專利名稱：用于熒光定量pcr法檢測腸道釀酒酵母菌的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體涉及一種用于熒光定量PCR法檢測腸道釀酒酵母菌的試劑 背景技術(shù)在正常人類腸道中存在一個豐富、多樣的真菌群落。人們采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法已經(jīng)對人 類腸道真菌進行了許多研究(Khatib R， Riederer KM, Ramanathan J， et al. Faecal flmgal flora in healthy volunteers and inpatients. Mycoses, 2001, 44:151-6.),該方法通過對真菌表型進行診 斷，觀察固體培養(yǎng)基上的菌落生長和繁殖情況，根據(jù)菌落形狀、大小、顏色、粘性以及其他 結(jié)構(gòu)特征鑒定真菌，結(jié)合不同的生理、生化和耐熱性試驗等進行形態(tài)學(xué)診斷。運用分離培養(yǎng) 法可以準確的診斷某些致病性真菌，但是，在某些特殊情況下，比如分離培養(yǎng)的菌落形態(tài)不 典型、特殊培養(yǎng)基無法獲取、培養(yǎng)時間過長、表型結(jié)果非特異等等，則無法對真菌病原體進 行準確診斷，需要依靠非培養(yǎng)診斷技術(shù)進行真菌鑒定。實時熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物的各個領(lǐng)域(Espy MJ， Uhl JR, et al. Realtime PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing, Clin Microbiol, 2006， Rev 19(1): 165-256.)。該技術(shù)不僅能夠從本質(zhì)上增加病原體檢測的靈敏度，結(jié)合種特異性引 物和擴增產(chǎn)物融解曲線分析可以特異的檢測和鑒定某種病原體，檢測過程無需分離培養(yǎng)，操 作簡便、快速，極大的縮短了診斷時間；并且可以作為病原體感染患者治療療效的監(jiān)測手 段。但是，由于人類腸道微生態(tài)群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，存在大約1014個不同的微生物有機體，而真菌 所占比例較低，不到1%;某些真菌菌種的生長還需要復(fù)雜的培養(yǎng)條件，分離培養(yǎng)法只能檢測 到一小部分條件適合的微生物，檢測靈敏度低且診斷周期長。而實時熒光定量PCR技術(shù)是基 于對病原體核苷酸的檢測，不受培養(yǎng)條件限制且檢測靈敏度高，有利于更加準確、全面的了 解真菌群落在腸道病理生理過程中的作用。利用實時熒光定量PCR技術(shù)能夠準確、快速的檢 測和鑒定真菌病原體，這對于及時治療和有效控制腸道真菌感染都至關(guān)重要。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用于熒光定量PCR法檢測腸道釀酒 酵母菌的試劑盒。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的 提供一種用于熒光定量PCR法檢測腸道釀酒酵母菌的試劑盒，該試劑盒包括反應(yīng)總體積1/10的10xT叫manPCR buffer; 各0.15 nmol/L l pmol/L的上游和下游引物； 各200pmol/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP; 2.0 mmol/L 3.5 mmol/L的MgCl2; 0.05U/|xl HOTSTART Taq DNA聚合酶； 0.02xSYBR green I熒光染料；標準陽性模版，其濃度按定量標準曲線制備的要求系列稀釋； 余量為無菌雙蒸水；所述兩條引物為PCR擴增過程中使用的特異性擴增釀酒酵母菌ITS區(qū)的引物 上游引物序列為5，-TACTTACCGAGGCAAGCTGCA-3， (SEQ ID NO: 1) 下游引物序列為5，-AGGCGTGCGGTTCTTTG-3， (SEQ ID NO: 2) 所述標準陽性模版為釀酒酵母菌標準菌株DNA經(jīng)前述引物擴增，擴增產(chǎn)物與pGEMT-TEasy載體連接后獲得的標準質(zhì)粒DNA;編碼所述擴增產(chǎn)物的基因具有SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是操作簡便、快速；特異性好，靈敏度高；基于對核苷酸的檢測，不受培養(yǎng)條件限制；定 量檢測，能真實反映腸道釀酒酵母菌定植和發(fā)生感染的情況；可同時進行高通量的樣本檢 測。本發(fā)明提供的試劑盒可對腸道釀酒酵母菌進行快速定量檢測，可以替代一直沿用的分離 培養(yǎng)的傳統(tǒng)診斷方法，并適于在臨床實驗室廣泛推廣應(yīng)用。


圖1為將本發(fā)明試劑盒標準陽性模版梯度稀釋后，進行熒光定量PCR擴增所得的動力曲 線圖，橫坐標代表循環(huán)數(shù)，縱坐標代表相對熒光強度，圖中平行于橫坐標的直線代表熒光閾 值。圖2為將本發(fā)明試劑盒標準陽性模版梯度稀釋后，進行熒光定量PCR擴增所得的標準曲 線圖，橫坐標代表熒光閾值，縱坐標代表不同稀釋度標準陽性模版的濃度。圖3為具體實施例中所述熒光定量PCR擴增產(chǎn)物的融解曲線圖，橫坐標代表融解溫度， 縱坐標代表相對熒光強度。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步詳細地闡述本發(fā)明。本發(fā)明所述的用于熒光定量PCR法檢測腸道釀酒酵母菌的試劑盒包括引物、Taqman PCR buffer、 dNTPs、 MgCl2、 Taq DNA聚合酶、SYBR green I熒光染料、標準陽性模版和無菌雙蒸 水。其中(1) 引物是特異性擴增釀酒酵母菌ITS區(qū)的引物； 上游引物序列為5，-TACTTACCGAGGCAAGCTGCA-3， (SEQIDNO: 1)下游引物序列為5，-AGGCGTGCGGTTCTTTG-3， (SEQIDNO: 2)(2) 標準陽性模版釀酒酵母菌標準菌株DNA經(jīng)前述引物擴增，擴增產(chǎn)物與pGEMT-T Easy載體連接即為標 準陽性模版；編碼所述擴增產(chǎn)物的基因具有SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列；擴增產(chǎn)物與 pGEMT-TEasy載體連接后可在大腸桿菌DH5a中增殖。儲存濃度為101()拷貝/111，使用前進行 系列稀釋。該試劑盒保存于-2(TC，盡量減少反復(fù)凍融。本發(fā)明中所述釀酒酵母菌標準菌株購自生物梅里埃公司生產(chǎn)的釀酒酵母菌ATCC 2601菌 株，pGEMT-T Easy載體為Promega公司產(chǎn)品，PCR用Buffer、 MgCl2、 dNTPs、 HOTSTART Taq DNA聚合酶、SYBR green I熒光染料購自大連寶生物技術(shù)公司。具體實施例1:本實施例中的試劑盒包括反應(yīng)總體積1/10的10xTaqman PCR buffer;各0.15拜ol/L的上游和下游引物；各200,1/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP;2.0 mmol/L的MgCl2;0.05U4U HOTSTART T叫DNA聚合酶；0.02xSYBR green I熒光染料；標準陽性模版，其濃度按定量標準曲線制備的要求系列稀釋； 余量為無菌雙蒸水。具體實施例2: 試劑盒成份如下反應(yīng)總體積1/10的10xTaqman PCR buffer;各1.0 pmol/L的上游和下游引物；各200nmol/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP;3.5 mmol/L的MgCh;0.05U/W HOTSTART T叫DNA聚合酶；0.02xSYBR green I熒光染料；標準陽性模版，其濃度按定量標準曲線制備的要求系列稀釋； 余量為無菌雙蒸水。具體實施例3: 試劑盒成份如下反應(yīng)總體積1/10的10xT叫manPCR buffer;各0.4 |jmol/L的上游和下游引物；各200|imol/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP;3.Ommol/L的MgCl2;0.05U&1 HOTSTART Taq DNA聚合酶0.02xSYBR green I熒光染料；標準陽性模版，其濃度按定量標準曲線制備的要求系列稀釋； 余量為無菌雙蒸水。本發(fā)明試劑盒的工作原理介紹-在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙 鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒 光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。反應(yīng)包括以下幾個步驟(1) PCR變性過程產(chǎn)生單鏈DNA， SYBR熒光染料呈游離狀態(tài)，熒光信號很低；(2)引物退火過程中，雙鏈 DNA部分形成，SYBR熒光染料同時特異性地摻入DNA雙鏈，熒光信號增加；G)PCR延 伸過程中，雙鏈DNA逐漸形成，SYBR熒光染料不斷摻入DNA雙鏈中，熒光信號不斷增 加；(4)最后延伸階段結(jié)束后，所有DNA形成雙鏈，摻入DNA雙鏈中的熒光染料達到最大 值，熒光信號也達到最大值。本發(fā)明所述試劑盒使用方法舉例(1) 反應(yīng)體系10xT叫manPCR buffer化l, dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP的濃度分別為200nmol/L，上游和下游引物的濃度為0.4 pmol/L， MgCl2的濃度為3,0 mmol/L， 0.02xSYBR green I熒光染料，2UHOTSTART Taq DNA聚合酶，模版DNA2ptl，無菌雙蒸水補足體積至 40ul。(2) 反應(yīng)程序95。C變性5min，隨后94'C預(yù)變性30s， 6(TC退火30s， 72。C延伸45s， 循環(huán)35次，最后72'C延伸5min。(3) 定量標準曲線制備將標準陽性模版進行連續(xù)IO倍稀釋(如109， 108， 107， 106),獲得系列拷貝數(shù)梯度的標準質(zhì)粒DNA。按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，每個濃度重復(fù) 三次進行擴增。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)起始模版拷貝數(shù)的對數(shù)值和C(T)值繪制標準曲線Y=aX + b,R2。(4) 樣品檢測取受試者新鮮尾便200mg，按照常規(guī)方法提取DNA，取2ul DNA作為 模版，按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進行擴增。(5) 結(jié)果計算根據(jù)標準曲線和所得的C(T)值計算起始模版拷貝數(shù)。本發(fā)明的應(yīng)用實例介紹-取40例健康志愿者新鮮尾便，采用沙保氏培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和本發(fā)明所述熒光定量PCR檢 測試劑盒同時進行檢測。 1.模版DAN的制備(1) 試劑采用QIAamp DNA stool mini kit結(jié)合玻璃珠擊打法抽提受試者糞便標本 DNA， QIAamp DNA stool mini kit試劑盒購自北京東勝創(chuàng)新實驗技術(shù)有限公司，玻璃珠購自上 海生物工程公司。(2) 糞便標本DNA的提取用電子天平稱取受試者新鮮尾便200mg/份，加入ASL緩沖 液和0.3g玻璃珠，置入Fast Prep FP120快速核酸提取儀，6.5 m/s><45 s進行破壁，然后按照QIAamp DNA stool mini kit說明書進行操作，最后AE洗脫DNA。所有抽提獲得的DNA均置 于-8(TC保存?zhèn)溆谩?.熒光定量PCR反應(yīng)(1) 反應(yīng)體系10xTaqman PCR buffer 4|xl， dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP的濃度分別為 200拜ol/L，上游和下游引物的濃度為0.4 pmol/L， MgCl2的濃度為3.0 mmol/L， 0,02xSYBR greenl熒光染料，2U HOTSTART Taq DNA聚合酶，模版DNA 2pl，無菌雙蒸水補足體積至 40ul。(2) 反應(yīng)程序95'C變性5min，隨后94'C預(yù)變性30s， 60'C退火30s， 72'C延伸45s， 循環(huán)35次，最后72'C延伸5min。(3) 定量標準曲線制備將標準陽性模版進行連續(xù)IO倍稀釋(如109， 108， 107， 106),獲得系列拷貝數(shù)梯度的標準質(zhì)粒DNA。按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，每個濃度重復(fù) 三次進行擴增。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)起始模版拷貝數(shù)的對數(shù)值和C(T)值繪制出標準曲線Y=-0.2988X + 10.60,R2=0.998 (圖l, 2)。(4) 樣品檢測取40例健康志愿者糞便標本DNA作為模版，按照上述反應(yīng)體系和 反應(yīng)程序進行熒光定量PCR擴增。在循環(huán)結(jié)束時通過對PCR產(chǎn)物進行融解溫度曲線分析來決 定產(chǎn)物的特異性，即從75'C至95°C，每升溫0.5'C，持續(xù)2秒后采集反應(yīng)管中反應(yīng)液的熒光 信號。每次熒光定量PCR反應(yīng)均設(shè)置倍比稀釋的標準陽性模版構(gòu)建標準曲線，以此獲取樣本 中不同菌種基因拷貝數(shù)。各種真菌數(shù)量以每克糞便基因拷貝數(shù)的對數(shù)值表示，數(shù)據(jù)以均數(shù)(S) ±標準差(s)表示。結(jié)果顯示，本發(fā)明試劑盒檢測釀酒酵母菌所得標準曲線的相關(guān)系數(shù)為0.99,最低線性檢測限為1(^拷貝/ul (圖1， 2)。擴增產(chǎn)物的融解溫度為85.0°C，而且融解曲線顯示擴增反應(yīng)特異性較好(圖3)。本發(fā)明試劑盒的檢測陽性率(80.0%)顯著高于分離培養(yǎng)法(2.5%) (尸O.OOl) ， 40例健康志愿者腸道釀酒酵母菌的熒光定量PCR檢測結(jié)果為6.424±0.629 (10gH)拷貝/g)。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明試劑盒與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法比較，具有特異性好，靈敏度高，檢測快速等特點。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。序列表SEqiDNO: 1 tacttaccga ggcaagctgc a 21SEQIDNO: 2 aggcgtgcgg ttctttg 17SEQIDNO: 3tacttaccga ggcaagctgc attcctatgg atttatcctg ccaccaaaac tgatgctggc 60 cc喊gaaat gcg3gattcc cctacccaca agg3gc3g3g ggc3caaa3c accatgtctg 120 atcaaatgcc cttccctttc aacaatttca cgtacttttt cactctcttt tcaaagttct 180 tttcatcttt ccatcactgt acttgttcgc tatcggtctc tcgccaatat ttagctttag 240 atggaattta ccacccactt agagctgcat tcccaaacaa ctcgactctt cgaaggcact 300 ttac3犯g幼ccgcacgcct 320
權(quán)利要求
1、一種用于熒光定量PCR法檢測腸道釀酒酵母菌的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括反應(yīng)總體積1/10的10×Taqman PCR buffer；各0.15μmol/L～1μmol/L的上游和下游引物；各200μmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP；2.0mmol/L～3.5mmol/L的MgCl2；0.05U/μl HOTSTART Taq DNA聚合酶；0.02×SYBR green I熒光染料；標準陽性模版，其濃度按定量標準曲線制備的要求系列稀釋；余量為無菌雙蒸水；所述兩條引物為PCR擴增過程中使用的特異性擴增釀酒酵母菌ITS區(qū)的引物，其中上游引物序列為5’-TACTTACCGAGGCAAGCTGCA-3’；下游引物序列為5’-AGGCGTGCGGTTCTTTG-3’；所述標準陽性模版為釀酒酵母菌標準菌株DNA經(jīng)前述引物擴增，擴增產(chǎn)物與pGEMT-T Easy載體連接后獲得的標準質(zhì)粒DNA；編碼所述擴增產(chǎn)物的基因具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種試劑盒，旨在提供一種用于熒光定量PCR法檢測腸道釀酒酵母菌的試劑盒。該試劑盒包括標準陽性模版和兩條PCR擴增過程中使用的特異性擴增釀酒酵母菌ITS區(qū)的引物，其中編碼擴增產(chǎn)物的基因具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。本發(fā)明操作簡便、快速；特異性好，靈敏度高；基于對核苷酸的檢測，不受培養(yǎng)條件限制；定量檢測，能真實反映腸道釀酒酵母菌定植和發(fā)生感染的情況；可同時進行高通量的樣本檢測。本發(fā)明提供的試劑盒可對腸道釀酒酵母菌進行快速定量檢測，可以替代一直沿用的分離培養(yǎng)的傳統(tǒng)診斷方法，并適于在臨床實驗室廣泛推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK101555527SQ200910098560
公開日2009年10月14日 申請日期2009年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月14日
發(fā)明者李蘭娟, 郭仁勇, 瑜 陳, 陳珍晶, 魯海峰 申請人:浙江大學(xué)