釀酒酵母菌及一種微生物制備高純度d-半乳糖的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株釀酒酵母菌（Saccharomyces?cerevisiae）DLPU-GLC，保藏編號(hào)CGMCC?NO.7785。本發(fā)明還公開(kāi)了所述釀酒酵母菌在制備D-半乳糖的應(yīng)用——一種微生物制備高純度D-半乳糖的方法，將釀酒酵母菌體加入到乳糖水解液中厭氧發(fā)酵消耗葡萄糖完全后，去除菌體后的清液中加入活性炭脫色，之后過(guò)濾除去活性炭，脫色液濃縮，結(jié)晶，用乙醇結(jié)晶和漂洗，離心得D-半乳糖濕晶體。本發(fā)明以乳糖水解液為原料生產(chǎn)D-半乳糖的生物方法，具有生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)單、條件溫和、生產(chǎn)過(guò)程中不會(huì)產(chǎn)生污染物、產(chǎn)品純度高的特點(diǎn)。本發(fā)明摒棄傳統(tǒng)的化學(xué)方法，不使用有機(jī)溶劑，無(wú)廢水產(chǎn)生，是一種綠色生產(chǎn)工藝。
【專(zhuān)利說(shuō)明】釀酒酵母菌及一種微生物制備高純度D-半乳糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及發(fā)酵工程領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種微生物制備高純度D-半乳糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前市場(chǎng)上的D-半乳糖主要是由化學(xué)法生產(chǎn)，通過(guò)酸水解乳糖溶液成D-半乳糖和D-葡萄糖溶液，再用冰醋酸等化學(xué)試劑去除D-葡萄糖，經(jīng)濃縮結(jié)晶得到D-半乳糖。采用化學(xué)法生產(chǎn)的D-半乳糖成分中其純度不高，只能達(dá)到90%左右，同時(shí)生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)采用大量的化學(xué)試劑，不僅成本高，同時(shí)生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的有機(jī)物和有機(jī)廢水,對(duì)環(huán)境不友好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明利用以釀酒酵母為出發(fā)菌株誘變選育到的一株突變株CGMCCN0.7785，該菌株能發(fā)酵消耗乳糖水解液中的D-葡萄糖而不發(fā)酵D-半乳糖，使葡萄糖轉(zhuǎn)變成二氧化碳和水，通過(guò)脫色、濃縮、結(jié)晶等工序生產(chǎn)出D-半乳糖。本發(fā)明摒棄傳統(tǒng)的化學(xué)方法，不使用有機(jī)溶劑，無(wú)廢水產(chǎn)生，是一種綠色生產(chǎn)工藝。此外，以乳糖水解液為原料生產(chǎn)D-半乳糖的生物方法，具有生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)單、條件溫和、生產(chǎn)過(guò)程中不會(huì)產(chǎn)生污染物、產(chǎn)品純度高的特點(diǎn)。
[0004]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)DLPU-GLC,保藏編號(hào) CGMCC N0.7785?
[0005]本發(fā)明還提供了所述釀酒酵母菌DLPU-GLC在制備D-半乳糖的應(yīng)用。具體說(shuō)，本發(fā)明一種微生物制備高純度D-半乳糖的方法`，將釀酒酵母菌體DLPU-GLC加入到乳糖水解液中厭氧發(fā)酵消耗葡萄糖完全后，去除菌體后的清液中按加入活性炭脫色，之后過(guò)濾除去活性炭，脫色液濃縮，結(jié)晶，用乙醇結(jié)晶和漂洗，離心得D-半乳糖濕晶體。其中，所述釀酒酵母菌體選用保藏編號(hào)CGMCCN0.7785的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0006]此外，上述所得D-半乳糖濕晶體65~75°C烘干后得D-半乳糖成品。
[0007]而所述釀酒酵母菌體CGMCC N0.7785的獲得方法為:將菌體接種于裝有50ml完全培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，30°C，210rpm下培養(yǎng)24h，離心得菌體；所述培養(yǎng)基中葡萄糖
0.5%，酵母膏1%，蛋白胨2%，自然pH。
[0008]所述發(fā)酵過(guò)程為:以1.5~2.5克:100毫升的比例將所述菌體加入到乳糖水解液中，30~35°C、200~220rpm下發(fā)酵48~72小時(shí)，離心除去菌體，取上清液中按發(fā)酵液體積的0.6%~0.8%加入活性炭80~9(TC脫色30~40min,過(guò)濾除去活性炭,脫色清液減壓濃縮，待濃縮到有晶體出現(xiàn)時(shí)冷卻結(jié)晶24小時(shí)，離心得到D-半乳糖晶體，用乙醇漂洗60分鐘，離心得到所述D-半乳糖濕晶體。
[0009]此外，優(yōu)選方式下，所述乳糖水解液的制備方法為:用硫酸水解乳糖20~26小時(shí)，用碳酸鈣中和至PH6.5~7.5，冷卻到30~35°C，過(guò)濾得清液。
[0010]本發(fā)明通過(guò)一種誘變篩選微生物，利用微生物法發(fā)酵乳糖水解液中的葡萄糖而不發(fā)酵D-半乳糖的原理，從發(fā)酵液中提純獲制備純度D-半乳糖的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。除本發(fā)明釀酒酵母菌DLPU-GLC之外的普通釀酒酵母盡管消耗D-葡萄糖的速度大于消耗D-半乳糖的速度，但還是能夠消耗D-半乳糖的，尤其在通風(fēng)的條件下。本發(fā)明出發(fā)菌株的釀酒酵母是基本上能發(fā)酵所有的還原糖，在誘變之前釀酒酵母無(wú)論是厭氧發(fā)酵還是有氧通風(fēng)發(fā)酵在發(fā)酵葡萄糖的同時(shí)還發(fā)酵D-半乳糖。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)采用沒(méi)有誘變的菌株是生產(chǎn)不出來(lái)D-半乳糖的，發(fā)酵乳糖水解液最后得到的是二氧化碳和水，發(fā)酵液中不殘留任何糖，收率為O。而采用本發(fā)明提供的菌株CGMCC N0.7785發(fā)酵乳糖水解液時(shí)，無(wú)論是有氧還是厭氧，菌株均不消耗D-半乳糖，而葡萄糖均發(fā)酵成二氧化碳和水。通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們確定厭氧發(fā)酵，采用CGMCC N0.7785發(fā)酵乳糖水解液能得到D-半乳糖含量在98% (高效液相色譜柱測(cè)定)以上，收率達(dá)38-42% (以投入的乳糖原料計(jì)算)。
[0011]保藏說(shuō)明
[0012]本發(fā)明涉及的生物材料樣品的保藏信息:參據(jù)的微生物(株)為DLPU-GLC，分類(lèi)命名為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),于2013年6月13日由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC)保藏，保藏編號(hào)CGMCC N0.7785。CGMCC地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以釀酒酵母為出發(fā)菌株誘變選育到的一株突變株，保藏號(hào)CGMCC N0.7785(以下簡(jiǎn)稱(chēng)7785)，該菌株能消耗乳糖水解液中的D-葡萄糖而不消耗D-半乳糖。
[0014]一、擴(kuò)繁菌體 [0015]配制培養(yǎng)基:0.5%葡萄糖，1%酵母膏，2%蛋白胨，自然pH，121°C滅菌20min。
[0016]將菌株DLPU-GLC接入上述培養(yǎng)基中30~32°C、200~220rpm下培養(yǎng)48~96h，離心得濕菌體，發(fā)酵備用。
[0017]二、乳糖水解液的制備
[0018]用硫酸水解乳糖20~26小時(shí)，用碳酸鈣中和至pH6.5~7.5，冷卻到30~35°C，過(guò)濾得清液。
[0019]三、發(fā)酵
[0020]乳糖水解液投入離心得到的濕菌體；濕菌體和乳糖水解液的比例為(1.5~2.5克):100毫升。30~35°C、200~220rpm下培養(yǎng)48~72小時(shí)，離心除去菌體，取上清液中按發(fā)酵液體積的0.6~0.8%加入活性炭80~90°C脫色30~40分鐘，過(guò)濾，除去活性炭，脫色清液減壓濃縮，真空度大于-0.085MPa，待濃縮到有晶體出現(xiàn)時(shí)冷卻結(jié)晶24小時(shí)有大量D-半乳糖結(jié)晶出現(xiàn)，離心得到D-半乳糖晶體，用乙醇漂洗60分鐘，離心得到濕晶體65~75°C烘5小時(shí)，得到含量98.0%~99.0%的D-半乳糖成品。收率達(dá)38~42%。
[0021]實(shí)施例1:
[0022]將乳糖配成15%的水溶液(投入乳糖15克加入50毫升水，加入10克98%濃硫酸，最后定容到100毫升)，80°C水解24小時(shí)，然后用碳酸鈣中和至pH7.05，反應(yīng)2小時(shí)，過(guò)濾得清液。
[0023]將DLPU-GLC菌接種于裝有消毒后的50ml完全培養(yǎng)基(葡萄糖0.5%，酵母膏1%，蛋白胨2%，自然pH)的250ml三角瓶中，30°C，210rpm下培養(yǎng)24h，離心得菌體。將2.1g菌體加入到100ml，15%的乳糖水解液中，30°C，200rpm培養(yǎng)52h結(jié)束。離心除菌后，上清液100毫升加入0.6%0.6克的活性炭80°C脫色30min,趁熱抽濾，除去活性炭,取脫色清液減壓濃縮(真空度-0.09MPa)到有晶體出現(xiàn)后停止，冷卻至室溫，在濃縮液中加100毫升乙醇結(jié)晶24h，再抽濾。晶體用無(wú)水乙醇50毫升漂洗，離心得到晶體，70°C烘干。得到純度為98.12%的D-半乳糖6.2克。收率為41.33%。
[0024]實(shí)施例2:
[0025]將乳糖配成15%的水溶液(投入乳糖30克加入100毫升水，加入20克98%濃硫酸，最后定容到200毫升)，80°C水解24小時(shí)，然后用碳酸鈣中和至pH6.98，反應(yīng)2小時(shí)，過(guò)濾得清液。
[0026]將DLPU-GLC菌接種于裝有消毒后100ml完全培養(yǎng)基(葡萄糖0.5%，酵母膏1%，蛋白胨2%，自然pH)的500ml三角瓶中，30°C，210rpm下培養(yǎng)60h，離心得菌體。將4g菌體加入到200ml，15%的乳糖水解液中，30°C，200rpm培養(yǎng)55h結(jié)束。離心除菌后，上清液100毫升加入0.7%1.4克的活性炭80°C脫色30min,趁熱抽濾,除去活性炭，取脫色清液減壓濃縮(真空度-0.095MPa)到有晶體出現(xiàn)后停止，冷卻至室溫，在濃縮液中加200毫升乙醇結(jié)晶24h，再抽濾。晶體用無(wú)水乙醇100毫升漂洗，離心得到晶體，72°C烘干。得到純度為98.56%的D-半乳糖11.5克。收率為38.33%。
[0027]實(shí)施例3:
[0028]將乳糖配成15%的水溶液投入乳糖60克加入200毫升水，加入40克98%濃硫酸，最后定容到400毫升)，80°C水解24小時(shí)，然后用碳酸鈣中和至pH6.56，反應(yīng)2小時(shí)，過(guò)濾得清液。
[0029]將DLPU-GLC菌接種于裝有50ml完全培養(yǎng)基(葡萄糖0.5%，酵母膏1%，蛋白胨2%，自然pH)的500ml三角瓶中，30°C，220rpm下培養(yǎng)64h，離心得菌體。將7.9g菌體加入到400ml 15%的乳糖水解液中，30°C，210rpm培養(yǎng)64h結(jié)束。離心除菌后，上清液400毫升加入06%2.4克的活性炭80°C脫色30min,趁熱抽濾，除去活性炭,取脫色清液減壓濃縮(真空度為-0.095MPa)到有晶體出現(xiàn)后停止，冷卻至室溫，在濃縮液中加400毫升乙醇結(jié)晶24h，再抽濾。晶體用無(wú)水乙醇200毫升漂洗，離心得到晶體，68°C烘干。得到純度為98.22%的D-半乳糖25.5克。收率為42.5%。 [0030]除本發(fā)明提供菌株之外的普通釀酒酵母盡管消耗D-葡萄糖的速度大于消耗D-半乳糖的速度，但還是能夠消耗D-半乳糖的，尤其在通風(fēng)的條件下。這和菌體的特性有關(guān)，一般的釀酒酵母均能發(fā)酵消耗還原糖，而D-半乳糖也是還原糖。
[0031]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae) DLPU-GLC,其特征在于,保藏編號(hào)CGMCCN0.7785。
2.權(quán)利要求1所述釀酒酵母菌DLPU-GLC在制備D-半乳糖的應(yīng)用。
3.—種微生物制備高純度D-半乳糖的方法，其特征在于，將釀酒酵母菌體DLPU-GLC加入到乳糖水解液中厭氧發(fā)酵消耗葡萄糖完全后，去除菌體后的清液中按加入活性炭脫色，之后過(guò)濾除去除活性炭，脫色液濃縮，結(jié)晶，用乙醇結(jié)晶和漂洗，離心得D-半乳糖濕晶體； 所述釀酒酵母菌體選用保藏編號(hào)CGMCC N0.7785的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述微生物制備高純度D-半乳糖的方法，其特征在于，所述D-半乳糖濕晶體65~75°C烘干后得D-半乳糖成品。
5.根據(jù)權(quán)利要求3 或4所述微生物制備高純度D-半乳糖的方法，其特征在于，所述釀酒酵母菌體CGMCC N0.7785的獲得:將菌體接種于裝有50ml完全培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，30°C, 21Orpm下培養(yǎng)24h,離心得菌體； 所述培養(yǎng)基中葡萄糖0.5%，酵母膏1%，蛋白胨2%，自然pH。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述微生物制備高純度D-半乳糖的方法，其特征在于，以1.5~2.5克:100毫升的比例將所述菌體加入到乳糖水解液中，30-35°C、200~220rpm下發(fā)酵48~72小時(shí)，離心除去菌體，取上清液中按發(fā)酵液體積的0.6%~0.8%加入活性炭80~90°C脫色30~40min，過(guò)濾除去活性炭，脫色清液減壓濃縮，待濃縮到有晶體出現(xiàn)時(shí)冷卻結(jié)晶24小時(shí)，離心得到D-半乳糖晶體，用乙醇漂洗60分鐘，離心得到所述D-半乳糖濕晶體。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述微生物制備高純度D-半乳糖的方法，其特征在于，所述乳糖水解液的制備:用硫酸水解乳糖20~26小時(shí),用碳酸鈣中和至pH6.5~7.5,冷卻到30~35 °C，過(guò)濾得清液。
【文檔編號(hào)】C12R1/865GK103667090SQ201310689320
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】浦軍平, 張春枝, 韓鵬軍, 祖國(guó)仁, 陳明 申請(qǐng)人:大連工業(yè)大學(xué)