專利名稱：檢測志賀菌的實(shí)時(shí)熒光pcr試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測志賀菌(Shigella)的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒及其檢測方法。
(二)
背景技術(shù)：
志賀菌(Shigella)作為侵襲性病原菌，可直接破壞腸黏膜，引起細(xì)菌性痢疾和食 物中毒。全球每年有1.6億志賀菌患者，約有110萬人死亡。是我國夏、秋季常見的腸道傳 染病，也是傳染病防制法規(guī)定的丙類傳染病病原菌，屬于對人類和動(dòng)物健康有極大危害的 一類食源性病原菌。 志賀菌目前主要通過培養(yǎng)法分離，生化方法鑒定，整個(gè)過程操作繁瑣，耗時(shí)長，陽 性率低。T叫Man-MGB探針熒光PCR方法是在熒光定量PCR技術(shù)上發(fā)展起來的一種新型實(shí)時(shí) 定量體外核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)，比后者具有更好的敏感性、特異性和重復(fù)性，而且時(shí)間更縮短 為2 3h以內(nèi)。
(三)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是根據(jù)志賀菌ipaH基因設(shè)計(jì)引物和T叫Man探針，提供一種檢測志賀 菌的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒及檢測方法，可實(shí)現(xiàn)對志賀菌快速、準(zhǔn)確、特異檢測。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 —種檢測志賀菌(Shigella)的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，所述試劑盒主要包括特異性 引物和熒光探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特異 性引物和熒光探針序列如下 上游引物5' -GGAAAACCCTCCTGGTCCAT-3'
下游引物5' -CGCCGGTATCATTATCGAAAA-3'
熒光探針5' -FAM-AGGCATCAGAAGGC-MGB-3'
其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，MGB為熒光淬滅基團(tuán)。 本發(fā)明關(guān)鍵在于特異性引物和熒光探針序列的設(shè)計(jì)及檢測方法，試劑盒中其他組 成，可按本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，該試劑盒可用作志賀菌的定性檢測，也可加入標(biāo)準(zhǔn)菌株標(biāo)準(zhǔn) 品進(jìn)行定量檢測。 為達(dá)到定量檢測的效果，所述試劑盒還包括志賀菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC51570)的DNA 標(biāo)準(zhǔn)品。以梯度濃度的志賀菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC51570)的DNA溶液在與樣品DNA相同條件下 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以志賀菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC51570)濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)、 Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)樣品測得的Ct值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得樣品中志賀菌的 濃度。 本發(fā)明應(yīng)用新型T叫Man-MGB探針，建立的志賀菌實(shí)時(shí)PCR方法，可直接檢測疑似 病人、食品和環(huán)境中志賀菌，為志賀菌食物中毒事件快速診斷，為迅速采取相應(yīng)措施，避免 任何食品來源疾病的爆發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。 本發(fā)明一種檢測賀菌的熒光定量PCR方法，所述方法包括
3
(1)按照常規(guī)方法提取待測樣品DNA ;通常采用熱裂解法將菌株收集于1. 5mL管 中，置沸水浴10min， 10000rpm離心5min，吸上清至另一離心管，-4(TC保存?zhèn)溆茫?
(2)以待測樣品DNA為模板，與特異性引物和熒光探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核 苷混合物和DNA聚合酶混合配制PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物置于定量PCR儀進(jìn) 行熒光檢測； 所述特異性引物和熒光探針序列如下
上游引物5' -GGAAAACCCTCCTGGTCCAT-3'
下游引物5' -CGCCGGTATCATTATCGAAAA-3'
熒光探針5' -FAM-AGGCATCAGAAGGC-MGB-3'
其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，MGB為熒光淬滅基團(tuán)； (3)擇熒光檢測模式FAM熒光，基線調(diào)整取3 15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，以閾值線剛 好超過正常陰性對照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；若待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈良 好的對數(shù)增長，CT值小于35，則判斷為陽性，即樣本中存在志賀菌。 所述陰性對照品可按本領(lǐng)域常規(guī)方法選擇，通常選擇不含靶基因的非靶細(xì)菌， 如副溶血性弧菌、單增李氏菌、沙門菌等。進(jìn)一步，所述方法同時(shí)以梯度濃度的志賀菌 (ATCC51570)DNA溶液在與樣DNA相同條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以志賀菌 (ATCC51570)濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)、Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)樣品測得的Ct值， 對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得樣品志賀菌的濃度。 所述PCR反應(yīng)體系組成及反應(yīng)條件可按參照本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR方法，具體 的，步驟(3)中PCR體系終濃度組成如下
PCR緩沖液 終濃度為1X 脫氧三磷酸核苷混合物 各0. 1 0. 5mmol/L
各O. 2 0. 4iimo1/1 0. 1 0. 2iimo1/1 0. 5 5U/反應(yīng) 10 103ng/ii L




上、下游引物 熒光探針 DNA聚合酶 模板DNA 溶劑為ddH20。
所述PCR緩沖液為one st印RT-PCR緩沖液，其終濃度為1 X ，是指緩沖液各組分 在反應(yīng)體系中的終濃度與1Xone st印RT-PCR緩沖液中各組分的濃度相同。1Xone st印 RT-PCR緩沖液的組成參見Takara公司的one st印Prime Script RT-PCR (Perfect Real time) ， Code :DRR064A。 實(shí)際使用中，通常選用將DNA聚合酶、反應(yīng)用Buffer、 dNTP等試劑預(yù)混在一起的 Premix Type試劑(如Premix Ex Taq TM(2X) ， TaKaRa， DRR039S)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，PCR反應(yīng) 液的配制十分方便簡單。 步驟(3)中PCR反應(yīng)條件如下95。C預(yù)變性20S，95。C變性10S，50。C退火40S，40 個(gè)循環(huán)。 發(fā)明建立了利用T叫Man-MGB熒光定量PCR技術(shù)檢測志賀菌的方法，并經(jīng)檢測模擬 雙盲食品污染樣本，表明該方法切實(shí)可行。由于本方法采用了 PCR擴(kuò)增技術(shù)，使得細(xì)菌的檢 測敏感性大大提高，而且由于熒光探針的應(yīng)用，使得其特異性亦大大提高，降低了常規(guī)PCR擴(kuò)增的假陽性率。 在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)出現(xiàn)之前，人們對PCR模板的定量不論是直接PCR 還是競爭性PCR，基本上都要通過PCR產(chǎn)物電泳，再將電泳結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像處理，根據(jù)電 泳條帶的亮度來確定最終PCR產(chǎn)物量的多少，或?qū)?biāo)記的PCR產(chǎn)物以ELISA的方式進(jìn)行 檢測，再由此推測起始模板的量，但這些方法實(shí)際上都屬于半定量水平，因?yàn)榧词筆CR條件 已最優(yōu)化，電泳及后續(xù)步驟的操作的不穩(wěn)定性仍會(huì)給結(jié)果分析帶來影響，從而影響定量這 一目的。 隨著實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)，人們可以真正地做到對PCR模板的精確定量， 這種定量不僅保持了常規(guī)PCR的高靈敏性，而且由于特異性熒光探針雜交技術(shù)的應(yīng)用，使 得被檢測基因的特異性大大提高。 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在靶細(xì)菌的檢測敏感性高，特異性好，降低了常規(guī) PCR擴(kuò)增的假陽性率；可實(shí)現(xiàn)對志賀菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、特異檢測。
(四)


圖1為實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測志賀菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)菌株
(ATCC51570)檢測結(jié)果，從左至右分別為105、1()4、103、102、1(^CFU/mL標(biāo)準(zhǔn)品； 圖2為實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y = -4. 296X+lgX+6. 190 :對應(yīng)
的CT值；X :細(xì)菌的CFU ; 圖3為熒光定量PCR檢測特異性結(jié)果。
(五)
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此 實(shí)施例1 :特異性引物、熒光探針
1、材料 Premix Ex Taq TM(2X)購自TaKaRa公司(DRR039S);
MX3000P型定量PCR儀為美國STRATAGNE公司產(chǎn)品。
2、引物及探針設(shè)計(jì)與合成 以志賀菌ipaH基因序列(注冊號(hào)為DQ448042)為模板，使用 PrimerExpressTM(V2. 0，美國ABI公司)軟件分析TaqMan-MGB引物和探針位點(diǎn)，從中選擇最 佳組合 上游引物5' -GGAAAACCCTCCTGGTCCAT-3'
下游引物5' -CGCCGGTATCATTATCGAAAA-3'
熒光探針5' -FAM-AGGCATCAGAAGGC-MGB-3'
其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，MGB為熒光淬滅基團(tuán)。
均由大連寶生物工程有限公司合成。
實(shí)施例2 :志賀菌熒光定量PCR法特異性評價(jià)
1、菌株檢測用3株志賀菌標(biāo)準(zhǔn)株(痢疾志賀菌CMCC 51570、宋內(nèi)志賀菌CMCC51334、福氏志賀菌ATCC 12022) 、30株志賀菌分離株，以及大腸桿菌、沙門氏菌、檸檬酸桿菌、大腸桿菌、副 溶血性弧菌、耶爾森菌、變形桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、糞產(chǎn)堿 桿菌、萊曼氏乳酸菌、臘樣芽孢桿菌、鴨沙門氏菌、奇異變形桿菌、溶血性鏈球菌等91株非 志賀菌菌懸液，用熱裂解法提取DNA，然后用檢測用上下游引物及探針在美國STRATAGNE公 司MX3000P型定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 (1)熱裂解法將菌株收集于1. 5mL管中，置沸水浴10min， 10000rpm離心5min，吸
上清至另一離心管，_401:保存?zhèn)溆茫?(2)總反應(yīng)體系包括Premix Ex Taq TM(2X) (TaKaRa，DRR039S) 12. 5ii L，上、下游
引物(20iimol/L)各0.4iiL，探針(20 ii mol/L)0. 2 ii L，模板DNA量為5.0iiL(約100ng/
ii L)，用ddH20補(bǔ)足25 i！ L。反應(yīng)管置于定量PCR儀進(jìn)行熒光檢測； 反應(yīng)條件95。C預(yù)變性20S，95。C變性10S，50。C退火40S，40個(gè)循環(huán)。 以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；若待測菌株熒光增長曲線
超過閾值線，并呈良好的對數(shù)增長，CT值小于35，則判斷為陽性。 同時(shí)在相同條件下以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC51570)DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，并繪 制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 待測樣本的測定結(jié)果經(jīng)儀器處理根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出檢測樣本中的志賀菌的數(shù)
2、樣品檢測結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC51570)DNA標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果參見圖l，標(biāo)準(zhǔn)曲線參見圖2。
特異性結(jié)果顯示顯示3株志賀菌標(biāo)準(zhǔn)株，30株志賀菌分離株Ct值均小于35，而非 志賀菌的Ct值大于35或擴(kuò)增曲線成一平滑直線。 本發(fā)明是結(jié)合最佳實(shí)施例進(jìn)行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)
域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求
書所限定的范圍。 SEQUENCE LISTING 〈110〉浙江省疾病預(yù)防控制中心 〈120〉檢測志賀菌的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒及檢測方法
〈130〉
〈160>3 〈170>PatentIn version 3. 4 〈210>1 〈211>20 〈212>DNA 〈213>Unknown 〈220〉 〈223〉人工序列 〈400〉 1 ggaaaaccct cctggtccat 20
〈210>2
〈211>21〈212>DNA〈213〉Unk訓(xùn)n<220>〈223〉人工序列〈400>2cgccggtatc attetcg朋3 a〈210〉3<211>14〈212>DNA〈213〉Unk麗n〈220〉〈223〉人工序列<400>33ggcatc3ga aggc
權(quán)利要求
一種檢測志賀菌(Shigella)的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，所述試劑盒主要包括特異性引物和熒光探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特異性引物和熒光探針序列如下上游引物5′-GGAAAACCCTCCTGGTCCAT-3′下游引物5′-CGCCGGTATCATTATCGAAAA-3′熒光探針5′-FAM-AGGCATCAGAAGGC-MGB-3′其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，MGB為熒光淬滅基團(tuán)。
2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還含有志賀菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的 DNA標(biāo)準(zhǔn)品。
3. —種檢測賀菌的熒光定量PCR方法，所述方法包括(1) 提取待測樣品DNA ;(2) 以待測樣品DNA為模板，與特異性引物和熒光探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混 合物和DNA聚合酶混合配制PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物置于定量PCR儀進(jìn)行熒 光檢測；所述特異性引物和熒光探針序列如下 上游引物5' -GGAAAACCCTCCTGGTCCAT-3' 下游引物5' -CGCCGGTATCATTATCGAAAA-3' 熒光探針5' -FAM-AGGCATCAGAAGGC-MGB-3' 其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，MGB為熒光淬滅基團(tuán)；(3) 擇熒光檢測模式FAM熒光，基線調(diào)整取3 15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，以閾值線剛好超 過正常陰性對照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；若待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好的 對數(shù)增長，CT值小于35，則判斷為陽性，即樣本中存在志賀菌。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同時(shí)以梯度濃度的志賀菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 的DNA溶液在與樣品DNA相同條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以志賀菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)、Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)樣品測得的Ct值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲 線，獲得樣品中志賀菌的濃度。
5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(3)中PCR體系終濃度組成如下 PCR緩沖液 終濃度為1 X脫氧三磷酸核苷混合物 各0. 1 0. 5mmol/L 上、下游引物 各0. 2 0. 4iimol/L熒光探針 0. 1 0. 2iimol/LDNA聚合酶 0. 5 5U/反應(yīng)模板DNA 10 103ng/ ii L溶劑為ddH20。
6. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(3)中PCR反應(yīng)條件如下 95。C預(yù)變性20S，95。C變性10S，50。C退火40S，4Q個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測志賀菌(Shigella)的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒及其檢測方法。所述試劑盒主要包括特異性引物和熒光探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特異性引物和熒光探針序列如下上游引物5′-GGAAAACCCTCCTGGTCCAT-3′，下游引物5′-CGCCGGTATCATTATCGAAAA-3′，熒光探針5′-FAM-AGGCATCAGAAGGC-MGB-3′，其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，MGB為熒光淬滅基團(tuán)。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在靶細(xì)菌的檢測敏感性高，特異性好，降低了常規(guī)PCR擴(kuò)增的假陽性率；可實(shí)現(xiàn)對志賀菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、特異檢測。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101792794SQ200910098649
公開日2010年8月4日 申請日期2009年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月22日
發(fā)明者占利, 張俊彥, 朱敏, 梅玲玲, 程蘇云 申請人:浙江省疾病預(yù)防控制中心