專利名稱：控制志賀菌分子傳播流行的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種控制方法，特別涉及一種控制志賀菌分子傳播流行的方法。
背景技術(shù)：
控制志賀菌爆發(fā)流行的一項(xiàng)重要措施是快速溯源，切斷傳播途徑，脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)指紋圖譜分析分辨力高，重復(fù)性好被認(rèn)為是對(duì)致病菌分型的″金標(biāo)準(zhǔn)″。美國由HHS/CDC、若干衛(wèi)生部門及實(shí)驗(yàn)室于1996基于PFGE技術(shù)，建立了PulseNet，在2001年達(dá)到全國共享。在標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)技術(shù)和分析程序下對(duì)病原細(xì)菌進(jìn)行分子分型監(jiān)測(cè)、并交流信息的數(shù)據(jù)庫工作網(wǎng)絡(luò)，用于食源性病原體暴發(fā)流行的分型、追蹤、溯源和應(yīng)對(duì)。顯著地提高了發(fā)現(xiàn)疾病大規(guī)模爆發(fā)的監(jiān)控能力。
我國對(duì)志賀菌的分型主要是血清學(xué)方法PFGE未見報(bào)道，無法有效預(yù)防和監(jiān)測(cè)菌痢的爆發(fā)流行。本發(fā)明所在實(shí)驗(yàn)室具有PFGE相關(guān)設(shè)備，積累了一定的經(jīng)驗(yàn)，將對(duì)本省分離的志賀菌進(jìn)行PFGE指紋圖譜分析闡明本省菌痢流行的分子特征，建成我省志賀菌指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，并爭取使本試驗(yàn)室能成為PulseNet China的一個(gè)分支。
腸桿菌科細(xì)菌對(duì)三代頭孢菌素的耐藥機(jī)制主要是產(chǎn)生質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和AmpC酶，我國志賀菌對(duì)三代頭孢菌素耐藥機(jī)制的研究未見報(bào)道，本發(fā)明實(shí)驗(yàn)室已建立了檢測(cè)臨床致病菌ESBLs、AmpC酶的表型和基因型的成熟技術(shù)，在國內(nèi)率先報(bào)道了DHA-1質(zhì)粒AmpC酶，通過這些技術(shù)我們將闡明我省志賀菌對(duì)三代頭孢菌素的耐藥機(jī)制。
我國是目前世界上細(xì)菌對(duì)喹諾酮耐藥性最高的國家，通過對(duì)質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因qnr耐藥機(jī)制的深入研究，將使我們更加深入和全面的闡述細(xì)菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥物的耐藥機(jī)制。在志賀菌中，國外對(duì)氟喹諾酮耐藥機(jī)制的研究很少，尤其是質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥。我國質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥也未見報(bào)道，本發(fā)明將充分利用我國豐富的耐藥菌基因資源對(duì)質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥機(jī)制進(jìn)行深入研究。
耐藥質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移是志賀菌耐藥性日益嚴(yán)重的主要原因。最近的研究顯示整合子在志賀菌的多重耐藥性方面起著重要作用。國外已發(fā)現(xiàn)了兩類整合子的存在，其可變區(qū)往往同時(shí)攜帶多個(gè)耐藥基因盒，但有關(guān)整合子與三代頭孢菌素和氟喹諾酮耐藥基因關(guān)系的研究則很少，國內(nèi)也未見報(bào)道。
如何及時(shí)準(zhǔn)確的識(shí)別菌痢爆發(fā)的流行株？某地區(qū)志賀菌的分子流行特征及耐藥特點(diǎn)如何？他們對(duì)三代頭孢菌素及喹諾酮耐藥機(jī)制是什么？上述耐藥性的播散由何種機(jī)制介導(dǎo)？通過本方法我們將全面系統(tǒng)的回答上述問題。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種將把多重耐藥志賀菌中的質(zhì)粒、整合子及耐藥基因有機(jī)聯(lián)系起來，系統(tǒng)研究其耐藥性轉(zhuǎn)移機(jī)制的控制志賀菌分子傳播流行的方法。
本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種控制志賀菌分子傳播流行的方法，其特殊之處在于包括如下步驟(1)對(duì)收集自某地區(qū)的志賀菌進(jìn)行血清學(xué)分型，確定這一地區(qū)菌痢流行的主要血清型及不同地區(qū)是否存在差異；(2)嚴(yán)格按照美國疾病預(yù)防和控制中心分子分型網(wǎng)站PulseNetUSA提供的針對(duì)志賀菌的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方案對(duì)收集的志賀菌進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳，通過BioNumerics軟件分析確定各地區(qū)菌痢流行的分子亞型及地區(qū)間的相關(guān)性，初步建立該地區(qū)志賀菌DNA指紋圖譜分型數(shù)據(jù)庫；(3)按照CLSI要求對(duì)所收集的志賀菌進(jìn)行紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)，了解這一地區(qū)志賀菌對(duì)不同抗菌藥物的表型耐藥特征并篩選出對(duì)三代頭孢菌素和氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥的菌株；(4)用雙紙片平行抑制試驗(yàn)及三相水解試驗(yàn)檢測(cè)耐三代頭孢菌素的志賀菌中的超廣譜β內(nèi)酰胺酶和AmpC酶，通過等電聚焦電泳、特異PCR引物擴(kuò)增及其產(chǎn)物的序列分析明確其基因型；(5)對(duì)氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥的菌株通過PCR擴(kuò)增DNA促旋酶gyrA、拓?fù)洚悩?gòu)酶IVparC喹諾酮耐藥決定區(qū)QRDRs并對(duì)產(chǎn)物測(cè)序分析，明確志賀菌染色體介導(dǎo)的喹諾酮耐藥的機(jī)制，設(shè)計(jì)特異的PCR引物擴(kuò)增質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB和qnrS，了解志賀菌中是否存在質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥；(6)通過對(duì)多重耐藥的志賀菌株進(jìn)行質(zhì)粒圖譜分析、接合試驗(yàn)、轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、southern雜交、PCR擴(kuò)增檢測(cè)1、2、3類整合子的整合酶基因intI并對(duì)整合子的全可變區(qū)測(cè)序分析來了解耐藥性傳播的分子機(jī)制；(7)對(duì)新發(fā)現(xiàn)的耐藥酶、耐藥位點(diǎn)及通過前述方法無法明確的耐藥現(xiàn)象進(jìn)行隨機(jī)分子克隆進(jìn)一步闡述或發(fā)現(xiàn)新的耐藥機(jī)制。
本發(fā)明存在以下特點(diǎn)1.本發(fā)明對(duì)某地區(qū)分離的志賀菌進(jìn)行PFGE指紋圖譜分析，建立數(shù)據(jù)庫，闡明該地區(qū)菌痢流行的分子特征，并爭取使本試驗(yàn)室能成為PulseNet China的一個(gè)分支。
2.本發(fā)明實(shí)驗(yàn)室經(jīng)多年研究已建立了檢測(cè)臨床致病菌ESBLs、AmpC酶的表型和基因型的成熟技術(shù)，在國內(nèi)率先報(bào)道了DHA-1等質(zhì)粒AmpC酶，通過這些技術(shù)我們闡明志賀菌對(duì)三代頭孢菌素的耐藥機(jī)制。
3.我國是目前世界上細(xì)菌對(duì)喹諾酮耐藥性最高的國家，腸桿菌科細(xì)菌對(duì)氟喹諾酮的耐藥機(jī)制主要是編碼DNA促旋酶gyrA、拓?fù)洚悩?gòu)酶IVparC的喹諾酮耐藥決定(QRDRs)發(fā)生基因突變，而最近發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因qnr則改變了傳統(tǒng)的染色體介導(dǎo)的觀點(diǎn)，而且當(dāng)細(xì)菌獲得qnr基因后其本身QRDR堿基突變的幾率明顯升高，通過對(duì)此機(jī)制深入研究將使我們更加深入和全面的闡述細(xì)菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥物的耐藥機(jī)制。在志賀菌中由于國外的菌株對(duì)氟喹諾酮的敏感率高而很少能獲得耐藥株，所以有關(guān)其耐藥機(jī)制的研究很少，尤其是質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥。我國有少數(shù)在福氏志賀菌中檢測(cè)染色體QRDRs突變的報(bào)道，但其研究均局限于單一的血清型或局部地區(qū)的菌株，而質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥也未見報(bào)道，本發(fā)明充分利用我國豐富的耐藥菌基因資源對(duì)上述機(jī)制進(jìn)行了深入研究。
4.志賀菌的耐藥性日益嚴(yán)重，耐藥質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移是其主要原因第一個(gè)耐藥″R″質(zhì)粒，第一個(gè)介導(dǎo)四環(huán)素耐藥質(zhì)粒，第一個(gè)介導(dǎo)喹諾酮耐藥質(zhì)粒均是首次在志賀菌中發(fā)現(xiàn)，而最近的研究顯示整合子在志賀菌的多重耐藥性方面則起著重要作用。整合子的一個(gè)顯著特點(diǎn)是具有突出的基因捕獲及表達(dá)能力。目前在細(xì)菌耐藥中的作用是國內(nèi)外的一個(gè)研究熱點(diǎn)，志賀菌中整合子的研究方面國外已發(fā)現(xiàn)了兩類整合子的存在，其可變區(qū)同時(shí)攜帶多個(gè)耐藥基因盒，如dfaA、oxa、tet、cat等分別介導(dǎo)對(duì)磺胺、氨芐西林、四環(huán)素和氯霉素的耐藥，但有關(guān)整合子與三代頭孢菌素和氟喹諾酮耐藥基因關(guān)系的研究很少，國內(nèi)也未見報(bào)道。本發(fā)明將把多重耐藥志賀菌中的質(zhì)粒、整合子聯(lián)系起來，有所突破。
本發(fā)明將把多重耐藥志賀菌中的質(zhì)粒、整合子及耐藥基因有機(jī)聯(lián)系起來，系統(tǒng)研究其耐藥性轉(zhuǎn)移的機(jī)制，并對(duì)整合子的全可變區(qū)測(cè)序分析來了解耐藥性傳播的分子機(jī)制，作到了有所突破。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例的技術(shù)路線包括如下步驟(1)血清學(xué)分型對(duì)收集的志賀菌通過生化試驗(yàn)進(jìn)行菌種鑒定，并采用志賀菌屬多價(jià)診斷血清對(duì)志賀菌屬的四種血清型及其不同的亞型進(jìn)行血清學(xué)分型。
(2)藥敏試驗(yàn)按照NCCLS規(guī)定，采用紙片擴(kuò)散法對(duì)上述菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，質(zhì)控菌株ATCC25922，所選用的抗菌藥物紙片包括氨芐西林、四環(huán)素、萘定酸、復(fù)方磺胺、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟和頭孢他啶。上述試驗(yàn)中對(duì)氟喹諾酮和三代頭孢菌素耐藥的菌株用Etest試條(瑞典AB BIODISK公司)檢測(cè)其MIC值，用WHONET5.3軟件對(duì)藥敏結(jié)果進(jìn)行分析。
(3)脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)嚴(yán)格按照PulseNetUSA提供的針對(duì)志賀菌的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方案進(jìn)行，(http//www.cdc.gov/pulsenet/protocols/ecoli_salmonella_shigella_protocols.pdf)BioNumerics軟件(Applied Maths，Kortrijk，比利時(shí))分析PFGE圖像建立數(shù)據(jù)庫。
(4)耐三代頭孢菌素機(jī)制分析表型篩選ESBLs和AmpC酶根據(jù)藥敏結(jié)果用雙紙片平行抑制試驗(yàn)檢測(cè)產(chǎn)ESBLs菌株，用本實(shí)驗(yàn)室建立的改良三相水解試驗(yàn)檢測(cè)產(chǎn)AmpC酶菌株。
等電聚焦電泳按照美國BIO-RAD操作說明進(jìn)行。
ESBLs和AmpC酶基因型PCR檢測(cè)根據(jù)耐藥表型和β-內(nèi)酰胺酶的pI值，選擇設(shè)計(jì)特異性的ESBL引物(如SHV、TEM、CTX-M)和AmpC引物(如DHA、CMY)，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后在ABI Prism 3700 DNA測(cè)序儀上測(cè)序。
(5)氟喹諾酮耐藥機(jī)制分析通過GenBank已知的基因序列用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增DNA促旋酶gyrA、拓?fù)洚悩?gòu)酶IVparC喹諾酮耐藥決定(QRDRs)、質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB和qnrS的特異引物擴(kuò)增上述耐藥基因并測(cè)序。
(6)質(zhì)粒分析質(zhì)粒圖譜和酶切圖譜分析耐藥菌株用UNIQ-10質(zhì)粒抽提試劑盒(上海生工)抽提后通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳作圖，以11種超螺旋混合質(zhì)粒(美國Sigma)為分子量標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)來自不同菌株相同大小的質(zhì)粒酶切后1％瓊脂糖凝膠電泳作圖。
質(zhì)粒結(jié)合試驗(yàn)篩選三代頭孢菌素耐藥質(zhì)粒和喹諾酮耐藥質(zhì)粒。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化試驗(yàn)篩選轉(zhuǎn)化成功的耐藥質(zhì)粒。
(7)整合子分析根據(jù)文獻(xiàn)分別用針對(duì)不同整合酶的特異引物PCR擴(kuò)增篩選整合子IintI1、intI2、intI3，對(duì)陽性菌株設(shè)計(jì)針對(duì)整合子全可變區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序。
(8)對(duì)新發(fā)現(xiàn)的耐藥酶、耐藥位點(diǎn)及前述方法無法明確的耐藥菌株采用Sau3AI消化細(xì)菌染色體DNA或耐藥質(zhì)粒，BamHI酶切質(zhì)粒pBK-CMV進(jìn)行分子克隆，重組質(zhì)粒在大腸桿菌HB101中進(jìn)行表達(dá)。
A、主要技術(shù)指標(biāo)
1.脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)志賀菌進(jìn)行PFGE指紋圖譜分析，建立數(shù)據(jù)庫，闡明山東地區(qū)菌痢流行的分子流行特征。
2.雙紙片平行抑制試驗(yàn)及三相水解試驗(yàn)檢測(cè)耐三代頭孢菌素的志賀菌中的超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和AmpC酶表型。
3.等電聚焦電泳檢測(cè)酶的等電點(diǎn)。
4.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)設(shè)計(jì)特異PCR引物(1)擴(kuò)增耐三代頭孢菌素的志賀菌中的編碼超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和AmpC酶的耐藥基因，明確其基因型別。(2)擴(kuò)增對(duì)氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥的菌株中DNA促旋酶gy rA、拓?fù)洚悩?gòu)酶IVparC喹諾酮耐藥決定(QRDRs)基因并對(duì)產(chǎn)物測(cè)序分析，明確志賀菌染色體介導(dǎo)的喹諾酮耐藥的機(jī)制。(3)擴(kuò)增質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB和qnrS，了解我國志賀菌中是否存在質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥。(4)檢測(cè)1、2、3類整合子的整合酶基因intI并對(duì)整合子的全可變區(qū)測(cè)序分析來了解耐藥性傳播的分子機(jī)制。
5.質(zhì)粒圖譜分析、接合試驗(yàn)、轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、southern雜交分析耐藥基因傳播途徑是染色體、質(zhì)?；蛘献?。
6.隨機(jī)分子克隆對(duì)本研究新發(fā)現(xiàn)的耐藥酶、耐藥位點(diǎn)及通過前述方法無法明確的耐藥現(xiàn)象進(jìn)行進(jìn)一步闡述或發(fā)現(xiàn)新的耐藥機(jī)制。
B、工作基礎(chǔ)本發(fā)明組多年從事細(xì)菌耐藥性方面的研究工作，了解本專業(yè)的研究前沿，建立了一支結(jié)構(gòu)合理、具有良好團(tuán)隊(duì)精神的專業(yè)研究隊(duì)伍，在革蘭陰性桿菌的耐藥機(jī)制和分子流行病學(xué)分析方面形成了較強(qiáng)的專業(yè)特色。
1.本發(fā)明負(fù)責(zé)人為某地區(qū)臨床檢驗(yàn)中心微生物學(xué)組組長，負(fù)責(zé)某地區(qū)各地市醫(yī)院檢驗(yàn)科室間質(zhì)量評(píng)價(jià)工作，與各個(gè)實(shí)驗(yàn)室有密切聯(lián)系，可以保證志賀菌株的來源和質(zhì)量。
2.本實(shí)驗(yàn)室建立了長期的細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)的數(shù)據(jù)庫和電腦分析系統(tǒng)，可對(duì)細(xì)菌的表型耐藥特征和耐藥趨勢(shì)進(jìn)行精確、科學(xué)的分析。
3.建立了ESBLs、AmpC和金屬酶等重要耐藥細(xì)菌的表型及基因型檢測(cè)的方法，在國內(nèi)首先發(fā)現(xiàn)并報(bào)導(dǎo)鑒定出DHA-1等耐藥基因。
4.建立了成熟的repPCR、PFGE等醫(yī)院和社區(qū)感染的分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)方法。
C、工作條件細(xì)菌鑒定、藥敏檢測(cè)和分析系統(tǒng)API、ATB和VITEK2系統(tǒng)法國生物梅里埃公司E test系統(tǒng)瑞典AB BIODISK公司藥敏專用分析軟件WHONET5.3，世界衛(wèi)生組織CHEF-Mapper脈沖場(chǎng)電泳儀，美國BIO-RAD公司等電聚焦電泳儀phastsys2tem型，美國Pharmacia公司MDF-U2086S低溫冰箱，SANYOTanon GIS-2020凝膠成像系統(tǒng)，上海天龍公司電轉(zhuǎn)儀electroporator 2510，德國eppendorf9700型PCR儀，AppliedBiosystems。
權(quán)利要求
1.一種控制志賀菌分子傳播流行的方法，其特征在于包括如下步驟(1)對(duì)收集自某地區(qū)的志賀菌進(jìn)行血清學(xué)分型，確定這一地區(qū)菌痢流行的主要血清型及不同地區(qū)是否存在差異；(2)嚴(yán)格按照美國疾病預(yù)防和控制中心分子分型網(wǎng)站PulseNetUSA提供的針對(duì)志賀菌的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方案對(duì)收集的志賀菌進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳，通過BioNumerics軟件分析確定各地區(qū)菌痢流行的分子亞型及地區(qū)間的相關(guān)性，初步建立該地區(qū)志賀菌DNA指紋圖譜分型數(shù)據(jù)庫；(3)按照CLSI要求對(duì)所收集的志賀菌進(jìn)行紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)，了解這一地區(qū)志賀菌對(duì)不同抗菌藥物的表型耐藥特征并篩選出對(duì)三代頭孢菌素和氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥的菌株；(4)用雙紙片平行抑制試驗(yàn)及三相水解試驗(yàn)檢測(cè)耐三代頭孢菌素的志賀菌中的超廣譜β內(nèi)酰胺酶和AmpC酶，通過等電聚焦電泳、特異PCR引物擴(kuò)增及其產(chǎn)物的序列分析明確其基因型；(5)對(duì)氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥的菌株通過PCR擴(kuò)增DNA促旋酶gyrA、拓?fù)洚悩?gòu)酶IVparC喹諾酮耐藥決定QRDRs并對(duì)產(chǎn)物測(cè)序分析，明確志賀菌染色體介導(dǎo)的喹諾酮耐藥的機(jī)制，設(shè)計(jì)特異的PCR引物擴(kuò)增質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB和qnrS，了解志賀菌中是否存在質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥；(6)通過對(duì)多重耐藥的志賀菌株進(jìn)行質(zhì)粒圖譜分析、接合試驗(yàn)、轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、southern雜交、PCR擴(kuò)增檢測(cè)1、2、3類整合子的整合酶基因intI并對(duì)整合子的全可變區(qū)測(cè)序分析來了解耐藥性傳播的分子機(jī)制；(7)對(duì)新發(fā)現(xiàn)的耐藥酶、耐藥位點(diǎn)及通過前述方法無法明確的耐藥現(xiàn)象進(jìn)行隨機(jī)分子克隆進(jìn)一步闡述或發(fā)現(xiàn)新的耐藥機(jī)制。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種控制方法，特別公開了一種控制志賀菌分子傳播流行的方法。該方法包括如下步驟(1)確定一地區(qū)菌痢流行的主要血清型及不同地區(qū)是否存在差異；(2)初步建立該地區(qū)志賀菌DNA指紋圖譜分型數(shù)據(jù)庫；(3)按照CLSI要求對(duì)所收集的志賀菌進(jìn)行紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)；(4)分析明確其基因型；(5)了解志賀菌中是否存在質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥；(6)對(duì)整合子的全可變區(qū)測(cè)序分析來了解耐藥性傳播的分子機(jī)制；(7)進(jìn)一步闡述或發(fā)現(xiàn)新的耐藥機(jī)制。本發(fā)明將把多重耐藥志賀菌中的質(zhì)粒、整合子及耐藥基因有機(jī)聯(lián)系起來，系統(tǒng)研究其耐藥性轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
文檔編號(hào)G01N33/15GK1837811SQ200610043619
公開日2006年9月27日 申請(qǐng)日期2006年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月24日
發(fā)明者王勇 申請(qǐng)人:王勇