一株木質(zhì)素耐受性釀酒酵母菌及其在生物乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株能耐受木質(zhì)素毒性的釀酒酵母LTY-1（ Saccharomyces cerevisiae LTY-1），已于2014年5月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（簡(jiǎn)稱CCTCC），其保藏編號(hào)為CCTCC NO：M2014184。當(dāng)采用葡萄糖242g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸粉61g/L、pH5.5的發(fā)酵培養(yǎng)基，在30℃、150rpm條件下發(fā)酵36h，釀酒酵母LTY-1的糖轉(zhuǎn)化率為84.4%。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基含有紫丁香醇、對(duì)羥基苯甲醛和香草醛等木質(zhì)素成分，且各成分的濃度均為1.44g/L時(shí)，釀酒酵母LTY-1的糖轉(zhuǎn)化率僅僅降低了7.0%。其降低程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于原始酵母的18.5%。為改善木質(zhì)纖維素水解液乙醇發(fā)酵效率提供了核心技術(shù)和材料。本發(fā)明技術(shù)可應(yīng)用于木質(zhì)纖維素為原料的生物乙醇生產(chǎn)，對(duì)促進(jìn)生物乙醇生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展、以及環(huán)境保護(hù)、糧食安全保障具有重要意義。CCTCC NO：M20141842014.05.06
【專利說明】一株木質(zhì)素耐受性釀酒酵母菌及其在生物乙醇生產(chǎn)中的應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于本發(fā)明涉及生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株木質(zhì)素耐受性釀酒酵母 菌及其在生物乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 秸桿、樹木邊材、牧草等木質(zhì)纖維素材料是地球上儲(chǔ)量最豐富且可持續(xù)再生的有 機(jī)物資源，其年產(chǎn)約1500億噸，所含的能量是全世界年消耗能量總和的10倍（劉剛，沈 鐳.中國(guó)生物質(zhì)能源的定量評(píng)價(jià)及其地理分布[J].自然資源學(xué)報(bào).2007, 41(3):9?19)。 以木質(zhì)纖維素為原料的生物乙醇生產(chǎn)和利用被認(rèn)為是解決能源、環(huán)境和糧食問題的有效途 徑之一。世界各國(guó)都在著力開發(fā)木質(zhì)纖維素生物乙醇生產(chǎn)過程的共性關(guān)鍵技術(shù)和專用設(shè) 備，以積極推進(jìn)生物能源產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
[0003] 木質(zhì)纖維素生物乙醇生產(chǎn)過程一般包括原料預(yù)處理、酶解、乙醇發(fā)酵和乙醇精制 等主要步驟。預(yù)處理是為了破壞木質(zhì)纖維素材料的結(jié)構(gòu)，從而取得良好的纖維素水解效 果（曾凡洲，蔣劍春，衛(wèi)民，等.生物質(zhì)水解發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的研究進(jìn)展[J].生物 質(zhì)化學(xué)工程，2009, 43(2) :43-48);酶解是指利用纖維素酶和半纖維素酶，將纖維素、半纖 維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖；乙醇發(fā)酵是指利用釀酒酵母，將酶解液中的可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為乙 醇。然而，在木質(zhì)纖維素材料的預(yù)處理及酶解過程中，木質(zhì)素會(huì)降解成小片段、以及阿魏 酸、香草醛、紫丁香醇、對(duì)羥基苯基醛（醇）等成分。因?yàn)檫@些木質(zhì)素成分對(duì)釀酒酵母具有 毒性，所以木質(zhì)纖維素水解液的乙醇發(fā)酵效率受到嚴(yán)重抑制（李文莉，繆冶煉，陳介余，花 衛(wèi)俊，邵慧麗.木質(zhì)素降解物對(duì)釀酒酵母的毒性及作用機(jī)理，生物加工過程，2014 ;Ezeji T，Qureshi N，Blaschek H P.Butanol production fromagricultural residues:impact of degradation products on Clostridium beijerinckii growth and butanol fermentation[J]. Biotechnol Bioeng，2007, 97:1460-1469)。
[0004] 為了提高木質(zhì)纖維素水解液的乙醇發(fā)酵效率，人們嘗試了對(duì)木質(zhì)纖維素水解液 進(jìn)行發(fā)酵前的脫毒處理。脫毒處理方法可以分為物理法、化學(xué)法和生物法。目前，物理 法包括活性炭吸附（Wang Lj Chen H Z. Increased fermentability of enzymatically hydrolyzed steam-exploded corn stover for butanol production by removal of fermentation inhibitors [J] · Process Biochemistry，2011，46:604-607)、離子交換吸 附(Larsson S, Reimann A, Joosson L, et al. Comparison of different methods for the detoxification of lignocellulosic hydrolysates of spruce[J]. Appl Microbiol Biotechnol，1999b，77:91-103)、膜分離（黃洲，繆冶煉，陳介余，李文莉.溶液中木質(zhì) 素和葡萄糖的超濾分離，生物加工過程，2014, 12(2) :56-62);化學(xué)法利用NH40H、NaOH、 Ca (OH) 2 和木質(zhì)素降解物的反應(yīng)（Qureshi N，Saha B C，Hector R E，et al. Production of butanol (a biofuel)from agricultural residues:Part II-Use of corn stover and switchgrass hydrolysates [J] · Biomass Bioenergy，2010, 34:566-571);生物法利用漆 酶、過氧化物酶催化木質(zhì)素降解物的聚合反應(yīng)（薛捃，蒲歡，孫春寶.纖維素稀酸水解 產(chǎn)物中發(fā)酵抑制物的去除方法[J].纖維素科學(xué)與技術(shù)，2004, 12(3) :48-52 ;Cho D H，Lee Y J, Um Y, et al. Detoxification of model phenolic compounds in lignocellulosic hydrolysates with peroxidase for butanol production from Clostridium beijerinckii[J].Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 83:1035-1043)。但是，這些方法存 在處理成本高、毒性成分去除率低、糖損失大等問題，因而其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用程度不高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一目的是提供一株同時(shí)具有較強(qiáng)的木質(zhì)素耐受能力和乙醇發(fā)酵 能力的釀酒酵母菌LTY-I (Saccharomyces cerevisiae LTY-1)。本發(fā)明以釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)CGMCC2. 1429為原始菌，利用紫外誘變結(jié)合定向馴化、篩選的 方法獲得釀酒酵母菌株LTY-I。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -株耐受木質(zhì)素的釀酒酵母菌，其特征在于，其分類命名為釀酒酵母 LTY_l(Saccharomyces cerevisiae LTY-1)，已于2014年5月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物 保藏中心CCTCC，地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2014184。
[0008] 本發(fā)明的第二目的是提供上述權(quán)利要求1所述的釀酒酵母菌株LTY-I在生產(chǎn)乙醇 中的應(yīng)用。
[0009] 該應(yīng)用的具體技術(shù)方案如下：
[0010] (1)種子培養(yǎng)：將釀酒酵母菌LTY-I在種子培養(yǎng)基、30°C、180rpm條件下培養(yǎng)至對(duì) 數(shù)中期，作為種子液；
[0011] (2)乙醇發(fā)酵：將種子液按10 %的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角 瓶中，在搖床上進(jìn)行乙醇發(fā)酵。
[0012] 進(jìn)一步的，所述步驟（2)中初始糖濃度220-260g/L，發(fā)酵時(shí)間36-40h，發(fā)酵溫度 30-33°C，搖床轉(zhuǎn)速 150-175rpm。
[0013] 進(jìn)一步的，所述步驟（2)中初始糖濃度為242g/L、發(fā)酵時(shí)間36h、發(fā)酵溫度30°C、搖 床轉(zhuǎn)速150rpm。
[0014] 進(jìn)一步的，所述步驟（2)中，發(fā)酵培養(yǎng)基還含有木質(zhì)素或木質(zhì)素成分。
[0015] 進(jìn)一步的，所述的木質(zhì)素在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為4. 3g/L。
[0016] 進(jìn)一步的，所述木質(zhì)素成分包括紫丁香醇、對(duì)羥基苯甲醛、香草醛中的一種或多 種。
[0017] 進(jìn)一步的，所述的紫丁香醇、對(duì)羥基苯甲醛、香草醛在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度各為 I. 44g/L〇
[0018] 本發(fā)明的有益效果：
[0019] 本發(fā)明的釀酒酵母LTY-I有較強(qiáng)的木質(zhì)素耐受能力和乙醇發(fā)酵能力，當(dāng)采用葡萄 糖242g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸粉61g/L、pH5. 5的發(fā)酵培養(yǎng)基，在30°C、150rpm條件下發(fā) 酵36h，釀酒酵母LTY-I的糖轉(zhuǎn)化率更是高達(dá)84. 4%。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基含有紫丁香醇、對(duì)羥基 苯甲醛和香草醛等木質(zhì)素成分，且各成分的濃度均為1.44g/L時(shí)，釀酒酵母LTY-I的糖轉(zhuǎn) 化率僅僅降低了 7. 0%，糖向乙醇的轉(zhuǎn)化率仍有77. 4%。其降低程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于原始酵母的 18. 5%，具有較強(qiáng)的木質(zhì)素耐受性。為改善木質(zhì)纖維素水解液乙醇發(fā)酵效率提供了核心技 術(shù)和材料。本發(fā)明技術(shù)可應(yīng)用于木質(zhì)纖維素為原料的生物乙醇生產(chǎn)，對(duì)促進(jìn)生物乙醇生產(chǎn) 的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展、以及環(huán)境保護(hù)、糧食安全保障具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 以下結(jié)合【專利附圖】

【附圖說明】本發(fā)明的特征和有益效果。
[0021] 圖1 :表示紫外誘變中的細(xì)胞存活率曲線。
[0022] 圖2 :突變株MS-W馴化過程中的菌液OD值變化（a、b、c、d、e、f分別表示各木質(zhì) 素成分濃度為〇. 25、0. 5、0. 75、1. 0、1. 25、I. 5g/L的培養(yǎng)階段）。
[0023] 圖3 :突變株MS-P馴化過程中的菌液OD值變化（a、b、c、d、e、f分別表示各木質(zhì) 素成分濃度為〇. 25、0. 5、0. 75、1. 0、1. 25、I. 5g/L的培養(yǎng)階段）。
[0024] 圖4 :表示釀酒酵母LTY-I在種子培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。
[0025] 圖5 :乙醇發(fā)酵過程中釀酒酵母LTY-I和原始酵母的發(fā)酵液OD值變化（〇釀酒酵 母LTY-I，Λ原始酵母）。
[0026] 圖6 :乙醇發(fā)酵過程中釀酒酵母LTY-I和原始酵母的糖轉(zhuǎn)化率和殘?zhí)菨舛茸兓?(〇釀酒酵母LTY-I的糖轉(zhuǎn)化率，?釀酒酵母LTY-I的殘?zhí)菨舛龋冀湍傅奶寝D(zhuǎn)化率，▲ 原始酵母的糖轉(zhuǎn)化率）。
[0027] 本發(fā)明提供的能耐受木質(zhì)素毒性的釀酒酵母菌LTY-I (Saccharomyces cerevisiae LTY-1)，已于2014年5月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（簡(jiǎn)稱CCTCC)， 地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2014184。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí) 施例范圍之中。
[0029] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法的條件。本發(fā)明對(duì)常規(guī) 方法的做了進(jìn)一步優(yōu)化，以得到最優(yōu)的技術(shù)效果。
[0030] 實(shí)施例1本實(shí)施例說明本發(fā)明所述的Saccharomyces cerevisiae LTY-1的篩選 方法。
[0031] 本發(fā)明篩選中采用的培養(yǎng)基為：
[0032] (1)液體Yro培養(yǎng)基：酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，自然pH。
[0033] (2)固體Yro培養(yǎng)基：在液體Yro培養(yǎng)基中加入瓊脂20g/L。
[0034] (3)固體再生培養(yǎng)基：在液體Yro培養(yǎng)基中加入瓊脂20g/L、蔗糖170g/L。
[0035] (4)種子培養(yǎng)基：酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，自然pH。
[0036] (5)發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸粉61g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖350g/L，自然pH。
[0037] 以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) CGMCC2. 1429 (中國(guó)普通微生物保藏中 心）為原始酵母菌種。菌種購(gòu)入后，從安瓿管轉(zhuǎn)接至斜面Yro培養(yǎng)基上，于3〇°c的生化培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)48h，連續(xù)傳兩代，進(jìn)行菌種活化。菌種活化后，在4°C條件下保藏待用。
[0038] 具體篩選步驟如下：
[0039] 1、采用紫外誘變箱對(duì)原始酵母的單倍體全細(xì)胞及其原生質(zhì)體進(jìn)行誘變。紫外燈功 率為15w，燈下垂直距離30cm處有磁力攪拌器，誘變箱體積為50cmX30cmX30cm。
[0040] (1)全細(xì)胞誘變
[0041] 將酵母單倍體全細(xì)胞在50ml液體YH)培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)（30°C、180rpm、12h)至 對(duì)數(shù)早期，取5mL適當(dāng)稀釋的菌液（其細(xì)胞濃度為IO 6個(gè)/mL)于直徑為9cm的滅菌培養(yǎng)皿 中，在每個(gè)培養(yǎng)皿中放一個(gè)回形針并置于紫外誘變箱內(nèi)的磁力攪拌器上，邊攪拌邊進(jìn)行紫 外線照射處理。紫外線照射時(shí)間分別設(shè)定為40、80、120、160、200、240、280、320、3608。紫外 線照射處理后，取菌液ImL涂布在平板YH)培養(yǎng)基上，每組樣品涂5-10個(gè)平板，避光條件下 30°C培養(yǎng)48h，測(cè)定菌落數(shù)（即活細(xì)胞數(shù)）。紫外誘變中的細(xì)胞存活率由下式計(jì)算：

【權(quán)利要求】
1. 一株耐受木質(zhì)素的釀酒酵母菌，其特征在于，其分類命名為釀酒酵母LTY-1 cerdisiae LTY-1)，已于2014年5月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心，地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)為CCTCC NO :M 2014184。
2. 如上述權(quán)利要求1所述的釀酒酵母LTY-1在生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述釀酒酵母LTY-1在生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步 驟： (1) 種子培養(yǎng)：將釀酒酵母菌LTY-1在種子培養(yǎng)基、30 °C、180 rpm條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù) 中期，作為種子液； (2) 乙醇發(fā)酵：將種子液按10 %的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶 中，在搖床上進(jìn)行乙醇發(fā)酵。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的釀酒酵母LTY-1在生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用，其特征在于，所述 步驟（2)中發(fā)酵初始糖濃度220-260g/L，發(fā)酵時(shí)間36-40h，發(fā)酵溫度30-33°C，搖床轉(zhuǎn)速 150_175rpm〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的釀酒酵母LTY-1生產(chǎn)乙醇應(yīng)用，其特征在于，所述步驟（2)中 發(fā)酵初始糖濃度為242 g/L、發(fā)酵時(shí)間36 h、發(fā)酵溫度30°C、搖床轉(zhuǎn)速150 rpm。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4-5所述釀酒酵母LTY-1生產(chǎn)乙醇的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟（2) 中，發(fā)酵培養(yǎng)基還含有木質(zhì)素或木質(zhì)素成分。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述釀酒酵母LTY-1生產(chǎn)乙醇的應(yīng)用，其特征在于，所述的木質(zhì)素在 發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為4. 3g/L。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的釀酒酵母LTY-1生產(chǎn)乙醇的應(yīng)用，其特征在于，所述木質(zhì)素成 分包括紫丁香醇、對(duì)羥基苯甲醛、香草醛中的一種或多種。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的釀酒酵母LTY-1生產(chǎn)乙醇的應(yīng)用，其特征在于，所述的紫丁香 醇、對(duì)羥基苯甲醛、香草醛在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度各為1. 44g/L。
【文檔編號(hào)】C12R1/865GK104263665SQ201410489663
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月23日
【發(fā)明者】繆冶煉, 尤業(yè)兵, 季萌, 陳君, 李文莉, 許琳 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)