專利名稱：：利用二價(jià)金屬離子制備Apo-2配體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及使用如鋅和鈷等二價(jià)金屬離子制備Apo-2配體和Apo-2配體的制劑的方法。也提供了這類Apo-2配體和具有改進(jìn)了Apo-2L的三聚體形成和穩(wěn)定性的Apo-2配體制劑的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及Apo-2配體變體，特別是丙氨酸取代型變體。
背景技術(shù)：
：對(duì)哺乳動(dòng)物中細(xì)胞數(shù)量的控制被認(rèn)為部分取決于細(xì)胞增殖和死亡之間的平衡。細(xì)胞死亡的形式之一，有時(shí)稱壞死性細(xì)胞死亡，其典型特征為創(chuàng)傷或細(xì)胞損傷所致病理形式的細(xì)胞死亡。相對(duì)比，有另外一種"生理性，，的細(xì)胞死亡形式，其通常以一種有序或受控形式進(jìn)展。這種有序的或受控的細(xì)胞死亡形式通常指"凋亡，，(參見，例如Barr等，Bio/Technology，12:487-493(1994);Steller等，4學(xué)，267:1445-1449(1995))。凋亡天然發(fā)生i許多生理過程中，包括胚胎發(fā)育和免疫系統(tǒng)中的克隆選擇(Itoh等，細(xì)胞(Cell),66:233-243(1991》。多種分子，如腫瘤壞死因子-a("TNF-a，，)，腫瘤壞死因子-卩("TNF-P"或"淋巴毒素-a，，)，淋巴毒素-P("LT-P")，CD30配體，CD27配體，CD40配體，OX-40配體，4-1BB配體，Apo-l配體(也稱為Fas配體或CD95配體)，Apo-2配體(也稱TRAIL,AIM-1或AGP-1)，和Apo-3配體(也稱為TWEAK)都被證實(shí)為細(xì)胞因子的腫瘤壞死因子家族的成員(參見例如Gruss和Dower，血液(Blood),85:3378-3404(1995);Pitti等，生物學(xué)化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),271:12687-12690(1996);Wiley等，Immunity,3:673-682(1995);Browning等，細(xì)胞，72:847-856(1993);Armitage等,自然(Nature),357:80-82(1992)，1997年1月16日公開的WO97/01633;1997年7月17日公開的WO97/25428;1997年12月11日公開的WO97/46686;1997年9月18日公開的WO97/33899;Marster等，Curr.Biol.，8:525-528(1998);Chicheportiche等，Biol.Chem.,272:32401-32410(1997))。在這些分子中，已有報(bào)導(dǎo)在凋亡+涉及TNF-ot,TNF-(3，CD30配體，4-1BB配體，Apo-l配體，Apo-2配體(TRAL)和Apo-2配體(TWEAK)。相信這些TNF家族細(xì)胞因子介導(dǎo)的對(duì)多種細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)是以它們與特異性細(xì)胞受體的結(jié)合而引發(fā)的。已證實(shí)約5S-kDa(TNFRl)和7S-kDa(TNFR2)的兩種不同的TNF受體(Hohman等，生物學(xué)化學(xué)雜志，264:14927-14934(1989));Brockhaus等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl,Acad.Sci.),87:3127-3131(1990);1991車3月20日公開的EP417563),已分離并鑒定了對(duì)應(yīng)這兩類受體的人和小鼠cDNA(Loetscher等，細(xì)胞，61:351(1990);Schall等，細(xì)胞，61:361(1990);Smith等，科學(xué)，248:1019-1023(1990);Lewis等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，88:2830-2834(1991);Goodwin等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)，11:3020-3026(1991))。這兩種TNF受體基因具有廣泛的多態(tài)性(參見，例如，Takao等，Immunogenetics，37:199-203(1993))。這兩種TNFR具有同樣的細(xì)胞表面受體的典型結(jié)構(gòu)，包括胞外區(qū)，跨膜區(qū)，胞內(nèi)區(qū)。已發(fā)現(xiàn)天然狀態(tài)下這兩種受體的胞外部分也可以為可溶性TNF結(jié)合蛋白(Nophar,Y等，EMBOJ,，9:3269(1990);和Kohno，T等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，87:8331(1990))。Hale等報(bào)導(dǎo)了對(duì)重組可溶性TNF受，的克，(J.Cell.Biochem.增刊15F，1991,p.ll3(P424)—)。以NH2末端開始的半胱氨酸富含區(qū)域(CRD)的重復(fù)氨基酸序列形式。每一CRD約40個(gè)氨基酸長(zhǎng)，在高度保守位置包含4到6個(gè)半胱氨酸殘基(Schall等，出處同上；Loetscher等，出處同上；Smith等，出處同上；Nophar等，出處同上；Kohno等，出處同上)。在TNFR1中，4個(gè)CRD的大致邊界如下CRDl-氨基酸14到約53;CRD2-約氨基酸54到約97;CRD3-約氨基酸98到約138;CRD4-約氨基酸139到約167。在TNFR2,CRD1包括氨基酸17到約54;CRD2-約氨基酸55到約97;CRD3-約氨基酸98到約140;CRD4-約氨基酸141到約179(Banner等，細(xì)胞，73:431-435(1993))。Banner等，出處同上，還記述了在配體結(jié)合中CRD的潛在作用。CRD相似的重復(fù)形式存在于幾種其它的細(xì)胞表面蛋白中，包括p75神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGFR)(Johnson等,細(xì)胞,47:545(1986);Radeke等，自然,325:593(1987》，B細(xì)胞抗原CD40(Stamenkovic等,E廳OJ.，8:1403(1989》，T細(xì)胞抗原OX40(Mallet等，EMBOJ.,9:1063(1990))和Fas抗原(Yonerhara等，J.Exp.Med.，169:1747-1756(1989)和Itoh等，細(xì)胞，66:233-243(1991))CRD還可見于兔痘病毒及粘液瘤病"4的可溶性TNFR(sTNFR)樣T2蛋白中(Upton等，Virology,160:20-29(1987);Smith等，Biochem.Biophys,Res.Commun"176:335(1991));Upton等,Virology,184:370(1991))。這些序列的最佳排列指示半胱氨酸殘基的位置是高度保守的。有時(shí)這些受體統(tǒng)稱TNF/NGF受體超家族成員。最近對(duì)于p75NGFR的研究i明CRD1的缺失(Welcher，A.A.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，88:159-163(1991))或此區(qū)域的5-氨基酸插入(Yan,H和Chao，M.V.,生物學(xué)化學(xué)雜志，266:12099-12104(1991))對(duì)NGF的結(jié)合有很少或沒有影響(Yan,H.和Chao,M.V.,出處同上)。p75NGFR在它的CRD4和跨膜區(qū)之間包括一段約60個(gè)氨基酸的富含脯氨酸的序列，其并不參與NGF結(jié)合(Peetre，C等，Eur.J.Hematol.，41:414-419(1988);Seckinger，P等，生物學(xué)化學(xué)雜志，264:11966-11973(1989);Yan,H和Chao，M.V.，出處同上)。在TNFR2中發(fā)現(xiàn)了類似的富脯氨酸區(qū)，但在TNFRl中沒有。除淋巴毒素-ot外，迄今鑒定的TNF家族配體是II型跨膜蛋白，其C-末端位于胞外。相反，在TNF受體(TNFR)家族中迄今鑒定的大多數(shù)受體是I型跨膜蛋白。然而在TNF配體和受體家族中，家族成員間的同源性主要在胞外區(qū)域("ECD")。TNF家族的幾種細(xì)胞因子，包括TNF-a，Apo-l配體和CD40配體在細(xì)胞表面被蛋白水解；每一種情況下得到的蛋白通常形成同型三聚體分子，其起可溶性細(xì)胞因子的作用。TNF受體家族的蛋白也通常被蛋白水解而釋放出可溶性受體ECD，其可作為同源細(xì)胞因子的抑制因子。最近，已鑒定了TNFR家族的其它成員。這些新鑒定的TNFR家族成員包括CAR1，HVEM和osteoprotegerin(OPG)(Brojatsch等，細(xì)胞，87:845-855(1996);Montgomery等，細(xì)胞，87:427-436(1996);Marsters等，生物學(xué)化學(xué)雜志，272:14029-14032(1997);Simonet等,細(xì)胞，89:309-319(1997;)。與其它已知TNFR-樣分子不同，Simonet等，出處同上報(bào)導(dǎo)OPG不包含橫跨疏水性5爭(zhēng)膜區(qū)的序列。OPG被認(rèn)為起誘何受體的作用，如下所論。TNF/NGF受體家族的另一新成員在小鼠中得到鑒定，此稱為GITR的受體是'糖(腎上腺)皮質(zhì)激素-誘導(dǎo)的胂瘤壞死因子受體家族相關(guān)基因，(Nocentini等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，94:6216-6221(1997))。小鼠GITR受體是228個(gè)氨基酸的I型跨膜蛋白，其在正常小鼠胸腺，脾和淋巴結(jié)的T淋巴細(xì)胞中表達(dá)。小鼠GITR受體的表達(dá)通過用抗-CD3抗體，伴刀豆球蛋白A或佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯活化T淋巴細(xì)胞而誘導(dǎo)。在Marster等，Curr.Biol.,6:750(1996)中，研究人員描述了一種叫做Apo-3的全長(zhǎng)天然序列人多肽，在其胞外富半胱氨酸重復(fù)處顯示出與TNRF家族的相似性，象TNFR1和CD95—樣，它包含一個(gè)細(xì)胞質(zhì)死亡區(qū)序列(同樣參見Masters等，Curr.Biol.,6:1669(1996))。其他研究人員稱Apo-3為DR3，wsl國(guó)l，TRAMP，和LARD(Chinnaiyan等，科學(xué)，274:990(1996);Kitson等,自然，384:372(1996);Bodmer等，Immunity,6:79(1997);Screaton等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，94:4615-4619(1997))。Pan等公開了稱為"DR4"的另一TNF受體家族成員(Pan等，科學(xué)，276:111-113(1997))。據(jù)報(bào)導(dǎo)DR4包含一個(gè)能引發(fā)(engage)細(xì)胞自殺裝置的細(xì)胞質(zhì)死亡區(qū)域。Pan等指出DR4被認(rèn)為是Apo-2配體或TRAIL配體的受體。在Sheridan等，科學(xué)，277:818-821(1997)和Pan等，科學(xué)，277:815-818(1997)中，記述了另一被認(rèn)為是Apo-2配體(TRAIL)的受體的分子。這一分子被稱為DR5(也可稱為Apo-2;TRAIL-R2或TRICK2或KILLER(Screaton等，Curr.Biol.,7:693-696(1997);Walczak等，EMBOJ.,16:5386-5387(1997);Wu等，NatureGenetics,17:141-143(1997))。象DR4一樣，有報(bào)導(dǎo)DR5包含一個(gè)細(xì)胞質(zhì)死亡區(qū)域并且能夠傳遞凋亡的信息。最近鑒定了另一含死亡區(qū)的受體DR6(Pan等，F(xiàn)EBSLetters,431:351-356(1998))。除含有4個(gè)假定的胞外區(qū)域和一個(gè)細(xì)胞質(zhì)死亡區(qū)域外，DR6被認(rèn)為包含一假定的亮氨酸-拉鏈序列，該j列與細(xì)胞質(zhì)區(qū)的富含脯氨酸的基序相重疊。富含脯氨酸的基序與結(jié)合到src-同族(homology)-3區(qū)域的序列相似，其^皮發(fā)現(xiàn)存在于許多胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子中?！陆b定的另一組TNFR家族成員是指"誘餌受體"，據(jù)認(rèn)為其起抑制因子的作用，而不是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。該組包括DCR1(也稱TRID，LIT或TRAIL-R3)(Pan等，科學(xué)，276:li1-113(1997));Sheridan等，科學(xué)，277:818-821(1997);McFarlane等，生物學(xué)化學(xué)雜志，272:25417-25420(1997);Schnerider等，F(xiàn)EBSLetters,416:329-334(1997);Degli-Esposti等,J.Exp.Med.，186:1165-1170(1997);和Mongkosapaya等，J.Immunol.,160:3-6(1998))和DCR2(也稱為TRUNDD或TRAIL-R4)(Marsters等，Curr.Biol.,7:1003-1006(1997);Pan等，F(xiàn)EBSLetters,424:41-45(1998);Degli-Esposti等，Immunity,7:813-820(1997)),這兩者都是表面分子，還者OPG(Simonet等，出處同上)和DCR3(Pitti等，自然，396:699-703(1998))，這兩者都是可溶性分泌蛋白。有關(guān)TNF家族細(xì)胞因子和它們的受體的綜述，參見Ashkenazi等，科學(xué)，281:1305-1308(1998);Golstein，Curr.Biol.,7:750-753(1997);和Gruss和Dower，出處同上。鋅結(jié)合位點(diǎn)在涉及不同界面的特定蛋白的蛋白-蛋白相互作用中顯示^構(gòu)上的作用(Feese等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，91:3544-3548(1994);SomerS等，自然，372:478-481(1994);Raman等，細(xì)胞，95:939-950(1998))，但具看前述結(jié)構(gòu)性特征的TNF家族成員(CD40配體，TNF-a，或TNF-(3)沒者一種可結(jié)合金屬。已在文獻(xiàn)中記述了在配制各種激素，如人生長(zhǎng)激素(hGH)時(shí)金屬離子如鋅的使用(參見，例如WO92/17200,1992年10月15日公開)。在WO92/03478(1992年3月15日公開)中同樣記述了鋅與hGH對(duì)受體的結(jié)合有關(guān)。Walter等，Structure,4:1453-1463(1996)和Karpusas等,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，94:11813-11818(1997)中分別報(bào)導(dǎo)了在干擾素-a二聚體和干擾素—P二聚體中鋅結(jié)合的作用。本領(lǐng)域^綜述了各種金屬離子如鋅的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)作用，參見如Christianson等,AdvancesinProteinChemistry,42:281-355(1991)。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)在制備Apo-2配體，或含Apo-2配體的制劑的方法和過程中包含入一或多種二價(jià)金屬離子會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量和Apo-2配體三聚體穩(wěn)定性提高?，F(xiàn)在認(rèn)為這樣包含一或多種二價(jià)金屬離子也會(huì)通過重組細(xì)胞培養(yǎng)中的表達(dá)而改進(jìn)Apo-2配體的折疊或Apo-2L三聚體的裝配。在氧化環(huán)境下，Apo-2L單體上的自由半胱氨酸可以形成分子間二硫鍵，產(chǎn)生游離的Apo-2L二聚體以及Apo-2L三聚體形式中的二碌u4建連接型Apo-2L二聚體。Apo-2L二聚體的這種形成可能導(dǎo)致Apo-2L的聚結(jié)，沉淀，和/或Apo-2L失活。在此所述方法和制劑中二價(jià)金屬離子的存在可以防止此類二硫鍵的形成。有顯示表明在Apo-2L三聚體的合成和裝配過程中二價(jià)金屬離子的加入可以進(jìn)一步改進(jìn)正確折疊的，同型三聚體式Apo-2L的積累和回收。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)與有二硫鍵連接的Apo-2L二聚體相比，Apo-2配體三聚體的活性高約10倍(在哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞+的細(xì)胞毒活性方面)。本發(fā)明說明書主要涉及Apo-2配體，也考慮了二價(jià)金屬離子在制備或穩(wěn)定各種其他蛋白的三聚體方面的應(yīng)用。這些其它蛋白特別包括那些需要形成三聚體以獲得生物活性的蛋白，例如，TNF家族的各成員。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供使用一或多種二價(jià)離子制備Apo-2配體的方法。所述方法包括的步驟為提供含有編碼Apo-2配體之核酸的可復(fù)制型載體的宿主細(xì)胞，提供含有一或多種二價(jià)金屬離子的培養(yǎng)基，在足以表達(dá)Apo-2配體的條件下在培募基中培抓宿主細(xì)胞，從宿主細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)液中回收Apo-2配體?？蛇x地，在回收或純化過程中使用一或多種二價(jià)金屬離子。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含Apo-2配體和一或多種二價(jià)金屬離子的制劑。該組合物可以是藥物學(xué)上可接受的可用于如誘導(dǎo)或激發(fā)哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞凋亡的有效制劑。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案提供制品和試劑盒，其中包含這類^r有一或多種二價(jià)金屬離子的Apo-2配體制劑。所述制品和試劑盒包括一個(gè)容器，容器上的標(biāo)記，容器中的制劑。容器上的標(biāo)記指示該制劑可用于特定的治療或非治療用途。該制劑包含Apo-2配體和一或多種二價(jià)金屬離子。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了按照本發(fā)明所述方法制備的Apo-2配體多肽。這類Apo-2配體多肽可能包括圖l(SEQIDNO:l)的氨基酸114-281，圖l(SEQIDNO:l)的氨基酸1-281,以及其具有生物活性的片段或變體。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了Apo-2配體變體。特別是，本發(fā)明提供了在Apo-2配體的天然序列(圖1;SEQIDNO:l)中包含一或多個(gè)氨基酸取代的Apo-2配體變體。在下表1中提供了包含丙氨酸取代的Apo-2配體變體。本發(fā)明還提供了編碼這類Apo-2L配體變體的核酸分子和包含編碼Apo-2L變體的核酸分子的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明更具體涉及1.一種含有Apo-2配體和一或多種二^f介金屬離子的制劑，其中所述一或多種二價(jià)金屬離子在制劑中的濃度與該Apo-2配體的摩爾比<2。2.項(xiàng)1的制劑，其中所述一或多種二^f介金屬離子包括鋅或鈷。3.項(xiàng)2的制劑，其中所述一或多種二i^金屬離子包括鋅。4.項(xiàng)3的制劑，其中所述鋅選自氯化鋅，醋酸鋅，硫酸鋅，碳酸鋅和檸檬酸鋅<5.項(xiàng)1的制劑，其中所述制劑是可藥用的制劑。6.項(xiàng)1的制劑，其中所述Apo-2配體包括圖l(SEQIDNO:l)的114-281位氨基酸。7.項(xiàng)1的制劑，其中所述Apo-2配體包括圖l(SEQIDNO:l)的1-281位氨基酸或其具有生物活性的片段或變體。8.項(xiàng)1的制劑，其中所述制劑的pH約為6-9。9.項(xiàng)8的制劑，其中所述制劑的pH約為7-7.5。10.項(xiàng)1的制劑，其中所述制劑是含水制劑。11.項(xiàng)l的制劑，其中所述制劑是凍干制劑。12.含有Apo-2配體和一或多種二價(jià)金屬離子的制劑，其中所述一或多種二價(jià)金屬離子在制劑中的濃度與該Apo-2配體的摩爾比22。13.促進(jìn)Apo-2配體三聚體形成的方法，包括使Apo-2配體多肽暴露于有效量的一或多種二價(jià)金屬離子。14.制備Apo-2配體的可藥用制劑的方法，包括將Apo-2配體、有效量的一或多種二價(jià)金屬離子、以及可藥用的載體混合。15.減少二硫鍵連接的Apo-2配體二聚體形成的方法，包括使Apo-2配體多肽暴露于有效量的一或多種二價(jià)金屬離子。16.制備Apo-2配體的方法，包括如下步驟(a)提供含有可復(fù)制的載體的宿主細(xì)胞，所述載體含有編碼Apo-2配體多肽的核苷酸序列；(b)提供含有有效量的一或多種二價(jià)金屬離子的培養(yǎng)基；(c)將所述宿主細(xì)胞在足以表達(dá)Apo-2配體的條件下于培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(d)從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收Apo-2配體。17.項(xiàng)16的方法，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。18.項(xiàng)16的方法，其中所述一或多種二價(jià)金屬離子包括鋅。19.項(xiàng)18的方法，其中所述的鋅包括硫酸鋅。20.項(xiàng)16的方法，其中所述一或多種二價(jià)金屬離子包括鈷。21.項(xiàng)20的方法，其中所述的鈷包括氯化鈷。22.項(xiàng)18的方法，其中培養(yǎng)基中所迷鋅的濃度約為50-25(Himol。23.項(xiàng)16的方法，其中所述可復(fù)制的載體包含編碼一或多個(gè)tRNA分子的核苷酸序列。24.項(xiàng)23的方法，其中所述可復(fù)制的載體是pAPApo2-P2RU載體。25.項(xiàng)16的方法，其中所述Apo-2配體包含圖l(SEQIDNO:l)的114-281位氨基酸。26.項(xiàng)16的方法，其中所述Apo-2配體包含圖l(SEQIDNO:l)的1-281位氨基酸或其具有生物活性的片段或變體。27.制備Apo-2配體的方法，包括如下步驟提供包含含有編碼Apo-2配體之核香酸序列的可復(fù)制型載體的宿主細(xì)胞；(b)提供培養(yǎng)基；(c)在足以表達(dá)Apo-2配體的條件下在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；(d)從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收Apo-2配體；(e)在有效量的一或多種二價(jià)金屬離子存在下純化Apo-2酉己體。28.項(xiàng)27的方法，其中在步驟(e)中，所述Apo-2配體在一或多種二價(jià)金屬離子和一種還原劑存在下純化。29.項(xiàng)27的方法，其中所述Apo-2配體包含圖l(SEQIDNO:l)的114-281位氨基酸。30.項(xiàng)27的方法，其中所述Apo-2配體包含圖l(SEQIDNO:l)的1-281位氨基酸或其具有生物活性的片^:或變體。31.從原核細(xì)胞培養(yǎng)中回收Apo-2配體的方法，包括如下步驟.'(a)分離已表達(dá)在培養(yǎng)的原核宿主細(xì)胞中的Apo-2配體；(b)將所述分離的Apo-2配體與含有一或多種二價(jià)金屬離子和還原劑的緩沖液接觸；(c)回收所述分離的Apo-2配體。32.項(xiàng)31的方法，其中在步驟(b)中，所述一或多種二^f介金屬離子選自鋅和鈷，所述還原劑選自DTT和BME。33.項(xiàng)31的方法，其中在步驟(c)中，所述Apo-2配體的回收是通過將Apo-2配體依次與陽離子層析載體，羥基磷灰石載體，疏水層析載體接觸而實(shí)現(xiàn)的。34.項(xiàng)33的方法，其中所述陽離子層析載體選自SP-Sepharose，CM-Sepharose，和Macro-Prep陶瓷HS樹脂。35.項(xiàng)33的方法，其中所述疏水層析栽體選自苯基瓊脂糖，丁基瓊脂糖，TSK樹脂和Toyopearl樹脂。36.分離的Apo-2配體變體多肽，其包含與天然序列Apo-2配體不同且在圖l(SEQIDNO:l)的殘基位置具有如下一或多個(gè)M酸取代的氨基酸序列R130A;N134A;L136A;S138A;N140A;N143A;S153A;E155A;R158A;R170A;K179A;R191A;Q193A;E195A;K197D;K201A;N202A;D203A;Y213A;D218A;Y240A;K251A;S259A;D267A;D269A。37.分離的Apo-2配體變體多肽，其包含與天然序列Apo-2配體不離且在圖l(SEQIDNO:l)的殘基位置具有如下一或多個(gè)M酸取代的氨基酸序列S141A，K142A，S159A,H264A。.38.分離的Apo-2配體變體多肽，其包含與天然序列Apo-2配體不同且在圖l(SEQIDNO:l)的殘基位置具有如下一或多個(gè)氨基酸取代的氨基酸序列R149A;C230S;C230A;Q205A;V207A;Y216A;E236A;Y237A。39.分離的核酸，其包含編碼項(xiàng)36所述Apo-2配體變體的核苷^列。40.包含項(xiàng)39的核酸的載體。41.包含項(xiàng)40的載體的宿主細(xì)胞。42.pAPApo2-P2RU載體。43.包含項(xiàng)42的載體的宿主細(xì)胞。44.項(xiàng)31的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。.分離的Apo-2配體，其包含圖l(SEQIDNO:l)的114-281位氨基酸并且依照項(xiàng)16而制備。46.分離的Apo-2配體，其包含圖l(SEQIDNO:l)的1-281位氨基酸或其具有生物活性的片段或變體并且依照項(xiàng)16而制備。47.分離的Apo-2配體，其包含圖l(SEQIDNO:l)的114-281位氨基酸并且依照項(xiàng)27而制備。48.分離的Apo-2配體，其包含圖l(SEQIDNO:l)的1-281位氨基酸或其具有生物活性的片段或變體，并且其依照項(xiàng)27而制備。圖1表示人Apo-2配體cDNA(SEQIDNO:2)及由其衍生的氨基,列(SEQIDNO:1)。核苷酸位置447(SEQIDNO:2中)的"N"用于指示該核苷酸堿基可能是"T"或"G"。圖2提供了Apo-2L的晶體結(jié)構(gòu)。圖2A顯示了沿三重軸向的三聚體視圖。每一單體都是相同的。有序的蛋白結(jié)構(gòu)始于殘基120，殘基131-141是無序的，殘基195-201也是如此(以虛線標(biāo)記)。包含三個(gè)對(duì)稱相關(guān)的半胱氨酸的鋅結(jié)合位點(diǎn)和溶劑配體表示為實(shí)心圖像。圖2B提供了鋅結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)斜視立體近視圖；Sy-鋅-Sy間的角度是112。，Sy-鋅-溶劑間的角度是107°，鋅-硫鍵距離為2.3埃，鋅-溶劑鍵距離為2.3埃。圖2(和5)用Molscript(Kraulis等，J.Appl.Cryst.，24:946-950(1991))和Raster3D(Merrit等，ActaCryst.,D50:869-873(1994))程序繪制。圖2C提供了得自實(shí)施例2所述實(shí)驗(yàn)的結(jié)晶學(xué)的數(shù)據(jù)總結(jié)。圖3顯示所選TNF家族成員的序列排列，包括Apo2L(SEQIDNO:1);TNF-p(SEQIDNO:3);TNF-a(SEQIDNO:4);CD40L(SEQIDNO:5);FasL(SEQIDNO:6);RANKL(SEQIDNO:7)。這些序列上的箭頭指示Apo2L中的P-鏈(strand)。排列的序列上的編號(hào)對(duì)應(yīng)圖1提供的Apo-2L序列編號(hào)(SEQIDNO:1)。圖4提供的生物分析數(shù)據(jù)顯示鋅結(jié)合位點(diǎn)的功能重要性。在用各種濃度的Apo-2L(114-228位)或經(jīng)螯合劑處理除去鋅的Apo-2L(l14-228位)孵育過夜后，用代謝活性的熒光分析確定SK-MKS-1細(xì)胞生存力。圖5顯示了在Apo-2L的空間填充才莫型上對(duì)突變分析的作圖。三聚體方向同圖2。將突變?yōu)楸彼釙r(shí)生物活性P爭(zhēng)低5倍以上的殘基作標(biāo)記并避光保存。在中度陰影區(qū)顯示了其它已突變的殘基，這些殘基中的幾個(gè)也進(jìn)行了標(biāo)記。圖6顯示了在經(jīng)處理除去結(jié)合鋅之前和之后Apo-2L的圓二色語(114-281位)。圖7顯示了在經(jīng)處理除去鋅之前和之后Apo-2L的熱變性，其通過在225nm進(jìn)行圓二色譜來監(jiān)控。報(bào)導(dǎo)了2微摩爾Apo-2L溶液的倍增電極電壓。圖8顯示了在使用AP啟動(dòng)子的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中添加ZnS04對(duì)可溶性Apo-2L產(chǎn)物積累(mg/L)的影響(時(shí)間進(jìn)程)。圖9顯示了有或沒有ZnS04時(shí)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(參見實(shí)施例8)所得細(xì)胞裂解液的MPHS層析的洗脫圖譜。圖10顯示了在使用trp啟動(dòng)子的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中添加ZnSC^對(duì)可溶性Apo-2L產(chǎn)物積累(mg/L)的影響(時(shí)間進(jìn)程)。圖11顯示了在使用AP啟動(dòng)子的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中添加CoC^對(duì)可溶性Apo-2L產(chǎn)物積累(mg/L)的影響(時(shí)間進(jìn)程)。圖12顯示了pAPApo2-P2RU質(zhì)粒的構(gòu)建。圖13顯示了pAPOK5質(zhì)粒的構(gòu)建。優(yōu)選實(shí)施方案詳述定義在此所用術(shù)語"Apo-2配體"，"Apo-2L",和"TRAIL"是指這類多肽序列，其包含圖1所示氨基酸序列(SEQIDNO:l)的114-281位氨基酸殘基，還包括95-281位殘基,92-281位殘基,91-281位殘基,41-281位殘基,15-281位殘基，1-281位殘基，同樣還包括上述序列的生物活性片段，以及缺失的，插入的，或取代的變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多肽序列包含圖l(SEQIDNO:l)的114-281殘基?？蛇x地，該多肽序列包含圖l(SEQIDNO:1)的92-281位殘基或91-281位殘基。Apo-2L多肽可由圖l(SEQIDNO:2)表示的天然核苦酸序列編碼。可選地，編碼Proll9殘基(圖1;SEQIDNO:2)的密碼子可以是"CCT，，或"CCG"。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述片段或變體具有生物學(xué)活性且與上述的任一序列有至少80%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少90%的序列同一性，更進(jìn)一步優(yōu)選有至少95%,96%，97%，98%,99%的序列同一性。所述定義包含Apo-2配體的取代型變體，其中其天然氨基酸中的至少一個(gè)被丙氨酸殘基取代。優(yōu)選的取代型變體包括下表1中證實(shí)的一或多個(gè)殘基取代。所述定義同樣包括自Apo-2配體源分離的或通過重組或合成方法制備的天然序列的Apo-2配體。本發(fā)明的Apo-2配體包括在1997年1月16日Z/Hf的WO97/01633和1997年7月17日^>開的W097/25428中稱為Apo-2配體或TRAIL的多肽。通常使用術(shù)語"Apo-2配體，，或"Apo-2L，，指Apo-2配體的形式，其包括所述多肽的單體，二聚體或三聚體形式。在Apo-2L序列中所用的氨基酸殘基的編號(hào)，除特別聲明，均依照?qǐng)D1中編號(hào)(SEQIDNO:1)。例如，"D203"或"Asp203"指圖1(SEQIDNO:l)的序列中203位的天冬氨酸殘基。術(shù)語"Apo-2配體胞外區(qū)域"或"Apo-2配體ECD"指Apo-2配體的基本上沒有跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)的形式。通常，ECD含有不到1%的這類跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)，優(yōu)選的，含有不到0.5%的這類.區(qū)域。術(shù)語"Apo-2配體單體，，或"Apo-2L單體，，指Apo-2L胞外區(qū)序列的共價(jià)鏈。術(shù)語"Apo-2配體二聚體"或"Apo-2L二聚體"指通過二硫鍵共價(jià)連接的兩個(gè)Apo-2L單體。本發(fā)明所用此術(shù)語包括游離的二聚體以及Apo-2L三聚體形式中的Apo-2L二聚體(即與另一Apo-2單體結(jié)合)。術(shù)語"Apo-2配體三聚體"或"Apo-2L三聚體"指通過非共價(jià)鍵連接在一起的三個(gè)Apo-2L單體。"TNF家族成員"廣義上指與腫瘤壞死因子(TNF)在結(jié)構(gòu)或功能上有一些相似之處的各種多肽。本領(lǐng)域已知并記述了與TNF家族多肽相關(guān)的某些結(jié)構(gòu)和功能特征，例如，在上述的發(fā)明背景部分。這類多肽包括，但不僅限于本領(lǐng)域稱為TNF-a,TNF-p，CD40配體，CD30配體，CD27配體，OX-40配體，4-1BB配體，Apo-l配體(也稱為Fas配體或CD95配體)，Apo-2配體(也稱為TRAIL)，Apo-3配體(也稱為TWEAK),APRIL,OPG配體(也稱RANK配體，ODF，或TRANCE)，和TALL-1(也稱BlyS,BAFF或THANK)的那些(參見例如Gruss和Dower,血液，85:3378-3404(1995);Pitti等,生物學(xué)化學(xué)雜志，271:12687-126卯(1996);Wiley等，Immunity,3:673-682(1995);Browning等，細(xì)胞，72:847-856(1993);Armitage等，自然，357:80-82(1992),1997年1月16日公開的WO97/01633;1997年7月17日公開的WO97/25428;Marster等，Curr.Biol.,8:525-528(1998);Chicheportiche等，Biol.Chem.，272:32401-32410(1997);Hahne等，J.Exp.Med,,188:1185-1190(1998);W098/28426,1998年7月2日公開；W098/46751,1998年10月22日公開；WO/98/18921,1998年5月7日公開；Moore等，科學(xué)，285:260-263(1999);Shu等,J丄eukocyteBiol.,65:680(1999);Schneider等，J.Exp.Med.,189:1747-1756(1999);Mukhopadhyay等，生物學(xué)化學(xué)雜志，274:15978-15981(1999))。在此所用術(shù)語"標(biāo)記的表位，，指包含與"標(biāo)記多肽"融合的Apo-2配體或其一部分的嵌合多肽。標(biāo)記多肽有充足的殘基以提供表位以制備抗該表位的抗體，但是它要足夠短，不會(huì)干擾Apo-2配體的活性。標(biāo)記多肽也優(yōu)選是相當(dāng)獨(dú)特的，使得抗體基本上不與其它表位交叉反應(yīng)。合適的標(biāo)記多肽通常有至少6個(gè)氨基酸殘基，且通常為約8到約50氨基酸殘基(優(yōu)選約10-20個(gè)殘基)。術(shù)語"二價(jià)金屬離子，，指具有兩個(gè)正電荷的金屬離子。本發(fā)明所用二價(jià)金屬離子包括但不限于鋅，鈷，鎳，鎘，鎂，錳。這些金屬的可利用形式包括鹽形式(如藥物上可接受的鹽形式)，如上述二價(jià)金屬離子的鹽酸鹽，乙酸鹽，碳酸鹽，檸檬酸鹽和疏酸鹽。本發(fā)明所用優(yōu)選的二價(jià)金屬離子是鋅，更優(yōu)選其鹽形式，硫酸鋅。本發(fā)明優(yōu)選所用二價(jià)金屬離子的濃度或量(如有效量)足以，例如(l)在所需時(shí)間內(nèi)增強(qiáng)Apo-2L三聚體的保存穩(wěn)定性，(2)在重組細(xì)胞培養(yǎng)或純化方法中增強(qiáng)Apo-2L三聚體的生產(chǎn)量，(3)增強(qiáng)Apo-2L三聚體的溶解性(或減少凝聚)，(4)促進(jìn)Apo-2L三聚體的形成。"分離，"當(dāng)用于描述本文公開的各種蛋白時(shí)，是指從蛋白的天然環(huán)境的成分中鑒定，分離和/或回收的蛋白。其天然環(huán)境中的雜質(zhì)成分是通?？梢愿蓴_對(duì)該蛋白的診斷或治療的物質(zhì)，可能包括酶，激素，及其它蛋白性或非蛋白性溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白可以(l)純化至足以通過采用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀得到至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(2)純化至在非還原或還原條件下經(jīng)SDS-PAGE及考馬斯蘭或優(yōu)選銀染色證實(shí)為均質(zhì)的程度。分離的蛋白包括重組細(xì)胞中的原位蛋白，因?yàn)锳po-2配體天然環(huán)境中的至少一種成分不存在。但是通常，需要通過至少一步純化步驟制備分離的蛋白。"分離"的Apo-2配體核酸分子是從Apo-2配體的天然來源中通常與其結(jié)合的至少一種雜質(zhì)核酸分子中鑒定并分離的核酸分子。分離的Apo-2配體核酸分子的形式和設(shè)定不同于其在天然環(huán)境中所見。因此分離得到的Apo-2配體核酸分子不同于Apo-2配體核酸分子在其天然細(xì)胞中的狀態(tài)。但是分離得到的Apo-2配體核酸分子包括通常表達(dá)Apo-2配體的細(xì)胞中的Apo-2配體核酸分子，例如在所述細(xì)胞中，核酸分子所處染色體位置不同于天然細(xì)胞中的。在此鑒定的序列的"氨基酸序列同一性百分比(％)"定義為在比對(duì)序列及必要時(shí)引入缺口以獲得序列同一性的最大百分比，且不考慮作為序列同一性的部分的任何保守取代時(shí)，候選序列中與Apo-2配體序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。旨在確定氨基酸序列同一性百分比的比對(duì)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的能確定用于測(cè)定比對(duì)所需相應(yīng)參數(shù)的多種途徑完成，包括指定能獲得對(duì)全長(zhǎng)比對(duì)序列的最大比對(duì)所需的算法。為此目的，氨基酸序列同一性百分比可通過使用序列比對(duì)的計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2得到，該程序由Genentech,Inc.授權(quán)，其源代碼已連同用戶手冊(cè)提交美國(guó)版權(quán)局，華盛頓特區(qū)，20559,在美國(guó)版^又局注冊(cè)號(hào)碼TXU510087。該程序可從Genetech,Inc.,SouthSanFrancisco,CA^HH尋到。所有序列比對(duì)參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定，沒有改變。術(shù)語"調(diào)控序列"指在特定宿主生物中使可操作連接的編碼序列表達(dá)所必需的DNA序列。適于原核生物的調(diào)控序列可包括如啟動(dòng)子，任選操縱子序列，和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核生物細(xì)胞利用啟動(dòng)子，聚腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。當(dāng)核酸與另一核酸序列所處的位置使它們功能相關(guān)時(shí)，它們是"可操縱連接的"。例如，前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA如果表達(dá)為參與其多肽分泌的前蛋白，則其與編碼該多肽的DNA可操縱相連；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子如果影響一個(gè)編碼序列的轉(zhuǎn)錄則與該編碼序列可操縱相連；或者核糖體結(jié)合位點(diǎn)當(dāng)位于可促進(jìn)翻譯的位置時(shí)其與編碼序列可操縱連接。通常，"可操縱連接"意指所連接的DNA序列相鄰，如果是分泌前導(dǎo)序列，是指是相鄰且在閱讀狀態(tài)下。但是，增強(qiáng)子不必相鄰。連接可通過在方便的限制位點(diǎn)的連接反應(yīng)來完成。如果這類位點(diǎn)不存在，按照傳統(tǒng)方法使用合成的寡核苷酸銜接體或接頭。本文中的"生物活性的"或"生物活性"意指(a)在體內(nèi)或體外至少一種哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞或感染病毒的細(xì)胞中誘導(dǎo)或刺激凋亡的能力；(b)能夠形成抗體，即具有免疫原性；或(c)能夠結(jié)合和/或刺激Apo-2L的受體；或(d)保留天然Apo-2L多肽的活性。術(shù)語"凋亡，，和"凋亡活性，，使用其廣義，指哺乳動(dòng)物中有序地或受控形式的細(xì)胞死亡，通常伴隨著一個(gè)或多個(gè)特征性細(xì)胞變化，包括細(xì)胞質(zhì)濃縮，質(zhì)膜微絨毛的缺失，細(xì)胞核的i節(jié)革殳，染色體DNA的降解或線粒體功能的喪失。這種活性可通過，例如細(xì)胞活力分析，F(xiàn)ACS分析或DNA電13泳來確定和測(cè)定。術(shù)語"癌，，"癌性的"或"惡性的"是指或描述哺乳動(dòng)物中通常以失控的細(xì)胞生長(zhǎng)為特征的生理狀態(tài)。癌的例子包括但不限于癌(carcinoma)，淋巴瘤，白血病，母細(xì)胞瘤，肉瘤。這些癌的更具體的例子包括鱗狀細(xì)胞癌，小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌，惡性膠質(zhì)瘤，胃腸道癌癥，腎癌(renalcancer),卵巢癌，肝癌，結(jié)直腸癌，子宮內(nèi)膜癌，腎臟癌(kidneycancer),前列&，癌，曱狀腺癌，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，胰腺癌，多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，子宮頸癌，胃癌，膀胱癌，肝細(xì)胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，頭和頸部癌。術(shù)語"治療"在此是指治愈性治療和預(yù)防性治療。術(shù)語"哺乳動(dòng)物，，在此是指任何可歸類為哺乳動(dòng)物的動(dòng)物，包括人，牛，馬，狗和貓。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是人。II.本發(fā)明的組合物和方法已有文獻(xiàn)記述了與TNF配體家族相關(guān)的新的細(xì)胞因子，本文稱之為"Apo-2配體"。人Apo-2配體預(yù)計(jì)的成熟氨基酸序列包含281個(gè)氨基酸，理論分子量約為32.5kDa。缺乏信號(hào)序列和具有內(nèi)部的疏水區(qū)域表明Apo-2配體是一種II型跨膜蛋白。還有文獻(xiàn)記述了可溶性胞外區(qū)域Apo-2配體多肽。參見，例如公開于1997.7.17的W097/25428。還有文獻(xiàn)記述了Apo-2L取代變體。利用丙氨酸掃描技術(shù)證實(shí)了多種具有生物活性的取代變體分子。特定的Apo-2配體取代變體包括其中至少一個(gè)氨基酸被丙氨酸殘基取代的那些。這些取代變體祐:確定為，例如，"D203A";"D218A";"D269A"。使用此命名法確定Apo-2配體變體，它們?cè)?03,218和/或269位的天冬氨酸殘基(使用圖l(SEQIDNO:l)中的編號(hào))為丙氨酸殘基所取代?？蛇x地，Apo-2配體變體可能包含下表1中引用的一個(gè)或多個(gè)丙氨酸取代。本發(fā)明也提供了Apo-2配體胞外區(qū)域的x-射線晶體結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了丙氨酸掃描誘變以提供其受體接觸區(qū)域的圖像。所得Apo-2配體結(jié)構(gòu)顯示為一種同型三聚體蛋白，其包含一個(gè)新的協(xié)調(diào)Apo-2配體三聚體分子三個(gè)亞基之間相互作用的二價(jià)金屬離子(鋅)結(jié)合位點(diǎn)。借助TNF-a模型通過分子取代確定Apo-2配體的x-射線結(jié)構(gòu)(Eck等，生物學(xué)化學(xué)雜志，264:17595-17605(1989))，精確到3.9埃(對(duì)于114-281位殘基形式而言)和1.3埃(對(duì)于D218A變體；91-281位形式而言)。象TNF家族其它成員一樣，Apo-2配體表現(xiàn)出包含由三個(gè)薄巻樣(jellyroll)單體形成的緊湊三聚體形式，共約5100平方埃(每個(gè)單體1700平方埃)以形成^求狀三聚體(參見圖2A)。核心p鏈的位置相對(duì)于TNF家族的其它結(jié)構(gòu)性特征性成員，如TNF-a(Eck等，出處同上；Jones等,自然，338:225-228(1989)),TNF-(3(Eck等，生物化學(xué)雜志，267:2119-2122(1992))，和CD40L(Karpusas等，Structure,3:1031-1039(1995))是高度保守的，與TNF國(guó)a或TNF-p的核心帶相比r.m.s.d.為0.8埃。在所有現(xiàn)在已知的人TNF家族成員的序列之間，Apo-2配體三聚體界面中沒有一個(gè)殘基表現(xiàn)出是絕對(duì)保守的；但是，保留了這些殘基的疏水性化學(xué)性質(zhì)。(參見圖3)。Apo-2配體三聚體界面中保守的殘基集中靠近底部(三聚體的最寬部分)且沿三重軸聚集。在Cys230鄰近區(qū)中靠近Apo-2配體三聚體界面的頂部的位置，結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出不同，在每一結(jié)構(gòu)中190，s和230's環(huán)的構(gòu)象是可變的。與卩-支架核心相比，TNF家族成員之間環(huán)和受體結(jié)合表面的結(jié)構(gòu)顯著不同。Apo-2配體和TNF-a，TNF-p,CD40L的結(jié)構(gòu)間的一個(gè)不同是A和A，鏈間的連接。在TNF-a,TNF-P,CD40L中，A鏈后接一個(gè)緊密的環(huán)。在Apo-2配體中，一個(gè)15個(gè)殘基的插入部分加長(zhǎng)了此環(huán)并改變了其構(gòu)象。此環(huán)的第一部分(131-141位殘基)是無序的，而此環(huán)的第二部分(142-154位殘基)在該分子表面從一個(gè)單體-單體界面跨到下一個(gè)界面(參見圖2A)，其構(gòu)象類似CD40L的C-末端部分。申請(qǐng)人驚訝的發(fā)現(xiàn)在三聚體界面的頂部附近埋藏著一個(gè)新的二價(jià)金屬離子(鋅)結(jié)合位點(diǎn)。通過序列分析根據(jù)Cys230可將TNF家族成員分為三組(l)如TNF-a和Fas配體等蛋白，它們?cè)趯?duì)應(yīng)于Cys230的位置有一個(gè)半胱氨酸殘基能與相鄰環(huán)(Apo-2L中的194-203環(huán))上的另一半胱氨酸形成二碗^橋，從而不與金屬離子反應(yīng)，(2)沒有對(duì)應(yīng)于Cys230的半胱氨酸的那些蛋白(如TNF-P和OPGL)，和(3)只有一個(gè)對(duì)應(yīng)于Cys230的半胱氨酸殘基的那些蛋白。在其它種類中Apo-2L和其ortholog符合后一標(biāo)準(zhǔn)(即只有Cys230的蛋白)，預(yù)計(jì)它們可在三聚體表面結(jié)合二價(jià)金屬離子。Apo-2配體中緊接Cys230之前的主鏈的構(gòu)象與含二硫橋的TNF家族成員如TNF-a和CD40L不同。在Apo-2配體中，Cys230的側(cè)鏈指向界面而不是相反。在每一Apo-2配體單體中的Cys230殘基向內(nèi)指向三聚體軸并調(diào)整與內(nèi)部溶劑分子相連的二價(jià)金屬離子。此二價(jià)金屬離子表現(xiàn)出稍微變形的四面體幾何形狀，其鍵和角度與鋅結(jié)合位點(diǎn)吻合且完全不能接觸溶劑(參見圖2B)。使用電感耦合的等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)(參見實(shí)施例5)確認(rèn)所結(jié)合的金屬。在使用ICP-AES對(duì)Cd,Co,Zn，Ni,Cu的定量分析中，每摩爾Apo-2配體三聚體中檢測(cè)到0.79摩爾Zn和0.06摩爾Co,這證明結(jié)構(gòu)中的結(jié)合離子是鋅，摩爾比例約為1:1(參見實(shí)施例5)。觀察到Cys230被丙氨酸取代導(dǎo)致凋亡活性降低>8倍，說明此位點(diǎn)的重要性(參見實(shí)施例7)。而且，通過對(duì)螯合劑透析從Apo-2L中除去結(jié)合的金屬會(huì)導(dǎo)致DR5親和力降低7倍，凋亡活性降低>90倍(參見實(shí)施例6)。除去Zn^f吏半胱氨酸變得易于氧化，形成二硫鍵連接的Apo-2L二聚體，其凋亡活性會(huì)降低。由于金屬結(jié)合位點(diǎn)顯示出埋藏在Apo-2L三聚體結(jié)構(gòu)中且預(yù)計(jì)不會(huì)和受體接觸，該資料顯示二價(jià)金屬離子的結(jié)合對(duì)保持三聚體結(jié)構(gòu)和Apo-2L的穩(wěn)定性是重要的。為繪出Apo-2配體的受體結(jié)合位點(diǎn)，通過丙氨酸掃描誘變鑒定對(duì)于受體結(jié)合和生物活性有重要意義的氨基酸殘基。(Cunningham等，科學(xué)，244:1081-1085(1989》。在Argl49，Gln205,Val207,Tyr216，Glu236或Tyr237處的單個(gè)丙氨酸取代導(dǎo)致在生物檢測(cè)中凋亡活性降低5倍以上，并且對(duì)受體的親和力也降低了(參見實(shí)施例3和4)。對(duì)Apo-2L與DR4，DR5，DcR2的結(jié)合影響最大的是在殘基Gln205,Tyr216,Glu236或Tyr237處的丙氨酸取代，這會(huì)導(dǎo)致對(duì)全部三種受體的親和力降低至少5倍。所有這些顯現(xiàn)出凋亡活性降低的變體同樣顯示出與DR4或DR5(或兩者)的結(jié)合受到損害，這表明凋亡活性需要受體結(jié)合。殘基Asp218和Asp269的丙氨酸取代產(chǎn)生凋亡活性提高的Apo-2配體變體。(參見實(shí)施例4)。殘基Asp218靠近凋亡活性所需殘基之一的Tyr216。與低解像度Apo-2L結(jié)構(gòu)(114-281位的形式)的對(duì)比表明216-220環(huán)的構(gòu)象沒有因D218A突變的出現(xiàn)而顯著改變。將該誘變分析的結(jié)果繪制為Apo-2L三聚體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Apo-2L上受體結(jié)合和生物活性的功能性表位位于由兩個(gè)單體連接而形成的表面(參見圖5),近似于TNF-P。位于單體-單體界面的淺溝形成受體結(jié)合位點(diǎn)，使這兩種單體對(duì)該結(jié)合位點(diǎn)均有貢獻(xiàn)。TNF-a中的殘基Arg32,Tyr87和Aspl43(對(duì)應(yīng)于Apo-2L的Argl58，Tyr216，Asp267位殘基)同樣對(duì)TNF受體的結(jié)合起作用。(Goh等，蛋白質(zhì)工程(ProteinEngineeing),4:785-791(1991))。作為對(duì)照，TNF-a中的殘基(對(duì)應(yīng)于Apo-2L的Gln205，Glu236,Tyr237位殘基)在TNFR結(jié)合中只起很小的作用。所以，在TNF-a中三聚體結(jié)構(gòu)的底部對(duì)受體結(jié)合起最重要的作用，但在Apo-2L中，在三聚體結(jié)構(gòu)頂部也有重要的受體結(jié)合殘基。在已知結(jié)構(gòu)的TNF家族成員中，Apo-2L的獨(dú)特性表現(xiàn)在它與其靶受體之間具有更大和更寬的相互作用接觸表面。相信優(yōu)選的Apo-2L變體將在對(duì)應(yīng)于Argl49，Gln205,Val207,Tyr216,Glu236和/或Tyr237的位點(diǎn)含有天然殘基(即未突變的)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>以下說明書涉及通過培育宿主細(xì)胞來生產(chǎn)Apo-2配體并從細(xì)胞培養(yǎng)中回收多肽的方法，所述宿主細(xì)胞已用含有編碼Apo-2配體的核酸的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染?？蓮恼J(rèn)為具有Apo-2配體mRNA且將其以可檢測(cè)水平表達(dá)的組織中制備cDNA文庫，然后從任意這樣的cDNA文庫中得到編碼Apo-2配體的DNA。相應(yīng)地，可從由人組織制備的cDNA文庫中方便地得到人Apo-2配體DNA,例如W097/25428中記述的人胎盤cDNA的噬菌體文庫。編碼Apo-2配體的基因也可從基因組文庫獲得或通過寡核苷酸合成的方法得到?？墒褂迷O(shè)計(jì)為鑒定目的基因或其編碼蛋白的4罙針(如Apo-2配體的抗體或至少約20-80個(gè)堿基的寡核苦S吏)來篩選文庫。用所選探針篩選cDNA或基因組文庫可按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，1989)中的方法。分離編碼Apo-2配體基因的備選方法是釆用PCR的方法(Sambrook等，出處同上；Dieffenbach等，PCR引物實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，1995))。Apo-2配體的氨基酸序列片段或變體的制備方法可以是在Apo-2配體DNA中引入適合的核苷酸改變，或合成所要的Apo-2配體的多肽。這類片段或變體是在胞內(nèi)區(qū)域，跨膜區(qū)域，或胞外區(qū)域，或圖1所示全長(zhǎng)度Apo-2配體的氨基酸序列(SEQIDNO:l)的一或兩端上或之內(nèi)出現(xiàn)殘基的插入，取代，和/或缺失?？蛇M(jìn)行插入，取代，和/或缺失的任意組合以得到最終的構(gòu)建體，以使最終的構(gòu)建體具有，例如，本文定義的所需生物活性或凋亡活性。在一優(yōu)選的實(shí)施例中，所述片段或變體與本文鑒定為Apo-2配體的胞內(nèi)區(qū)域，跨膜區(qū)域，或胞外區(qū)域，或全長(zhǎng)的序列有至少約80。/。的M酸序列同一性，更優(yōu)選至少約90%的序列同一性，更優(yōu)選至少95%，96%，97%,98%或99%的同一性。氨基酸改變可能還會(huì)改變Apo-2配體的轉(zhuǎn)錄后加工，例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)量或位置或改變膜錨著特征。上述的Apo-2配體序列的改變可利用美國(guó)專利5364934中提出的針對(duì)保守和非保守突變的技術(shù)和指南進(jìn)行。這些包括寡核苷酸介導(dǎo)的(定點(diǎn))誘變，丙氨酸掃描和PCR誘變?？刹捎脪呙璋被岱治鲎C實(shí)沿著鄰近序列的一或多個(gè)氨基酸。優(yōu)選的掃描氨基酸是相對(duì)較小的，中性氨基酸。這類氨基酸包括丙氨酸，甘氨酸，絲氨酸和半胱氨酸。在此組中丙氨酸是典型的優(yōu)選掃描氨基酸，這是因?yàn)樗コ?3-C外的支鏈，且較不可能改變變體的主鏈構(gòu)象(Cunningham等，科學(xué)，244:1081(1989))。優(yōu)選丙氨酸也是因?yàn)樗亲畛Ｒ姷陌被?。此夕卜，它頻繁出現(xiàn)在埋藏和暴露位置(Creighton，蛋白質(zhì)(TheProteins)，(W.H.Freeman&Co.，NY);Chothia，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)，150:1(1976))。本發(fā)明特定的Apo-2L變體包括Apo-2配體多肽，所述多肽包含在下表I中列出的一或多個(gè)丙氨酸取代。這類Apo-2配體變體通常包含一個(gè)非自然產(chǎn)生的氨基酸序列，該序列與天然Apo-2L氨基酸序列(如圖1:SEQIDNO:1所示的Apo-2L全長(zhǎng)序列或其成熟形式或其胞外區(qū)序列)有至少一或多個(gè)氨基酸不同。任選地，Apo-2L變體中與天然Apo-2L相比不同的一或多個(gè)氨基酸將包括例如那些在表1中列出的氨基酸取代。本發(fā)明的Apo-2L變體包括可溶性變體，其含有圖l(SEQIDNO:l)的91-281,92-281，95-281或114-281位殘基，并且具有表1所列的一或多個(gè)氨基酸取代。優(yōu)選的Apo-2L變體包括含有圖l(SEQIDNO:l)中91-281,92-281,95-281或114-281位殘基，并且具有表1所列增強(qiáng)生物活性，如受體結(jié)合之一或多個(gè)氨基酸取代的變體。同樣包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的Apo-2配體序列的改變涉及氨基末端衍生或修飾形式。這類Apo-2配體序列包括本發(fā)明所述在多肽序列的N-末端具有蛋氨酸或修飾過的蛋氨酸(如甲酰曱硫氨酰化或其它分段曱硫氨?；念惲?j)的任一Apo-2配體多肽。編碼天然或變體Apo-2配體的核酸(如cDNA或基因組DNA)可插入到復(fù)制載體進(jìn)行進(jìn)一步克隆(DNA擴(kuò)增)或表達(dá)。各種載體都是公開可得的。載體組件通常包括，但不限于，下列的一或多個(gè)信號(hào)序列，復(fù)制起點(diǎn)，一或多個(gè)標(biāo)記基因，增強(qiáng)子元件，啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄終止序列，下面對(duì)每一個(gè)進(jìn)行了記述。可采用的任選信號(hào)序列，復(fù)制起點(diǎn)，標(biāo)記基因，增強(qiáng)子元件和轉(zhuǎn)錄終止序列為本領(lǐng)域所公知，詳述于WO97/25428。表達(dá)和克隆載體通常包括，可被宿主有機(jī)體識(shí)別并與Apo-2配體核酸序列可操縱連接的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子是不翻譯序列，位于結(jié)構(gòu)基因起始密碼子的上游(5')(通常在100到1000bp以內(nèi))，可控制特定核酸序列，如與之可操縱連接的Apo-2配體核酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。這類啟動(dòng)子典型地分為兩類，誘導(dǎo)型和組成型。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子響應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境中的一些改變，如某種營(yíng)養(yǎng)成分的存在或缺少，或溫度變化而調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄水平的提高?，F(xiàn)在為多種潛在的宿主細(xì)胞識(shí)別的大量的啟動(dòng)子已熟知。通過采用限制酶消化從來源DNA取出啟動(dòng)子，然后將分離的啟動(dòng)子序列插入載體，可將這些啟動(dòng)子與Apo-2配體^i從連接。天然Apo-2配體啟動(dòng)子序列和許多異源啟動(dòng)子都可用于指導(dǎo)Apo-2配體DNA的擴(kuò)增和/或表達(dá)。適合原核生物和真核生物宿主所用的啟動(dòng)子為本領(lǐng)域所熟知，W097/25428中有詳述。在大腸桿菌中生產(chǎn)可溶性Apo-2L的優(yōu)選方法采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)產(chǎn)物的表達(dá)。使用可控的，誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子可以在誘導(dǎo)產(chǎn)物表達(dá)和大量產(chǎn)物積累(至宿主可能不能很好耐受的程度)之前使細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)到所需密度。本申請(qǐng)人評(píng)價(jià)了用于表達(dá)Apo-2L(114-281位)的三種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)(T7聚合酶，trp和堿性磷酸酶(AP))。釆用這三種啟動(dòng)子中每一個(gè)都可從收獲的細(xì)胞團(tuán)中得到大量可溶性的，具生物活性的Apo-2L三聚體。在檢測(cè)的這三種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)中優(yōu)選AP啟動(dòng)子，因?yàn)樗蛇M(jìn)行更嚴(yán)格地啟動(dòng)子控制，且在收獲的細(xì)胞團(tuán)中得到了更高的細(xì)胞密度和滴度。采用標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)構(gòu)建包含一或多個(gè)上列部件的合適載體。切割，修剪，并重新連接分離的質(zhì)?；駾NA片段為所需的形式以便形成質(zhì)粒。為分析確認(rèn)構(gòu)建質(zhì)粒中的正確序列，使用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌抹294(ATCC31446)，通過氨千青霉素或四環(huán)霉素抗性挑選相應(yīng)的成功的轉(zhuǎn)化體。制備來自轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒，通過限制性內(nèi)切酶消化分析，和/或用本領(lǐng)域所知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。(參見，例如Messing等，核酸研究(NucleicAcidsRes.),9:309(1981));Maxam等，酶學(xué)方法(MethodsinEnzymology)，65:499(1980》?？刹捎糜糜谠诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)Apo-2配體編碼DNA的表達(dá)載體。通常，瞬時(shí)表達(dá)涉及使用可在宿主細(xì)胞中有效復(fù)制的表達(dá)載體，使宿主細(xì)胞積累該表達(dá)載體的許多拷貝，合成高水平的為該表達(dá)載體編碼的所需多肽(Sambrook等，出處同上)。包含合適的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)可以便利地對(duì)由克隆的DNA編碼的多肽進(jìn)行陽性鑒定，同樣可以快速篩選具有所要生物或生理性質(zhì)的多肽。這樣，瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)特別有用于本發(fā)明目的鑒定具有生物活性的Apo-2配體的類似物和變體。其它適于在重組脊推動(dòng)物細(xì)胞珞養(yǎng)中合成Apo-2配體的方法，載體和宿主細(xì)胞記述于Gething等，自然，293:620-625(1981);Mantei等，自然，281:40-46(1979);EP117060和EP117058中。適于在本文所述載體中克隆或表達(dá)DNA的宿主細(xì)胞包^r原核生物，酵母，或高等真核生物細(xì)胞。適于此目的的原核生物包括，但不限于真細(xì)菌，如革蘭氏陰性或陽性生物，如腸桿菌科如埃希氏菌屬，如大腸桿菌，腸桿菌屬，歐文氏菌屬，克雷伯氏菌屬，變形菌屬，沙門氏菌屬，如鼠傷寒沙門氏菌，沙雷氏菌屬，如粘質(zhì)沙雷氏菌，志賀氏菌屬，芽孢桿菌屬，如枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌(如1989年4月12日的DD266710公開的地衣芽孢桿菌41P)，假單胞菌屬如銅綠假單胞菌，鏈霉菌屬。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞分泌蛋白水解酶的量應(yīng)最小。本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。大腸桿菌特別適于Apo-2配體(114-281位)的表達(dá)，其為小于20kd且不需糖基化的多肽。作為生產(chǎn)宿主，大腸桿菌可培養(yǎng)到相對(duì)高的細(xì)胞密度，且相對(duì)M平地生產(chǎn)異源蛋白。除原核生物外，真核微生物如絲狀真菌或酵母也適于作編碼Apo-2配體的載體的克隆或表達(dá)宿主。適合于糖基化Apo-2配體表達(dá)的宿主細(xì)胞得自多細(xì)胞生物。所有這些宿主細(xì)胞的例子，包括CHO細(xì)胞，如W097/25428所述。用上述生產(chǎn)Apo-2配體的表達(dá)載體或克隆載體轉(zhuǎn)染并優(yōu)選轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞培養(yǎng)在已經(jīng)修飾適于誘導(dǎo)啟動(dòng)子，選擇轉(zhuǎn)化體，或擴(kuò)增編碼所需序列的基因的培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染指表達(dá)載體被宿主細(xì)胞吸收，而無論是否實(shí)際表達(dá)了任何編碼序列。多種轉(zhuǎn)染方法為普通技術(shù)人員所熟知，例如，CaP04和電穿孔。通常當(dāng)此載體的作用的任何指示表現(xiàn)在宿主細(xì)胞中時(shí)就可認(rèn)定轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)化意味著將DNA引入到生物中，使該DNA可作為染色體外元件或通過染色體整合體而復(fù)制。根據(jù)所用宿主細(xì)胞，釆用適于這類細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。Sambrook等(出處同上)所述利用了氯化鈣的鈣處理或電穿孔通常可用于原核生物或其它具有實(shí)際的細(xì)胞壁屏障的細(xì)胞。根癌農(nóng)桿菌感染可用于特定植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，如Shaw等，基因，23:315(1983)和1989年6月29日公開的WO89/05859。此外，可如1991年1月10日公開的WO91/00358所述采用超聲處理來轉(zhuǎn)染植物。對(duì)于沒有這類細(xì)胞壁的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可4吏用Graham和vanderEb，Virology,52:456-457(1978)所述的磷酸鈣沉淀的方法。US4399216記述了哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的各個(gè)方面。典型地，可按照VanSolingen等，J.Bact.，130:946(1977)和Hsiao等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院才艮，76:3829(1979)轉(zhuǎn)化酵母。但也可使用其它將DNA引入細(xì)胞的方法，如核顯微注射，電穿孔，細(xì)菌原生質(zhì)體與完整細(xì)胞融合，或聚陽離子，如polybrene，聚鳥氨酸。對(duì)于轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的各種技術(shù)，參見Keown等，酶學(xué)方法，185:527-537(1990)和Mansour等，自然，336:348-352(1998)。用于生產(chǎn)Apo-2配體的原核生物細(xì)胞可培養(yǎng)在適合的培養(yǎng)基中，如Sambrook等，出處同上，所述。在下面的實(shí)施例中還給出了用于培養(yǎng)大腸桿菌的特殊形式的培養(yǎng)基。用于生產(chǎn)Apo-2配體的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可培養(yǎng)在多種培養(yǎng)基中。市售培養(yǎng)基有Ham，sF10(Sigma),極限必需培養(yǎng)基("MEM，，，Sigma)，RPMI-1640(Sigma),Dulbecco'sModifiedEagles'sMedium("DMEM，，，Sigma)。任何這類培養(yǎng)基可在必要時(shí)補(bǔ)充激素和/或其它生長(zhǎng)因子(如胰島素，運(yùn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)，鹽(如氯化鈉，鈣，鎂和磷酸)，緩沖液(如HEPES)，核苷(如腺噤呤和胸腺嘧啶)，抗生素(如遺傳霉素TM),痕量元素(定義為無機(jī)化合物，通常最終濃度為inmol級(jí))，以及葡萄糖或等效的能源。任何其它必需的補(bǔ)充物質(zhì)都按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的合適的濃度添加其中。培養(yǎng)條件，如溫度，pH等等都與前面所選用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的條件相同，且對(duì)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員來說是顯而易見的。通常，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞生物技術(shù)實(shí)踐方法，M.Butler,編(IRL出版，1991)中可找到哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)能力最大化的原理，方法，和實(shí)踐技術(shù)。按照本發(fā)明，用于宿主細(xì)胞培養(yǎng)或發(fā)酵的培養(yǎng)基中可加入或包括一或多種二價(jià)金屬離子。存在于或加入到培養(yǎng)基中的二價(jià)金屬離子的濃度優(yōu)選足以提高保存穩(wěn)定性，提高溶解性，或有助于形成穩(wěn)定的受一或多個(gè)鋅離子調(diào)節(jié)的Apo-2配體三聚體。加入的二價(jià)金屬離子的量部分有賴于培養(yǎng)液中的宿主細(xì)胞密度或宿主細(xì)胞對(duì)這些二價(jià)金屬離子的潛在敏感性。當(dāng)培養(yǎng)液中宿主細(xì)胞密度較高時(shí)，提高二價(jià)金屬離子的濃度較有利。如果在宿主細(xì)胞的產(chǎn)物表達(dá)期間或之后加入二價(jià)金屬離子，可隨宿主細(xì)胞產(chǎn)物表達(dá)的增加而調(diào)整或提高二價(jià)金屬離子濃度。通常認(rèn)為常用細(xì)胞培養(yǎng)基中的痕量的二價(jià)金屬離子不足以促使穩(wěn)定三聚體的形成。所以，優(yōu)選如本文所述進(jìn)一步添加二價(jià)金屬離子。優(yōu)選在宿主細(xì)胞生長(zhǎng)階段將二價(jià)金屬離子加入到培養(yǎng)基中時(shí)，其濃度不會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)有不利或負(fù)面影響。在搖瓶培養(yǎng)中，觀察到ZnS04的加入濃度大于lmM時(shí)會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞密度低。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，細(xì)菌細(xì)胞能通過與細(xì)胞基質(zhì)形成金屬離子復(fù)合物有效螯合金屬離子。如此，在細(xì)胞培養(yǎng)液中，優(yōu)選在細(xì)胞生長(zhǎng)階段后(達(dá)到所要的宿主細(xì)胞密度后)或恰好在宿主細(xì)胞的產(chǎn)物表達(dá)之前加入所選的二價(jià)金屬離子。為確保存在足夠量的二價(jià)金屬離子，可能要在產(chǎn)物表達(dá)階段加入額外的二價(jià)金屬離子。培養(yǎng)基中二價(jià)金屬離子的濃度不應(yīng)超過對(duì)宿主細(xì)胞有毒害作用的濃度。在本發(fā)明使用大腸桿菌為宿主細(xì)胞的方法中，優(yōu)選培養(yǎng)基中二價(jià)金屬離子濃度不超過約lmM(優(yōu)選SlmM)。更優(yōu)選所述濃度為約50-250|iimol。最優(yōu)選這類方法中的二價(jià)金屬離子是硫酸鋅。二價(jià)金屬離子需要加入的量應(yīng)使金屬離子和Apo-2配體三聚體摩爾比為1:1。二價(jià)金屬離子可以任何可接受的形式加入到細(xì)胞培養(yǎng)液。例如，可用水配制金屬離子溶液，然后將二價(jià)金屬離子溶液加入或流加到培養(yǎng)基中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所選的Apo-2配體(114-281位)在大腸桿菌中表達(dá)，且在細(xì)胞培養(yǎng)或發(fā)酵期間，設(shè)定工藝參數(shù)使得在培養(yǎng)物約為40-50gm/L細(xì)胞干重時(shí)以約1.0-3.0mmol/L-min的氧攝入率進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)各種活動(dòng)。優(yōu)選新合成的新生Apo-2配體多肽有足夠的時(shí)間使Apo-2L單體進(jìn)行正確的蛋白折疊和三聚體化。發(fā)酵培養(yǎng)的生長(zhǎng)階段優(yōu)選在3CTC進(jìn)行。在產(chǎn)物表達(dá)即將出現(xiàn)之前，工藝溫度控制點(diǎn)可保持在30。C或下移到25。C以便隨后的發(fā)酵。任選地，可能需要提高培養(yǎng)中細(xì)胞密度，上述參數(shù)也要相應(yīng)調(diào)整(或22提高)。例如，提高培養(yǎng)中細(xì)胞密度以提高單位體積產(chǎn)量可能是有利的。如果需要，本領(lǐng)域技術(shù)人員能通過常規(guī)技術(shù)遞增細(xì)胞密度并且遞增上述的參數(shù)?？芍苯訙y(cè)定樣品中Apo-2L的表達(dá)，例如采用合適的標(biāo)記探針，根據(jù)本文提供的序列通過常規(guī)Southern印跡，定量mRNA的轉(zhuǎn)錄的Northern印跡(Thomas，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，77:5201-5205(1980))，斑點(diǎn)印跡(DNA分析)，或原位雜交等方法?？墒褂枚喾N標(biāo)記，最常用的是放射性同位素，具體是32P。但是也可采用其它方法，如利用生物素修飾的核苷酸以引入多核苷酸。然后生物素成為結(jié)合抗生物素蛋白或抗體的位點(diǎn)，后者可用多種標(biāo)記，如放射性核苦酸，熒光劑或酶標(biāo)記。替代地，可使用能識(shí)別特定的雙鏈體(duplex),包括DNA雙鏈體，RNA雙鏈體，和DNA-RNA雜合雙鏈體或DNA-蛋白雙鏈體的抗體?？贵w可被標(biāo)記且可在所述雙鏈體與某一表面結(jié)合處進(jìn)行檢測(cè)，從而根據(jù)表面雙鏈體的形成檢測(cè)到與該雙鏈體結(jié)合的抗體?；蛘呖赏ㄟ^免疫學(xué)方法檢測(cè)基因表達(dá)，如通過細(xì)胞或組織切片的免疫組織化學(xué)染色，細(xì)胞培養(yǎng)液或體液的分析，直接定量基因產(chǎn)物的表達(dá)。采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，制備細(xì)胞樣品的典型方法為脫水和固定，然后與特異性針對(duì)所結(jié)合的基因產(chǎn)物的標(biāo)記抗體反應(yīng)，其中所述標(biāo)記是通?？赡繙y(cè)檢測(cè)的，如酶標(biāo)記，熒光標(biāo)記，發(fā)光標(biāo)記等。免疫組織化學(xué)染色和/或樣品液分析所用抗體可以是單克隆的或多克隆的，可在任何哺乳動(dòng)物中制備。抗體制備成針對(duì)天然Apo-2配體多肽或針對(duì)基于本文所述DNA序列的合成肽或針對(duì)與Apo-2配體DNA融合并編碼特異性抗體表位的外源序列的抗體較為方便。盡管Apo-2配體當(dāng)沒有分泌信號(hào)而直接產(chǎn)生時(shí)也可從宿主細(xì)胞裂解液回收，優(yōu)選從培養(yǎng)液作為分泌型多肽回收。如果Apo-2配體是膜結(jié)合型，可使用合適的清洗劑(如Triton-X100)從膜釋放，或可通過酶解釋放其胞外區(qū)。當(dāng)Apo-2配體產(chǎn)生于重組細(xì)胞而不是一種人類細(xì)胞中時(shí)，該Apo-2配體不含人源蛋白或多肽。但是，通常從重組細(xì)胞蛋白或多肽中回收或純化Apo-2配體以得到基本均質(zhì)的Apo-2配體制品是必需的。第一步，離心培養(yǎng)液或裂解液以除去顆粒狀細(xì)胞碎片。然后從可溶性雜質(zhì)蛋白和多肽中純化Apo-2配體，下面的步驟可作為純化步驟舉例在離子交換柱上分級(jí)分離；乙醇沉淀；反相HPLC;硅或陽離子交換樹脂如DEAE或CM層析；層析聚焦；SDS-PAGE;硫酸銨沉淀；采用如SephadexG-75的凝膠過濾；滲濾和蛋白ASephrose柱除去雜質(zhì)如IgG。在一優(yōu)選的實(shí)施例中，可采用親和層析分離Apo-2配體。以與天然Apo-2配體相同的方式回收發(fā)生了殘基缺失，插入或取代的Apo-2配體片段或變體，并考慮由所述變異引起性質(zhì)的任何實(shí)質(zhì)性變化。例如，制備Apo-2配體與另一蛋白或多肽，例如細(xì)菌或病毒抗原的融合體利于純化；可用含有所述抗原的抗體的免疫親和柱吸附該融合多肽。蛋白酶抑制因子如苯曱基磺酰氟(PMSF)可用于純化過程中抑制蛋白水解性降解，還可使用抗生素預(yù)防外來雜質(zhì)的生長(zhǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解適于天然Apo-2配體的純化方法可能需要進(jìn)行改動(dòng)以適應(yīng)重組細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)的Apo-2配體或其變體的特性的改變。在任何這類純化過程中，可能需要將回收的Apo-2配體暴露于二價(jià)金屬離子溶液或含有一或多種二價(jià)金屬離子的純化材料(如層析介質(zhì)或載體)。在一優(yōu)選的實(shí)施例中，在Apo-2配體的純化或回收過程中使用二價(jià)金屬離子和/或還原試劑任選地，在Apo-2L的回收或純化期間，二價(jià)金屬離子和還原劑，如DTT或BME都可使用。認(rèn)為在回收或純化過程中使用二價(jià)金屬離子有助于Apo-2L三聚體的穩(wěn)定性或保持細(xì)胞培養(yǎng)過程中形成的Apo-2L三聚體。從原核生物宿主細(xì)胞(最優(yōu)選從細(xì)菌宿主細(xì)胞)回收和純化所表達(dá)的Apo-2L的優(yōu)選方法包括如下步驟(a)從大腸桿菌細(xì)胞提取Apo-2L(胞內(nèi)型)；(b)在含二價(jià)金屬離子和/或還原劑的緩沖液中穩(wěn)定正確折疊的Apo-2L;(c)通過依次使用陽離子交換劑，羥基磷灰石和疏水作用層析純化Apo-2L，和(d)從每一這類層析載體上用含二價(jià)金屬離子和/或還原劑的緩沖液選擇性洗脫Apo-2L。此類方法中所用二價(jià)金屬離子和還原劑可包括硫酸鋅，氯化鋅，硫酸鈷，DTT和BME,更優(yōu)選硫酸鋅或DTT。下面的實(shí)施例8更為詳盡地記述了此回收和純化方法。如上所述，除Apo-2配體外，本發(fā)明的這類方法還適用于各種其它蛋白，所述蛋白的三聚體形式具有改進(jìn)的活性或需要蛋白的三聚體化以具有活性。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>本發(fā)明也提供了含有Apo-2配體和一或多種二價(jià)金屬離子的制劑。相信這類制劑特別適用于保存(和維持Apo-2配體的三聚體化)，以及用于治療性給藥。優(yōu)選的制劑包含Apo-2配體和鋅或鈷。更優(yōu)選地，制劑將包含Apo-2配體和鋅或鈷溶液，其中所述金屬與蛋白的摩爾比小于2X。如果需要水性的懸浮液，制劑中二價(jià)金屬離子對(duì)蛋白的摩爾比大于2X。采用硫酸鋅，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)Apo-2配體(114-281位)沉淀并在制劑中硫酸鋅濃度約為100mM時(shí)形成水性懸浮液。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解摩爾比大于2X時(shí)，制劑中二價(jià)金屬離子濃度會(huì)在較高范圍，此時(shí)該金屬會(huì)對(duì)制劑有害或不能作為治療用制劑?？刹捎靡阎夹g(shù)制備所述制劑。例如，可通過凝膠過濾柱上的緩沖液交換來制備Apo-2配體制劑。通常，在制劑中采用合適量的可藥用鹽以使該制劑為等滲?？伤幱幂d體的例子包括生理鹽水，Ringer，s溶液和葡萄糖溶液。優(yōu)選制劑的pH約為6-9，更優(yōu)選約7-7.5。優(yōu)選地，所選pH可確保維持鋅與Apo-2配體結(jié)合。如果pH太高或太低，鋅不能保持與Apo-2配體的結(jié)合，結(jié)果會(huì)形成Apo-2配體的二聚體形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，某些載體可能更優(yōu)選依賴于，例如，給藥途徑以及Apo-2配體和二價(jià)金屬離子的濃度。Apo-2L的藥用組合物的制備可以是將具有合適純度的所需Apo-2配體分子與任選的可藥用載體，賦形劑，或穩(wěn)定劑混合(Remington，s藥用科學(xué)，16th版，Oslo,A編(1980))，制成凍干制劑，水溶液或水性懸浮液?？山邮艿妮d體，賦形劑或穩(wěn)定劑優(yōu)選在所用劑量和濃度下對(duì)接受者無毒，它們包括緩沖液如Tris，HEPES，PIPES,磷酸，檸檬酸和其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基千基氯化銨；氯化乙烷雙胺；苯扎氯胺，氯化千乙氧銨；酚，丁醇或千醇；對(duì)羥基苯甲酸烷基酯如對(duì)羥基苯曱酸曱酯或?qū)αu基苯曱酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間-曱酚)；低分子量(小于10個(gè)殘基)多肽；蛋白如血清白蛋白，明膠，或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，組氨酸，精氨酸，或賴氨酸；單糖，二糖，其它碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖或糊精；糖類如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子如鈉；和/或非離子表面活性劑如TWEEN,PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。其它這類載體包括離子交換劑，礬土，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白，如人血清白蛋白，緩沖物質(zhì)如甘氨酸，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，硅膠，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，和基于纖維素的物質(zhì)。局部用藥的載體或基于凝膠的載體包括多糖如羧甲基纖維素鈉或曱基纖維素鈉，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙烯酸酯，聚氧乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物，聚乙二醇，木蠟醇。對(duì)所有給藥而言，適合用常規(guī)的延效型制劑。這類劑型包括，例如微膠嚢，納米膠嚢(nano-capsules),脂質(zhì)體，藥膏，吸入劑型，噴鼻劑型(nosespray),舌下片劑和控釋制劑。制劑中Apo-2配體的有效劑量可根據(jù)經(jīng)-險(xiǎn)確定，這類確定可由本領(lǐng)域技術(shù)人員完成?，F(xiàn)認(rèn)為Apo-2配體的有效劑量為每天約lpg/kg-100mg/kg體重或更多。劑量的種間縮》文比例可以4安本領(lǐng)域已知方式進(jìn)行，如Mordenti等，Pharmaceut.Res.,8:1351(1991)中所述。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解Apo-2配體給藥劑量將根據(jù)，例如要接受Apo-2配體的哺乳動(dòng)物，給藥途徑，和給哺乳動(dòng)物的其它藥物或治療的不同而不同。用于體內(nèi)給藥的Apo-2L必須是無菌的。這可以在凍干和重新調(diào)配之前或之后通過除菌濾膜過濾而輕易實(shí)現(xiàn)。全身性給藥的Apo-2配體通常以凍干或溶液形式保存。凍干形式的Apo-2配體通常與其它成分一起配制，臨用時(shí)再用適當(dāng)稀釋劑重建。Apo-2配體的液體制劑可以是無菌，澄清，無色未加防腐劑的溶液，盛放于一次劑量的小瓶中用于皮下注射。治療用Apo-2配體制劑通常存放于有無菌出入口的容器中，例如，靜脈注射液袋或帶有能通過皮下注射針穿刺的塞子的小瓶。制劑優(yōu)選通過多次的靜脈(i.v.),皮下(s.c.),肌肉(i.m.)注射或輸注給藥，或作為適用于鼻內(nèi)或肺內(nèi)輸送的氣溶膠而給藥(肺內(nèi)輸送參見例如EP257956)。Apo-2配體也可以以控釋制劑形式給藥?？蒯屩苿┑倪m當(dāng)實(shí)例包括含有所述蛋白的固態(tài)疏水聚合物的半通透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為具有一定形狀的制品，如膜或微膠嚢?？蒯尰|(zhì)實(shí)例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥乙基-異丁烯酸酯)(如Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)和Langer，Chem.Tech.,12:98-105(1982)所述)或聚(乙烯醇)，聚交酯(US3，773，919,EP58481),L-谷氨酸與y乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers,21547-556(1983)),不可降解的乙烯乙酸乙酯(Langer等，出處同上)，可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LupronDepot(由乳酸-羥基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolide)組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸(EP133988)。本發(fā)明所述Apo-2配體及其制劑可用于許多治療和非治療用途。其中有治療多種癌癥(如上)和病毒性病癥的方法。這類治療和非治療用途如W097/25428和WO97/01633中所述。包含可用于上述疾病的診斷或治療的Apo-2配體的一種生產(chǎn)制品，如試劑盒包括至少一個(gè)容器和一個(gè)標(biāo)簽。適當(dāng)?shù)娜萜饔衅孔?，小瓶，注射器和試管等。容器可由各種材料如玻璃或塑料制成。該容器可內(nèi)含一種能有效診斷或治療目標(biāo)疾病的Apo-2L制劑，并具有無菌出入口(例如該容器可以是靜脈注射液袋或帶有能通過皮下注射針穿刺的塞子的小瓶)。容器表面的或所附的標(biāo)簽將指明所述制劑可用于診斷或治療所選疾病。所述制品還可包含第二個(gè)容器，該容器中含有可藥用緩沖液，如磷酸鹽緩沖液，Ringer，s溶液和葡萄糖溶液。還可包括具有商業(yè)需要以及符合用戶需要的材料，包括其它緩沖液，稀釋劑，濾器，針頭，注射器和用于指導(dǎo)使用的包裝插頁。所述制品還可包含帶有上述另一活性制劑的第二個(gè)或第三個(gè)容器。下面的實(shí)施例只用于舉例說明，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明中引用的所有發(fā)明和文獻(xiàn)都全文引入作為參考。實(shí)施例實(shí)施例中所指市售試劑除非特別指明，都按照生產(chǎn)商手冊(cè)使用。按照ATCC保藏號(hào)碼在下列實(shí)施例和說明書全文中定義的細(xì)胞來源是美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,Manassas,Wrginia。實(shí)施例1Apo-2L變體的表達(dá)和純化通過對(duì)質(zhì)粒(pAPOK5)(參見圖13)進(jìn)行寡核苷酸指導(dǎo)的誘變來構(gòu)建Apo-2L的丙氨酸取代變體(Kunkel等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，82:488-492(1985));Kunkel,酶學(xué)方法，154:367-382(1987)),所述質(zhì)粒設(shè)計(jì)為可在frp啟動(dòng)子控制下于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Apo-2L的91-281位氨基酸。借助PCR構(gòu)建pAPOK5以便將Apo-2LcDNA(編碼91J81位殘基)克隆進(jìn)帶有啟動(dòng)子的質(zhì)粒pSl162。用該突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌抹294在37°C下250mlM9加100pmZnS04的培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期中期，加入25|ig/mL(3-吲哚丙烯酸誘導(dǎo)表達(dá)，然后將培養(yǎng)物于30。C下培養(yǎng)過夜。通過離心收獲細(xì)胞并冷凍。在6倍體積0.1MTris-HClpH8，0.2MNaCl,5mMDTT，lmMEDTA中勻漿上述細(xì)胞團(tuán)，在加入有鎳的hiTRAT螯合柱(Pharmacia)上通過IMAC從可溶性級(jí)分分離Apo-2L。Apo-2L對(duì)固定化的金屬有弱親和性，可用低濃度的咪唑洗脫。在SPhiTRAP柱(Pharmacia)上通過陽離子交換層析進(jìn)行最后的純化。測(cè)定吸光度并以e珈為1.4mg"ml.cm"來確定純化Apo-2L變體的濃度。表1中列出了通過寡核苷酸指導(dǎo)的誘變證實(shí)的Apo-2L變體。表1Apo-2L變體的受體結(jié)合和凋亡活性a比例(變體/野生型)變體DR4-lgGDR5-IgGDcR2-IgG竭亡厶加cR130AN134AL136AS138AN140AS141AK142AN143AR149AS153AE155AR158AS159AR170AK179AR191AQ193AE195AK197DK201AN202AD203AQ205AV207AY213A'Y216AD218AC230SE236AY237AY240AK25IAS259AH264AD267AD269A2ri<5613od1oiL21;4!SJ4;乂1;22-Lrt53.c5Lf丄110121916785<<"刀刀27J3c.l29L22-OSGJ刀9j0,1HLOSOJ7;28a所示數(shù)值代表了變體對(duì)野生型的比例。對(duì)野生型Apo-2L(91-281位殘基)而言，DR4-IgG,DR5-IgG，DcR2-IgG的Kd值是0.8土0.3nM,0.9土0.4nM，0.3士0.2nM。在凋亡試驗(yàn)中野生型Apo-2L(91-281位殘基)的ED5Q為24±3.1ng/mL，而Apo-2L的114-281位形式的活性稍」微高一些，ED50為16.0±3.6ng/mL。只有與野生型的值相比兩倍的改變才認(rèn)為是顯著的。實(shí)施例2Apo-2L的結(jié)晶學(xué)分析20。C下Apo-2L的晶體(l14-281位殘基)在位于一孔50%peg2KMME溶液之上的70pL靜止液滴(sittingdrop)中生長(zhǎng)，該液滴中含有40pL蛋白(濃度2,6mg/mL，在20mMTris，pH8.0中)，20|aL50mMTrispH8.0，lOpL8%peg2KMME,所述晶體屬于空間群P63，其中在不對(duì)稱單位中具有兩個(gè)單體，晶胞常數(shù)a-72.5,c-140埃并在室溫下衍射為3.9埃。D218A變體的晶體(參見實(shí)施例1)4。C下在位于一孔32%MPD溶液之上的14pL靜止液滴中成長(zhǎng)，該液滴中含有4]liL4%MPD和1OpL蛋白(1.7mg/ml，在20mMTris,pH7.5中)，所述晶體屬于空間群R32，其中每個(gè)不對(duì)稱單位有一個(gè)單體，晶胞參數(shù)66.4，c=197.7埃，-180"€經(jīng)synchrotonradiation衍射為1.3埃。在裝備有MAR檢測(cè)器并具有DENZO/SCALEPACK的Rigaku旋轉(zhuǎn)陽極X-射線發(fā)生器上測(cè)定Apo-2L(114-281位殘基)衍射為3.9埃和D218A變體衍射為1.9埃的數(shù)據(jù)組(Otwinowski等，ProceedingsoftheCCP4StudyWeekend:DataCollectionandProcessing(eds.Sawyer等),pp.56-62DaresburyLaboratory,Daresbury，England,1993)。在ArgonneNationalLabs的高級(jí)光子源(AdvancedPhotonSource)上測(cè)定D218A變體的1.3埃數(shù)據(jù)組。用HKL2000/SCALEPACK處理且Rsym為6.4%(在1.35-1.30shell中34%)，具有100%完整性和12倍冗余度，I/<I>=12.4。采用Amore程序借助基于TNF-a(pdb編碼1TNTF)的模式通過分子堆放解釋天然Apo-2L結(jié)構(gòu)(ActaCryst.D50:760-763(1994)),并采用嚴(yán)4各2倍非晶體學(xué)約束使之精細(xì)化(Brunger,X-PLOR:版本3.1，YalePress，NewHaven1987),直到Rfree為35%。用Refinac和SHELXL將該結(jié)構(gòu)針對(duì)1.9埃數(shù)據(jù)組精細(xì)化直到R^為25%，并最終對(duì)1.3埃數(shù)據(jù)進(jìn)行精細(xì)化(Sheldrick等，酶學(xué)方法，pp.319-343，AcademicPress,SanDiego1997)直到、為22%且Rfec加為20%，其具有較好幾何形狀(rmsd鍵0.011埃，rmsd角度1.7°)。所有的殘基都在Ramachandran圖中允許的區(qū)域內(nèi)。在精細(xì)化過程中，在三聚體軸上對(duì)稱相關(guān)的Cys230之間可觀察到一個(gè)28sigma的電子密度峰值。此密度以鋅離子作模型，用B-系數(shù)精細(xì)化為10。據(jù)認(rèn)為在三聚體軸上的氯分子作為鋅的第四個(gè)配體而存在。最終的it型由帶有170個(gè)溶劑分子和一個(gè)鋅離子和一個(gè)氧離子的120-130，142-194，203-281位殘基組成。91-119，131-141和195-202位殘基為無序狀態(tài)。幾種晶體的N-末端測(cè)序證實(shí)N-末端是完整的，而起始物質(zhì)的質(zhì)譜分析表明其為全長(zhǎng)。圖2C總結(jié)了結(jié)晶學(xué)數(shù)據(jù)。實(shí)施例3Apo-2L變體的受體結(jié)合親和性的確定通過在PharmaciaBIAcore1000上進(jìn)行的表面等離子體激元共振(SPR)測(cè)量法測(cè)定Apo-2L變體(參見表l)與固相受體免疫粘附素結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)。分別依照1998年11月19日公開的W098/51793和1999年3月9日公開的WO99/10484所述制備DR5-IgG(也稱為Apo-2-IgG)和DcR2-IgG受體免疫粘附素?！缦轮苽銬R4-IgG。將成熟DR4ECD序列(1-218位氨基酸；Pan等，出處同上)克隆至pCMV-lFlag載體(Kodak)中Flag信號(hào)序列下游，并如前所述(Aruffo等，細(xì)胞，61:1303-1313(19卯))與人免疫球蛋白Gl重鏈的CH1、絞鏈區(qū)和Fc區(qū)融合。如Ashkenazi等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院4艮，88:10535-10539(1991)所述，免疫粘附素通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至人293細(xì)胞中而表達(dá)，然后采用蛋白A親和層析從細(xì)胞上清中純化。采用胺耦合化學(xué)(aminecouplingchemistry)(PharmaciaBiosensor)使受體免疫粘附素蛋白與傳感器芯片表面在1000-2000共振單位的水平上耦合。記錄在15.6nM到500nM的濃度范圍以2倍增長(zhǎng)的Apo-2L結(jié)合的傳感圖譜(Sensorgrams)。通過非線性回歸分析確定動(dòng)力學(xué)常數(shù)，并用于計(jì)算結(jié)合常數(shù)。所得結(jié)果顯示于表l中。實(shí)施例4Apo-2L變體的體外凋亡活性變體的凋亡活性。在含有0.1%BSA的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)中配制Apo-2L(114-281位)或Apo-2L變體(參見表l)的2倍系列稀釋液，將每種稀釋液50nL移入96孑LFalcon組織培養(yǎng)微板的單個(gè)孔中。以2x104個(gè)細(xì)胞/孔的密度力。入50pLSKMES-1人肺癌細(xì)胞(ATCCHTB58)(在RPMI-1640，0.1。/。BSA中)?；旌衔?7。C下孵育24小時(shí)。20小時(shí)時(shí)，加入25|liLalamarBlue(AccuMed，Inc.，Westlake,Ohio)。通it^530nm;敫發(fā)后測(cè)定590nm處的相對(duì)熒光而確定細(xì)胞數(shù)。通過使用一種4參數(shù)吻合法來分析這些數(shù)據(jù)，以便計(jì)算ED5(),它是在細(xì)胞生存力上減少了50%的Apo-2L濃度。在殘基Argl49，Gln205,Val207，Tyr216，Glu236，Tyr237處的單個(gè)丙氨酸取代導(dǎo)致在所述生物試驗(yàn)中凋亡活性下降5倍以上，并且表現(xiàn)出對(duì)DR4,DR5，DcR2的親和力降低(表1)。Apo-2L對(duì)這些受體的結(jié)合受Gln205，Tyr216,Glu236，Tyr237處的丙氨酸取代的影響最大，所有這些取代都會(huì)導(dǎo)致對(duì)所有三種受體的親和力降低至少5倍。所有表現(xiàn)出凋亡活性降低的Apo-2L變體同樣表現(xiàn)出與DR4或DR5(或兩者)的結(jié)合受到損害，這表明所述生物學(xué)效應(yīng)需要受體結(jié)合。Asp218或Asp269的丙氨酸取代導(dǎo)致凋亡活性提高2倍以上。值得注意的是大多數(shù)丙氨酸取代對(duì)DR4和DR5結(jié)合有相似的影響，唯一的例外是Glnl93,Glul95,Ser259，His264,Asp267的突變，所有這些突變都對(duì)DR4結(jié)合有大于5倍的影響(親和力降低)，但對(duì)DR4-結(jié)合的影響卻很小或幾乎可以忽略。DcR2-結(jié)合的變化傾向于與DR4結(jié)合的效應(yīng)平行。減小的凋亡活性顯示出與降低的DR5結(jié)合最密切相關(guān)，表明SK-MES應(yīng)答Apo-2L給藥時(shí)死亡信號(hào)的傳遞需要DR5。實(shí)施例5元素分析和定量分析確定Apo-2L的金屬含量采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)進(jìn)行Apo-2L的元素分析。為此，使用配制在20mMTris,pH7.5中的2mg/mLApo-2L溶液(按照W097/25428公開的方法在大腸桿菌中生產(chǎn)的114-281位殘基；按照在此所述方法在發(fā)酵或純化過程中不加入額外量的二l介金屬離子)。確定樣品和制劑緩沖液的一部分中Cd，Co,Zn，Ni,Cu的含量。表n樣品CdCoZnNiCu緩沖液-0.058-0.090-o細(xì)-0.098-0.082Apo-2L-0.0580.1991.712-0.108-0.075與Apo-2L結(jié)合的金屬是Zn和Co(表11)。理論摩爾比為每摩爾Apo-2L三聚體0.79摩爾Zn和每摩爾Apo-2L三聚體0.06摩爾Co。這些數(shù)據(jù)表明每個(gè)Apo-2L三聚體有一個(gè)鋅結(jié)合位點(diǎn)。此Apo-2L制品中85%的所述位點(diǎn)被金屬占據(jù)。實(shí)施例6使用螯合劑從Apo-2L除去結(jié)合鋅所造成的影響用螯合劑處理Apo-2L(114-281位)樣品除去結(jié)合鋅。樣品首先對(duì)1000倍體積的50mMEDTA透析，換液2次，然后對(duì)1000倍體積的2mM1,10-菲羅啉透析，換液2次，最后對(duì)1000倍體積的無金屬的20mMTrispH7.5透析。在樣品進(jìn)行螯合處理之前和之后檢測(cè)其受體結(jié)合，金屬含量和凋亡活性。受體結(jié)合按照實(shí)施例3所述測(cè)定，金屬含量用ICP-AES測(cè)定，凋亡活性按照實(shí)施例4所述測(cè)定。ICP-AES顯示，透析步驟除去了結(jié)合鋅。此處理后，受體親和力顯著減少(表I)并且凋亡活性降低90倍(圖4)。在AVIV儀(Lakewood，NJ)202型分光偏振儀上記錄圓二色語(circulardichroicspectra)。光鐠從250nm掃描到200nm,其中步長(zhǎng)0.5nm,平均時(shí)間5秒，長(zhǎng)方形石英比色皿光路長(zhǎng)度lcm。含PBS的溶液中蛋白濃度為2pM。如圖6所示，Apo-2L(114-281位)發(fā)出具有高含量P-折疊的蛋白的典型CD光鐠。結(jié)合鋅的去除導(dǎo)致二色峰的強(qiáng)度降低，這表明P-折疊的含量減少了。圓二色性用于監(jiān)測(cè)鋅的去除對(duì)Apo-2L(114-281位)熱穩(wěn)定性的影響。這些實(shí)驗(yàn)也采用lcm長(zhǎng)方形石英比色皿和2jiM的蛋白濃度。當(dāng)樣品從30。C加熱到100。C時(shí)監(jiān)測(cè)225nm處圓二色性。每增長(zhǎng)2。C,後_樣品在該溫度下平衡1分鐘后測(cè)定一次。記錄橢圓率(CD)和倍增電極電壓，隨倍增電極電壓的溫度依賴性在圖7中繪出。倍增電極電壓正比于樣品吸收度。通過加熱樣品導(dǎo)致的倍增電極電壓的增長(zhǎng)反應(yīng)出蛋白的聚集。倍增電極電壓的增長(zhǎng)伴隨著225nm處橢圓率的減少指示的二極結(jié)構(gòu)的喪失。這些數(shù)據(jù)表明Apo-2L(114-281位)通過熱變性聚集，此轉(zhuǎn)化的中點(diǎn)(Tm)在約75。C處。結(jié)合陣的去除導(dǎo)致熱變性的Tm大大降低到約54°C。這些數(shù)據(jù)表明結(jié)合鋅是維持Apo-2L同型三聚體的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性必需的。實(shí)施例7通過突變?nèi)コ鼳po-2L的鋅結(jié)合位點(diǎn)所造成的影響如實(shí)施例1所述通過寡核苷酸定點(diǎn)誘變將Apo-2L(91-281位)的Cys230用Ala或Ser取代。然后按照實(shí)施例1所述使該變體蛋白表達(dá)并純化。如表1所示，Apo-2L(91-281位)的C230A和C230S突變體的受體結(jié)合親和力減小，凋亡活性大大降低。由于Apo-2L的x-射線結(jié)構(gòu)表明Cys230是一個(gè)被掩蓋的殘基，不太可能在復(fù)合體形成中直接接觸受體，這些數(shù)據(jù)提示Cys230的突變通過改變Apo-2L同型三聚體的結(jié)構(gòu)或穩(wěn)定性而間接影響其活性。實(shí)施例8添加Zn改進(jìn)了可溶性Apo-2L產(chǎn)物的積累和回收A.受堿性磷酸酶啟動(dòng)子調(diào)控的Apo-2U114-281位殘基〗表達(dá)pAPApo2-P2RU(參見圖12)編碼Apo-2L(114-281位殘基)以及由pra2和編碼的tRNA的共表達(dá)?；趐BR322的質(zhì)粒(Sutcliffe,ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.，43:77-90(1978))pAPApo2-P2RU用于在大腸桿菌中生產(chǎn)Apo-2L。Apo-2L表達(dá)所需的轉(zhuǎn)錄和翻譯序列由石威性磷酸酶啟動(dòng)子和所述^rpShine-Dalgarno提供，如對(duì)質(zhì)粒phGHl所述(Chang等，基因，55:189-196(1987))。ApoJL(114-281位殘基)的編碼序列位于啟動(dòng)子和Shine-Dalgarno序列的下游，它前面有起始蛋氨酸。該編碼序列包含編碼Apo-2L(圖l)中114-281位殘基的核苷酸(見圖1),但其中編碼Pro119殘基的密碼子已由"CCT，，變?yōu)?CCG，，，從而能消除潛在的二級(jí)結(jié)構(gòu)。編碼從入到轉(zhuǎn)錄終止子的序列(Scholtissek等，核酸研究，15:3185(1987》接在Apo-2L編碼序列之后。此質(zhì)粒還包括用于表達(dá)pra2(Komine等，分子生物學(xué)雜志，212:579-598(19卯))和argL%/"ay(Garcia等，細(xì)胞，45:453-459(1986))的tRNA的序列。這些基因可從大腸桿菌w3110通過PCR克隆并置于所述從A到轉(zhuǎn)錄終止子的序列的下游。此質(zhì)粒賦予生產(chǎn)宿主以四環(huán)素抗性和氨千青霉素抗性。菌抹43E7(大腸桿菌W3110fhuA(tonA)p/2a4zlf^gF-Zac^frJAg尸ihawSom;r//vGM")用作共表達(dá)Apo-2L和tRNA的生產(chǎn)宿主。采用標(biāo)準(zhǔn)方法制備43E7感受態(tài)細(xì)胞并用pAPApo2-P2RU轉(zhuǎn)化。從含20|ng/ml四環(huán)素的LB板(LB+Tet20)上挑出轉(zhuǎn)化體，劃線純化，在含20pg/ml四環(huán)素的LB肉湯中，在30°C的搖床/培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，然后-8(TC下保藏在DMSO中。將新鮮解凍的培養(yǎng)原液d、瓶接種在無菌培養(yǎng)基上，制備搖瓶接種物。培養(yǎng)基中包含相應(yīng)抗生素，以便提供選擇性壓力來確保質(zhì)粒的維持。搖瓶培養(yǎng)基組成見表III。使瓶中培養(yǎng)物在約30。C(28。C-32。C)振蕩培養(yǎng)14-18小時(shí)。然后用該培養(yǎng)物接種生產(chǎn)發(fā)酵罐。接種量為培養(yǎng)基起始體積的0.1%-10%。表m搖瓶培養(yǎng)基的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>采用表IV中給出的生產(chǎn)培養(yǎng)基進(jìn)行Apo-2L的生產(chǎn)。在約30°C(28°C-32。C)下進(jìn)行發(fā)酵過程，pH控制在約7.0(6.5-7.5)。設(shè)置通氣速率和攪拌速度使得培養(yǎng)基中通有足夠的氧。在磷酸鹽耗場(chǎng)所誘發(fā)的產(chǎn)物表達(dá)開始時(shí)，工藝溫度從30。C變?yōu)?5°C。在整個(gè)發(fā)酵過程中，根據(jù)計(jì)算機(jī)的運(yùn)算向細(xì)胞培養(yǎng)物中補(bǔ)加葡萄糖以便在保證通氣條件的同時(shí)滿足對(duì)碳源的需求。在發(fā)酵過程中分兩批添加ZnS04。一批恰好在誘導(dǎo)產(chǎn)物表達(dá)之前加入。第二批約在生產(chǎn)期中點(diǎn)加入。在此實(shí)施例中，所述添加發(fā)生在培養(yǎng)物的光學(xué)密度OD瀏約為80-120和接種后約28小時(shí)時(shí)。加入足夠量的100mMZnSO4以使每批加入金屬離子的濃度為約50-1OOiimol(終濃度)。發(fā)酵可以進(jìn)行約34-45小時(shí)，然后從培養(yǎng)液中回收細(xì)胞團(tuán)用于隨后的產(chǎn)物回收分析。表IVAP啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)培養(yǎng)基的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>a這些成分的一部分可在發(fā)酵過程中補(bǔ)加至培養(yǎng)物中。可才艮據(jù)需要添加氨水以控制pH。在發(fā)酵的不同時(shí)間對(duì)培養(yǎng)液取樣。將1ml培養(yǎng)液樣品稀釋到細(xì)胞密度為20OD55()，離心收集細(xì)胞，所得細(xì)胞沉淀于-20。C保存以備分析。將細(xì)胞沉淀解凍并重懸在0.5ml提取緩沖液(50mMHEPES,pH8.0，50mMEDTA和0.2mg/ml雞蛋白溶菌酶)中，通過機(jī)械破碎從細(xì)胞質(zhì)中釋放產(chǎn)物。離心去除細(xì)胞裂解液中的固體，然后將澄清的裂解液上樣至DionexProPacIEXHPLC柱以便定量三聚體。HPLC分析通過以25mM磷酸緩沖液(pH7.5)中1MNaCl的5。/。-22。/。梯度按0.5ml/min的流速洗脫25分鐘，而將產(chǎn)物與大腸桿菌雜質(zhì)蛋白分開。使凍存的細(xì)胞團(tuán)解凍并重懸在提取緩沖液(100mMHepes緩沖液，pH8.0,50mMEDTA,5mMDTT)中。使該細(xì)胞懸液多次通過才;i^成勻漿器而從胞質(zhì)空間釋放出Apo-2L產(chǎn)物，添加0.2%PEI(終濃度)并離心除去固體。用HP將澄清的裂解液1:l稀釋，pH調(diào)為7.2，然后上樣至已用3-4倍柱體積的50mMHepes/0.05%TritonAmMDTTpH7.2預(yù)平衡的MPHS柱(BioRad)。用2-3倍柱體積的平衡緩沖液洗一次，再用含0.1MNaCl的平衡緩沖液洗第二次，然后用平衡緩沖液中0.1M-0.8M的NaCl梯度以6倍柱體積將Apo-2L蛋白從MPHS柱上洗脫。收集洗脫級(jí)分，分析，匯集有關(guān)級(jí)分并保存在4-8°C。對(duì)發(fā)酵過程中Apo-2L積累的分析表明，ZnS04的加入不會(huì)顯著影響細(xì)胞生長(zhǎng)。培養(yǎng)液中磷酸鹽耗竭時(shí)Apo-2L開始產(chǎn)生，這一^:在接種的約15-25小時(shí)后。圖8顯示了可溶性Apo-2L三聚體的積累經(jīng)IEXHPLC方法測(cè)得的時(shí)間變化圖譜。添加了ZnS04的培養(yǎng)液與無ZnSCXt的對(duì)照培養(yǎng)液相比，其細(xì)胞裂解液樣品中產(chǎn)物濃度較高。對(duì)最初捕獲步驟(涉及IEX層析)(圖9)中產(chǎn)物回收的分析顯示了，在添加或不添加ZnS04的發(fā)酵條件下所得細(xì)胞裂解液經(jīng)MPHS層析的洗脫圖謙。在最初的過柱和洗柱步驟后，分出了A和B兩個(gè)主要峰。通過SDS-PAGE分析，這兩個(gè)峰主要由Apo-2L組成。從這兩個(gè)峰制備純化物質(zhì)并分析其生物活性和穩(wěn)定性。研究結(jié)果表明，峰A匯集的Apo-2L產(chǎn)物更為穩(wěn)定，峰B的產(chǎn)物時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)凝聚。為使不穩(wěn)定性最小，不再對(duì)峰B的產(chǎn)物進(jìn)行回收。通過對(duì)每個(gè)峰以下代表積分面積的輪廓的計(jì)量來估計(jì)峰A對(duì)峰B的比例。表V所列結(jié)果顯示，當(dāng)峰A從無ZnS04的情況下平均約為45%到添加ZnS04的情況下達(dá)到約80%時(shí)Apo-2L的百分比變化，即在可回收的集合中Apo-2L產(chǎn)量顯著提高。表V<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>B.trp啟動(dòng)子調(diào)控的Apo-2U氨基酸殘基114-280表達(dá)PS1346.Apo2L.0質(zhì)粒的構(gòu)建:將編碼Apo-2L中114-281位殘基的DNA(前面有一個(gè)起始蛋氨酸密碼子)插入到pS1346質(zhì)粒載體。pS1346質(zhì)粒衍生自pHGH207-l(DeBoer等，啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)和功能，Praeger,紐約，pp.462國(guó)481(1982))并且在Apo-2L編碼序列的下游含有從入到轉(zhuǎn)錄終止子(lambda-totranscriptionalterminator)的序列(Scholtissek等，核酸研究，15:3185(1987))。采用菌抹54C2(大腸桿菌W3110fhuA(tonA)/o"^0/^s(72爐i^)c/;尸/flc/g)作為表達(dá)Apo-2L(氨基酸殘基114-281)的生產(chǎn)宿主，其中該配體的表達(dá)受trp啟動(dòng)子調(diào)控。采用標(biāo)準(zhǔn)方法制備54C2的感受態(tài)細(xì)胞并用pS1346.Apo2L.0轉(zhuǎn)化。從含20嗎/ml四環(huán)素的LB平板(LB+Tet20)挑出轉(zhuǎn)化體，劃線純化，在30。C的搖床/培養(yǎng)箱中含20pg/ml四環(huán)素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，然后-8(TC下保藏在DMSO中。用生產(chǎn)菌抹54C2/pS1346.Apo2L.O在類似于上述AP啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)酵參數(shù)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同在于培養(yǎng)基組成略有調(diào)整(表VI)、添加誘導(dǎo)物吲哚3-丙烯酸(IAA)、和工藝的耗時(shí)不同。在最初的培養(yǎng)基中加入色氨酸以便在生長(zhǎng)的最初階段抑制啟動(dòng)子的活性。當(dāng)培養(yǎng)液的細(xì)胞密度達(dá)到約30OD柳時(shí)使溫度從3(TC變?yōu)?5°C。當(dāng)培養(yǎng)液的細(xì)胞密度達(dá)到約55OD55。時(shí)加入誘導(dǎo)物。在添加了ZnS04的實(shí)驗(yàn)中，于細(xì)胞密度達(dá)25ODss。和接種后24小時(shí)時(shí)添加ZnS04至終濃度約50-100|iM。在添加i秀導(dǎo)物的6小時(shí)后收獲細(xì)胞并保存在-20。C到-80°C。表VI在AP啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)培養(yǎng)基中應(yīng)trp啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)的需要進(jìn)行的添加<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>trp啟動(dòng)子系統(tǒng)的細(xì)胞達(dá)到40-60OD^后生長(zhǎng)放緩。在添加IAA進(jìn)行誘導(dǎo)之前有顯著的Apo-2配體滲漏表達(dá)，這可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)問題。對(duì)添加或不添加ZnS04的情況下的細(xì)胞生長(zhǎng)圖i普進(jìn)行比較。圖10顯示了可溶性Apo-2L三聚體的積累經(jīng)IEXHPLC方法測(cè)得的時(shí)間變化圖鐠。在添加了ZnS04的試驗(yàn)中，可溶性Apo-2L的積累持續(xù)增加，并在細(xì)胞裂解物樣品中獲得較高產(chǎn)物濃度。C.采用二價(jià)金屬離子/DTT從大腸桿菌中回收和純化Apo-2U氨基酸殘基114-281)可采用下列方法,人大腸桿菌中回收和純化Apo-2L。首先，如下進(jìn)行細(xì)胞的勻漿和提取。將冷凍收獲的大腸桿菌細(xì)胞懸浮在6倍體積的提取液中(100mMHEPES/5mMDTT(或5mMZnS04而不是DTT)，pH8.0)，或?qū)⒄麄€(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液用5mMDTT(或5mMZnS04而不是DTT),pH8.0調(diào)整。懸浮液2-8。C下充分混合1小時(shí)，然后在勻漿器(Gaulincorporation,Everett,MA)中勻漿。破碎細(xì)胞的懸浮液在0.2%PEI中絮凝l-2小時(shí)，用BTPX205(AlfaLavalSeparationAB,瑞典)連續(xù)加料離心機(jī)離心，深層過濾澄清。提取fe,如下純化Apo-2L。澄清的細(xì)胞懸浮液(提取液)用等體積H20/0.1%Triton-100調(diào)理，使pH達(dá)到7.2，然后進(jìn)行Macro-PrepceramicHighS(MP-HS)層析。將調(diào)整好的提取液上柱至已用50mMHEPES/0.05%Triton-100/lmMDTT(或100)imZnS04)，pH7.2平衡的MP-HS陽離子交換柱(Bio-Rad,Hercules,CA)(前兩個(gè)步驟可用SP-SepharoseFastFlow(AmershamPharmacia,瑞典)代替)。未結(jié)合的蛋白流過層析柱，被平衡緩沖液洗出，直至達(dá)到A280的基線水平。用3倍柱體積的0.1MNaCl/平衡緩沖液洗柱。用8倍體積的平衡緩沖液中0.1-0.8M的NaCl線性梯度洗脫Apo-2L。收集級(jí)分，并將那些經(jīng)SDS-PAGE或SEC-HPLC測(cè)定含有正確4斤疊的Apo-2L的級(jí)分匯集在一起。將從MP-HS柱匯集的Apo-2L上樣至已在50mMHEPES/lmMDTT(或100jnmZnS04),pH7.2中平衡的Macro-Prep羥基磷灰石層析柱(Bio-Rad，Hercules,CA)(可用SP-S印haroseFastFlow代替Macro畫Prep羥基石粦灰石層析柱)。上樣后，用平衡緩沖液洗柱以達(dá)到A280的基線水平。用平衡緩沖液中0.15M磷酸鈉的等梯度從層析柱中洗脫Apo-2L。MP-HA匯集液用等體積的1.0M硫酸銨/50mMTris/lmMDTT(或lOOnM碌u酸鋅)，pH7.5配制，上樣至已在0.5M硫酸銨/50mMTris/lmMDTT(或lOOiuM碌u酸鋅)，pH7.5中平衡的Phenyl誦SepharoseFF(AmershamPharmacia,瑞典)(可使用0.6M石克酸鈉代替0.5M辟u酸銨)。用平衡緩沖液洗柱，從洗脫液中收集Apo-2L。然后通過超濾和G25凝膠過濾(AmershamPharmacia,瑞典)層析來配制Apo-2L。將來自phenyl-Sepharose的匯集液用TFF超濾膜(Millipore,Bedford,MA)濃縮，并在G25凝膠過濾柱上用20mMTris/8%海藻糖，pH7.5配制。(或者，所述物質(zhì)可通過滲濾配制)。通過SDS-PAGE，SEC-HPLC和氨基酸序列分析確定Apo-2L的最終純度。實(shí)施例9添加氯化鈷改善了可溶性Apo-2配體的產(chǎn)物積累和回收堿性磷酸酶啟動(dòng)子調(diào)控的Apo-2L(氨基酸殘基114-281)表達(dá)采用與實(shí)施例8中所用相同的生產(chǎn)菌林，培養(yǎng)基組成，發(fā)酵條件和樣品分析來研究添加非鋅的金屬離子，即氯化鈷，對(duì)Apo-2L(氨基酸殘基114-281)產(chǎn)物積累的影響。用lOOmMCoCl2水溶液替代100mMZnS04，添加足夠量使兩次添加的終濃度達(dá)到50-100|uM。圖11顯示了添加CoCl2對(duì)發(fā)酵過程中可溶性Apo-2L產(chǎn)物積累的好處。如ZnS04添加實(shí)驗(yàn)一樣，用IEXHPLC分析方法檢測(cè)到了可溶性Apo-2L產(chǎn)物的較高積累率，但顯著程度不及。此數(shù)據(jù)說明，添加某些金屬離子通常可改進(jìn)可溶性Apo-2L的積累，還可使已裝配好的Apo-2L三聚體保持穩(wěn)定。實(shí)施例10各種金屬離子對(duì)Apo-2L制劑的影響進(jìn)行體外試驗(yàn)，即將SO^ilApoJL(114-281位)與5mM金屬鹽(見表VII;金屬對(duì)蛋白的摩爾比為100:l)在20mMTris,8%海藻糖，0.01%Tween20，pH7.5的制劑中5。C保溫24小時(shí)。然后用實(shí)施例4所述SK-MES試-瞼評(píng)價(jià)樣品的凋亡活性。EC50(或?qū)е录?xì)胞50%死亡的Apo-2L濃度)見表VII(單位ng/ml)。如表VII所示，向培養(yǎng)液中添加乙酸鋅和碌b酸鋅可增強(qiáng)Apo-2L活性。表VII所添加的金屬生物試-驗(yàn)中的EC50對(duì)照19.0±1.9(n=3)醋酸錳19.8氯化錳19.9醋酸鐵32.5醋酸鈷25.9氯化鈷17.9硫酸鈷16.7醋酸鎳18.7醋酸銅844氯化銅984硫酸銅774醋酸銀20醋酸鋅12.3氯化鋅17.2硫酸鋅(100:1)9.3±1.2(n=3;>(10:1)10,0±0(n=2)(1:1)11.5±0.7(n=2)實(shí)施例11鋅離子對(duì)Apo-2配體制劑穩(wěn)定性的影響如實(shí)施例8B所述，純化步驟中第一步使用MPHS陽離子交換柱產(chǎn)生兩個(gè)峰，A和B。為檢查這兩個(gè)峰的保存穩(wěn)定性，將Apo-2L(114-281位)從大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物(采用帶有trp啟動(dòng)子的pS1346.ApoL.0質(zhì)粒)中提取，并通過MPHS陽離子交換柱純化。MPHS峰A進(jìn)一步通過MP-羥基磷灰石和Phenyl-SepharoseFF純化，然后用G-25凝膠過濾柱配制。MPHS峰B通過MP-羥基磷灰石、Phenyl-SepharoseFF、和Ni-NTASuperflow純化，然后在G-25凝膠過濾柱上用20mMTris,8%海藻糖，0.01%Tween20，pH7.5配制。將樣品無菌灌入3cc玻璃小瓶中，并用聚四氟乙烯(Teflon)涂布的greybutyl塞子密封。純化并配制好的峰A和峰B的保存穩(wěn)定性在表VIII所列的時(shí)間(周("wk")或月("mo"))和溫度(。C)下評(píng)價(jià)。表vm<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表VIII顯示了單體的百分比(。/。M)和二聚體的百分比(y。D);"ND"指未測(cè)的數(shù)值。在第0天時(shí)，峰A所含二聚體和其它雜質(zhì)比峰B略少。如表VIII所示，峰B更為熱不穩(wěn)定，因?yàn)樵?0。C的沉淀更多(比在2個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)多約40%)。即使在5。C,峰B形成二聚體的傾向性約為峰A的2倍。對(duì)峰A和B的生物分析指示這兩種物質(zhì)除了穩(wěn)定性不同，其它生物化學(xué)特性相同。據(jù)認(rèn)為峰B穩(wěn)定性較低可能與不當(dāng)?shù)?三聚體)裝配或較低的鋅含量有關(guān)(峰A中鋅對(duì)蛋白的摩爾比為0.83,峰B的為0.7)。序列表<110>杰南才支術(shù)7>司(Genentech，Inc.)<120〉利用二價(jià)金屬離子制備Apo-2配體的方法<130>P1761R1PCT<140〉PCT/US00/17579<141>2000-06-26<150>US60/141'342<151〉1999-06-28<160>7<210>1<211〉281<212〉PRT<213〉人(Homosapiens)<400〉1MetAlaMetMetGluValGinGlyGlyPro10SerLeuGlyGinThr15CysValLeulieVal20liePheThrValLeu25LeuGinSerLeuCys30ValAlaValThrTyr35ValTyrPheThrAsn40GluLeuLysGinMet45GinAspILysTyrSer50LysSerGlylieAla55CysPheLeuLysGlu60AspAspSerTyrTrp65AspProAsnAspGlu70GluSerMetAsnSer75ProCysTrpGinVal80LysTrpGinLeuArg85GinLeuValArgLys90MetlieLeuArgThr95SerGluGluThrlie100SerThrValGinGlu105LysGinGinAsnlie110SerProlxuValArg115GluArgGlyProGin120iVrgValAlaAlaHis125lieThrGlyThrArg130GlyArgSerAsnThr135LeuSerSerProAsn140SerLysAsnGluLys145AlaLeuGlyArgLys150lieAsnSerTrpGlu155SerSerArgSerGly160HisSerPheLeuSer165AsnLeuHisLeuArg170AsnGlyGluLeuVal175lieHisGluLysGly180PheTyrTyrlieTyr185SerGinThrTyrPhe190ArgPheGinGluGlu195lieLysGluAsnThr200LysAsnAspLysGin205MetValGinTyrlie210TyrLysTyrThrSerTyrProAspProlieLeu215220AlaArgAsnSerCysTrpSerLysAspAlaGlu230235SerlieTyrGinGlyGlyliePheGluLeuLys245250liePheValSerValThrAsnGluHisLeulie260265GluAlaSerPhePheGlyAlaPheLeuValGly275<210〉2<211〉1042<212〉腿<213〉人(Homosapiens)<220><221〉變異<222〉447<223〉N可以是T或G280<400>2UtcctcactctgcctggcttggaggtccaatcttcacagctttaccaacttgcttgUtgagagUtgacgtUgaaagaagaaaagcaagagtagcagttctccaaacgggaatcatc汪"ggtgaacaacatactttaacaaatggtttgttg"gatggactctatacagaattUgactataaaagaaUgagaagactUcagcagtcagactcggggggacccagcctgggactgctcctgcagtctctctgtgagctgaagc柳tgcaggacttaaaagaagatgacagttacagcccctgctggc^gtcatgattttgagaacctctgaacaaaatatttctcccctagctcacataactgggaccagatccaaga"gaaaaggctctaaggagtgggcattcattcctggtcatccatgaaa,ggcgatttcaggaggaaaUaaccaatatatttacaaatacaaaagtgctagaaatagttgttcc"cUtcaagggggaattgUtctgtaacaaatgagcggaagggctttgacaggatcagacctgcgtgtggctgtaacaagUctcc"tgggacccaagtggcaacggaaaccattgg^gaagcagggccgc謹(jǐn)tgagcaacttttttactacaagaaaacacacaagttatcctggtct謹(jǐn)gatttgagcttacUgatagaLeuMetLysSer225TyrGlyLeuTyr240GluAsnAspArg255AspMetAspHis270cagtgaccgg50atggcUtga100gctgatcgtg150ctUcgtgta200aaaagtggca250caatgacgaa300tccgtcagct350tcUcagttc400aggtccncag450acacattgtc500ataaactcct550gcacttgagg600tct汪Uccca650aagaacgaca700tgaccctata750atgcagaata800aaggaaaatg850catggaccat900gaagccagttUUcggggcctttUagttggctaactgacctggaaaga950aaaagcaataacctcaaagtgactattcagttttcaggatgatacactat1000gaagatgtUcaaaaaatctgaccaaaacaaacaaacagaaa1042<210>3<211>144<212>PRT<213〉人(Homosapiens)<400>3LysProAlaAlaHisLeulieGlyAspProSerLysGinAsnSer151015LeuLeuTrpArgAlaAsnThrAspArgAlaPheLeuGinAspGly202530PheSerLeuSerAsnAsnSerLeuLeuValProThrSerGlylie354045TyrPheValTyrSerGinValValPheSerGlyLysAlaTyrSer505560ProLysAlaThrSerSerProUuTyrLeuAlaHisGluValGin657075LeuPheSerSerGinTyrProPheHisValProLeuLeuSerSer808590GinLysMetValTyrProGlyLeuGinGluProTrpLeuHisSer95100105MetTyrHisGlyAlaAlaPheGinLeuThrGinGlyAspGinLeu110115120SerThrHisThrAspGlylieProHisLeuValLeuSerProSer125130135ThrValPhePheGlyAlaPheAlaLeu140<210>4<211〉147<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>4LysProValAlaHisValValAlaAsnProGinAlaGluGlyGin151015LeuGinTrpLeuAsnArgArgAlaAsnAlaLeuLeuAlaAsnGly202530ValGluLeuArgAspAsnGinLeuValValProSerGluGlyLeu354045TyrLeulieTyrSerGinValLeuPheLysGlyGinGlyCysPro505560SerThrHisValLeuLeuThrHisThrlieSerArglieAlaVal657075SerTyrGinThrLys80ValAsnLeuLeuSer85CysGinArgGluThr95ProGluGlyAlaGlu100GluProlieTyrLeu110GlyGlyValPheGin115ArgLeuSerAlaGlu125lieAsnArgProAsp130GluSerGlyGinVal140TyrPheGlylielie145<210>5<211〉141<212〉PRT<213>人(Homosapiens)<400>5GinlieAlaAla1HisVallieSerGluAla10SerValLeuGinTrp20AlaGluLysGlyTyr25AsnLeuValThrLeu35GluAsnGlyLysGin40GinGlyLeuTyrTyr50lieTyrAlaGinVal55ArgGluAlaSerSer65GinAlaProPhelie70LysSerProGlyArg80PheGluArglieLeu85ThrHisSerSerAla95LysProCysGlyGin100GlyGlyValPheGlu110LeuGinProGlyAla115ValThrAspProSer125GinValSerHisGly130PheGlyLeuLeuLys140Leu<210>6<211>137<212〉PRT<213>人(Homosapiens)<400〉6ArgLysValAla1His5LeuThrGlyLysSer10ProLeuGluTrpGluAsp20ThrTyrGlylie25AlalieLysSerPro90AlaI>ysProTrpTyr105LeuGluLysGlyAsp120TyrLeuAspPheAla135AlaLeuSerTyrLeuThrAlaLeuGinSerThrSerLysThrThr15ThrMetSerAsn30ThrValLysArg45PheCysSerAsn60SerLeuCysLeu75ArgAlaAlaAsn90SerlieHisLeu105ValPheValAsn120GlyPheThrSer135AsnValSerArgSerMet15LeuLeuSerGly30ValLysTyrTyrPheValAsnLeuProProGinAspThrThrGlyPheAsnLeuLeuSerLeuTyrLysLysTyrLeuLeuGinThrValLys35Ser50Ser65Val80Met95Ser110Asn125GlyGlyLeuValLysValTyrPheHisLysValTyrMetMetGluGlyTrpAlaArgSerAlaAspHisLeuPheGluGluSer<210>7<211>152<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400〉7GinPro1GlySerTrpAlaValAsnArgHisLeuMetHisThrPheAlaHisLysGinHisValLeuLyslieAspGluTyrMetSerGluPheHisLeuArgLeuLeuValArgSerAspGlyProHis5Val20Ser35Gly50Thr65Val80Lys95Phe110Glu125Asp140lie40Arg55Met70Lys85Ser100Tyr115Gin130IxuThrlieAsnSerLeuSerSerAsnMetThrPhePheTyrTyrLeuSerGlyAspLeuThrLysThrSerGlyGlySerThrTyrSerlieAsnGlulieSerlieGinAspAlaThrAsnGlyArgMetTyrValThrAla10Trp25Ser40Tyr55Ala70lie85Lys100Val115Glu130Tyr145ThrTyrAsnAlaThrLysTyrGlyValPheGluThrGlyGinSerCysAsnSerLysMetSerTyrLeuGlyAlaAsnValSerPhePheGlyLeu45Asn60Tyr75Cys90Val105Glu120Leu13AsplieProHisAspArgGlyLysLeuAsnlieCysGluTyrLeulieProSerTrpSerGlyGlyPhePheSerAsnProGlyAlaPheSer15Gly30lie45Phe60Gin75Ser90Asn105Lys120Ser135Lys150權(quán)利要求1.分離的Apo-2配體變體多肽，包含與天然序列Apo-2配體不同且在圖1(SEQIDNO1)的殘基位置具有如下一或多個(gè)氨基酸取代的氨基酸序列R130A；N134A；L136A；S138A；N140A；N143A；S153A；E155A；R158A；R170A；K179A；R191A；Q193A；E195A；K197D；K201A；N202A；D203A；Y213A；D218A；Y240A；K251A；S259A；D267A；D269A。2.分離的Apo-2配體變體多肽，包含與天然序列Apo-2配體不同且在圖l(SEQIDNO:l)的殘基位置具有如下一或多個(gè)氨基酸取代的氨基酸序列S141A,K142A,S159A，H264A。3.分離的Apo-2配體變體多肽，包含與天然序列Apo-2配體不同且在圖l(SEQIDNO:l)的殘基位置具有如下一或多個(gè)氨基酸取代的氨基酸序列R149A;C230S;C230A;Q205A;V207A;Y216A;E236A;Y237A。4.分離的核苷酸，包含編碼權(quán)利要求1的Apo-2配體變體的核苷酸序列。5.載體，包含權(quán)利要求4的核酸。6.宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求5的載體。7.pAPApo2-P2RU載體。8.宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求7的載體。9.制品或試劑盒，在容器中包含具有一或多種二Y介金屬離子的Apo-2配體制劑，容器上有標(biāo)記指示該制劑的用途。全文摘要本發(fā)明提供了使用二價(jià)金屬離子制備Apo-2配體和Apo-2配體的制劑的方法。這類二價(jià)金屬離子包括鋅和鈷，它們改進(jìn)了Apo-2配體的三聚體形成和穩(wěn)定性。還提供了Apo-2配體的晶體結(jié)構(gòu)，以及采用寡核苷酸定向誘變鑒定的Apo-2配體變體多肽。文檔編號(hào)C12R1/19GK101633692SQ200910145880公開日2010年1月27日申請(qǐng)日期2000年6月26日優(yōu)先權(quán)日1999年6月28日發(fā)明者伊菲吉妮亞·庫米尼斯,勞拉·西蒙斯,扎拉·沙羅克,羅伯特·F·凱利,羅杰·佩,蘇珊·勒恩格,薩拉·希莫威茨,阿維·J·阿什克納茲,馬克·奧康奈爾申請(qǐng)人:杰南技術(shù)公司