片段。這些片段在二硫酚復(fù)合劑亞砷酸鈉存在下被還原， 從而穩(wěn)定了連位的二硫酚并防止形成分子間的二硫鍵。產(chǎn)生的Fab'片段接著被轉(zhuǎn)變成硫 代硝基苯甲酸(thionitrobenzoate，TNB)衍生物。Fab' -TNB衍生物中的一種然后通過 用巰基乙胺還原而被再轉(zhuǎn)變成Fab'-巰基，再與等摩爾量的另一種Fab' -TNB衍生物相 混合，從而形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作選擇性地固定酶的試劑。在另 一例子中，從大腸桿菌中直接回收的Fab' -SH片段，被體外化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。 Shalaby 等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J. Exp. Med.)，175 :217_225 (1992)各種直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)物制備和分離雙特異性抗體片段的技術(shù)已有描 述。例如，已用亮氨酸拉鏈生成了雙特異性抗體。Kostelny等，免疫學(xué)雜志148(5) 1547-1553(1992)。來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩個不同抗體的Fab'部分連接。該抗體同二聚體在鉸鏈區(qū)被還原成單體，然后重新氧化成抗體異二聚體。該方法還可以被用來產(chǎn)生抗體同二聚體。Hollinger等人在美國科學(xué)院院報90: 6444-6448(1993)中所述的“二體”技術(shù)，提供了另一種制造雙特異性抗體片段的機(jī)制。所 述片段包含通過接頭而連接在一起的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)(Vh)，接頭很短以致 于同一鏈上的兩個功能區(qū)之間無法配對。所以，同一片段上的Vh和八功能區(qū)被迫與其 它片段上的互補(bǔ)性\和Vh功能區(qū)配對，由此形成兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。利用單鏈Fv(sFv) 二聚體制備雙特異性抗體片段的其它方法也已有所報道。參見Gruber等，免疫學(xué)雜志 (J. Immunol.) 152 :5368(1994)?；蛘撸p特異性抗體可以是按Zapata等人，蛋白質(zhì)工程 (Protein Eng.) 8 (10) 1057-1062 (1995)中所述方法制備的“線性抗體”?？煽紤]使用二價以上的抗體。例如可以制備三特異性抗體。Tutt等人，免疫學(xué)雜 志 147 60(1991)。(viii)其他修飾形式人源化或變異的抗-VEGF抗體的其他修飾形式也在范圍之中。例如，可能需要就 效應(yīng)子功能對本發(fā)明抗體進(jìn)行修飾，從而加強(qiáng)抗體在例如治療癌癥中的效果。例如，可在 Fc區(qū)內(nèi)引入半胱氨酸殘基，由此允許在該區(qū)形成鏈間二硫鍵。由此形成的同源二聚體抗 體可以具有改善的內(nèi)在能力和/或提高的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷性和抗體依賴性細(xì)胞毒性 (ADDC)。參見Caron等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志176 :1191_1195 (1992)和Shopes, B.，免疫學(xué)雜志 148 :2918-2922(1992)。抗癌活性增強(qiáng)的同源二聚體抗體，還可以如Wolff等在癌癥研究 (Cancer Research) 53 2560-2565 (1993)中所述利用異源雙功能(heterobifunctional) 交聯(lián)劑來制備?；蛘?，抗體可以經(jīng)改造后具有兩個Fc區(qū)，并由此加強(qiáng)其補(bǔ)體裂解性和ADDC 能力。參見 Stevenson 等，抗癌藥的設(shè)計(Anti-Cancer Drug Design) 3 =219-230(1989) 本發(fā)明還涉及包含與細(xì)胞毒劑偶聯(lián)的所述抗體的免疫偶聯(lián)物，細(xì)胞毒劑例如化療 齊U、毒素(例如細(xì)菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即 放射性偶聯(lián)物)。用于產(chǎn)生所述免疫偶聯(lián)物的化療劑已在前文論述過?？梢允褂玫拿富钚远舅鼗?其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌)、 蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、modeccin A鏈、α八疊球菌素(α-sarcin)、油桐蛋 白、dianthin 蛋白、美商路(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII 和 PAP-S)、苦瓜抑制 物、麻風(fēng)樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制物、gelonirumitogellin、局限曲菌素、酚霉素、 伊諾霉素和單端孢菌素(tricothecenes)。有多種放射性核素可用于生成放射性偶聯(lián)的抗 VEGF 抗體。例如 212Bi、mI、131In、90Y 和 186Re0抗體與細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物可用各種不同雙官能蛋白偶合劑制備的，例如N-琥珀 酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫代戊環(huán)(iminothiolane) (IT)、亞 胺酯的雙官能衍生物(例如己二亞氨酸二甲酯鹽酸鹽)、活潑酯(例如二琥珀酰亞胺辛二 酸酯)、醛(例如戊二醛)、二疊氮基化合物(例如二(對疊氮基苯甲酰)己二胺)、二重氮 衍生物(例如二 _(對重氮苯甲酰)_乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2，6_ 二異氰酸酯) 和二活性氟化合物(例如1，5_ 二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可以如 Vitetta等在科學(xué)(Science) 238 =1098(1987)中所述的方法來制備。碳14標(biāo)記的1-異硫 氰酸根合芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是一種代表性的用于將放射性核素與抗體偶聯(lián)的螯合劑。參見W094/11026。在另一實(shí)施方案中，為了用于腫瘤導(dǎo)向，抗體可以與“受體”(例如鏈霉親和素)偶 聯(lián)，并給患者使用抗體_受體偶聯(lián)物，接著用清除劑去除循環(huán)系統(tǒng)中的未被結(jié)合的偶聯(lián)物， 然后施用與細(xì)胞毒劑(例如放射性核素)偶聯(lián)的“配體”(例如親和素)。 本處所述的抗VEGF抗體還可以制成免疫脂質(zhì)體。含有抗體的脂質(zhì)體是利用本 領(lǐng)域已知方法制備的，例如以下所述=Epstein等，美國科學(xué)院院報82 =3688(1985) ；Hwang 等，美國科學(xué)院院報77 =4030(1980)；和美國專利4，485，045和4，544，545。美國專利 5，013，556公開了具有更長循環(huán)時間的脂質(zhì)體。特別有用的脂質(zhì)體可以通過含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇 胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物，用反相蒸發(fā)法生成。將脂質(zhì)體擠壓通過一定孔徑的濾器形 成具有所需直徑的脂質(zhì)體。如Martin等在生物化學(xué)雜志257 :286-288 (1982)中所述， 可通過二硫鍵互換反應(yīng)將本發(fā)明中抗體的Fab'片段與脂質(zhì)體偶聯(lián)。脂質(zhì)體中可以任選 的包含化療劑(例如阿霉素)。參見Gabizon等人，國立癌癥研究所雜志(J. National CancerInst.)81(19) 1481(1989)。通過將抗體與可將前藥(例如肽基化療劑，參見W081/01145)轉(zhuǎn)化成活性抗癌藥 物的前藥激活酶偶聯(lián)，本發(fā)明的抗體還可以用于抗體依賴性酶介導(dǎo)的前藥療法(ADEPT)。例 如，可參見WO 88/07378和美國專利No. 4，975，278。用于ADEPT的免疫偶聯(lián)物的酶組份，包括任何能以此途徑作用于前藥使之轉(zhuǎn)化為 更具活性、更有細(xì)胞毒性的形式的酶。可用于本發(fā)明的該方法的酶組份包括(但不限于)用于將含磷酸根的前藥轉(zhuǎn)化 成游離藥的堿性磷酸酶；將含硫酸根的前藥轉(zhuǎn)化成游離藥的芳基硫酸酯酶；將無毒的5-氟 胞嘧啶轉(zhuǎn)化成抗癌藥5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；用于將含肽前藥轉(zhuǎn)化成游離藥的蛋白 酶，例如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧基肽酶和組織蛋白酶(例如 組織蛋白酶B和L)；用于轉(zhuǎn)化含D-氨基酸取代基的前藥的D-丙胺?；然拿福挥糜趯?糖基化前藥轉(zhuǎn)化成游離藥的糖切割酶，例如β -半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；用于將β "內(nèi)酰 胺衍生的藥物轉(zhuǎn)化成游離藥的內(nèi)酰胺酶；和用于分別將在其胺氮原子上帶有苯氧基乙 ?；虮交阴；鶊F(tuán)的藥物轉(zhuǎn)化成游離藥的青霉素酰胺酶，諸如青霉素V酰胺酶和青霉 素G酰胺酶?；蛘撸梢杂镁哂忻富钚缘目贵w(在本領(lǐng)域中又稱“抗體酶”)將本發(fā)明的前 藥轉(zhuǎn)化成游離的活性藥(參見Massey，自然328 :457_458 (1987))。可以如本文所述制備抗 體_抗體酶偶聯(lián)物，用于向腫瘤細(xì)胞群輸送抗體酶。本發(fā)明的酶可以利用本領(lǐng)域的公知技術(shù)與抗VEGF抗體共價結(jié)合，例如利用前文 所述的異源雙官能交聯(lián)劑?；蛘?，利用本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建這樣的融合蛋白，它 包含與本發(fā)明酶的至少一個功能活性部分連接的本發(fā)明抗體的至少一個抗原結(jié)合區(qū)(參 見 Neuberger 等，自然 312 :604_608 (1984))。在本發(fā)明某些例子中，可能需要采用抗體片段而不是完整的抗體來加強(qiáng)對腫瘤的 穿透。此時，為了延長它的血清半衰期可能需要對抗體片段加以修飾。這可以通過例如在抗 體片段中加入補(bǔ)救受體結(jié)合表位來做到(例如，通過對抗體片段對應(yīng)區(qū)的突變，或通過將 表位引入肽標(biāo)記中，然后通過例如DNA或肽合成將肽標(biāo)記融合在抗體片段的兩端或中部)。 參見1996年10月17日出版的WO 96/32478。
補(bǔ)救受體結(jié)合表位通常構(gòu)成這樣一個區(qū)域，在其中，F(xiàn)c區(qū)一個或兩個環(huán)的一個或多個氨基酸殘基被轉(zhuǎn)移到抗體片段的類似位置上。較佳地，F(xiàn)c區(qū)一個或兩個環(huán)的三個或更 多個殘基被轉(zhuǎn)移。更佳地，表位來自(例如IgG的)Fc區(qū)的CH2區(qū)，并被轉(zhuǎn)移到抗體的CH1、 CH3或，或一個以上的此類區(qū)域。或者，表位來自Fc區(qū)的CH2區(qū)，并被轉(zhuǎn)移到抗體片段 的Q區(qū)或\區(qū)，或轉(zhuǎn)移到Q和\兩個區(qū)。在一個最佳例子中，補(bǔ)救受體結(jié)合表位含有序列PKNSSMISNTP(SEQID NO 17), 而且可任選地含有選自下組的序列HQSLGTQ(SEQ IDNO 18)、HQNLSDGK (SEQ ID NO: 19)、HQNISDGK (SEQ ID NO 20)、或 VISSHLGQ (SEQ ID NO :21)，尤其當(dāng)抗體片段是 Fab 或 (Fab' )2時。在另一最佳例子中，補(bǔ)救受體結(jié)合表位是這樣的多肽，該多肽是含有以下序 列的多肽HQNLSDGK (SEQ ID NO 19)、HQNISDGK (SEQ ID NO 20)、或 VISSHLGQ (SEQ ID NO: 21)，以及序列 PKNSSMISNTP(SEQ ID N0:17)。人源化或變異的抗-VEGF抗體的共價修飾形式也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。它們的制備 可以通過化學(xué)合成，或用化學(xué)法或酶法來切割抗體(如果可行)?？贵w的其他類型共價修 飾形式，可以通過將抗體的靶殘基與能和所選側(cè)鏈或N-端或C-端殘基反應(yīng)的有機(jī)衍生劑 反應(yīng)，而被引入到分子中。代表性的多肽共價修飾形式在美國專利5，534，615中有描述， 該專利在此引用作為參考。一種優(yōu)選抗體共價修飾包括，將抗體連于各種非蛋白質(zhì)的聚合 物如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，其方法描述于美國專利No. 4，640，835 ；4, 496，689 ； 4，301，144 ；4，670，417 ；4，791，192 ；或 4，179，337 中。B.載體、宿主細(xì)胞和重組方法本發(fā)明還提供了分離的編碼人源化或變異的抗-VEGF抗體的核酸、包含該核酸的 載體和宿主細(xì)胞，以及用于產(chǎn)生該抗體的重組技術(shù)。為了重組產(chǎn)生抗體，其編碼核酸被分離出來并插入到用于進(jìn)一步克隆(擴(kuò)增DNA) 或表達(dá)的復(fù)制載體中。在另一例子中，抗體是用例如美國專利5，204，244中所述的同源重 組法產(chǎn)生的(該專利在此引用作為參考)。利用常規(guī)技術(shù)可方便地分離出編碼單克隆抗體 的DNA并測序(例如使用能夠特異性結(jié)合編碼抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。 有許多載體可以使用。載體的組成通常包括(但不限于)以下之一或幾個信號序列、復(fù)制 起點(diǎn)、一個或多個標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列，例如在1996年7月9日 授權(quán)的美國專利5，534，615 (該專利在此引用作為參考)中所描述。適于在本發(fā)明載體中克隆或表達(dá)DNA的宿主細(xì)胞是所述的原核、酵母或高等真 核相比。適于此目的的原核生物包括真細(xì)菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細(xì)菌。例如腸 桿菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏桿菌屬(Escheriachia)(比如大腸桿菌)、腸桿 菌屬、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、 沙門氏菌屬如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌屬如粘質(zhì)沙雷氏菌 (Serratiamarcescans)、志賀氏菌屬(Shigella)，以及芽胞桿菌屬如枯草桿菌和蘚樣芽 胞桿菌(B. Iicheniformis)(如1989年4月12日出版的DD 266，710中所公開的蘚樣芽 胞桿菌41P)、假單胞菌屬如綠膿假單胞菌(P. aeruginosa)和鏈霉菌屬。一種優(yōu)選的大 腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294 (ATCC 31，446)，盡管其他的菌株如大腸桿菌B、大腸桿菌 X1776(ATCC 31，537)、和大腸桿菌13110仏1027，325)也是合適的。這些例子僅僅是闡述 性的，并不起限制作用。
用于克隆和表達(dá)載體內(nèi)的DNA的合適宿主細(xì)胞是上述的原核、酵母或其他更高級的真核細(xì)胞。用于該目的的合適原核生物包括真細(xì)菌如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體， 例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏桿菌屬(Escheriachia)(比如大腸桿菌)、 腸桿菌屬、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、 沙門氏菌屬如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌屬如粘質(zhì)沙雷氏菌 (Serratiamarcescans)、志賀氏菌屬(Shigella)，以及芽胞桿菌屬如枯草桿菌和蘚樣芽胞 桿菌(B. Iicheniformis)(如1989年4月12日出版的DD 266，710中所公開的蘚樣芽胞桿 菌41P)、假單胞菌屬如綠膿假單胞菌(P. aeruginosa)和鏈霉菌屬。一種優(yōu)選的大腸桿菌克 隆宿主是大腸桿菌294 (ATCC 31,446)，盡管其他的菌株如大腸桿菌B、大腸桿菌XJ76 (ATCC 31，537)、和大腸桿菌13110仏1027，325)也是合適的。這些例子僅僅是闡述性的，并不起 限制作用。除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適用于抗-VEGF抗體編碼 載體的克隆或表達(dá)宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，即常見的發(fā)面酵 母，是低級真核宿主微生物中最常用的。然而，大量其他屬、種或株通常是可得到并可 用于此處的，如裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬宿主，如乳克 魯維酵母(K. lactis)、脆壁克魯維酵母(K. fragilis) (ATCC 12，424)、保加利亞克魯維 酵母(K. bulgaricus) (ATCC 16,045)、成克曼氏克魯維酵母(K. wicheramii) (ATCC24, 178)、K. waltii (ATCC 56，500)、果蠅克魯維酵母(K. drosophilarum) (ATCC 36，906)、 K. thermotoIerans 和馬克斯克魯維酵母(K. marxianus) ；yarrowia[EP 402, 226]；巴士 德畢赤氏酵母(Pichia pastoris) (EP 183, 070)；念珠菌屬；Trichoderma reesia[EP 244, 234]；粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)；許旺氏酵母屬(Schwanniomyces)如西方許旺 氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和絲狀真菌如鏈抱霄屬(Neurospora)、青霄菌 屬(penicillium)、Tolypocladium 和曲霄屬(Aspergillus)如構(gòu)巢曲霄(A. nidulans)和黑曲霉(A.niger)。適用于表達(dá)糖基化抗-VEGF抗體的宿主細(xì)胞可衍生自多細(xì)胞生物體。無脊椎動物 細(xì)胞的例子包括植物和昆蟲的細(xì)胞。已經(jīng)鑒別出許多桿狀病毒株和變異株，以及相應(yīng)的來 自宿主[如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(蟲蜀)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊 子)、白紋伊岐(Aedes albopictus)(岐子)、果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)禾口 家蠶(Bombyx mori)]的允許性昆蟲宿主細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)染的各種不同的病毒株是公眾可以 獲得的，如苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)NPV的L-I變異體和家蠶NPV的Bm_5 株，而且這類病毒可根據(jù)本發(fā)明在此處用作病毒，尤其是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牽?；ā⒎押蜔煵莸闹参锛?xì)胞培養(yǎng)物也可以 被用作宿主。然而，脊椎動物細(xì)胞是最感興趣的，而通過培養(yǎng)繁殖脊椎動物細(xì)胞(組織培養(yǎng))已 經(jīng)成為一種常規(guī)的程序。有用的哺乳動物宿主細(xì)胞系的例子是，被SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVl系 (COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細(xì)胞系(293細(xì)胞或亞克隆的懸浮培養(yǎng)生長的293細(xì)胞， Graham 等人，J.Gen Virol. 36 59[1977])；幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠 卵巢細(xì)胞/-DHFR (CHO，Urlaub等人，美國科學(xué)院院報，77 :4216「19801)；小鼠Sertoli細(xì) 胞(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23 243-251 [1980])；猴腎細(xì)胞(CVIATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCC CCL2)；犬腎細(xì)胞(MDCK， ATCC CCL34)；水牛鼠(buffalo rat)肝細(xì)胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)；人肺細(xì)胞(W138, ATCCCCL75)；人肝細(xì)胞(Hep G2, HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51) ；TRI 細(xì)胞(Mather 等人，Annals N. Y. Acad. Sci. 383 44-68 [1982]) ；MRC 5 細(xì)胞；FS4 細(xì)胞；和人 肝癌細(xì)胞系OfeP G2)。
宿主細(xì)胞用本發(fā)明上述的用于產(chǎn)生抗-VEGF抗體的表達(dá)或克隆載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然 后在常規(guī)的營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基可被加以改進(jìn)以便誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子或 擴(kuò)增編碼所需序列的基因。用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗-VEGF抗體的宿主細(xì)胞可在各種不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)。市 售的培養(yǎng)基如 Ham' s FlO(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM, Sigma)、RPMI-1640 (Sigma) 和Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)都適合培養(yǎng)這些宿主細(xì)胞。此外， 任何在例如下列文獻(xiàn)中描述的培養(yǎng)基也可用作宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基Ham和Wallace， Meth. Enz. 58 44 (1979)，Barnes 等人，分析化學(xué)(Anal. Biochem) 102 255(1980)，美國 專利 No. 4，767，704 ；4，657，866 ；4，927，762 ；4，560，655 ；或 5，122，469 ；WO 90/03430 ； W087/00195 ；或美國專利RE No. 30，985。所有這些培養(yǎng)基都可按需要添加激素和/或其他 的生長因子(如胰島素、運(yùn)鐵蛋白、或表皮生長因子[EGF])、鹽類(如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸 鹽)、緩沖液(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素(如慶大霉素(Gentamycin )藥 物)、痕量元素(定義為以微摩爾級的終濃度存在的無機(jī)化合物)、和葡萄糖或等價的能量 源。任何其他必要的補(bǔ)充物也可以合適的濃度加入，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的。培養(yǎng)條 件如溫度、PH等是以往用于培養(yǎng)所選的表達(dá)宿主細(xì)胞的條件，這是一般技術(shù)人員所熟知的。在使用重組技術(shù)時，抗體可以產(chǎn)生在細(xì)胞內(nèi)、周質(zhì)間隙內(nèi)或直接分泌在培養(yǎng)基中。 如果抗體產(chǎn)生在細(xì)胞內(nèi)，第一步是通過例如離心或超濾去除顆粒狀碎片(或者是宿主細(xì)胞 或者是裂解片段)。Cater等人在生物技術(shù)(Bio/Technology) 10 163-167 (1992)中，敘述了 分離分泌在大腸桿菌周質(zhì)間隙內(nèi)的抗體的方法。簡而言之，在乙酸鈉(pH3. 5)、EDTA和苯甲 基磺酰氟(PMSF)存在下融解細(xì)胞糊約30分鐘。細(xì)胞碎片可以通過離心去除。如果抗體分 泌在培養(yǎng)基中，通常，首先用市售的蛋白質(zhì)濃縮濾膜(例如Amicon或Millipore Pellicon 超濾單元)將得自此類表達(dá)系統(tǒng)的上清液濃縮?？梢栽谌魏吻笆霾襟E中加入諸如PMSF這 樣的蛋白酶抑制劑以抑制蛋白酶解，并加入抗生素以阻止外來污染菌的生長。由細(xì)胞制得的抗體組合物可以利用例如羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析和親和 色譜來純化，其中親和色譜是最好的純化技術(shù)。A蛋白是否適合用作親和性配體取決于抗體 中的免疫球蛋白Fc區(qū)的種類和同種型。A蛋白可以用于純化基于人Yl、Y2或重鏈 的抗體(Lindmark等，免疫學(xué)方法雜志(J. Immunol. Meth.) 62 1-13(1983))。G蛋白可推薦 用于所有的鼠同種型和人Y 3 (Guss等，歐洲生物學(xué)雜志(EMBO) 5 1567-1575 (1986))。對 于固定親和性配體的基質(zhì)，最常用的是瓊脂糖，但是也可以用其它基質(zhì)。機(jī)械性能穩(wěn)定的基 質(zhì)例如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可以獲得比瓊脂糖更快的流率和較短的處 理時間。如果抗體包含Ch3區(qū)，可以使用BakerbondABX 樹脂(J. T. Baker, Philipshburg, NJ)來純化。根據(jù)待回收的抗體，也可以使用其它蛋白質(zhì)純化技術(shù)，例如離子交換柱分級、乙 醇沉淀、反相HPLC、硅膠柱色譜、肝素S印harose 上的色譜、陰離子或陽離子交換樹脂上的 色譜(例如聚天冬氨酸色譜柱)、層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀。
在任何初步純化步驟之后，可以對包含感興趣抗體和污染物的混合物進(jìn)行低pH 疏水性色譜，用PH在約2. 5-4. 5的洗脫緩沖液進(jìn)行，最好在低鹽濃度(例如約0-0. 25M的 鹽)下進(jìn)行。C.藥物制劑為了便于保存，可以通過將具有要求純度的抗體與任選的生理上可接受的載體、 賦形劑或穩(wěn)定劑混合，制成凍干制劑或水溶液形式的抗體治療用制劑(《雷明頓藥物科學(xué)》 (Remington' s Pharmaceutical Sciences)第 16 版，Osol，Α·編(1980))。可接受的載體、 賦形劑或穩(wěn)定劑在使用劑量和濃度對接受者是無毒的，它們包括例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和 其它有機(jī)酸的緩沖液；包括維生素C和甲硫氨酸在內(nèi)的抗氧化劑；防腐劑(例如氯化十八 烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙胺；氯化苯甲烴銨；氯化芐乙氧銨；苯酚、丁醇或芐醇；對羥 苯甲酸甲酯或丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲苯酚)；低分子量(少于約 10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯 吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖 或其它糖，其中包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA ；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海 藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子，例如鈉；金屬絡(luò)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)絡(luò)合物)；和/或非離 子表面活性劑，例如吐溫 Pluronics 或聚乙二醇(PEG)。本發(fā)明制劑還可以包含一種以上治療特殊狀況所需的活性混合物，它們最好具有 互補(bǔ)的活性但是不相互產(chǎn)生負(fù)影響(見下面的章節(jié)F)。所述分子，以適合各自預(yù)定目的所 需的有效含量相互組合?；钚猿煞葸€可以包裹在分別通過凝聚法或界面聚合法制備的例如羥甲基纖維素 或明膠膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。亦可在膠態(tài)藥物釋放系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、 白蛋白微珠、微乳液、毫微顆粒和毫微膠囊)或粗滴乳液(macroemulsion)。(《雷明頓藥物 科學(xué)》(Remington' s PharmaceuticalSciences)第 16 版，Osol，A.編(1980))中敘述了 此類技術(shù)。用于體內(nèi)使用的制劑必須是無菌的。通過滅菌濾膜過濾可以方便地做到這一點(diǎn)?？梢灾苽渚忈屩苿：线m的緩釋制劑包括例如包含所述抗體的固體疏水聚合物 的半滲透基質(zhì)體，所述的基質(zhì)體是有形的物體，例如膜或微膠囊。合適的緩釋基質(zhì)體包括 例如聚酯、水凝膠(例如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美國專 利3，773，919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸、乙酯的共聚物、非降解性乙烯乙酸乙烯酯、諸如 Lupron Depot (由乳酸-乙醇酸共聚物和leuprolide acetate組成的可注射微球)之類 可降解乳酸-乙醇酸共聚物和聚-D-(-)_3-羥基丁酸。諸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙 醇酸之類聚合物能夠使分子釋放持續(xù)100天以上，有些水凝膠可在較短的時間內(nèi)釋放蛋白 質(zhì)。當(dāng)膠囊化的抗體在體內(nèi)保留較長時間時，它們可能會因?yàn)樵?7°C接觸水分而變性或凝 聚，結(jié)果造成生物活性降低并可能造成免疫原性改變。根據(jù)有關(guān)的機(jī)制可以設(shè)計出合理的 穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)凝聚機(jī)制是通過硫_ 二硫鍵互換反應(yīng)而形成了分子間的S-S 鍵，穩(wěn)定化可以是通過修飾巰基殘基、凍干酸性溶液、控制含水量、使用合適的添加劑和設(shè) 計特殊的聚合基質(zhì)組合物而達(dá)到。D.抗體的非治療性用途本發(fā)明的抗體可以用作親和純化試劑。在這種方法中，抗體利用本領(lǐng)域公知的方法固定在例如S印hadex樹脂或?yàn)V紙的固相上。被固定的抗體與待純化的含VEGF蛋白(或 其片段)的樣品接觸，然后用合適的溶劑洗滌載體，所述的溶劑能夠基本上去除樣品中除 了與固定化抗體結(jié)合的VEGF蛋白之外所有其它物質(zhì)。最后，用另一種能將VEGF蛋白從抗 體上釋放的溶劑洗滌載體，例如pH5. O的甘氨酸緩沖液?？筕EGF抗體還可以用于VEGF蛋白的診斷性分析中，例如檢測其在特定細(xì)胞、組織 或血清中的表達(dá)。這種診斷方法可用于診斷癌癥。 用于診斷時，抗體通常用可檢測分子進(jìn)行標(biāo)記。有許多標(biāo)記可以使用，它們可以大 致如下分類(a)放射性同位素，例如35S、14C、125I、3H和1311?？梢岳美纭冬F(xiàn)代免疫學(xué)方法》 (Current Protocols in Immunology)第 1 禾口第 2 卷，Coligen 等編，Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)中所述的方法以放射性同位素來標(biāo)記抗體，放射性可以 利用閃爍計數(shù)法來測定。(b)熒光標(biāo)記，例如稀土螯合劑(銪螯合劑)或螢光素及其衍生物，羅丹明及其衍 生物，丹酰，麗絲胺，藻紅素和德克薩斯紅(Texas red)。熒光標(biāo)記可以利用例如上文《現(xiàn)代 免疫學(xué)方法》中所述的方法與抗體偶聯(lián)。熒光可以利用熒光計來定量。(c)有各種酶底物標(biāo)記可供使用，而美國專利4，275，149公開了其中部分。所述的 酶通常催化可以用各種技術(shù)測定的生色底物的化學(xué)改變。例如，酶催化底物的顏色變化，這 種變化可以用分光光度計來測定?；蛘?，酶改變底物的熒光性或化學(xué)發(fā)光性。前文已經(jīng)說 明了定量測定熒光變化的技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光底物因化學(xué)反應(yīng)而被電激發(fā)，并由此發(fā)光，發(fā)出的 光可以被測定(例如利用化學(xué)光度計)或向熒光受體供能。酶標(biāo)記包括例如螢光素酶(例 如螢火蟲螢光素酶和細(xì)菌螢光素酶；美國專利4，737，456)，螢光素，2，3- 二氫二氮雜萘二 酮(2，3-dihydrophthalazinediones)，蘋果酸脫氫酶，脲酶，過氧化物酶如辣根過氧化物酶 (HRPO)，堿性磷酸酶，β -半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶， 半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)，雜環(huán)氧化酶(例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)，乳 過氧化物酶，微過氧化物酶等。0' Sullivan等在“制備用于酶免疫分析的酶-抗體偶聯(lián)物 的力夕去，，，((Bl^^fe)) ( "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay"(Methods inEnzym. ) (J. Langone禾口H. Van Vunakis編)， Academic press, New York，73 :147_166 (1981)中描述了酶與抗體偶聯(lián)的技術(shù)。酶-底物的組合包括，例如(i)辣根過氧化物酶(HRPO)和作為底物的氫過氧化物酶，其中的氫過氧化物酶使 染料前體(例如鄰苯二胺(OPD)或鹽酸3，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB))氧化；(ii)堿性磷酸酶(AP)和作為生色底物的對硝基苯磷酸；(iii) β -D-半乳糖苷酶(β -D-Gal)和生色底物(例如對硝基苯_ β -D-半乳糖苷 酶)或熒光底物4-methylumbelIiferyl-β -D-半乳糖苷酶。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說還有許多其它酶_底物組合。對這些組合的綜述可參見美 國專利4275149和4318980。有時，標(biāo)記物與抗體間接偶聯(lián)。技術(shù)人員也知道各種獲得所述 組合的方法。例如，抗體可以與生物素偶聯(lián)，上述三大類標(biāo)記中的任何一種都可以與親和素 偶聯(lián)，或者正相反。生物素選擇性地結(jié)合親和素，標(biāo)記可以間接方式與抗體偶聯(lián)?；蛘?，為 了將標(biāo)記與抗體間接偶聯(lián)，抗體可以與小的半抗原(例如地高辛)偶聯(lián)，而上述不同類型的標(biāo)記之一與抗半抗原抗體(例如抗地高辛抗體)偶聯(lián)。這樣就獲得的標(biāo)記與抗體的間接偶
聯(lián)。 在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，抗VEGF抗體不必被標(biāo)記，其存在可以利用標(biāo)記過的結(jié) 合該VEGF抗體的抗體來檢測。本發(fā)明抗體可以用在任一種已知的分析方法中，例如競爭性結(jié)合分析，直接或間 接夾心分析和免疫沉淀分析。Zola，《單克隆抗體技術(shù)手冊》(Monoclone Antibodies =A Manual of Techniques)，pp.147-158(CRC Press, Inc.，1987)。競爭性結(jié)合分析依賴于標(biāo)記過的標(biāo)準(zhǔn)物與被測樣品中分析物競爭結(jié)合有限量抗 體的能力。被測樣品中VEGF蛋白的量與與抗體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物的量成反比。為了方便測定 被結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)物的量，通常令抗體在競爭前或競爭后不溶解，這樣就可以方便地將與抗體結(jié) 合的標(biāo)準(zhǔn)物和分析物與未結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物和分析物分離。夾心分析法涉及使用兩種抗體，各自結(jié)合待測蛋白不同的免疫原性部位或表位。 在夾心分析中，被測樣品分析物與固定在固相載體上的第一抗體結(jié)合，然后第二抗體與分 析物結(jié)合，由此形成不溶性三部分復(fù)合物。參見美國專利4，376，110。第二抗體本身可以是 用可檢測部分標(biāo)記過的(直接夾心分析法)，或者利用被可檢測部分標(biāo)記的抗免疫球蛋白 抗體來測定(間接夾心分析法)。例如，夾心分析法之一是ELISA，其中的可檢測部分是酶。對于免疫組織化學(xué)來說，腫瘤樣品可以是新鮮的或者冷凍的或者包在石蠟和以福 爾馬林之類防腐劑固定的?？贵w還可以用于體內(nèi)診斷分析。通常，以放射性核素(例如mIn、99Tc、14C、mI、125I、 3H、32p或35S)標(biāo)記抗體，使得可以利用免疫閃爍照相術(shù)來定位腫瘤。E.診斷試劑盒為了方便，本發(fā)明抗體可以試劑盒的形式提供，即將預(yù)定量的試劑與進(jìn)行診斷分 析的說明書的包裝組合在一起。如果抗體是用酶標(biāo)記的，試劑盒將包含酶所需的底物和輔 因子(例如提供可測定的生色團(tuán)和熒光團(tuán)的底物前體)。此外，還可能包括其它添加劑，例 如穩(wěn)定劑、緩沖劑(例如封閉緩沖劑或裂解緩沖劑)等。為了使所提供的試劑濃度能使得 分析的靈敏度最高，各種試劑的相對量變化很大。具體地說，試劑可以是干粉，通常是凍干 粉末形式的，可包括賦形劑在內(nèi)，它們一經(jīng)溶解將形成具有合適濃度的試劑溶液。F.抗體的治療用途對于治療用途，可將上述的在藥學(xué)上可接受的劑型中的本發(fā)明抗-VEGF抗體，用 已知方法施用于哺乳動物，最好是人。所述方法包括在靜脈內(nèi)(例如靜脈注射濃縮藥團(tuán) (bolus)或在一段時間內(nèi)連續(xù)輸注)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓腔內(nèi)、皮下、動脈內(nèi)、滑膜腔內(nèi)、 鞘內(nèi)注射、口服、局部或吸入途徑使用。抗體還可合適地通過瘤內(nèi)、瘤周圍、損傷部位內(nèi)、損 傷部位周圍的途徑給藥，以發(fā)揮局部和全身的治療效果。腹膜內(nèi)途徑預(yù)計特別有用，例如對 于治療卵巢癌。為了預(yù)防或治療疾病來說，抗體的合適劑量將取決于上述定義的待治疾病的類 型、疾病的嚴(yán)重程度和病程、抗體給予是用來預(yù)防還是用來治療、以前的治療情況、患者病 史和對抗體的應(yīng)答性，以及主治醫(yī)師的獨(dú)立判斷。抗體適合一次性或系列地給患者使用。抗-VEGF抗體可用于治療各種腫瘤和非腫瘤的疾病。可被治療的腫瘤和相關(guān)病癥 包括乳房癌、肺癌、胃癌、食管癌、結(jié)腸直腸癌、肝癌、卵巢癌、泡膜細(xì)胞瘤、卵巢男胚瘤、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜異位、纖維肉瘤、絨毛膜上皮癌、腦癌和頸癌、鼻 咽癌、喉癌、肝母細(xì)胞瘤、Kaposi氏肉瘤、黑色素瘤、皮膚癌、血管癌、海綿狀血管瘤、成血管 細(xì)胞瘤、胰腺癌、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、 成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、甲狀腺癌、 Wilm氏瘤、腎細(xì)胞瘤、前列腺瘤、與斑痣性錯構(gòu)瘤病相關(guān)的血管異常增生、水腫(如與腦瘤 相關(guān)的水腫)以及Meigs氏綜合癥?？杀恢委煹姆悄[瘤性病癥包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、動脈粥樣硬化、糖尿病， 和其他增生性視網(wǎng)膜疾病包括早熟性視網(wǎng)膜疾病、晶狀體后纖維增生癥、新生血管性青光 目艮、年齡相關(guān)性黃斑變性、甲狀腺增生(包括Grave氏病)、角膜和其他組織的移植、慢性炎 癥、肺炎、腎病綜合癥、先兆子癇、腹水、心包積液(如與心包炎相關(guān)的)和胸膜腔積液。年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是在老年人群中導(dǎo)致嚴(yán)重喪失視力的主要原因。滲出 性AMD的特征是脈絡(luò)膜的新血管生成和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的脫落。因?yàn)槊}絡(luò)膜的新血管 生成與預(yù)后劇烈惡化相關(guān)，因此，本發(fā)明的抗-VEGF抗體預(yù)期在降低AMD嚴(yán)重性方面特別有 用。根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度，不論是一次或多次分開給藥，還是連續(xù)輸注，1微克 /公斤至50毫克/公斤(例如0. 1-20毫克/公斤)的抗體是給患者使用的最初候選劑量。 典型的日劑量或周劑量可在約1微克/公斤-20毫克/公斤或以上，這取決于上述提到的 因素。對于幾天或更長時間內(nèi)的重復(fù)給藥(這取決于病況)來說，治療需持續(xù)直至疾病癥 狀發(fā)生所期望的抑制。但是，也可以使用其它給藥方案。所述治療的進(jìn)展可以方便地利用 常規(guī)技術(shù)和分析方法(例如放射性腫瘤成像技術(shù))來監(jiān)測。根據(jù)本發(fā)明的另一例子，抗體的預(yù)防或治療疾病有效性可以通過連續(xù)地施用，或 者通過與其他對該目的有效物質(zhì)聯(lián)用而提高。這些有效物質(zhì)有例如腫瘤壞死因子TNF，能 夠抑制或中和酸性或堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)或肝細(xì)胞生長因子(HGF)的血管生 成活性的抗體，能夠抑制或中和組織因子、C蛋白或S蛋白的促凝活性的抗體(見Esmon等 人，PCT專利申請出版物No. WO 91/01753,1991年2月21日出版)，能結(jié)合于HER2受體的 抗體(參見Hudziak等人，PCT專利申請出版物No. W089/06692,1989年7月27日出版)， 或一種或多種常規(guī)的治療劑例如烷基化試劑、葉酸拮抗劑、抗_核酸代謝的代謝產(chǎn)物、抗生 素、嘧啶類似物、5-氟尿嘧啶、順鉬、嘌呤核苷、胺、氨基酸、三唑核苷、或皮質(zhì)類固醇。這些其 他物質(zhì)可以存在于被施用的組合物中，或者被分開施用。此外，抗體可合適地連續(xù)施用或與 放射性治療(無論是用放射性物質(zhì)進(jìn)行輻射還是給藥)聯(lián)用。在一個例子中，用聯(lián)合療法攻擊腫瘤的血管生成。將抗體和一種或多種抗-VEGF 拮抗劑施用于腫瘤病人，用量為通過例如觀察腫瘤或轉(zhuǎn)移性病灶(如果有的話)的壞死而 確定的治療有效量。這種療法被繼續(xù)，直至觀察不到進(jìn)一步的有利效果或者臨床檢測顯示 沒有腫瘤或轉(zhuǎn)移性病灶的跡象。然后，施用TNF，或者單獨(dú)施用，或者與下列的輔助性試劑聯(lián) 用例如α-、β-或γ-干擾素，抗-HER2抗體、heregulin、抗-heregulin抗體、D-因子、 白細(xì)胞介素1 (IL-I)、白細(xì)胞介素2 (IL-2)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，或者 促進(jìn)腫瘤微血管凝結(jié)的物質(zhì)如抗-C蛋白抗體、抗-S蛋白抗體、或C4b結(jié)合蛋白(見Esmon 等人，PCT專利申請出版物No.W091/01753，1991年2月21日出版)，或者熱，或者輻射。 因?yàn)檩o助性試劑的有效性有所不同，因此需要按常規(guī)的矩陣篩選法比較其對腫瘤的影響。施用抗-VEGF抗體和TNF可重復(fù)進(jìn)行，直至達(dá)到所需的臨床效果。或者，將抗-VEGF 抗體和TNF以及任選地的輔助性試劑一起施用。當(dāng)在實(shí)體瘤位于四肢或其他懷疑與全身循 環(huán)系統(tǒng)隔開的部位時，此處公開的治療劑可被施用于隔開的腫瘤或器官。在其他例子中， 可將FGF或血小板衍生生長因子(PDGF)拮抗劑(例如抗-FGF或抗-PDGF中和抗體)與 抗-VEGF抗體一起施用于病人。在傷口愈合或需要新血管生成的期間，最好宜停止抗-VEGF 抗體治療。G.產(chǎn)品本發(fā)明另一實(shí)施方案提供了一種含有用于治療上述疾病的材料的產(chǎn)品。該產(chǎn)品包括容器和標(biāo)簽。合適的容器包括例如普通瓶、藥瓶、注射器和試管。容器可以用各種材料制 成，例如玻璃或塑料。容器中含有治療疾病的有效組合物，并具有一個無菌的出入口(例如 容器可以是一個有塞子的靜脈輸液袋或藥瓶，該塞子可用皮下注射針頭穿透)。該組合物 中的有效成份是抗VEGF抗體。容器上或與容器相聯(lián)的標(biāo)簽說明組合物所治療的特定病癥。 產(chǎn)品還可以含有另一個容器，其中包含藥學(xué)上可接受的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液、林格氏 (Ringer)溶液和葡萄糖溶液。根據(jù)商業(yè)上的需要或使用者的需要，它還可以包括其它材料， 例如其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、以及附有使用說明的包裝說明書。實(shí)施例1該實(shí)施例描述了具有有利的治療特性的人源化抗-VEGF抗體的產(chǎn)生。材料和方法鼠A4. 6. 1單克隆抗體的克隆和小鼠-人嵌合Fab的構(gòu)建鼠抗-VEGF單克隆 抗體A4. 6. 1已被描述過(Kim等人，生長因子(Growth Factors) 7，53 (1992) ；Kim等人， 自然(Nature) 362，841 (1993))。從產(chǎn)生抗-VEGF單克隆抗體A4. 6. 1的雜交瘤細(xì)胞中用 RNAsol (TEL-TEST)分離出總 RNA，然后用 oligo-dT 引物和 SuperScript II 系統(tǒng)(GIBC0 BRL, Gaithersburg, MD)反向轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)抗體輕鏈和重鏈的N端氨基酸序列，合成 簡并的寡核苷酸引物混合物，然后用作正向引物。反向引物根據(jù)從鼠輕鏈亞組kV和重鏈亞 組 II (Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th), Public Health ServiceNational Instistutes of Health，Bethesda，MD (1991))獲得的構(gòu)架 4 序列制備。在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增之后，將DNA片段連于TA克隆載體(Invitrogen， SanDiego, CA) 0對8個克隆的輕鏈和重鏈都進(jìn)行測序。一個具有輕鏈VL區(qū)共有序列的克 隆和一個具有重鏈VH區(qū)共有序列的克隆，被分別亞克隆入含人CL和CHl區(qū)的PEMX1載體 (Werther等人，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) 157 :4986_4995 (1996))，從而產(chǎn)生鼠-人嵌合抗 體。這種嵌合的F(ab)由在氨基酸SerH113處融合于人CHl區(qū)完整的鼠A4.6. IVH區(qū)以及 在氨基酸LysL107處融合于人CL區(qū)的完整的鼠A4. 6. IVL區(qū)構(gòu)成。嵌合F(ab)的表達(dá)和純 化與人源化F(ab)相同。嵌合F(ab)被用作結(jié)合測試中的標(biāo)準(zhǔn)物。鼠的和人源化F(ab)的計算機(jī)立體圖模型VL和VH區(qū)的序列(圖IA和1B)被 用來構(gòu)建鼠A4. 6. IVL-VH區(qū)的計算機(jī)立體圖模型。該模型被用來確定哪些構(gòu)架殘基應(yīng) 被引入人源化抗體。人源化F(ab)模型的構(gòu)建還被用來證實(shí)正確選擇了鼠構(gòu)架殘基。 模型的構(gòu)建按早先描述的方法進(jìn)行(Carter等人，美國科學(xué)院院報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)89 4285-4289(1992)和 Eigenbrot 等人，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.) 229 969-995(1993))。
構(gòu)建人源化的F(ab)用于誘變和在大腸桿菌中表達(dá)的質(zhì)粒PEMX1早已被描述過 (Werther等人，同上)。簡而言之，該質(zhì)粒含有編碼共有的人κ亞組I輕鏈(VLk I-CL)和 共有的人亞組III重鏈(VHIII-CH1)的DNA片段以及堿性磷酸酶啟動子。VL和VH共有序 列的使用，早已被描述過(Carter等人，同上)。
為了構(gòu)建人源化A4. 6. 1的第一個F(ab)變異體F(ab)_l，在PEMX1的含脫氧尿 苷的模板上進(jìn)行定點(diǎn)誘變(Kunkel等人，美國科學(xué)院院報(Proc. Natl. Acad. Sci.USA)82 488-492(1985))。將根據(jù)Kabat等人(同上)的6個CDR變?yōu)槭驛4. 6. 1序列。因此， F(ab)-1由完整的人構(gòu)建(VLk亞組I和VH亞組III)和6個完整的鼠⑶R序列構(gòu)成。所 有其他F(ab)變異體的質(zhì)粒是用F(ab)-1的質(zhì)粒模板構(gòu)建的。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌XL-I Blue株(Stratagene，San Diego, CA)中，以制備雙鏈和單鏈DNA。對于每種變異體，用雙 脫氧核苷酸法(Sequenase，U. S. Biochemical Corp.，Cleveland, OH)對編碼輕鏈和重鏈的 DNA進(jìn)行全部測序。質(zhì)粒被轉(zhuǎn)入大腸桿菌16C9株(這是MM294的一種衍生菌株)，接種在 Luria肉湯平板(含50微克/毫升羧芐青霉素)，然后選擇有蛋白質(zhì)表達(dá)的單一克隆。單 一克隆在5毫升Luria肉湯-100毫克/毫升羧芐青霉素中37°C生長5_8小時。將5毫升 培養(yǎng)物加至500毫升AP5-50微克/毫升羧芐青霉素中，在4升帶擋板的搖瓶中于30°C生 長20小時。AP5培養(yǎng)液是在1升水中含有1. 5克葡萄糖，11. 0克Hycase SF、0. 6克酵母提 取物(已檢驗(yàn)合格)、0. 19克MgSO4 (無水)、1.07克NH4Cl、3. 73克氯化鉀、1. 2克氯化鈉、 120毫升IM三乙醇胺，pH 7. 4，然后通過0. Imm Sealkeen過濾器滅菌過濾。細(xì)胞通過在1 升離心瓶中于3000Xg離心而收獲，上清液被棄去。在冰凍1小時后，將沉淀再懸浮于25 毫升冷的IOmM Tris-ImM EDTA_20%蔗糖，pH 8. 0中。加入250毫升0. IM苯甲脒(Sigma， St. Louis, MO)以抑制蛋白水解。在冰上輕柔攪拌3小時后，樣品在40000Xg離心15分 鐘。然后將上清液上樣于用IOmM Tris-IMM EDTA(pH 7.5)平衡過的G蛋白-S印harose CL-4B (Pharmacia, Uppsala, Sweden)柱(0. 5 毫升床體積)。柱用 10 毫升 IOmM Tris-IMM EDTA (pH 7. 5)洗滌，然后用3毫升0. 3M甘氨酸(pH 3.0)洗脫入1.25毫升IM Tris (pH 8.0) 中。用Centricon-30(Amicon，Beverly, ΜΑ)將F(ab)的緩沖液換成PBS，并濃縮至終體積 為0. 5毫升。對所有F(ab)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，以確定純度，每種變異體的分子量用 電噴質(zhì)譜法驗(yàn)證。嵌合的和人源化IgG的構(gòu)建和表達(dá)為了產(chǎn)生嵌合的(ChIgGl)和人源化 (huIgGl)A4. 6. 1的人IgGl變異抗體，將合適的鼠或人源化VL和VH區(qū)(F (ab)-12，表2)亞 克隆入早已描述過的各個pRK載體(Eaton等人，Biochemistry25 :8343-8347 (1986))。編 碼每種變異體的完整輕鏈和完整重鏈的DNA，用雙脫氧核苷酸測序法進(jìn)行驗(yàn)證。為了瞬時表達(dá)變異抗體，用高效程序(Gorman等人，DNA Prot. Eng. Tech. 2 3-10 (1990))將重鏈和輕鏈質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入人293細(xì)胞(Graham等人，J. Gen. Virol. 36 59-74(1977))。培養(yǎng)基被換成無血清型，并在5天之內(nèi)每天收獲。從合并的上清液中用A蛋 白-S印harose CL-4B (Pharmacia)純化抗體。洗脫抗體的緩沖液用Centricon-30 (Amicon) 交換成PBS，濃縮至0. 5毫升，用MiIlex-GV (Mi 11 ipore，Bedford，MA)滅菌過濾，并在4°C貯 存。為了穩(wěn)定地表達(dá)最終的人源化IgGl變異抗體(rhuMAb VEGF)，用設(shè)計的共表達(dá) 重鏈和輕鏈的雙順反子型(dicistronic)載體(Lucas等人，《核酸研究》(Nuc 1. AcidsRes.) 24 1774-79 (1996))轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。將質(zhì)粒通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法引入 DP12 細(xì)胞(這是由 L. Chasin(Columbia University)開發(fā)的 CH0-K1 DUX Bll 細(xì)胞系的 一種專有衍生株)，然后根據(jù)在無GHT的培養(yǎng)基上的生長情況而選擇(Chisholm，V. High efficiency gene transfer in mammaliancells. In :Glover,D. M. ,Hames,BD. DNA Cloning 4 Mammalian systems. OxfordUniv. Press. Oxford pp 1-41(1996))。隨機(jī)挑選出約 20 個 未擴(kuò)增的克隆，并再接種于96孔板。用ELISA監(jiān)測各菌落的相對特異性產(chǎn)量，以定量每個 孔中在3天后所積累起的全長人IgG數(shù)量，一種熒光染料Calcien AM被用作每個孔中存活 細(xì)胞的代用標(biāo)記物。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，選擇了數(shù)種未擴(kuò)增的克隆用于在氨甲蝶呤濃度逐漸增 加下進(jìn)一步擴(kuò)增。在10、50和IOOnM氨甲蝶呤下存活的各克隆被選出，轉(zhuǎn)移至96孔板以便 進(jìn)行產(chǎn)量篩選。一個重復(fù)性地表現(xiàn)出高特異性產(chǎn)量的克隆在T-燒瓶中繁殖并用于接種旋 轉(zhuǎn)培養(yǎng)基。在數(shù)次傳代后，適應(yīng)懸浮的細(xì)胞被用于接種生產(chǎn)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)物位于含GHT、 無血清并添加有各種激素和蛋白質(zhì)水解酶的培養(yǎng)基中。收獲的含rhuMAb VEGF的細(xì)胞培養(yǎng) 液，用A蛋白-S印harose CL-4B純化。該步驟后的純度約為99%。用離子交換色譜步驟進(jìn) 行隨后的純化至均質(zhì)。最終的純化抗體的內(nèi)毒素含量小于0. lOeu/mg。F(ab)和IgG的定量為了定量F(ab)分子，ELISA板用50mM碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)中的 2 微克 / 毫升羊抗-人 IgG Fab (Organon Teknika,Durham,NC)在 4°C進(jìn)行包被， 然后用PBS-0. 5%牛血清白蛋白(封閉緩沖液)在室溫下封閉1小時。標(biāo)準(zhǔn)物(0. 78-50ng/ ml人F(ab))購自Chemicon (Temecula, CA)。樣品在PBS-0. 5%牛血清白蛋白(封閉緩沖 液)-0.05%聚山梨醇酯20(分析緩沖液)作一系列稀釋，在板上孵育2小時。被結(jié)合的 F(ab)的檢測，是用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgGF(ab) (Organon Teknika)，再用3， 3,5' ,5'-四甲基聯(lián)苯胺(Kirkegaard & PerryLaboratories, Gaitherburg, MD)作為 底物。在各步驟之間板被洗滌。吸光度是在Vmax板閱讀器(Molecular Devices, Menlo Park, CA)上于450納米處讀取。標(biāo)準(zhǔn)曲線用四參數(shù)非線性回歸曲線擬合程序進(jìn)行擬合。 在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)點(diǎn)被用來計算樣品的F(ab)濃度。全長抗體濃度的確定，是用羊 抗-人IgGFc (Cappel，Westchester, PA)進(jìn)行捕獲并用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗-人 Fc (Cappel)進(jìn)行檢測。人的IgGl(Chemicon)被用作標(biāo)準(zhǔn)物。VEGF結(jié)合分析為了測量F (ab)的VEGF結(jié)合活性，ELISA板用2微克/毫升針對 人 IgG Fc 的羊抗-人 IgG F(ab‘ )2(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)進(jìn)行包 被，然后用上述的封閉緩沖液封閉。加入用封閉緩沖液配的含3ng/mlKDR-IgG(Park等人， 生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 269 =25646-25645(1994))的稀釋條件培養(yǎng)液，在板上孵育1 小時。將標(biāo)準(zhǔn)物(6. 9-440ng/ml嵌合的F(ab))和2倍系列稀釋的樣品與2nM生物素化的 VEGF在管中一起孵育1小時。然后將管中的溶液轉(zhuǎn)移至ELISA板并孵育1小時。洗滌后， 檢測結(jié)合于KDR的生物素化VEGF，其中用辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(Zymed，South San Francisco，CA或Sigma，St. Louis，MO)，再用 3，3，5'，5'-四甲基聯(lián)苯胺作為底物。效 價曲線用四參數(shù)非線性回歸曲線擬合程序(KaleidaGraph，Synergy Software, ReadingPA) 進(jìn)行擬合。計算對應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)效價曲線中點(diǎn)吸光度的F(ab)變異抗體的濃度，然后除以對應(yīng) 于標(biāo)準(zhǔn)效價曲線中點(diǎn)吸光度的標(biāo)準(zhǔn)物濃度。對全長IgG的分析與F(ab)相同，不同點(diǎn)在于 分析緩沖液含有10%人血清。BIAcore 生物傳感器分析用BIAcore 生物傳感器(Karlsson等人，Methods =AComparison to Methods in Enzymology 6:97—108(1994))比較人源化的禾口嵌合的 F(ab) 的VEGF結(jié)合性。F (ab)的濃度用定量氨基酸分析加以確定。按制造商的說明(Pharmacia)， 通過伯胺基團(tuán)將VEGF偶聯(lián)于CM-5生物傳感器芯片。解離速率(off-rate)動力學(xué)的測量 是通過用F(ab) (35微升2μΜ F(ab)，流速為20微升/分鐘)飽和芯片然后切換至緩沖液 (PBS-0.05%聚山梨醇酯20)。0-4500秒的數(shù)據(jù)點(diǎn)被用作解離動力學(xué)分析。通過ln(R0/ R)-時間曲線的斜率，獲得解離速率常數(shù)(k。ff)，其中RO是在t = O時的信號，而R是各時 間點(diǎn)時的信號。結(jié)合速率(on-rate)動力學(xué)是用F(ab)的2倍系列稀釋液(0. 0625_2mM)進(jìn)行測 量的。對于每種F(ab)濃度，用BIAcore 動力學(xué)評估軟件按Pharmacia生物傳感器手冊中 所述的方法，從ln(-dR/dt)_時間曲線得出斜率Ks。R是在時間t時的信號。在80與168、 148、128、114、102 和 92 秒之間的數(shù)據(jù)分別用于 0. 0625,0. 125,0. 25,0. 5、1 和 2mM F(ab)。 結(jié)合速率常數(shù)(K。n)是通過Ks-F(ab)濃度曲線的斜率而得出。在每輪循環(huán)結(jié)束時，通過注 入5微升50mM鹽酸(流速20微升/分鐘)去除結(jié)合的F (ab)，從而使芯片再生。內(nèi)皮細(xì)胞生長分析基本上按以前所述的方法(Leung等人，科學(xué)(Science) 246 1306-1309 (1989))，在補(bǔ)充有10%牛血清、2mM谷氨酰胺和抗生素的低葡萄糖Dulbecco改 良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM) (GIBCO)(生長培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)牛腎上腺皮質(zhì)衍生毛細(xì)血管內(nèi)皮 細(xì)胞。對于促有絲分裂分析，將內(nèi)皮細(xì)胞以6 X IO3細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板的生長培養(yǎng) 基中。muMAb VEGF A4. 6. 1 或 rhuMAb VEGF 的加入濃度為 l_5000ng/ml。在 2-3 小時后，力口 入純化的大腸桿菌表達(dá)的rhVEGF165至終濃度為3ng/ml。對于特異性對照，以每種抗體以 5000ng/ml的濃度加至內(nèi)皮細(xì)胞，或者單獨(dú)加入，或者在2ng/ml bFGF存在下加入。在5或6 天之后，通過暴露于胰蛋白酶而使細(xì)胞解離，并在Coulter計數(shù)器(Coulter Electronics, Hialeah, FL)上計數(shù)。用四常數(shù)曲線擬合程序(KaleidaGraph)分析數(shù)據(jù)。體內(nèi)腫瘤研究按以前所述的方法，在補(bǔ)充有10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺和 抗生素的DMEM/F12中培養(yǎng)人A673成橫紋肌細(xì)胞瘤細(xì)胞(ATCC ；CRL1598) (Kim等人， 自然(Nature) 362 :841_844 (1993)和 Borgstrom 等人，癌癥研究(Cancer Res.) 56 4032-4039(1996))。將6_10周齡的雌性BLAB/c裸鼠，在背部區(qū)域皮下注射200微升體積、 2 X IO6個腫瘤細(xì)胞。然后用muMAb VEGFA4. 6. 1、rhuMAb VEGF或針對gpl20蛋白的對照單 克隆抗體處理動物(Kim等人，自然(Nature) 362 :841_844 (1993))。兩種抗-VEGF單克隆 抗體的施用劑量是0. 5和5mg/kg ；而對照單克隆抗體的給藥劑量是5mg/kg。在腫瘤細(xì)胞接 種開始后24小時，每種單克隆抗體在腹膜內(nèi)一周施用2次，體積各為100微升。每組由10 只小鼠構(gòu)成。每周測定腫瘤大小。在腫瘤細(xì)胞接種4周后，動物被安樂死亡，然后取出腫瘤 并稱量。用ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果
人源化人重鏈亞組III和輕鏈亞組κ I的共有序列被用作人源化構(gòu)架(Kabat等 人，同上)(圖IA和1B)。該構(gòu)架已經(jīng)被成功地用于使其他鼠抗體人源化(Werther等人，同 上；Carter 等人，同上；Presta 等人，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) 151 :2623_2632 (1993)；和 Eigenbrot 等人，Proteins，18 :49_62 (1994))。CDR-Hl 包括殘基 H26-H25。其他 CDR 根據(jù) Kabat等人(同上)。所有的人源化變異抗體最初以大腸桿菌中表達(dá)的F(ab)形式制備，然 后根據(jù)結(jié)合性進(jìn)行篩選。500毫升搖瓶的典型產(chǎn)量是0. 1-0. 4毫克F(ab)。
嵌合的F(ab)被用作結(jié)合分析中的標(biāo)準(zhǔn)物。在最初的變異抗體F(ab)_1中，CDR 殘基被從鼠抗體轉(zhuǎn)移到人構(gòu)架上，并且根據(jù)鼠和人源化F(ab)模型將H49位殘基(在人中 為Ala)改為鼠的Gly。此外，產(chǎn)生了由嵌合重鏈/F(ab)_1輕鏈構(gòu)成的F(ab) (F(ab)_2)和 由F(ab)_l重鏈/嵌合輕鏈構(gòu)成的F(ab) (F(ab)-3)，并測試其結(jié)合性。F(ab)_l的結(jié)合親 和力比嵌合F (ab)高100倍(表2)。F (ab)-2和F (ab)-3之間結(jié)合親和力的比較提示，在 F (ab)-IVH區(qū)中的構(gòu)架殘基需要被改變以提高結(jié)合力。表2 人源化抗-VEGF F (ab)變異抗體對VEGFa的結(jié)合 3抗-VEGF F(ab)變異抗體與生物素化的VEGF —起孵育，然后轉(zhuǎn)移至包被有 KDR-IgG (Park 等人，同上)的 ELISA 板b鼠殘基帶下劃線；殘基編號根據(jù)Kabat等人(同上)。c平均值和標(biāo)準(zhǔn)差是各獨(dú)立分析中計算出的比率的平均值；嵌合F(ab)的EC50是 0. 049士0. 013mg/ml(l. OnM)在F(ab)_4中將人殘基H71和H73改為其鼠中對應(yīng)的殘基，使結(jié)合力提高了 4倍(表2)。對鼠和人源化F(ab)模型的研究揭示，包埋在VL-VH界面中并且與⑶R-H3作用的 殘基L46(圖2)，可能在確定CDR-H3的構(gòu)型和/或影響VL和VH區(qū)相互關(guān)系方面起作用。 在L46中當(dāng)鼠的Val與人的Leu交換(F(ab)-5)，結(jié)合親和力增加了近4倍(表2)。3個 其他的包埋構(gòu)架殘基也根據(jù)分子模型進(jìn)行了評估H49、H69和H78。H69位可影響⑶R-H2 構(gòu)型，而H78位可影響CDR-Hl構(gòu)型(圖2)。當(dāng)各殘基從人的變?yōu)槭蟮膶?yīng)殘基時，在每種 情況下都使結(jié)合力增加了 2倍爾(油)-6和？(油)-7，表2)。當(dāng)兩者同時改變時，結(jié)合力增 加了 8倍(F(ab)-8，表2)。最初包含的H49殘基是鼠的Gly ；當(dāng)變?yōu)槿斯灿械膶?yīng)殘基Ala 時，結(jié)合力下降了 15倍(F(ab)-9，表2)。在F(ab)_10和F(ab)_ll中，構(gòu)架環(huán)3(FR_3)中的兩個殘基被變?yōu)槭蟮膶?yīng)殘基 AsnH76被變?yōu)槭骃er (F (ab)-10)和LysH75被變?yōu)槭驛la (F (ab)-11)。兩種變化都使結(jié)合力 有小幅提高(表2)。最后，在H94位，人和鼠序列最常見的是Arg(Kabat等人，同上)。在 F (ab) -12中，該精氨酸被鼠抗體(圖1)中罕見的Lys所替換，而這導(dǎo)致結(jié)合力比嵌合F (ab) 小2倍(表2)。還用BIAcore 系統(tǒng)(Pharmacia)將F (ab)-12與嵌合F (ab)作比較。用該 技術(shù)，人源化F(ab)-12的Kd因?yàn)楦?、和更快?^而比嵌合F(ab)弱2倍(表3)。表3 用BIAcore 系統(tǒng)測得的抗-VEGF F (ab)變異抗體與VEGF的結(jié)合 a以共振單位(RU)表示的F(ab)結(jié)合量，是將2微克F(ab)注射到含2480RU固 定化VEGF的芯片上，用BIAcore 系統(tǒng)進(jìn)行測量。解離速率動力學(xué)(k。ff)的測量是通過用 F(ab)來飽和芯片，然后在切換緩沖液之后檢測解離情況。結(jié)合速率動力學(xué)(k。n)的測量是 用F(ab)的2倍系列稀釋液。平衡解離常數(shù)Kd按k。ff/k。n進(jìn)行計算。bChim-F (ab)是嵌合的F (ab)，其中鼠VL和VH區(qū)被融合于人的CL和CHl重鏈區(qū)。全長單克隆抗體的構(gòu)建是通過將嵌合F (ab)和變異抗體F (ab) _12的VL區(qū)和VH區(qū) 融合于人κ輕鏈和人IgGl重鏈的恒定區(qū)。全長的12-IgGl(F(ab)-12融合于人IgGl)表 現(xiàn)出的結(jié)合力比嵌合IgGl弱1.7倍(表4)。12-IgGl和嵌合IgGl兩者的結(jié)合力都稍弱于 原始的鼠單克隆抗體A4. 6. 1 (表4)。表4抗-VEGF IgG變異抗體與VEGF的結(jié)合情況 a抗-VEGF IgG變異抗體與生物素化的VEGF —起孵育，然后轉(zhuǎn)移至包被有 KDR-IgG (Park 等人(1994)，同上)的 ELISA 板。bChIgGl是嵌合的IgGl，其中鼠的VL和VH區(qū)被融合于人CL和IgGl重鏈；chlgGl 的EC50 是 0. 113 士 0. 013 微克 / 毫升(0. 75nM)。cmurIgGl 是從腹水中純化出的 muMAb VEGF A4. 6. 1。d12-IgGl是將F(ab)_12的VL和VH區(qū)融合于人CL和IgGl重鏈。 生物學(xué)研究比較rhuMAb VEGF和muMAb VEGF A4. 6. 1在接近VEGF最大有效濃度 (3ng/ml)下對牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制能力。如圖3所示，這兩種單克隆抗體在效 能和效力方面基本上相近。ED50值分別為50士 5ng/ml和48士8ng/ml (約3nM)。在兩種情 況下，在約500ng/ml (約3nM)的濃度下達(dá)到了 90%抑制。rhuMAb VEGF A4. 6. 1和muMAb VEGF A4. 6. 1兩者對基底或bFGF-刺激的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖都沒有效力，這證實(shí)了 這種抑制作用是對VEGF特異的。為了確定這種等價性是否適用于體內(nèi)系統(tǒng)，比較了兩種抗體在裸鼠中抑制人A673 成橫紋肌細(xì)胞瘤細(xì)胞生長的能力。早先的研究已表明，muMAbVEGF A4. 6. 1對這種腫瘤模型 有強(qiáng)抑制效應(yīng)(Kim等人，自然(Nature)362 =841-844(1993)和Borgstrom等人，癌癥研究 (Cancer Res.) 56 =4032-4039 (1996))。如圖4所示，在兩種測試劑量(0. 5和5毫克/千 克)下，通過在細(xì)胞接種后4周測量腫瘤重量加以評估，兩種抗體都顯著抑制了腫瘤生長。 與對照組相比，用muMAbVEGF A4. 6. 1在各劑量下處理的動物其腫瘤重量分別下降85%和 93%，用rhuMAb VEGF處理的動物其腫瘤重量各下降90%和95%。用乳房癌細(xì)胞系MDA-MB 435，也獲得了類似的結(jié)果。實(shí)施例2在該實(shí)施例中，對上述的鼠抗-VEGF抗體A4. 6. 1如下進(jìn)行人源化通過使一小組 構(gòu)架殘基隨機(jī)變化以及通過將形成的抗體分子文庫在絲狀噬菌體表面上單價展示出來，以 便用基于親和力的選擇法鑒別出高親和力的構(gòu)架序列。材料和方法構(gòu)建抗-VEGF抗體的噬菌粒載體pMB4-19 鼠抗-VEGF單克隆抗體A4. 6. 1如實(shí)施例1中所述。A4. 6. 1的第一個人源化Fab 變異體hu2. 0是這樣構(gòu)建的對編碼人V^ I-CK1輕鏈和人VhIII-ChI υ ！重鏈Fd片段的 質(zhì)粒ΡΑΚ2的含脫氧尿苷的模板進(jìn)行定點(diǎn)誘變(Carter等人，美國科學(xué)院院報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)89，4285-4289 (1992))。根據(jù)Kabat等人(同上)中的序列定義，選擇被 移植的A4. 6. 1的CDR序列，除T CDR-Hl之外(CDR-H1包括殘基26-35)。Fab編碼序列 被亞克隆入噬菌粒載體 phGHamg3(Bass 等人，Proteins，8，309-314 (1990) ；Lowman 等人， Biochemistry. 30 10832-10838 (1991))。該構(gòu)建物 pMB4_19 編碼最初的人源化 A4. 6. 1 的 Fab (即hu2. 0)，其中重鏈的C末端被精確地融合于M13基因III外被蛋白的羧基部分。 PMB4-19這個構(gòu)建物的構(gòu)建與PDH188 ( 一種早已描述過的用于單價展示Fab片段的質(zhì)粒 (Garrard 等人，Biotechnology. 9 1373-1377 (1991)))相似。pMB4_19 與 pDH188 之間的明 顯區(qū)別包括更短的M13基因III片段(密碼子249-406)以及使用緊跟在抗體重鏈Fd片段 之后的琥珀終止密碼子。這樣可以在大腸桿菌的supE抑制型菌株中表達(dá)分泌的重鏈或重 鏈_基因III融合蛋白兩種物質(zhì)。
人源化A4. 6. IFab片段的表達(dá)和純化用噬菌粒pMB419或其變異噬菌粒來轉(zhuǎn)化大 腸桿菌34B8菌株(一種非抑制型菌株)。單菌落在5毫升含50微克/毫升羧芐青霉素的 2YT培養(yǎng)基中37°C生長過夜。將這些培養(yǎng)物稀釋于200毫升含20微克/毫升羧芐青霉素 的AP5培養(yǎng)液(Chang等人，Gene，55，189-196 (1987))，然后在30°C孵育26小時。細(xì)胞在 4000 Xg下離心，在-20°C下冷凍至少2小時。然后將細(xì)胞沉淀再懸浮于5毫升含ImM EDTA 的IOmM Tris-HCl (pH7. 6)中，在4°C振蕩90分鐘，然后在10，000 X g下離心15分鐘。上 清液被加至1毫升鏈球菌G蛋白-S印harose柱(Pharmacia)上，用10毫升IOmM MES(pH 5. 5)洗滌。結(jié)合的Fab片段用2. 5毫升IOOmM乙酸洗脫并立刻用0. 75毫升IM Tris-HCl, PH 8. 0中和。Fab制劑的緩沖液被換成PBS，然后用CENTRIC0N-30濃縮器(Amicon)濃縮。 在G蛋白純化之后，典型的Fab產(chǎn)量約為1毫克/升培養(yǎng)物。純化的Fab樣品用電噴射質(zhì) 譜法加以確定，而濃度用氨基酸分析確定。構(gòu)建抗-VEGFFab 噬菌粒文庫按照 Kunkel 等人，Methods Enzymo 1. 204， 125-139(1991)的方法，通過定點(diǎn)誘變而構(gòu)建人源化A4. 6. 1噬菌粒文庫。制備用作誘變模 板的PMB4-19的衍生質(zhì)粒，它在Vh的密碼子24、37、67和93處含有TAA終止三聯(lián)體密碼 (所有的序列編號按照Kabat等人，同上)。這種修飾可防止以后野生型序列所造成的背景 污染。定點(diǎn)隨機(jī)變化的密碼子是4和71(輕鏈)，以及24、37、67、69、71、73、75、76、78、93和 94(重鏈)。為了用一個誘變寡核苷酸來使重鏈密碼子67、69、71、73、75、76、93和94隨機(jī)化，2 個126-聚物的寡核苷酸先通過模板協(xié)助式酶連接法用60-聚物和66-聚物的片段預(yù)組裝 成。具體地講，將1. 5nmol 5'磷酸化的寡核苷酸503-1 (5‘ -GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TCT AGA GAC AACTCC AAA AAC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC-3' (SEQ ID NO 22))或503-2(5' -GAT TTC MA CGT CGT NYT ACT WTT TCT TTA GAC ACC TCCGCA AGC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC-3' (SEQ ID NO 23))與 1. 5nmol 503-3(5' -AGC CTG CGC GCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TACTGT JM ARG TAC CCC CAC TAT TAT GGG-3' (SEQ ID NO 24))混合。隨機(jī)化的密碼子帶下劃線，而N表示A/G/T/C ；W表示A/T ；B表示G/T/C ；D表示 G/A/T ；R表示A/G ；而Y表示C/T。然后，加入1. 5nmol模板寡核苷酸(5' -CTC AGC GCG CAG GCT GTT CAT CTG CAG GTA-3‘ (SEQ ID NO 25))(具有與 503-1/2 的 5'端以及 503-3 的 3'端互補(bǔ)的序列)，使其與連接接頭處的各末端雜交。向該混合物中，加入Taq連接酶(New England Biolabs的耐熱連接酶)和緩沖液，反應(yīng)混合物經(jīng)過40輪熱循環(huán)(95°C 1. 25分鐘 和50°C 5分鐘)，從而使模板寡核苷酸在連接的和未連接的接頭之間循環(huán)。產(chǎn)物126-聚物 寡核苷酸在6%尿素/TBE聚丙烯酰胺凝膠上純化，然后以緩沖液從聚丙烯酰胺膠上提取出 來。將兩個126-聚物產(chǎn)物等比例地混合，乙醇沉淀，最后溶解在IOmM Tris-HCl, ImM EDTA 中。將混合的126-聚物寡核苷酸產(chǎn)物標(biāo)記為504-01。
在兩個步驟中實(shí)現(xiàn)對選定構(gòu)架密碼子(Vl的4、71 ；Vh的24、37、67、69、71、73、75、 76,93和94)的隨機(jī)誘變。首先，通過制備修飾的pMB4-19模板的另外3個衍生模板而實(shí) 現(xiàn)Vl的隨機(jī)化。輕鏈的構(gòu)架密碼子4和71，用兩個誘變寡核苷酸5' -GCT GAT ATC CAG TTG ACC CAG TCCCCG-3‘ (SEQ ID NO 26)和 5' -TCT GGG ACG GAT TAC ACT CTG ACC ATC-3' (SEQ ID NO 27)單個地或成對地予以替換。從每個新的衍生模板制備含脫氧尿苷 的模板。與最初的模板一起，這4個構(gòu)建物編碼輕鏈構(gòu)架序列4種可能組合中的每一種組合(見表5)。用寡核苷酸504-1 (2種126-聚物寡核苷酸的混合物(見上面))以及5_' CGT TTG TCC TGT GCA RYT TCT GGC TAT ACC TTC ACC AAC TAT GGTATG AAC TGG RTC CGT CAG GCC CCG GGT AAG-3' (SEQ ID NO :28)，在用剛才所述的4種模板中的一種模板時使重鏈 構(gòu)架密碼子隨機(jī)誘變。將4種文庫電穿孔導(dǎo)入大腸桿菌XL-IBLUE細(xì)胞(Stratagene)并合 并。各種轉(zhuǎn)化子的總數(shù)估計> 1.2X108，比文庫中的DNA序列最大數(shù)約大1500倍。已開發(fā)了各種不同的系統(tǒng)用于在絲狀噬菌體表面上功能性地展示抗體片段(Winter等人，Ann. Rev. Immunol. 12，433 (1994))。它們包括以融合于M13噬菌體基因III 或基因VIII包被蛋白的融合蛋白形式，來展示Fab或單鏈Fv(SCFV)片段。本文所選的系 統(tǒng)與Garrard等人，Biotechn. 9 1373-1377 (1991)所述的系統(tǒng)相似，其中Fab片段以基因 III融合物形式被單價地展示(圖7)。該系統(tǒng)有兩個顯著特征。具體地講，與scFv不同， Fab片段沒有形成二聚體物質(zhì)的傾向，而二聚體的存在會因親合效應(yīng)而阻礙選出最強(qiáng)的結(jié) 合物。此外，被展示蛋白質(zhì)的單價性消除了第二種親合效應(yīng)的潛在來源，而原本在每個噬 菌粒顆粒上存在一個蛋白的多個拷貝會產(chǎn)生這種親合效應(yīng)(Bass and Wells,Proteins,8, 309 (1990) ；Lowman 等人，Biochem. 30，10832 (1991))。使展示人源化A4. 6. IFab片段的噬菌粒顆粒，在大腸桿菌XL-IBlue細(xì)胞中繁殖。 簡而言之，使攜帶隨機(jī)化PMB4-19構(gòu)建物的細(xì)胞，在25毫升含50微克/毫升羧芐青霉素和 約101QM13K07輔助噬菌體的2YT培養(yǎng)基中，37°C生長過夜(Vieira and Messing, Methods Enzymo 1. 153，3 [1987])。用聚乙二醇鹽水溶液沉淀培養(yǎng)上清液純化噬菌粒原液，然后重懸 于100微升PBS中(約IO14噬菌粒/毫升)。選擇人源化的A4. 6. IFab變異體將純化的VEGF121 (100微升，10微克/毫升PBS) 包被微量滴定板孔，4°C過夜。棄去包被溶液，用6%脫脂奶封閉這個孔以及未包被的孔1 小時，并用含0.05%吐溫20(洗滌劑)的PBS洗孔，然后每孔加入噬菌粒原液10微升(用 含BSA和0. 05%吐溫20的20mM Tris, pH7. 5稀釋至100微升)。2小時后洗滌各孔， 然后用100微升0. IM甘氨酸(pH2. 0)洗脫結(jié)合的噬菌體并用25微升IM Tris pH8. 0液中 和，取其等份用于洗脫噬菌體數(shù)目的滴定。從VEGF包被孔上洗脫下的留存噬菌體被繁殖， 以用于下一輪選擇循環(huán)?？傆嬤M(jìn)行了 8輪選擇，之后20個克隆可以被選出并測序(Sanger 等人，美國科學(xué)院院報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)，74，5463 (1977))。測定VEGF的結(jié)合親和力通過表面胞質(zhì)團(tuán)共振法(surface plasmonresonance) (Karlsson 等人，J. Immun. Methods 145，229-240 (1991))，在 Pharmacia BIAcore 儀器上測 定了人源化A4. 6. IFab變異體與VEGF121結(jié)合的結(jié)合速率常數(shù)(k。n)和解離速率常數(shù)(k。ff)。 VEGF121通過伯氨基而共價固定于生物傳感器芯片上。人源化A4. 6. IFab變異體的結(jié)合性的 測定，是通過將Fab (以PBS/0. 05% TWEEN-20 (去污劑)配)溶液以20微升/分鐘的流速 流過芯片。在每次結(jié)合測量之后，用5微升50mM鹽酸水溶液以3微升/分鐘速度洗滌，從 而將殘留的Fab從固相化的配體上脫下。用簡單的單價結(jié)合模式(BIAevaluation軟件2.0 版；Pharmacia)，通過非線性回歸法分析結(jié)合曲線。結(jié)果構(gòu)建人源化A4. 6. 1抗體構(gòu)建最初的人源化A4. 6. IFab片段(hu2. 0，圖5A和5B)， 其中A4. 6. 1的⑶R被移植于人的V^ I-VhIII構(gòu)架上。hu2. 0中所有其他的殘基都保留與人序列相同。該最初的人源化抗體與VEGF的結(jié)合力如此之弱，以致于無法檢測。根據(jù)其他 弱結(jié)合的人源化A4. 6. 1變異體的相對親和力，hu2. O的結(jié)合Kd估計大于7 μ Μ。這與嵌合 Fab構(gòu)建物(由鼠Α4. 6. 1的完整\和Vh區(qū)和人的恒定區(qū)所構(gòu)成)的1. 6ηΜ親和力形成了 反差。因此，hu2. O與VEGF的結(jié)合比嵌合抗體下降了至少4000倍。設(shè)計抗體文庫在本發(fā)明中對人構(gòu)架序列進(jìn)行構(gòu)架改變的一組殘基列于表5和圖 6。表5 對于抗原結(jié)合至關(guān)重要以及作為定點(diǎn)隨機(jī)變化目標(biāo)的關(guān)鍵性構(gòu)架殘基 a在噬菌粒文庫中的氨基酸多樣性bVa 71、73、75、76被隨機(jī)化以產(chǎn)生全鼠(L71/T73/A75/S76)或全人(R71/D73/K75/ N76)的 VhIII 四聯(lián)體(tetrad)在設(shè)計人源化A4. 6. 1噬菌粒文庫時的一個著眼點(diǎn)是，定點(diǎn)隨機(jī)化的目標(biāo)殘基是 廣泛分布于\和Vh序列中的。合成的寡核苷酸長度方面的限制，要求這些構(gòu)架部位各點(diǎn)同 時進(jìn)行隨機(jī)化只能通過使用多個寡核苷酸而實(shí)現(xiàn)。然而，隨著寡核苷酸總數(shù)的增加，誘變的 效率(即獲摻入了所有誘變寡核苷酸序列的突變體的比例)會下降。為了巧妙地克服這一 問題，在文庫構(gòu)建中引入兩個特征。第一個特征是制備4個不同的、編碼每種可能的\構(gòu) 架組合的誘變模板。由于輕鏈構(gòu)架的多樣性很有限(僅4種不同序列)，這是簡單可行的， 但是其優(yōu)點(diǎn)是不再需要使用誘變策略的兩種寡核苷酸。第二，兩個126堿基的寡核苷酸用 更小的合成片段預(yù)組裝成。這樣可以用一個長寡核苷酸而不是用兩個較短的寡核苷酸隨機(jī) 誘變Vh密碼子67、69、71、73、75、76、93和94。因此，最終的隨機(jī)誘變策略是在4種不同模板上同時采用僅兩種寡核苷酸。選擇牢固結(jié)合的人源化A4. 6. IFab'根據(jù)與VEGF的結(jié)合性選出人源化的 A4. 6. IFab噬菌粒文庫的變異體。通過比較VEGF包被的和未包被的微量滴定板孔中所洗脫 出的噬菌體效價，確定功能性噬菌粒的富集程度，在7輪親和力淘選之內(nèi)富集程度是增加 的。在又一輪挑選之后，對20個克隆進(jìn)行測序以鑒定在每個隨機(jī)化位點(diǎn)處選出的優(yōu)選構(gòu)架 殘基。這些結(jié)果總結(jié)于表6，揭示出在所選的克隆之間有強(qiáng)共有序列。20個克隆中的10個 有相同的DNA序列，命名為h2. 10。在13個被隨機(jī)化的構(gòu)架位置中，在hu2. 10中選出了 8 個取代(Vl71 ；Vh 37、71、73、75、76、78 和 94)。有趣的是，選出的殘基乂11 37(Ile) ^P 78 (Val) 既不是人VhIII的也不是鼠A4. 6. 1序列的。這個結(jié)果提示，通過將多樣性擴(kuò)展至靶定的人 和親代鼠構(gòu)架序列之外，可以使某些構(gòu)架位置受益。表6從人源化A4. 6. 1噬菌粒Fab文庫中選出的序列 Hu2. 0和鼠A4. 6. 1抗體之間的區(qū)別用下劃線標(biāo)出。對于每種噬菌體選出序列 相同的克隆數(shù)目在括號中標(biāo)出。在噬菌體選出的克隆序列中的破折號表示選出的是人 V1 κ I-VhIII構(gòu)架序列(即與hu2. 0中相同)。在被分析的其余10種克隆中，有另外4種獨(dú)特的氨基酸序列hu2. I、hu2. 2、hu2. 6 和hu2. 7。除了 hu2. 10之外，所有這些克隆在位置Vh 37 (Ile),78 (Val)和94 (Lys)處含有 相同的構(gòu)架取代，但是在位置24和93保留了 AVhIII共有序列。4個克隆丟失了輕鏈編碼 序列，在噬菌體ELISA試驗(yàn)(Cunningham等人，EMBO J. 13，2508-251 (1994))中測試時不結(jié) 合于VEGF。通過減少選擇循環(huán)次數(shù)或者通過在固相培養(yǎng)基上繁殖文庫，常可最大程度減少 這種人為現(xiàn)象。人源化A4. 6. 1變異抗體的表達(dá)和結(jié)合親和力用搖瓶在大腸桿菌中表達(dá)噬菌體選出的變異體hu2. I、hu2. 2、hu2.6、hu2. 7和hu2. 10，然后用G蛋白親和層析從周質(zhì)提取物 中純化得到Fab片段。這5種克隆的Fab回收產(chǎn)率在0.2 (hu2. 6)-1.7毫克/升(hu2. 1)之 間。這些變異體對抗原(VEGF)的親和力用表面胞質(zhì)團(tuán)共振法在BIAcore儀器上測定(表 7)。對這些結(jié)合數(shù)據(jù)的分析揭示，在5種被測試的變異體中，共有序列的克隆hu2. 10對VEGF 具有最高親和力。因此，F(xiàn)ab噬菌粒文庫選擇性富集了結(jié)合最牢的克隆。計算出的hu2. 10 的Kd是55nM，至少比沒有構(gòu)架變化的hu2. 0 (KD > 7 μ Μ)結(jié)合牢固125倍。其他4種選出 的變異體都表現(xiàn)出與VEGF的弱結(jié)合，最弱的(hu2.7)低至Kd為360nM。有趣的是，hu2. 6 的Kd是67nM，只比hu2. 10略低，但是在20個被測序克隆中發(fā)現(xiàn)此克隆只有一個拷貝。這 可能是因?yàn)楸磉_(dá)和展示的水平較低，正如表達(dá)該變異體的可溶性Fab時一樣。然而，盡管表 達(dá)率較低，該變異體仍可用作人源化抗體。表7人源化A4. 6. IFab變異體的VEGF結(jié)合親和力 *Hu2. IOV =具有\(zhòng) Leu46 — Val突變的Hu2. 10 ；估計在Biacore結(jié)合測量值中的 誤差為士25% ；**太弱以致于無法測量，更低結(jié)合的估計值人源化變異抗體hu2. 1的進(jìn)一步改進(jìn)盡管抗原親和性已比最初的人源化變異體 有了大幅提高，hu2. 10與VEGF的結(jié)合仍比含有鼠A4. 6. IVl和Vh區(qū)的嵌合Fab片段弱35倍。 這種相當(dāng)大的差別提示，可通過額外的突變使人源化構(gòu)架進(jìn)一步優(yōu)化。在Foote & Winter 等人，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.) 224，487-499 (1992)所鑒別的游標(biāo)殘基中，僅殘基Vl 46、Vh2和Vh48在A4. 6. 1和人V1 κ I-VhIII構(gòu)架之間是不同的(圖5Α和5Β)但在我們的噬 菌粒文庫中沒有被隨機(jī)變化。人源化Α4. 6. IFv片段的分子模型顯示，Vl 46位于Vh界 面處而且可能影響CDR-H3的構(gòu)型。此外，該氨基酸在大多數(shù)V1 κ構(gòu)架中幾乎總是亮氨酸 (Kabat等人，同上)，但是在Α4. 6. 1中是纈氨酸。因此，在hu2. 10的基礎(chǔ)上在該位置進(jìn)行了 Leu — Val取代。對該新變異體hu2. IOV的結(jié)合動力學(xué)分析表明，與VEGF結(jié)合的Kd又提高T 6倍。這表明在抗體A4. 6. 1的Vl46位上纈氨酸的重要性。這樣，hu2. IOV的Kd (9. 3nM) 就在嵌合體Kd的6倍之內(nèi)。與\ 46相反，將乂11 2或乂11 48殘基用鼠A4. 6. 1的相應(yīng)殘基進(jìn) 行替換時，未見hu2. 10結(jié)合親和力的提高。實(shí)施例3在該實(shí)施例中，通過使用以下手段來提高人源化抗-VEGF抗體的親和力⑶R隨機(jī) 變化、通過單價Fab噬菌體展示進(jìn)行的親和力突變、以及將突變累積組合起來。構(gòu)建人源化抗體ρΥΟΙΟΙ 將噬菌體展示的抗體載體phMB4-19_l. 6(見圖8A-8F) 用作親代載體。在該構(gòu)建物中，抗-VEGF是以Fab片段形式表達(dá)，其中它的重鏈被融合于截 斷的g3p的N端。輕鏈和重鏈兩者都在phoA啟動子和上游StII周質(zhì)分泌信號序列的控制 之下。在CDR區(qū)之外的點(diǎn)突變是用下表8所示寡核苷酸通過定點(diǎn)誘變法進(jìn)行，以改善VEGF 的親和力寡核苷酸 HL-242、HL-243、HL-244、HL-245、HL-246、和 HL-242。表8 用于定點(diǎn)誘變的寡核苷酸 形成的變異體被命名為YOlOl (圖9A和9B)。構(gòu)建第一代抗體-噬菌體文庫為了防止野生型序列的污染，制備在靶定隨機(jī)化 位點(diǎn)處具有TAA終止密碼子的模板，并通過定點(diǎn)誘變構(gòu)建文庫，其中具有簡并NNS密碼子(N是A、G、C和T的等量混合物，而S是G和C的等量混合物)寡核苷酸進(jìn)行飽和誘變。將 VLl和VH3選作潛在的候選者用于提高親和力(圖9A和9B)。在⑶R中，用ρΥΟΙΟΙ模板構(gòu) 建了 2個文庫。VLl用終止模板寡核苷酸HL-248和HL249 (表9)和文庫寡核苷酸HL-258 和HL259(表10)進(jìn)行突變。類似地，用終止模板寡核苷酸HL-250、HL-251、和HL-252 (表 9)以及文庫寡核苷酸HL-260、HL-261和HL262 (表10)構(gòu)建了 3個VH3的文庫。文庫的構(gòu) 建總結(jié)于下表9和和10中。表9 用于誘變的模板寡核苷酸 表10 用于文庫構(gòu)建的隨機(jī)寡核苷酸 將隨機(jī)誘變反應(yīng)產(chǎn)物電穿孔導(dǎo)入大腸桿菌XL-IBLUE細(xì)胞(Stratagene)，然后通 過與M13K07輔助噬菌體一起生長15-16小時而得以擴(kuò)增。通過將最初轉(zhuǎn)化物接種于含羧 芐青霉素的平板而加以評估，每個文庫的復(fù)雜度為2 X IO7-L 5 X 108。最初的親和力選擇對于每輪選擇，根據(jù)與包被有2微克/毫升VEGF (重組的，殘 基為9-109個)(在50mM碳酸鹽緩沖液，pH 9. 6中)并用5%速溶牛奶(在50mM碳酸鹽緩 沖液，pH 9. 6中)封閉的板(Nunc Maxsorp 96孔)的結(jié)合情況，篩選IO9-IOici個噬菌體。在 存在0. 5%牛血清白蛋白和0.05% TffEEN 20 的PBS溶液下，室溫下結(jié)合1_2小時之后，用 PBS/TWEEN (含0. 05 % TWEEN20 的PBS緩沖液)洗滌板。典型地，為了選擇解離速度更慢 的親和力提高的變異體，將板與PBS/TWEEN 緩沖液孵育一段時間，孵育時間在每輪選擇中 逐漸延長(第一輪為0分鐘，然后逐漸增加至第9輪選擇中為3小時)。在去除PBS/TWEEN 緩沖液之后，將剩余的噬菌體用0. IM鹽酸洗脫，然后立刻用1/3體積的IM Tris-HCl, pH 8. 0中和。洗脫下的噬菌體通過感染XLl-BLUE細(xì)胞(Stratagene)而進(jìn)行繁殖，以用于下一 輪選擇。測序數(shù)據(jù)揭示，兩種VL文庫，即使在挑選了 8和9輪之后，仍然保留了多樣性，在 隨機(jī)化位點(diǎn)處能容忍各種不同殘基。與之相反，VH3文庫僅保留了野生型殘基和非常保守 的取代。這表明，VLl更暴露于溶劑并且位于結(jié)合界面外側(cè)。與之相反，VH3沒有明顯不同 的側(cè)鏈取代，因此可能更密切地在抗原結(jié)合中被涉及。結(jié)合親和力的噬菌體-ELISA測定從每種這些文庫中，在噬菌體-ELISA測定中分 析代表性克隆(由豐富序列所代表的克隆)相比親代克隆PYOlOl而言的親和力。在該測 定中，先將噬菌體系列稀釋，以確定保持穩(wěn)定的組份飽和效價，然后將其用于與不同濃度的 VEGF(200nM-0nM)溶液一起孵育。接著將混合物轉(zhuǎn)移至包被有VEGF(2微克/毫升)并用 5%速溶牛奶封閉的板，在室溫下平衡1小時。之后，除去噬菌體溶液，對殘留的結(jié)合噬菌體 用兔抗_噬菌體抗體和山羊抗_兔抗體和辣根過氧化物酶的偶聯(lián)物的混合溶液檢測。在室 溫下孵育1小時后，用生色底物鄰-苯二胺(Sigma)使板顯色。通過加入1/2體積2. 5MH2S04 而終止反應(yīng)。用分光光度計板閱讀器測量在492納米處的光密度。盡管在噬菌體-ELISA測定中，從這5個文庫中選出的所有克隆都表現(xiàn)出比野生型 PYOlOl更弱或類似的親和力，但是來自文庫HL-258的一個特殊的變異體(pY0192)卻在表 達(dá)水平或噬菌體展示方面表現(xiàn)出優(yōu)于PYOlOl的明顯優(yōu)勢(高約10倍)。該克隆在VL區(qū) 含有突變S24R、S26N、Q27E、D28Q和I29L(圖9A)。此外，發(fā)現(xiàn)該變異抗體在VH區(qū)有亂真的突變M34I。這個變異抗體與ρΥΟΙΟΙ相比，對VEGF的結(jié)合親和力沒有明顯差異。為了提高 Fab在噬菌體上的展示水平以及噬菌體-ELISA測定的信號-噪音比，將pY0192中的相應(yīng)取 代引入背景模板，以構(gòu)建兩種⑶R的Ala突變體和第二代抗-VEGF文庫。對抗-VEGF的CDR進(jìn)行丙氨酸掃描為了確定CDR區(qū)中各氨基酸對結(jié)合力的貢 獻(xiàn)并更好地選擇用于隨機(jī)變化的靶定殘基，通過用丙氨酸替換每個殘基而對CDR區(qū)進(jìn)行篩 選。每個丙氨酸變異體的構(gòu)建是通過定點(diǎn)誘變法并使用編碼各具體丙氨酸取代的合成寡核 苷酸。當(dāng)丙氨酸是野生型殘基時，用絲氨酸加以替換以測試側(cè)鏈取代的效應(yīng)。如上所述，對 具有單個丙氨酸突變的噬菌體克隆進(jìn)行純化和用噬菌體-ELISA分析。丙氨酸掃描的結(jié)果 表明，在不同位置上的丙氨酸替換可能有效，與ΡΥ0192相比抗原結(jié)合親和力下降了 2-150 倍。此外，證實(shí)了早先的觀察結(jié)果，即在抗原結(jié)合中涉及的是VH3而不是VL1。CDR丙氨酸 掃描的結(jié)果總結(jié)于下表11。表11 丙氨酸掃描的Fab變異抗體的相對VEGF親和力 所有變異抗體都以ρΥ0192( “野生型(wt) ” ；見圖9A-B)為基礎(chǔ)。IC50通過競爭 性噬菌體-ELISA分析加以測定。在⑶R H1、H2和H3中觀察到了丙氨酸替換的最大效應(yīng)，其中包括Y27A(親和力下 降 34 倍)、N31A、Y32A、W50A、N52A、Y99A、S 106A 和 W108A(各下降了> 150 倍)；N35A(下 降66倍)、P100A (下降38倍)和FlIOA (下降25倍)。與之相反，僅有一個VL替換對結(jié)合 親和力有大影響，即W96A(下降> 150倍)。這些結(jié)果表明，3個VH⑶R是Fab與VEGF結(jié) 合的主要力能決定因素，而VL3有部分貢獻(xiàn)。設(shè)計第二代CDR突變文庫根據(jù)對晶體結(jié)構(gòu)的研究，設(shè)計了另2種對抗-VEGF抗體Y0192中現(xiàn)有殘基進(jìn)行隨機(jī)變化的文庫。在VH2中，對殘基52-55隨機(jī)變化，因?yàn)樗鼈兾挥谂cVEGF的結(jié)合界面中。稱為“CDR7”的一個Fab額外區(qū)域，也被選定進(jìn)行隨機(jī)化，因?yàn)樵谠?環(huán)中有數(shù)個殘基盡管不與VEGF接觸但是卻與抗體的VH環(huán)接觸。這些是通過界面殘基的二 級效應(yīng)來提高親和力的潛在位點(diǎn)。在該⑶R7文庫中，殘基L72、T74和S77被隨機(jī)變化。還根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)，再構(gòu)建了一個原始CDR文庫來再次測試VHlCDR中親和力成熟的 潛力。用新的Y0192為背景，對殘基27、28和30-32進(jìn)行隨機(jī)變化?？?VEGF文庫的第二代選擇根據(jù)丙氨酸掃描結(jié)果和抗原-抗體(F(ab)_12)復(fù)合 物的晶體結(jié)構(gòu)，用PY0192模板和終止模板寡核苷酸(在靶定的隨機(jī)化位點(diǎn)具有終止密碼子 的寡核苷酸)YC-80、YC-100、YC-102、HL-263、和HL_264(上表9)構(gòu)建總計17個文庫。對 應(yīng)的隨機(jī)化寡核苷酸(在靶定的隨機(jī)化位點(diǎn)為NNS)是YC81、YC-10U YC-103、HL-265、和 HL-266(上表10)。形成的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生了復(fù)雜度為6 X 107-5 X IO8的文庫，這表明文庫是全 面的且覆蓋了所有可能的變異體。用下表12所述的條件，對噬菌體文庫挑選7-8輪。表12Fab變異抗體的第二代選擇的條件 ELISA緩沖液在PBS中含有0.5%牛血清白蛋白和0.05% TWEEN 20 。將VEGF包 含在孵育緩沖液中以減少噬菌體與包被在板表面上的VEGF之間的再結(jié)合。對這些文庫的 挑選導(dǎo)致噬菌體在7-8輪選擇后富集。第二代克隆的噬菌體-ELISA測定在8輪選擇之后，從攜帶大腸桿菌(XLl)菌落 (已用洗脫的噬菌體混合物感染)的含羧芐青霉素的平板上，分離出各文庫的10-20個克 隆。菌落被分離并與輔助噬菌體一起生長，以獲得單鏈DNA用于測序。選出的與VEGF結(jié)合 更好CDR取代，是通過噬菌粒克隆的DNA推導(dǎo)出的。選定克隆的采樣結(jié)果示于下表13。表13 第二代Fab-噬菌體文庫的抗-VEGF變異抗體的蛋白質(zhì)序列
) 僅示出了根據(jù)DNA測序推導(dǎo)出的隨機(jī)變化區(qū)域的序列。當(dāng)大量克隆與親代克隆pY0192 —起用噬菌體-ELISA法測試時，沒有一個克隆表 現(xiàn)出比親代克隆明顯改善。這可能是因?yàn)闇y試進(jìn)行的時間(<3小時)所限。為了定量分析與親代克隆相比在抗原結(jié)合性方面的改善，將數(shù)種抗-VEGF變異 體的DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌34B8菌株，以Fab形式表達(dá)，然后將周質(zhì)破碎物(periplasmic shockate)如上面實(shí)施例2所述通過G蛋白柱(Pharmacia)進(jìn)行純化。CDR組合型變異抗體為了進(jìn)一步改善VEGF結(jié)合親和力，將噬菌體展示中所發(fā)現(xiàn) 的突變與不同的⑶R組合，以產(chǎn)生多種⑶R變異體。具體地，將VH1、VH2和VH3文庫中親和 力提高程度最大的噬菌體變異體中所鑒別出的突變合并(表14)，以測試它們對結(jié)合親和 力的增加程度。表14 抗-VEGF變異抗體的⑶R組合 將所示的親代載體中的突變與所示寡核苷酸中的突變，通過定點(diǎn)誘變進(jìn)行組合 (合并)，以產(chǎn)生所示的組合型變異抗體。Y0317與Y0313-1是相同的，不同點(diǎn)僅在于在VLl中的背景突變被去除并將其序列 逆轉(zhuǎn)回ρΥΟΙΟΙ中的序列。突變HlOlY和S105T的效應(yīng)是通過用Y0238-3構(gòu)建回復(fù)突變體 而加以測試的。BIAcore分析Fab片段的VEGF-結(jié)合親和力是根據(jù)用BIAcore-2000 表面胞質(zhì) 團(tuán)共振系統(tǒng)(BIAcore，Inc. , Piscataway, NJ)測得的結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)計算出 的。根據(jù)供應(yīng)商(BIAcore，Inc.，Piscataway, NJ)的說明，用鹽酸N-乙基-N' _(3_ 二甲 基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺將生物傳感器芯片活化，以便與VEGF 共價偶聯(lián)。將VEGF的緩沖液換為20mM乙酸鈉(pH 4. 8)，然后稀釋至約50微克/毫升。將 一等份樣品(35微升)以2微升/分鐘的流速注入，以達(dá)到約700-1400共振單位(RU)的 偶聯(lián)蛋白。最后，注入IM乙醇胺作為封閉劑。對于動力學(xué)測量，將25°C的、Fab在PBS/TWEEN 緩沖液(含0. 05% TffEEN 20 的 磷酸鹽緩沖液)中的的2倍系列稀釋液，以10微升/分鐘的速度注入。結(jié)合和解離速率用 標(biāo)準(zhǔn)方法(Karlsson 等人，免疫學(xué)方法雜志(J. Immun. Methods) 145 =229-240(1991))計算。 平衡解離常數(shù)Kd (表面胞質(zhì)團(tuán)共振(SPR)測量值的Kd)是按k。ff/k。n進(jìn)行計算。數(shù)據(jù)列于下 表15。 *觀察到的解離速率可能反映了在這些試驗(yàn)中真實(shí)解離速率的上限，因?yàn)榻怆x速 率接近BIAcore的測量極限。在表15中所示的BIAcore 數(shù)據(jù)表明，數(shù)種變異抗體具有高于Y0192的親和力。例 如，CDRHl變異抗體Y0243-l(具有突變T28D和N31H)的親和力高4. 1倍。變異抗體Y0238-3 的結(jié)合親和力比Y0192高至少14倍。兩種⑶RH3突變都使Y0238-3的親和力上升，因?yàn)閷?T105回復(fù)至S (變異抗體Y0313-3)將Y0238-3的親和力從0. 15nM降至0. 65nM(見表15)。 相對于Y0192而言更大的親和力提高見于Y0313-1，它含有⑶RH3突變和⑶RHl突變。基于細(xì)胞的VEGF抑制分析測試了數(shù)種A4. 6. 1抗-VEGF抗體拮抗VEGF (重組型， 種類1-165)誘導(dǎo)HuVEC (人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)生長的能力。以1000個HuVEC/孔接種96孔 板，然后在分析培養(yǎng)液(F12 DMEM(50 50)，并補(bǔ)充有1. 5%滲濾處理過的胎牛血清)中 禁食24小時。用于誘導(dǎo)細(xì)胞的VEGF濃度，通過測定能刺激80%最大DNA合成所需的VEGF 量而加以確定。然后，加入含固定量VEGF (0.2nM終濃度)以及抗-VEGF Fab或MAb濃度逐 漸增加的新鮮分析培養(yǎng)基。在孵育40小時后，通過含氚胸苷的摻入量來測量DNA合成情況。 將0. 5 μ Ci [3H]-胸苷/每孔加入細(xì)胞培育24小時，然后收獲，用TopCoimt伽馬計數(shù)器計 數(shù)。結(jié)果(圖11)表明，在抑制VEGF活性方面，全長IgG形式的F(ab)-12明顯強(qiáng)于 Fab形式(此處使用的是Y0192)。然而，兩種變異抗體Y0238-3和Y0313-1甚至表現(xiàn)出強(qiáng) 于Y0192 Fab或F(ab)_12單克隆抗體的對VEGF活性的抑制作用。通過比較Fab形式，變 異體Y0313-1表現(xiàn)出比野生型Fab強(qiáng)> 30倍。應(yīng)注意，用于此分析中的VEGF量(0. 2nM)， 可能潛在地限制了對變異體IC50的精確測量。例如，如果變異體的結(jié)合親和力(Kd)事實(shí) 上小于0. 2nM，那么在該試驗(yàn)中IC50會明顯高于在更低VEGF濃度下所測得的IC50。因此， 這個結(jié)果支持這樣的結(jié)論親和力提高的變異體與VEGF的親和力至少提高了 30倍，而且它 可在體外有效地阻斷VEGF活性。因?yàn)樽儺惪贵wY0317與Y0313-1的差別僅在于VLl序列 回復(fù)至野生型(圖10)，因此可預(yù)計Y0317具有與Y0313類似的活性。
將變異抗體Y0317(Fab)與實(shí)施例1的人源化F (ab)-12 (全長及Fab)進(jìn)行比較，即用實(shí)施例1所述的分析方法比較它們對響應(yīng)近最大有效濃度VEGF時牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞 增殖的抑制能力。如圖12所示，在該分析中，在抑制牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖方面，Y0317 明顯比全長或Fab形式的F (ab)-12更有效。在該分析中，Y0317親和力成熟形式的Fab表 現(xiàn)出的ED50值比F(ab)-12的Fab低至少20倍。
權(quán)利要求
一種人源化抗-VEGF抗體，它在體外抑制VEGF誘導(dǎo)型內(nèi)皮細(xì)胞增殖的ED50值不超過約5nM。
2.一種人源化抗-VEGF抗體，它在體內(nèi)抑制VEGF-誘導(dǎo)型血管生成。
3.如權(quán)利要求2所述的人源化抗-VEGF抗體，5毫克/千克的該抗體在A673體內(nèi)腫瘤 模型中抑制至少50%腫瘤生長。
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的人源化抗-VEGF抗體，其中該人源化抗-VEGF抗體包 含具有氨基酸序列 GYDFTHYGMN(SEQ ID NO 126)的 CDRHl。
5.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的人源化抗-VEGF抗體，其中該人源化抗-VEGF抗體包 含具有氨基酸序列 YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO: 127)的 CDRH3。
6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的人源化抗-VEGF抗體，具有重鏈可變區(qū)，該重鏈可變 區(qū)包括具有如下氨基酸序列的高變區(qū)序列GYX1FTX2YGMN所示的⑶RH1，其中X1是0，X2是 H ；WINTYTGEPTYAADFKR 所示的 CDRH2 ；以及序列 YPXJYGXjHWYFDV 所示的 CDRH3，其中 X1 是 Y，X2 是 T。
7.如權(quán)利要求6所述的人源化抗-VEGF抗體，它包括含有氨基酸序列SEQID NO 116的重鏈可變區(qū)。
8.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的人源化抗-VEGF抗體，具有輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū) 包括具有如下氨基酸序列的高變區(qū)CDRL1(SASQDISNYLN ;SEQ ID NO 4), CDRL2 (FTSSLHS ； SEQ ID NO :5)andCDRL3(QQYSTVPWT ；SEQ ID NO :6)。
9.如權(quán)利要求8所述的人源化抗-VEGF抗體，它包括含有氨基酸序列SEQID NO 115 的輕鏈可變區(qū)。
10.如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的人源化抗-VEGF抗體，它包括含有氨基酸序列SEQID NO 116的重鏈可變區(qū)和含有氨基酸序列SEQ ID NO 115的輕鏈可變區(qū)。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗-血管內(nèi)皮生長因子的抗體。公開了人源化和變異的抗-VEGF抗體及其各種不同用途。抗-VEGF抗體對VEGF有很強(qiáng)的結(jié)合親和力，可在體外抑制VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并且可在體內(nèi)抑制腫瘤生長。
文檔編號C12N15/09GK101838328SQ20091014701
公開日2010年9月22日 申請日期1998年4月3日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月7日
發(fā)明者H·B·洛曼, J·A·韋爾斯, L·G·普雷塔, M·巴卡, Y·M·-Y·陳 申請人:基因技術(shù)股份有限公司