專利名稱：一種增強骨髓間充質(zhì)干細胞移植后存活率的處理方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種增強骨髓間充質(zhì)干細胞移植后存活率的處理方法，以 提高細胞移植修復組織損傷的效能。。
(二)
背景技術(shù)：
熱休克蛋白(heat shock protein, Hsp )是一類在生物進化過程中高度
保守并廣泛存在于原核及真核生物中的蛋白質(zhì)。熱休克蛋白是一個多基因 家族，其中不同基因的產(chǎn)物在細胞中的表達、功能和定位都有不同。熱休 克蛋白在機體內(nèi)作為分子伴侶，參與維持蛋白的正常折疊以形成蛋白的正 常結(jié)構(gòu)，并在調(diào)節(jié)蛋白合成與降解的平衡及蛋白定位中起著重要的作用。 當細胞受到環(huán)境的各種刺激時，細胞內(nèi)熱休克蛋白的表達增加，能快速短 暫地保護細胞對抗內(nèi)源性應激的進攻，增強細胞的修復功能以及提高細胞 對應激的耐受程度。
熱休克蛋白90 (Hsp90)是細胞內(nèi)最活躍的分子伴侶蛋白之一，影響 著細胞內(nèi)許多信號轉(zhuǎn)導蛋白的正常功能發(fā)揮。研究發(fā)現(xiàn)，Hsp90對腫瘤發(fā) 生發(fā)展起著重要作用，已成為治療腫瘤的新靶位。熱休克蛋白通常被認為 是細胞生存因子，在細胞凋亡發(fā)生過程中，Hsp90可以通過阻止 procaspase-9與Apaf-l凋亡體的結(jié)合而抑制凋亡的發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)提示分 子伴倡的作用就像是個分界點，它引導感受到外界應激作用的細胞的走向 生存或是死亡。在細胞發(fā)生凋亡前，Hsp90允許細胞暫時休整，并動員細 胞本身的能力對應激誘導的損傷進行修復,這個作用有點類似于細胞周期 中的4企測點。細胞移植治療修復組織損傷是目前新興的醫(yī)療領域熱點。細胞療法是 對傳統(tǒng)醫(yī)學的一種補充手段，為某些難治性疾病的治療提供新的希望。干 細胞是一種能自我復制無限增殖,在特定的誘導條件下向同胚層或其他胚 層細胞分化的祖細胞。大量基礎實驗發(fā)現(xiàn)，骨髓千細胞移植能改善心肌梗
死后心功能，延緩心室重構(gòu)。通過20個臨床研究薈萃分析，顯示骨髓來 源的干細胞移植能提高左室射血分數(shù)3.66% (95%CI為1.93%~5.40%, PO.OOl)。有研究發(fā)現(xiàn)，細胞移植后4小時存活的細胞僅占20%,但在 24小時后細胞存活不到10%,細胞移植7天后存活的細胞少之又少。通 過優(yōu)化細胞種類、移植途徑、移植時間等方法能改善干細胞移植的療效， 此外還可以通過提高移植細胞抗凋亡能力和改善移植微環(huán)境來獲取最大 限度的細胞移植效能。目前已有的技術(shù)包括缺氧預處理，藥物預處理和基 因轉(zhuǎn)染等。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種增強骨髓間充質(zhì)干細胞移植后存活率的預處 理方法，以提高細胞移植修復組織損傷的效能。 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
一種增強骨髓間充質(zhì)干細胞移植后存活率的處理方法，所述方法包 括將經(jīng)傳代培養(yǎng)穩(wěn)定的骨髓間充質(zhì)干細胞置于Hsp90濃度0.1~20ju mol/L的細胞培養(yǎng)基中，缺氧培養(yǎng)24 36小時，獲得處理后的骨髓間充質(zhì) 干細胞用于細胞移植。所述細胞培養(yǎng)基為常規(guī)用于骨髓間充質(zhì)干細胞體外 培養(yǎng)的培養(yǎng)基，并且不添加血清，如低糖DMEM液體培養(yǎng)基等，培養(yǎng)溫 度為常規(guī)適用于骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)溫度，只是本發(fā)明在培養(yǎng)基中添 加了 Hsp90,其添加濃度為0.1 20jumol/L,優(yōu)選l~10|amol/L,最優(yōu)選 為10iamol/L;所述缺氧培養(yǎng)是指在沒有氧氣存在下進行培養(yǎng)，通?？稍诘獨?、二氧化碳或者氮氣與二氧化碳混合氣的氛圍下進行培養(yǎng)。所述傳代 培養(yǎng)按常規(guī)方法在常規(guī)氧濃度(即常氧培養(yǎng))條件下進行，通常的，所述
常氧培養(yǎng)為在0)2體積濃度5%、 02體積濃度95%的混合氣體中培養(yǎng)。 本申請發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在細胞移植術(shù)前，Hsp90預處理能激發(fā)細胞內(nèi)源 性保護機制，通過細胞內(nèi)多條信號傳導通路，增強細胞抗凋亡能力。研究 發(fā)現(xiàn)，Hsp90預處理(培養(yǎng)基中終濃度為0.1~20pmol/L,其中以10)amol/L 時作用最強)能提高骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)Akt和ERK磷酸化水平，降低 SPAK/JNK磷酸化水平，從而降低骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)前凋亡蛋白例如 bax的表達，誘導細胞表達抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-xl，降低凋亡執(zhí)行蛋白 Caspase-3的表達。Hsp90預處理尚能促進細胞合成和分泌一氧化氮(Nitric oxide, NO),減少缺氧無血清誘導的細胞凋亡，Hsp90預處理的細胞移 植到急性心肌梗死局部能提高移植細胞的存活率，改善心功能，增強細胞 移植的效能。
具體的，所述方法如下將繼代第3代的骨髓間充質(zhì)干細胞于37°C 下在Hsp90濃度10 ju mol/L的低糖DMEM培養(yǎng)基中缺氧培養(yǎng)24小時， 獲得處理后的骨髓間充質(zhì)干細胞用于細胞移植。
Hsp90包括四個亞單位Hsp90a、 Hsp90p、 GRP94 、 Hsp75/TRAP1。 本發(fā)明中，所述Hsp90優(yōu)選為Hsp90a( GenBank登錄號為CR381646.8 )。
所述缺氧培養(yǎng)是指在缺氧條件下進行培養(yǎng),具體的，所述缺氧培養(yǎng)為
在C02體積濃度5%、 N2體積濃度95%的混合氣體中培養(yǎng)。
具體的，所述方法如下將繼代第3代的骨髓間充質(zhì)干細胞于37°C
下、在C02體積濃度5。/。、 N2體積濃度95。/。的混合氣體中，于Hsp90a濃
度10|imol/L的低糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，獲得處理后的骨髓
間充質(zhì)干細胞用于細胞移植。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在通過Hsp90預處理，可有效提高骨 髓間充質(zhì)干細胞的抗細胞凋亡能力，能提高骨髓間充質(zhì)干細胞移植修復組 織損傷的療效。
(四)


圖1為Hsp90預處理能減少缺氧無血清誘導的細胞凋亡示意圖
圖2為Hsp90預處理能減少缺氧無血清誘導的凋亡率示意圖3為Hsp90預處理能促進細胞合成和分泌一氧化氮(NO)示意圖4為Hsp90預處理通過激活細胞內(nèi)Akt和ERK信號通路，降低SPAK/
JNK磷酸化水平，從而降低細胞內(nèi)前凋亡蛋白bax表達，誘導細胞表達
抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-xl，降低凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3表達的示意圖。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍
并不僅限于此
實施例1:
1. 無菌條件下從合適的健康志愿者(排除造血系統(tǒng)疾患)(王某某，25 歲，來自杭州，本人同意將骨髓捐獻供研究使用)的髂后上棘抽取骨 髓液50mL,放置于預先添加4000IU肝素的無菌玻璃瓶中，充分混勻 避免骨髓液凝固，移至層流室生物安全拒進行下一步操作。
2. 將等量低糖DMEM培養(yǎng)基(購自美國GIBCO公司)(添加100U/mL 青霉素和100U/mL鏈霉素)加入放置骨髓液的無菌玻璃瓶中稀釋骨髓 液，用無菌移液器充分吹散骨髓細胞。
3. 按照密度梯度分離法分離骨髓單個核細胞。在50mL無菌離心管中加 6入20mL淋巴細胞分離液(密度是1.077士0.001 g/mL，購自上海恒信化 學試劑有卩艮公司)，將20mL骨髓液輕輕疊加在淋巴細胞分離液表面。 在高速低溫離心機中(Heraeus D-37520,購自德國Thermo Electron 乂> 司)以4。C條件下900g離心25分鐘。離心完畢后，細胞分層，從下 至下，可見培養(yǎng)基、白膜層、淋巴分離液和紅細胞層。用lmL無菌移 液器收集中間白膜層細胞于另一 50mL離心管中，然后加入20mL低 糖DMEM培養(yǎng)基(購自美國GIBCO公司)，漂洗細胞表面殘留淋巴 分離液。于4。C條件下900g離心10分鐘，棄上清，收集骨髓單個核 細胞。以含10%( v/v )胎牛血清(購自美國GIBCO公司)的低糖DMEM 培養(yǎng)基重懸沉淀細胞，按2《105/0112細胞密度接種至75cn^生長面積 的細胞培養(yǎng)瓶(購自美國Corning公司)，放置于37°C,含5%C02 (空 氣體積濃度95% )和飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱(Forma3 111,購自美國 Thermo Fisher公司)中，靜置48小時后首次換液，以去除不貼壁細胞。 此后每4~5天換液一次，長滿80% 90%以上傳代。
4. 以含10。/。胎牛血清低糖DMEM培養(yǎng)基進行原代和繼代細胞培養(yǎng)，放置 于37。C、 一定濕度的含5。/。C02的混合氣體(空氣體積濃度95%)中 常氧培養(yǎng)，根據(jù)骨髓間充質(zhì)干細胞貼壁生長的特性，每4 5天更換細 胞培養(yǎng)基，去除非貼壁細胞，不斷純化人骨髓間充質(zhì)干細胞。繼代第 3代時細胞可進行形態(tài)學、流式細胞學等細胞鑒定。
5. 將正常氧濃度下培養(yǎng)的繼代第3代人骨髓間充質(zhì)千細胞更換含一定濃 度的人重組Hsp90a (美國assay designs公司，Cat# SPP-776 )的低糖 DMEM培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中Hsp90a終濃度為0.1 10 ju mol/L ),繼續(xù)于 37°C、 一定濕度的含5% (v/v) C02和950/。 (v/v) N2的混合氣體中進 行缺氧培養(yǎng)培養(yǎng)處理。缺氧處理在一個能精確調(diào)控氧濃度的ProOx-C-chamber系統(tǒng)(購自美國Biospherix, Redfield公司)中進行， 設定氧濃度為不大于0.5%,缺氧時間為24小時。缺氧處理結(jié)束后進 行免疫染色、流式細胞學檢測、培養(yǎng)上清液比色法和免疫印跡法檢測 細胞凋亡及其相關蛋白。
6. 免疫熒光Hoechst33258染色檢測細胞凋亡情況加入Hoechst33258(美 國Molecular probe公司)染料于細胞培養(yǎng)液中，避光孵育15分鐘。棄 除細胞培養(yǎng)基，以磷酸鹽緩沖液PBS ( 1000mL蒸餾水中含8gNaCl， 0.2gKCl， 1.44gNa2HP04， 0.24gKH2PO4, PH 7.2-7.6)沖洗3遍后， 于熒光倒置顯微鏡(放大400倍，德國Zeiss公司)攝片觀察細胞核 內(nèi)凋亡小體，實驗結(jié)果見圖1,在熒光倒置顯微鏡下觀察Hoechest染 色的細胞(400倍放大)，左圖顯示在缺氧-缺血清培養(yǎng)24小時后，細 胞核染色體斷裂，出現(xiàn)凋亡小體(藍色亮點)。右圖顯示Hsp90共培養(yǎng) 24 d、時的細胞在缺氧-缺血清環(huán)境下細胞核凋亡小體不明顯；
7. 流式細胞學檢測細胞表面Annexin-V的表達率反映細胞凋亡率根據(jù) Annexin-V試齊寸盒(美國BD Biosciences/>司)才喿作i兌明書進4亍。以水 PBS緩沖液漂洗細胞兩遍后加入結(jié)合緩沖液，將細胞密度調(diào)整至lx106 個/ml。取100ul細胞懸液(lx105個細胞)移至5ml離心管，加入5ul Annexin-V和5ul PI。充分混合后常溫避光孵育15分鐘。每個離心管 中加入400ul結(jié)合緩沖液， 一小時內(nèi)在流式細胞儀下讀數(shù)。該步驟反 復3遍以上，獲取每組樣本的細胞凋亡率，實驗結(jié)果見圖2。
8. 比色法檢測細胞培養(yǎng)上清液NO水平收集細胞培養(yǎng)上清液，應用NO 試劑盒(美國MERCK-Calbiochem公司)；險測細胞分泌NO水平。測 定方法按試劑盒操作說明書進行，繪制標準曲線，根據(jù)酶標儀讀取的OD值獲得相應的NO產(chǎn)量，實驗結(jié)果見圖3。
9.免疫印跡法檢測細胞內(nèi)Akt、 ERK、 SAPK/JNK信號通路蛋白及凋亡相 關蛋白bax、 bcl-2、 bcl-xL和caspase-3的表達改變。
收集的細胞用RIPA buffer ( 50 mM HEPES, pH 7.3， 1% sodium deoxycholate, 1% Triton X畫100, 0.1o/oSDS， 150mMNaCl， ImMEDTA, lmMNa3V04， lmMNaF)裂解后，14，000g離心30 min，收集上清 液凍存于-80。C備用。BCA法(Bicinchoninic Acid Assay,購自美國Sigma 公司)測定蛋白濃度。40昭蛋白樣品在6 15% SDS-PAGE梯度膠用 Hoefer Mini-Gel system ( Amersham Biosciences, 購自美國Piscataway 公司)電;永分離，用Hoefer Transfer Tank (Amersham Biosciences,美國 Piscataway公司)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(購自美國BioRad公司)上， 膜置于緩沖液[Tris緩沖鹽溶液，含0.1% Tween-20 ( TBS-T )， 7%牛奶， pH7.6]室溫下封閉2h,加入相應一抗(1: 1000,購自美國Cell Signaling 公司)于4。C條件下孵育過夜，小鼠抗p-actin( 1: 1000，購自美國Santa Cruz Biotechnology公司)作為蛋白上樣對照；膜用0.5% TBS-T洗滌 后室溫下與結(jié)合堿性磷酸酶的抗兔IgG或抗小鼠IgG抗體(購自美國 Promega公司)孵育2小時，最后TBS-T及TBS洗滌后用BCIP/NBT溶 液顯色(購自美國Sigma公司)，掃描后用Adobe Photoshop CS 8.0 軟件分析信號，實驗結(jié)果見圖4。
結(jié)論Hsp90預處理能通過激活細胞內(nèi)Akt和ERK信號通路， 抑制細胞內(nèi)SAPK/JNK通路，抑制細胞內(nèi)前凋亡蛋白bax表達降低， 抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-xl表達增高，降低凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的表達，同時提高細胞合成NO。實驗結(jié)果顯示，Hsp90在10umol/L時 預處理抗細胞凋亡的作用最強。Hsp90預處理能提高細胞在缺血缺氧 的心肌微環(huán)境中抗凋亡能力
權(quán)利要求
1.一種增強骨髓間充質(zhì)干細胞移植后存活率的處理方法，所述方法包括將經(jīng)傳代培養(yǎng)穩(wěn)定的骨髓間充質(zhì)干細胞置于Hsp90濃度0.1～20μmol/L的細胞培養(yǎng)基中，缺氧培養(yǎng)24～36小時，獲得處理后的骨髓間充質(zhì)干細胞用于細胞移植。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下將繼代第3代的骨髓間充質(zhì)干細胞于37°C下在Hsp90濃度10 in mol/L的低糖DMEM培養(yǎng)基中缺氧培養(yǎng)24小時，獲得處理后的骨髓間充質(zhì)干細胞用于細胞移植。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述Hsp90為Hsp卯a(chǎn)。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，所述缺氧培養(yǎng)為在C02體積濃度5%、N2體積濃度95%的混合氣體中培養(yǎng)。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下將繼代第3代的骨髓間充質(zhì)干細胞于37。C下、在C02體積濃度5%、 N2體積濃度95%的混合氣體中，于Hsp90a濃度10 ja mol/L的低糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，獲得處理后的骨髓間充質(zhì)干細胞用于細胞移植。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種增強骨髓間充質(zhì)干細胞移植后存活率的處理方法，所述方法包括將經(jīng)傳代培養(yǎng)穩(wěn)定的骨髓間充質(zhì)干細胞置于Hsp90濃度0.1～20μmol/L的細胞培養(yǎng)基中，缺氧培養(yǎng)24～36小時，獲得處理后的骨髓間充質(zhì)干細胞用于細胞移植。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在通過Hsp90預處理，可有效提高骨髓間充質(zhì)干細胞的抗細胞凋亡能力，能提高骨髓間充質(zhì)干細胞移植修復組織損傷的療效。
文檔編號C12N5/08GK101550409SQ20091009799
公開日2009年10月7日 申請日期2009年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月29日
發(fā)明者王建安, 謝小潔, 峰 高 申請人:浙江大學