專利名稱：一種增強(qiáng)細(xì)胞特異性目的基因表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及增強(qiáng)細(xì)胞特異性目的基因表達(dá)的方法。
利用細(xì)胞或腫瘤特異性啟動(dòng)子控制治療基因(目的基因)的表達(dá)在基因治療中受到廣泛的重視與研究。特別是在應(yīng)用細(xì)胞毒基因進(jìn)行腫瘤或其他疾病的治療時(shí)，將治療基因的表達(dá)限制在靶細(xì)胞中是減少副作用，提高療效的唯一有效手段。迄今已證明一些啟動(dòng)子在某些細(xì)胞中活性較強(qiáng)，而在另一些細(xì)胞中活性很弱或無(wú)活性。這些啟動(dòng)子已用于控制治療基因在特定的靶細(xì)胞中的表達(dá)，以減少其在非靶細(xì)胞中的表達(dá)。例如，酪氨酸酶基因的啟動(dòng)子用于控制治療基因在黑色素瘤中的表達(dá)(Vile，R.G.and Hart，I.R.Cancer Res.，53962-967，1993)，癌胚抗原基因的啟動(dòng)子用于控制治療基因在結(jié)腸癌與肺癌中的表達(dá)(Osaki，T.，Tanio，Y.，Tachibana，I.，Hosoe，S.，Kumagai，T.，Kawase，I.，Oikawa，S.，and Kishimoto，T.Cancer Res.，545258-61，1994)，粘液蛋白基因的啟動(dòng)子用于控制治療基因在乳腺癌中的表達(dá)(Chen，L.，Chen，D.，Manome，Y.，Dong，Y.，F(xiàn)ine，H.A.，and Kufe，D.W.Journal of Clinical Investigation，962775-82，1995)，前列腺特異抗原基因的啟動(dòng)子用于控制治療基因在前列腺癌中的表達(dá)(Gotoh，A.，Ko，S.C.，Shirakawa，T.，Cheon，J.，Kao，C.，Miyamoto，T.，Gardner，T.A.，Ho，L.J.，Cleutjens，C.B.，Trapman，J.，Graham，F(xiàn).L.，andChung，L.W.Journal of Urology，160220-9，1998)，甲胚蛋白基因的啟動(dòng)子用于控制治療基因在肝癌中的表達(dá)(Arbuthnot，P.B.，Bralet，M.P.，LeJossic，C.，Dedieu，J.F.，Perricaudet，M.，Brechot，C.，and Ferry，N.HumanGene Therapy，71503-14，1996；Bui，L.A.，Butterfield，L.H.，Kim，J.Y.，Ribas，A.，Seu，P.，Lau，R.，Glaspy，J.A.，McBride，W.H.，and Economou，J.S.Human Gene Therapy，82173-82，1997；Kaneko，S.，Hallenbeck，P.，Kotani，T.，Nakabayashi，H.，McGarrity，G.，Tamaoki，T.，Anderson，W.F.，and Chiang，Y.L.Cancer Res.，555283-7，1995)，E2F因子基因的啟動(dòng)子用于控制治療基因含視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因缺陷的腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)(Parr，M.J.，Manome，Y.，Tanaka，T.，Wen，P.，Kufe，D.W.，Kaelin，W.G.，Jr.，and Fine，H.A.Nature Medicine，31145-9，1997)，熱休克蛋白基因的啟動(dòng)子與熱療法聯(lián)合用于控制治療基因在特定的靶細(xì)胞中的表達(dá)(Halfon，M.S.，Kose，H.，Chiba，A.，and Keshishian，H.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，946255-6260，1997；Pelham，H.R.and Bienz，M.EMBO Journal，11473-7，1982)。上述研究雖然都證明應(yīng)用細(xì)胞或腫瘤特異性啟動(dòng)子將治療基因限制在靶細(xì)胞中表達(dá)是可行的，但同時(shí)也顯示了這些啟動(dòng)子的共同弱點(diǎn)，即在靶細(xì)胞中，它們的轉(zhuǎn)錄活性遠(yuǎn)低于常用的病毒類強(qiáng)啟動(dòng)子。在多數(shù)情況下，治療基因在靶細(xì)胞中表達(dá)水平太低，難以達(dá)到治療效果。
為了解決這一難題，日本幾家大學(xué)實(shí)驗(yàn)室最近應(yīng)用Cre/loxP系統(tǒng)放大弱啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，并證明這一系統(tǒng)可增強(qiáng)甲胚蛋白，甲狀腺球蛋白，癌胚抗原等基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(Kijima，T.，Osaki，T.，Nishino，K.，Kumagai，T.，F(xiàn)unakoshi，T.，Goto，H.，Tachibana，I.，Tanio，Y.，and Kishimoto，T.Cancer Res.，594906-4911，1999；Nagayama，Y.，Nishihara，E.，Iitaka，M.，Namba，H.，Yamashita，S.，and Niwa，M.Cancer Res.，593049-3052，1999；Ueda，K.，Iwahashi，M.，Nakamori，M.，Nakamura，M.，Yamaue，H.，andTanimura，H.Oncology，59255-265，2000)。在他們的系統(tǒng)中，將兩端含loxP的無(wú)活性DNA插入到一病毒類強(qiáng)啟動(dòng)子與治療基因之間，以阻止治療基因的表達(dá)。同時(shí)，應(yīng)用甲胚蛋白，甲狀腺球蛋白，癌胚抗原等基因啟動(dòng)子控制Cre的表達(dá)。當(dāng)表達(dá)治療基因的載體與表達(dá)Cre基因的載體同時(shí)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞時(shí)，上述組織特異性基因啟動(dòng)子啟動(dòng)Cre基因的表達(dá)。Cre蛋白則催化loxP特異的DNA重組，將兩端含loxP的無(wú)活性DNA切除，這樣，病毒類強(qiáng)啟動(dòng)子即可啟動(dòng)治療基因的表達(dá)。而在非靶細(xì)胞中，上述組織特異性基因啟動(dòng)子活性太低，由Cre催化的loxP特異的DNA重組很少，治療基因的表達(dá)也比靶細(xì)胞中的少。應(yīng)用這一方法，可將甲胚蛋白，甲狀腺球蛋白，癌胚抗原等基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)5-50倍。但這一技術(shù)有其不足之處。第一，遺傳載體必須發(fā)生loxP特異的重組。第二，病毒類強(qiáng)啟動(dòng)子可能在一些靶細(xì)胞中活性較弱。
德國(guó)馬堡大學(xué)Mueller實(shí)驗(yàn)室則設(shè)計(jì)了一正反饋技術(shù)來(lái)解決這一難題(Jerome，V.and Muller，R.Human Gene Therapy，92653-2659，1998.Nettelbeck，D.M.，Jerome，V.，and Muller，R.Gene Ther.，51656-1664，1998)。在他們的系統(tǒng)中，在細(xì)胞或組織特異的起動(dòng)子之上游加一轉(zhuǎn)錄蛋白識(shí)別序列，同時(shí)，將報(bào)告基因或目的基因與該轉(zhuǎn)錄蛋白基因通過(guò)核糖體內(nèi)部識(shí)別序列(IRES)進(jìn)行連接。當(dāng)細(xì)胞或組織特異的起動(dòng)子啟動(dòng)報(bào)告基因或目的基因時(shí)，轉(zhuǎn)錄蛋白基因亦同時(shí)得到表達(dá)。表達(dá)的轉(zhuǎn)錄蛋白進(jìn)而結(jié)合到細(xì)胞或組織特異的起動(dòng)子之上游的轉(zhuǎn)錄蛋白識(shí)別序列，再次激活其下游的啟動(dòng)子。通過(guò)這樣的正反饋，使得目的基因的表達(dá)增大。但轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因的表達(dá)也同時(shí)增大。
本發(fā)明所含技術(shù)則聯(lián)合應(yīng)用轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因與一人工合成的，本身并無(wú)活性的啟動(dòng)子來(lái)解決上述難題。一方面避免遺傳載體重組的必要性，同時(shí)避免轉(zhuǎn)錄激話基因本身的大量表達(dá)。
本發(fā)明的目的是提供一種增強(qiáng)細(xì)胞特異性目的基因表達(dá)的方法。
本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)細(xì)胞特異性目的基因表達(dá)的方法，包括(a)將細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄激活蛋白的基因相連；(b)將能夠被所述的轉(zhuǎn)錄激活蛋白激活的啟動(dòng)子與目的基因相連；(c)將步驟(a)中得到的與細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子相連的轉(zhuǎn)錄激活蛋白的基因和步驟(b)中得到的與能夠被所述的轉(zhuǎn)錄激活蛋白激活的啟動(dòng)子相連的目的基因同時(shí)導(dǎo)入靶細(xì)胞；(d)使所述的轉(zhuǎn)錄激活蛋白的基因和目的基因在靶細(xì)胞中表達(dá)。
在本發(fā)明的方法中，細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因的相連連接方式應(yīng)使轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因在細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子的控制之下進(jìn)行表達(dá)；能夠被所述的轉(zhuǎn)錄激活蛋白激活的啟動(dòng)子與目的基因的表達(dá)方式應(yīng)使目的基因在所述的轉(zhuǎn)錄激活蛋白激活的啟動(dòng)子的控制之下進(jìn)行表達(dá)。
也就是說(shuō)，本發(fā)明的核心是應(yīng)用細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)錄激活蛋白的基因的表達(dá)，同時(shí)應(yīng)用能被該轉(zhuǎn)錄激活蛋白激活的啟動(dòng)子控制治療基因(或稱目的基因)的表達(dá)。當(dāng)兩者同時(shí)轉(zhuǎn)入到靶細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄激活蛋白的表達(dá)，而該轉(zhuǎn)錄激活蛋白又激活治療基因的表達(dá)。通過(guò)這一連鎖反應(yīng)，達(dá)到治療基因在靶細(xì)胞，靶組織，或腫瘤中大量表達(dá)的目的。這樣，既保留了細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子的細(xì)胞，組織或腫瘤特異性，又克服了這些啟動(dòng)子活性低的弱點(diǎn)。這一技術(shù)既可增強(qiáng)治療基因在腫瘤組織或靶組織中的表達(dá)，提高其療效，又避免治療基因在非靶細(xì)胞中的表達(dá)，減少其毒性或副作用。
本發(fā)明所述的細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子是指在某些細(xì)胞中有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，而在另一些細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性很低或無(wú)轉(zhuǎn)錄活性的核心啟動(dòng)子序列。這種核心啟動(dòng)子序列也可包括其周圍的增強(qiáng)子序列。啟動(dòng)子位于蛋白質(zhì)編碼基因的上游，是能被轉(zhuǎn)錄蛋白(包括轉(zhuǎn)錄激活蛋白及轉(zhuǎn)錄抑制蛋白)識(shí)別的DNA序列，包括核心啟動(dòng)子序列及其周圍的調(diào)節(jié)序列，增強(qiáng)子序列等(Herman，J.G.and Baylin，S.B.Current.Topics.inMicrobiology.&Immunology，24935-54，2000；Fickett，J.W.andWasserman，W.W.Current.Opinion.in Biotechnology，1119-24，2000；Struhl，K.Cell，981-4，1999；Werner，T.Mammalian.Genome，10168-175，1999)。多數(shù)啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄起始部位(通常含CA序列)上游25-30bp處有一TATAA序列。但也有一些啟動(dòng)子不含TATAA序列。那些不含TATAA序列的啟動(dòng)子常含能被SP1轉(zhuǎn)錄蛋白識(shí)別的，CG富有序列。在核心啟動(dòng)子周圍還有一些能影響啟動(dòng)子活性的序列，稱增強(qiáng)子。增強(qiáng)子可在核心啟動(dòng)子的上游或下游。這些序列與各種轉(zhuǎn)錄蛋白的綜合作用，控制基因的表達(dá)水平。所有基因都有其自己的啟動(dòng)子。一些啟動(dòng)子在各種細(xì)胞中都有活性。如巨細(xì)胞病毒早期基因的啟動(dòng)子(CMV)，Rous肉瘤病毒基因的啟動(dòng)子(RSV)(Guo，Z.S.，Wang，L.H.，Eisensmith，R.C.，and Woo，S.L.Gene Ther.，3802-810，1996)，SV40病毒基因的啟動(dòng)子，一些與糖代謝有關(guān)的酶的基因的啟動(dòng)子(如3-磷酸甘油酸激酶基因啟動(dòng)子(PGK))(McBurney，M.W.，Sutherland，L.C.，Adra，C.N.，Leclair，B.，Rudnicki，M.A.，and Jardine，K.Nucleic Acids Res.，195755-5761，1992)等。而另一些啟動(dòng)子則在某些特定的細(xì)胞中有活性，如在肌細(xì)胞，表皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞中有較強(qiáng)的活性，而在其他細(xì)胞中活性很弱或無(wú)活性。這些啟動(dòng)子即本發(fā)明所指的細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子。它們中的代表如，酪氨酸酶基因的啟動(dòng)子在黑色素瘤細(xì)胞中活性較強(qiáng)(Vile，R.G.and Hart，I.R.Cancer Res.，53962-967，1993)，癌胚抗原基因的啟動(dòng)子在一些結(jié)腸癌與肺癌細(xì)胞中活性較強(qiáng)(Osaki，T.，Tanio，Y.，Tachibana，I.，Hosoe，S.，Kumagai，T.，Kawase，I.，Oikawa，S.，and Kishimoto，T.Cancer Res.，545258-61，1994)，粘液蛋白基因(MUC1)的啟動(dòng)子在一些乳腺癌細(xì)胞中活性較強(qiáng)(Chen，L.，Chen，D.，Manome，Y.，Dong，Y.，F(xiàn)ine，H.A.，and Kufe，D.W.Journal of Clinical Investigation，962775-82，1995)，前列腺特異抗原基因的啟動(dòng)子在一小前列腺癌細(xì)胞中活性較強(qiáng)(Chung，L.W.，Kao，C.，Sikes，R.A.，and Zhau，H.E.Hinyokika Kiyo-Acta Urologica Japonica，43815-820，1997；Gotoh，A.，Ko，S.C.，Shirakawa，T.，Cheon，J.，Kao，C.，Miyamoto，T.，Gardner，T.A.，Ho，L.J.，Cleutjens，C.B.，Trapman，J.，Graham，F(xiàn).L.，and Chung，L.W.Journal of Urology，160220-9，1998)，甲胚蛋白基因的啟動(dòng)子在肝癌或新生的肝細(xì)胞中活性較強(qiáng)(Bui，L.A.，Butterfield，L.H.，Kim，J.Y.，Ribas，A.，Seu，P.，Lau，R.，Glaspy，J.A.，McBride，W.H.，andEconomou，J.S.Human Gene Therapy，82173-82，1997；Hasse，A.andSchulz，W.A.Journal of Biological Chemistry，2691821-6，1994；Kaneko，S.，Hallenbeck，P.，Kotani，T.，Nakabayashi，H.，McGarrity，G.，Tamaoki，T.，Anderson，W.F.，and Chiang，Y.L.Cancer Res.，555283-7，1995)，E2F因子基因的啟動(dòng)子在含視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因缺陷的腫瘤細(xì)胞活性較強(qiáng)(Parr，M.J.，Manome，Y.，Tanaka，T.，Wen，P.，Kufe，D.W.，Kaelin，W.G.，Jr.，and Fine，H.A.Nature Medicine，31145-9，1997)，端粒酶(又稱端粒反轉(zhuǎn)錄酶，簡(jiǎn)稱TERT)基因在各種癌細(xì)胞及干細(xì)胞中活性較強(qiáng)(Gu，J.，Kagawa，S.，Takakura，M.，Kyo，S.，Inoue，M.，Roth，J.A.，and Fang，B.Cancer Res.，605359-5364，2000；Kyo，S.，Kanaya，T.，Takakura，M.，Tanaka，M.，andInoue，M.International Journal of Cancer，8060-63，1999)。一啟動(dòng)子在某一細(xì)胞中是否有活性取決于該啟動(dòng)子及其周圍增強(qiáng)子的序列，以及該細(xì)胞是否有能識(shí)別這些序列的轉(zhuǎn)錄蛋白及其種類。啟動(dòng)子的活性強(qiáng)弱又與識(shí)別該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄蛋白在細(xì)胞中的含量多少，活性強(qiáng)弱有關(guān)。
細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子也可由來(lái)自兩個(gè)或兩個(gè)以上的啟動(dòng)子序列組合而成。如將低氧誘導(dǎo)啟動(dòng)子與甲胚蛋白基因的啟動(dòng)子相連接而得到的組合啟動(dòng)子既可被低氧誘導(dǎo)(實(shí)體瘤中常有低氧存在)，又在肝癌細(xì)胞中活性較強(qiáng)(Ido，A.，Uto，H.，Moriuchi，A.，Nagata，K.，Onaga，Y.，Onaga，M.，Hori，T.，Hirotsu，T.，Hayashi，K.，Tamaoki，T.，and Tsuchida，A.Cancer Res，613016-3021，2001)。又如在甲胚蛋白基因的啟動(dòng)子或前列腺特異抗原基因的啟動(dòng)子與別的啟動(dòng)子的增強(qiáng)子(如SV40增強(qiáng)子)序列相連接得到的組合啟動(dòng)子在它們的靶細(xì)胞中活性更高。
本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)錄激活蛋白是一類天然或人工融合基因編碼的，能直接與DNA相結(jié)合并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的蛋白。它們是一類轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子是一類能直接作用于轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。它們的作用可以是激活轉(zhuǎn)錄或抑制轉(zhuǎn)錄，可以直接與DNA相結(jié)合或通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合而影響基因的轉(zhuǎn)錄。能與DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子多能識(shí)別特定的DNA序列。如SP1蛋白能識(shí)別10-bp GC富有序列。AP-1族轉(zhuǎn)錄因子的識(shí)別序列為TGANTCA或TGANNTCA。STAT蛋白質(zhì)的結(jié)合序列為TTCCNGGAA。CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)族轉(zhuǎn)錄因子的保守序列為RTTGCGYAAY(Y＝C或T，R＝A或G)。NF-kapaB/Rel族轉(zhuǎn)錄因子的保守序列為GGGAATTCCC或GGGAATCCCC。Myc-Max-Mad族轉(zhuǎn)錄因子的保守序列為E-合子序列CACGTG。酵母的GAL4蛋白能識(shí)別5’-CGGAGTACTGTCCTCCG-3’或5’-CGGAGGACTGTCCTCCG-3’的17-bp序列(稱GAL4識(shí)別序列)(Giniger，E.，Varnum，S.M.，and Ptashne，M.Cell，40767-774，1985；Sadowski，I.Genetic Engineering，17119-148，1995)。細(xì)菌LexA蛋白的識(shí)別序?yàn)?’-GTCGAGTACTGTATGTACATACAGTAC3’(Schnarr，M.，Oertel-Buchheit，P.，Kazmaier，M.，and Granger-Schnarr，M.Biochimie，73423-431，1991)，四環(huán)素抑制子(tetR)蛋白的識(shí)別序列為TCCCTATCAGTGATAGAGA(Gossen，M.and Bujard，H.Proceedings.of the National.Academy.ofSciences.of the United.States.of America.，895547-5551，1992)。這些直接與DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子除含有DNA結(jié)合區(qū)外還其他的功能區(qū)。如轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，調(diào)節(jié)區(qū)或轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)等。本發(fā)明所述的天然轉(zhuǎn)錄激活蛋白，如p53蛋白，Myc蛋白，酵母GAL4蛋白等。這些蛋白至少含有兩個(gè)功能區(qū)，即DNA結(jié)合區(qū)與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。但它們也可含有其他功能區(qū)，如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，抑制區(qū)，配體結(jié)合區(qū)等。如GAL4蛋白有881個(gè)氨基酸殘基。其N-端1-147氨基酸為DNA識(shí)別區(qū)，能識(shí)別GAL4識(shí)別序列。兩個(gè)激活區(qū)分別位于第148-238與767-881氨基酸殘基處。239-600氨基酸區(qū)域?yàn)檗D(zhuǎn)錄抑制區(qū)。600-768氨基酸區(qū)域?yàn)槠咸烟钦{(diào)節(jié)區(qū)(Sadowski，I.Genetic Engineering，17119-148，1995)。
本發(fā)明所述的人工融合基因編碼的轉(zhuǎn)錄激活蛋白是指將編碼一轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)的基因片段與編碼一轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的基因片段相組合，組合后的基因即編碼含DNA結(jié)合區(qū)與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的融合蛋白。其中DNA結(jié)合區(qū)與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)可來(lái)自同一轉(zhuǎn)錄因子或來(lái)自不同的轉(zhuǎn)錄因子。例如，將GAL4蛋白的DNA結(jié)合區(qū)與其轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合即得GAL4-GAL4融合蛋白，將GAL4蛋白的DNA結(jié)合區(qū)與泡疹病毒VP16蛋白的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合即得GAL4-VP16融合蛋白(Oligino，T.，Poliani，P.L.，Marconi，P.，Bender，M.A.，Schmidt，M.C.，F(xiàn)ink，D.J.，and Glorioso，J.C.GeneTher.，3892-9，1996；Sadowski，I.，Ma，J.，Triezenberg，S.，and Ptashne，M.Nature，335563-564，1988)，GAL4蛋白的DNA結(jié)合區(qū)與Myc蛋白的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合即得GAL4-Myc融合蛋白，LexA蛋白的DNA結(jié)合區(qū)與泡疹病毒VP16蛋白的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合即得LexA-VP16融合蛋白(Brent，R.andPtashne，M.Cell，43729-736，1985；Nettelbeck，D.M.，Jerome，V.，andMuller，R.Gene Ther.，51656-1664，1998)，四環(huán)素抑制子蛋白的DNA結(jié)合區(qū)與泡疹病毒VP16蛋白的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合即得四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄激活蛋白(tTA)(Gossen，M.and Bujard，H.Proceedings.of theNational.Academy.of Sciences.of the United.States.of America.，895547-5551，1992)。這些融合的轉(zhuǎn)錄激活蛋白除含有最基本的DNA結(jié)合區(qū)與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)外，還可有或加入其他功能區(qū)。例如，四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄激活蛋白還含有四環(huán)素結(jié)合區(qū)，以調(diào)節(jié)該蛋白與DNA靶序列的結(jié)合。在GAL4-VP16融合蛋白上可加激素受體蛋白的激素結(jié)合區(qū)，即可通過(guò)激素調(diào)節(jié)該蛋白與其靶DNA的結(jié)合。
編碼天然的或人工融合的轉(zhuǎn)錄激活蛋白的基因可以含有/或不含有內(nèi)含子(MacCumber，M.and Ornstein，R.L.Science，224402-5，1984；Waring，R.B.and Davies，R.W.Gene，28277-91，1984)。內(nèi)含子是真核細(xì)胞基因內(nèi)不編碼蛋白的序列。這些序列也存在于轉(zhuǎn)錄后的mRNA前體，經(jīng)編輯加工而被去除。因此，成熟的mRAN中不含內(nèi)含子。細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄激活蛋白的基因之間的連接可以是直接連接，也可在兩者之間加內(nèi)含子。但是啟動(dòng)子的序列必須在轉(zhuǎn)錄激活蛋白的基因的上游(即5’端)。在轉(zhuǎn)錄激活蛋白的基因下游(即3’端)還必須有一多聚A信號(hào)序列。多聚A信號(hào)序列是真核細(xì)胞蛋白編碼基因下游的DNA序列，與轉(zhuǎn)錄終止及在mRNA上加多聚A序列有關(guān)(Shatkin，A.J.and Manley，J.L.Nature Structural.Biology.，7838-842，2000；Minvielle-Sebastia，L.andKeller，W.Current.Opinion.in Cell Biology.，11352-357，1999)。本發(fā)明對(duì)多聚A信號(hào)序列沒(méi)有特別的要求。它們可以是任何基因的多聚A信號(hào)序列，如SV40病毒基因的多聚A信號(hào)序列，牛或人生長(zhǎng)激素基因的多聚A序列等。因此，細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄激活蛋白的基因之間優(yōu)選的連接方式是細(xì)胞或組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子--轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因--多聚A信號(hào)序列。
本發(fā)明直接控制目的基因(或治療基因)表達(dá)的啟動(dòng)子是能被特定的轉(zhuǎn)錄激活蛋白激活的組合啟動(dòng)子。它們有如下特點(diǎn)1)含有能被特定的轉(zhuǎn)錄激活蛋白識(shí)別的序列，如含有能被GAL4蛋白識(shí)別的序列5’-CGGAGTACTGTCCTCCG-3’或5’-CGGAGGACTGTCCTCCG-3’，或含有四環(huán)素抑制子(tetR)蛋白的識(shí)別序列TCCCTATCAGTGATAGAGA，或含有LexA蛋白的識(shí)別序5’-GTCGAGTACTGTATGTACATACAGTAC-3’等。2)含有TATAA序列或其他基本的啟動(dòng)子成份。理想的組合啟動(dòng)子在極大多數(shù)細(xì)胞中其本身的活性很低或無(wú)活性。只有當(dāng)能識(shí)別他們的特定的轉(zhuǎn)錄激活蛋白存在時(shí)它們才有活性。因此，治療基因或目的基因在極大多數(shù)非靶細(xì)胞中并不表達(dá)。只有當(dāng)細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子在靶細(xì)胞中啟動(dòng)其特異的轉(zhuǎn)錄激活蛋白表達(dá)后，治療基因才在該轉(zhuǎn)錄蛋白的作用下表達(dá)。例如，高等真核細(xì)胞并無(wú)識(shí)別GAL4識(shí)別序列的轉(zhuǎn)錄激活蛋白。由GAL4識(shí)別序列5’-CGGAGGACTGTCCTCCG-3’(或5’-CGGAGTACTGTCCTCCG-3’)與TATAA序列組合而成的組合啟動(dòng)子在高等真核細(xì)胞(如植物或哺乳類動(dòng)物細(xì)胞)中并無(wú)活性。但將GAL4基因轉(zhuǎn)入到植物或哺乳類動(dòng)物細(xì)胞后，GAL4即可激活含GAL4識(shí)別序列的組合啟動(dòng)子，導(dǎo)致其下游的基因的表達(dá)。若GAL4蛋白受細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子控制，則組合啟動(dòng)子下游的基因的表達(dá)也受這些細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子的控制。在GAL4啟動(dòng)子中含一個(gè)拷貝的GAL4識(shí)別序列即足以被GAL4所激活。但當(dāng)啟動(dòng)子中含兩個(gè)或兩個(gè)以上拷貝的GAL4識(shí)別序列時(shí)，其活性(被GAL4激活的能力)則更強(qiáng)。如含5個(gè)拷貝的GAL4識(shí)別序列與一個(gè)拷貝的TATAA序列的組合啟動(dòng)子有如下序列cggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccg(N)ntatataa其中N可以是a，t，c或g，n是大于或等于零的整數(shù)，酵母GAL4蛋白的識(shí)別序列5’-CGGAGTACTGTCCTCCG-3’或5’-CGGAGGACTGTCCTCCG-3的拷貝數(shù)可以是一個(gè)，兩個(gè)，三個(gè)，四個(gè)，五個(gè)，六個(gè)，七個(gè)，八個(gè)，九個(gè)，十個(gè)或更多個(gè)。TATAA序列與GAL4識(shí)別序列之間的序列可以有變化(N)n。本發(fā)明將這些僅含有GAL4識(shí)別序列及TATAA序列的組合啟動(dòng)子稱GT啟動(dòng)子。
本發(fā)明所述的治療基因或目的基因是指任何可用于疾病治療，生物制品開(kāi)發(fā)的基因。如用于腫瘤(癌癥)治療的基因(包括各種致死基因，細(xì)胞凋亡基因，細(xì)胞毒性基因，毒性藥物激活蛋白基因，免疫調(diào)節(jié)蛋白或免疫因子基因，血管生長(zhǎng)抑制蛋白基因等)，用于治療心血管疾病的基因，用于治療傳染性疾病的基因，用于治療代謝性疾病的基因，用于治療遺傳性疾病的基因，用于治療肝臟疾病，腎臟疾病，自身免疫性疾病的基因等。例如用于治療糖尿病的胰島素基因。用于腫瘤治療的泡疹病毒胸腺嘧啶激酶基因，胞嘧啶脫氨酶基因。細(xì)胞凋亡基因如Bax，Bik，Bak，Bid，TRAIL，F(xiàn)as，F(xiàn)as配體等基因。各類細(xì)菌或病毒的毒素基因如白喉?xiàng)U菌類毒素基因等。治療基因或目的基因也可以是融合基因。融合基因是指將兩個(gè)或兩個(gè)以上的基因(或基因片段)相連接，使它們擁有共同的啟始碼(ATG)及共同的終止碼(TAA，TAG，TGA)。但各基因片段編碼的氨基酸序列不變。如Bax，Bik，Bak，Bid，TRAIL，F(xiàn)as，F(xiàn)as配體等基因與熒光蛋白基因融合而成的融合基因，Bax，Bik，Bak，Bid，TRAIL，F(xiàn)as，F(xiàn)as配體等基因與免疫調(diào)節(jié)蛋白或免疫因子基因融合而成的融合基因，或者白介素(interleukin)-2，白介素-4，白介素-12，GM-CSF，腫瘤壞死因子，干擾素等基因。
治療基因或目的基因也可以含有/或不含有內(nèi)含子。組合啟動(dòng)子與治療基因之間的連接可以是直接連接，也可在兩者之間加內(nèi)含子。但是組合啟動(dòng)子的序列必須在治療基因的上游(即5’端)。在治療基因的下游(即3’端)還必須有一多聚A信號(hào)序列。多聚A信號(hào)序列是真核細(xì)胞蛋白編碼基因下游的DNA序列，與轉(zhuǎn)錄終止及在mRNA上加多聚A序列有關(guān)。本發(fā)明對(duì)多聚A信號(hào)序列沒(méi)有特別的要求。它們可以是任何基因的多聚A信號(hào)序列，如SV40病毒基因的多聚A信號(hào)序列，?；蛉松L(zhǎng)激素基因的多聚A序列等。因此組合啟動(dòng)子與治療基因或目的基因之間的連接方式是組合啟動(dòng)子--治療基因--多聚A信號(hào)序列。
控制轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因表達(dá)的各種成份(細(xì)胞或組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因，及多聚A信號(hào)序列)與控制治療基因的各種成份(組合啟動(dòng)子，治療基因，及多聚A信號(hào)序列)可以在同一遺傳載體中，也可以在兩個(gè)不同的遺傳載體中。當(dāng)它們?cè)谕贿z傳載體中時(shí)，它們作為兩個(gè)整體，連接順序可前可后。它們之間也可插入其他序列。即它們可以是細(xì)胞或組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子--轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因--多聚A信號(hào)序列--組合啟動(dòng)子--治療基因--多聚A信號(hào)序列。也可以是組合啟動(dòng)子一治療基因--多聚A信號(hào)序列--細(xì)胞或組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子--轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因--多聚A信號(hào)序列。其中多聚A信號(hào)序列可以是同一來(lái)源(例如都來(lái)自SV40基因的多聚A信號(hào)序列)或不同的來(lái)源(例如一個(gè)來(lái)自SV40基因的多聚A信號(hào)序列，另一個(gè)來(lái)自生長(zhǎng)激素基因的多聚A信號(hào)序列)。
本發(fā)明所述的靶細(xì)胞即病態(tài)細(xì)胞或需要治療的細(xì)胞。如癌癥患者的癌細(xì)胞，傳染病患者中被微生物感染的細(xì)胞，治療肌營(yíng)養(yǎng)不良患者時(shí)的肌細(xì)胞，治療糖尿病時(shí)用來(lái)表達(dá)胰島素的細(xì)胞。因此在不同的疾病中，靶細(xì)胞可以不同。
本發(fā)明所述的遺傳載體是指能將基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞的各類制劑，可以是DNA，質(zhì)粒DNA，DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，DNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物，DNA/多聚物復(fù)合物，各種病毒載體(例如腺病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，免疫缺陷病毒(HIV)載體，泡疹病毒載體，牛痘病毒載體，腺病毒相關(guān)病毒(AAV)載體)等(Cristiano，R.J.and Roth，J.A.Journal of Molecular Medicine，73479-86，1995)。當(dāng)病毒作為載體應(yīng)用時(shí)，部份或全部病毒基因被刪除，但含有病毒基因組復(fù)制及病毒顆粒包裝所必須的序列。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，免疫缺陷病毒(HIV)載體，及腺病毒相關(guān)病毒(AAV)載體僅有與復(fù)制，包裝或整合有關(guān)的病毒序列。而所有病毒基因序列都被刪除。多數(shù)腺病毒載體是將腺病毒的E1基因刪除，并在原E1基因處插入治療基因。有些腺病毒載體還刪除腺病毒的E3，E4，E2或其他所有的病毒基因(Kremer，E.J.and Perricaudet，M.British Medical Bulletin，5131-44，1995；Tuting，T.，Storkus，W.J.，and Lotze，M.T.Journal of MolecularMedicine，75478-91，1997；Yeh，P.and Perricaudet，M.FASEB Journal，11615-23，1997)。因?yàn)椴《緩?fù)制所必須的基因已被刪除，當(dāng)這些病毒載體感染細(xì)胞(如靶細(xì)胞或其他正常細(xì)胞)時(shí)，它們不能再?gòu)?fù)制成新的載體顆粒。因此，這些病毒載體也稱復(fù)制缺陷型病毒。但在包裝細(xì)胞中，被刪除的病毒基得到補(bǔ)充，病毒載體可以擴(kuò)增并包裝。例如，包裝腺病毒載體的293細(xì)胞或911細(xì)胞中含有被刪除的腺病毒E1基因。E1缺陷的腺病毒可以在293細(xì)胞或911細(xì)胞中復(fù)制。E3基因與腺病毒復(fù)制無(wú)關(guān)，其缺陷并不影響病毒復(fù)制。復(fù)制E4，E2或其他腺病毒基因缺陷的載體時(shí)，需在293細(xì)胞或911細(xì)胞中再加其相應(yīng)的缺陷基因，這些腺病毒載體才能得到復(fù)制(Kremer，E.J.and Perricaudet，M.British Medical Bulletin，5131-44，1995；Kovesdi，I.，Brough，D.E.，Bruder，J.T.，and Wickham，T.J.Current Opinion in Biotechnology，8583-589，1997)。
有些病毒載體是條件復(fù)制型載體，即能在特定的細(xì)胞中(如腫瘤細(xì)胞)復(fù)制。這些條件復(fù)制型病毒載體可以含有或不含有治療基因(Kirn，D.H.and McCormick，F(xiàn).Molecular Medicine Today，2519-527，1996)。本發(fā)明所述技術(shù)也可用來(lái)制備條件復(fù)制型病毒載體。以條件復(fù)制型腺病毒載體為例，用端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)啟動(dòng)子控制GAL4-VP16融合基因的表達(dá)，再以GAL4/TATA啟動(dòng)子(也稱GT啟動(dòng)子，見(jiàn)上文)控制腺病毒的E1A基因的表達(dá)。這樣，腺病毒的E1A基因只能在TERT啟動(dòng)子有活性的細(xì)胞(如癌細(xì)胞)中表達(dá)。因?yàn)镋1A基因產(chǎn)物是腺病毒復(fù)制所必須，按上述方法改建的條件復(fù)制型腺病毒載體亦只能在癌細(xì)胞中復(fù)制，將癌細(xì)胞殺死，以達(dá)到治療腫瘤的目的。但在正常細(xì)胞中TERT啟動(dòng)子無(wú)活性，這些條件復(fù)制型腺病毒載體不能復(fù)制。所以，正常細(xì)胞不受影響。
圖2，應(yīng)用CEA啟動(dòng)子經(jīng)GAL4/VP16融合基因間接驅(qū)動(dòng)Bax基因?qū)?xì)胞的殺傷作用。CEA陽(yáng)性的人結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo和人肺癌細(xì)胞A549，以及CEA陰性的人成纖維細(xì)胞經(jīng)相同總劑量(1000病毒顆粒/細(xì)胞)的腺病毒載體處理(當(dāng)應(yīng)用兩種腺病毒載體時(shí)它們的比例為1∶1)。Y軸表示細(xì)胞處理后的存活率。X軸表示處理后的時(shí)間(0-72小時(shí))。經(jīng)磷酸緩沖液處理的細(xì)胞的成活率定為1.0，并作為其他組的細(xì)胞成活率參照。圖中的數(shù)值為三次實(shí)驗(yàn)的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差。菱形號(hào)＝磷酸緩沖液處理，星號(hào)＝腺病毒載體AD/GT-LacZ加腺病毒載體AD/PGK-GV16，圓形＝腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/CMV-GFP，三角形＝腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/CEA-GV16，正方形＝腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/PGK-GV16。經(jīng)腺病毒載體處理48小時(shí)后，腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/PGK-GV16對(duì)三種細(xì)胞都有明顯的殺傷作用。而腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/CEA-GV16僅對(duì)CEA陽(yáng)性的癌細(xì)胞有殺傷作用(p＜0.01)。
圖3，應(yīng)用CEA啟動(dòng)子經(jīng)GAL4/VP16融合基因間接驅(qū)動(dòng)Bax基因?qū)?shí)體動(dòng)物瘤的生長(zhǎng)抑制作用。將CEA陽(yáng)性的人結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo注入裸鼠皮下，建立實(shí)體瘤。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)到直徑0.4-0.5厘米時(shí)，對(duì)腫瘤進(jìn)行三次治療(箭頭所示)。每次總量為5×1010病毒顆粒/腫瘤。當(dāng)應(yīng)用兩種腺病毒載體時(shí)它們的比例為1∶1。Y軸表示腫瘤體積。X軸表示腫瘤細(xì)胞接種后的時(shí)間(天)。圖中的數(shù)值為每組五只以上動(dòng)物的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差。圓形＝磷酸緩沖液處理，正方形＝腺病毒載體AD/CEA-GV16加對(duì)照腺病毒載體AD/E1-，三角形＝腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/PGK-GV16，星號(hào)＝腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/CEA-GV16。經(jīng)腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/CEA-GV16或腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/PGK-GV16后腫瘤生長(zhǎng)明顯抑制(p＜0.01)。
圖4，在培養(yǎng)的細(xì)胞中應(yīng)用TERT啟動(dòng)子直接驅(qū)動(dòng)LacZ基因與應(yīng)用TERT啟動(dòng)子經(jīng)GAL4/VP16融合基因間接驅(qū)動(dòng)LacZ基因之比較。
H1299，A549，H460為人肺癌細(xì)胞，Lovo為人結(jié)腸癌細(xì)胞，NHFB為人成纖維細(xì)胞。細(xì)胞在經(jīng)相同總劑量腺病毒載體處理48小時(shí)后，用組織化學(xué)方法檢測(cè)半乳糖甘酶活性。圖上方列出所用的腺病毒載體。AD/TERT-LacZ＝直接驅(qū)動(dòng)，AD/TERT-GV16加AD/GT-LacZ(1∶1)＝間接驅(qū)動(dòng)。AD/CMV-LaxZ＝陽(yáng)性對(duì)照。
圖5，應(yīng)用TERT啟動(dòng)子經(jīng)GAL4/VP16融合基因間接驅(qū)動(dòng)Bax基因時(shí)Bax基因在細(xì)胞中的表達(dá)。人肺癌細(xì)胞A549(1-4例)與正常人成纖維細(xì)胞(5-8例)經(jīng)磷酸緩沖液(例1、5)，腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/CMV-GFP(例2、6)，腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/TERT-GV16(例3、7)，或腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/PGK-GV16(例4、8)等處理后48小時(shí)，用西方印跡法分析Bax表達(dá)。腺病毒載體的總劑量為1000病毒顆粒/細(xì)胞。兩病毒載體的比例為1∶1。以肌動(dòng)蛋白(beta-actin)為內(nèi)對(duì)照，以經(jīng)磷酸緩沖液處理組的Bax/肌動(dòng)蛋白之比為1，計(jì)算出各組的Bax蛋白的相對(duì)含量(見(jiàn)每例之下方)。應(yīng)用PGK啟動(dòng)子間接驅(qū)動(dòng)Bax基因時(shí)，Bax在兩種細(xì)胞中都表達(dá)，而應(yīng)用TERT啟動(dòng)子間接驅(qū)動(dòng)Bax基因時(shí)，Bax基因僅在癌細(xì)胞中表達(dá)。
圖6，應(yīng)用TERT啟動(dòng)子經(jīng)GAL4/VP16融合基因間接驅(qū)動(dòng)Bax基因?qū)?xì)胞的殺傷作用。人肺癌細(xì)胞H1299與A549，以及正常人成纖維細(xì)胞(NHFB)與正常人支氣管上皮細(xì)胞(NHBE)經(jīng)相同總劑量(1000病毒顆粒/細(xì)胞)的腺病毒載體處理(當(dāng)應(yīng)用兩種腺病毒載體時(shí)它們的比例為1∶1)。Y軸表示細(xì)胞處理后的存活率。X軸表示處理后的時(shí)間(0-72小時(shí))。經(jīng)磷酸緩沖液處理的細(xì)胞的成活率定為1.0，并作為其他組的細(xì)胞成活率參照。圖中的數(shù)值為三次實(shí)驗(yàn)的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差。菱形號(hào)＝磷酸緩沖液處理，星號(hào)＝腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/PGK-GV16，圓形＝腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/TERT-GV16，三角形＝腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/CMV-GFP，正方形＝腺病毒載體AD/CMV-GFP加腺病毒載體AD/PGK-GV16。經(jīng)腺病毒載體處理48小時(shí)后，腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/PGK-GV16對(duì)四種細(xì)胞都有明顯的殺傷作用。而腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/TERT-GV16僅對(duì)癌細(xì)胞有殺傷作用(p＜0.01)。
圖7，應(yīng)用TERT啟動(dòng)子經(jīng)GAL4/VP16融合基因間接驅(qū)動(dòng)Bax基因?qū)?shí)體動(dòng)物瘤的生長(zhǎng)抑制作用。將人肺癌細(xì)胞H1299注入裸鼠皮下，建立實(shí)體瘤。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)到直徑0.4-0.5厘米時(shí)，對(duì)腫瘤進(jìn)行三次治療(箭頭所示)。每次總量為5×1010病毒顆粒/腫瘤。當(dāng)應(yīng)用兩種腺病毒載體時(shí)它們的比例為1∶1。Y軸表示腫瘤體積。X軸表示腫瘤細(xì)胞接種后的時(shí)間(天)。圖中的數(shù)值為每組五只以上動(dòng)物的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差。菱形＝磷酸緩沖液處理，黑色正方形＝對(duì)照腺病毒載體AD/E1-，三角形＝腺病毒載體AD/GT-LacZ加腺病毒載體AD/TERT-GV16，白色正方形＝腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/TERT-GV16，白色圓形＝腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/PGK-GV16。經(jīng)腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/TERT-GV16或腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/PGK-GV16治療后腫瘤生長(zhǎng)明顯抑制(p＜0.01)。
圖8，Bax基因的肝臟毒性實(shí)驗(yàn)。將總量為5×1010的腺病毒載體顆粒經(jīng)尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，兩天后取出肝臟進(jìn)行組織學(xué)分析。a)經(jīng)磷酸緩沖液處理，b)經(jīng)腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/CMV-GFP處理，c)經(jīng)腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/TERT-GV16處理，d)經(jīng)腺病毒載體AD/GT-Bax加腺病毒載體AD/PGK-GV16處理。應(yīng)用腺病毒載體AD/PGK-GV16可誘導(dǎo)腺病毒載體AD/GT-Bax中的Bax基因表達(dá)，而導(dǎo)致肝臟細(xì)胞大面積凋亡。但腺病毒載體AD/TERT-GV16則不能誘導(dǎo)腺病毒載體AD/GT-Bax中的Bax基因表達(dá)，對(duì)肝臟也無(wú)毒性。
圖9，腺病毒載體AD/gTRAIL示意圖。圖上方的數(shù)字表示腺病毒基因組的圖距單位。人第五型腺病毒共有35935堿基對(duì)，將其分成100份，每份為一個(gè)單位。其中1.3至9.3單位處的堿基被刪除并被治療基因的成份取代。下方示治療基因在這一載體中的結(jié)構(gòu)。從右到左依次為GT啟動(dòng)子，GFP/TRAIL融合基因，SV40多聚A信號(hào)，人TERT啟動(dòng)子，GAL4/VP16融合基因，牛生長(zhǎng)素基因多聚A信號(hào)序列。


圖10，應(yīng)用流式細(xì)胞分析法檢測(cè)基因表達(dá)與細(xì)胞凋亡。上排，檢測(cè)GFP基因或GFP-TRAIL融合基因的表達(dá)。下排，檢測(cè)細(xì)胞凋亡。人肺癌細(xì)胞H460用總劑量為2000載體顆粒/細(xì)胞的腺病毒載體感染，48小時(shí)后收獲細(xì)胞，并將其分成兩分，一份檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞(上排，每圖中的M2部份)，另一分檢測(cè)凋亡細(xì)胞(下排，每圖中的M4部份)。所用的腺病毒載體標(biāo)在每圖中。
圖11，腺病毒載體AD/gTRAIL對(duì)實(shí)體動(dòng)物瘤的生長(zhǎng)抑制作用。將人結(jié)腸癌細(xì)胞DLD癌注入裸鼠皮下，建立實(shí)體瘤。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)到直徑0.4-0.5厘米時(shí)，對(duì)腫瘤進(jìn)行三次治療(箭頭所示)。每次總量為5×1010病毒顆粒/腫瘤。當(dāng)應(yīng)用兩種腺病毒載體時(shí)它們的比例為1∶1。Y軸表示腫瘤體積。X軸表示腫瘤細(xì)胞接種后的時(shí)間(天)。圖中的數(shù)值為每組十只以上動(dòng)物的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差。方形＝磷酸緩沖液處理，三角形＝對(duì)照腺病毒載體AD/CMV-GFP，圓形＝腺病毒載體AD/GT-TRAIL加腺病毒載體AD/PGK-GV16，星號(hào)＝腺病毒載體AD/gTRAIL。經(jīng)腺病毒載體AD/GT-TRAIL加腺病毒載體AD/PGK-GV16或腺病毒載體AD/gTRAIL治療后腫瘤生長(zhǎng)明顯抑制(p＜0.01)。
實(shí)施例本發(fā)明描述的技術(shù)方案可以通過(guò)下述實(shí)施例證明其目的與效果。但是本發(fā)明并不限于下述實(shí)施例。本發(fā)明描述的技術(shù)方案中許多細(xì)節(jié)與成份可以改變，仍可達(dá)到同樣的目的與效果。因此，那些細(xì)節(jié)與成份的改變并不脫離本發(fā)明權(quán)利要求范疇。
癌胚抗原是一細(xì)胞膜糖蛋白，在一些正常組織，如腸上皮細(xì)胞等，有少量表達(dá)。但在許多癌癥細(xì)胞中(如結(jié)腸癌，肺癌等)它的表達(dá)水平明顯提高(Paxton，R.J.，Mooser，G.，Pande，H.，Lee，T.D.，and Shively，J.E.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84920-924，1987；Thompson，J.A.，Grunert，F(xiàn).，and Zimmermann，W.，Journal of Clinical Laboratory Analysis，5344-66，1991.)。一些研究表明，癌胚抗原基因的核心啟動(dòng)子是該基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的約400鹼基對(duì)(Hauck，W.and Stanners，C.P.，Journal of BiologicalChemistry，2703602-10，1995；Schrewe，H.，Thompson，J.，Bona，M.，Hefta，L.J.，Maruya，A.，Hassauer，M.，Shively，J.E.，von Kleist，S.，andZimmermann，W.，Molecular & Cellular Biology，102738-48，1990)。這一核心啟動(dòng)子(也稱CEA啟動(dòng)子)在癌胚抗原陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中活性較強(qiáng)。因此，CEA啟動(dòng)子也用來(lái)表達(dá)治療癌癥的治療基因，如單純泡疹病毒的胸嘧啶激酶(HSV/TK)基因，胞嘧啶脫氨酶(CD)基因等，以減少治療基因在正常細(xì)胞中表達(dá)，避免治療基因的毒性。但是CEA啟動(dòng)子的應(yīng)用應(yīng)其轉(zhuǎn)錄活性低而受到限制。為解決這一難題，Kijima等人應(yīng)用Cre/loxP系統(tǒng)來(lái)提高CEA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。在他們的系統(tǒng)中，用一強(qiáng)啟動(dòng)子(如巨細(xì)胞病毒早期基因啟動(dòng)子，簡(jiǎn)稱CMV啟動(dòng)子)驅(qū)動(dòng)治療基因，但在CMV啟動(dòng)子與治療基因之間插入一無(wú)活性DNA片段，以阻止來(lái)自CMV啟動(dòng)子的治療基因表達(dá)。在這一無(wú)活性DNA片段的兩端又加loxP序列。同時(shí)在另一遺傳載體中，用CEA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cre基因的表達(dá)。當(dāng)表達(dá)治療基因的載體與表達(dá)Cre基因的載體同時(shí)轉(zhuǎn)入細(xì)胞時(shí)，Cre基因在癌胚抗原陽(yáng)性的細(xì)胞中表達(dá)，其產(chǎn)物特異地識(shí)別loxP序列，使其發(fā)生重組，切除無(wú)活性的DNA片段，治療基因可以由CMV啟動(dòng)子表達(dá)。與直接用CEA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)治療基因相比，這方法可將治療基因的表達(dá)水平提高5-50倍。
而我們則用本發(fā)明發(fā)明的技術(shù)來(lái)提高CEA啟動(dòng)子的表達(dá)水平。即用CEA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GAL4/VP16融合蛋白基因的表達(dá)，而以含GAL4識(shí)別序列及TATAA序列的組合啟動(dòng)子(下稱GT啟動(dòng)子)驅(qū)動(dòng)治療基因或目的基因的表達(dá)。我們也將GAL4/VP16基因與治療基因(目的基因)分別放入兩個(gè)遺傳載體中。在此，我們應(yīng)用E1缺失的腺病毒載體。我們將表達(dá)GAL4/VP16基因的腺病毒載體稱AD/CEA-GV16，而將表達(dá)治療基因或目的基因的腺病毒載體稱AD/GT-Bax(表達(dá)人Bax基因)，或AD/GT-LacZ(表達(dá)報(bào)告基因LacZ)。由于正常人體細(xì)胞不含能識(shí)別GAL4識(shí)別序列的轉(zhuǎn)錄激活蛋白，GT啟動(dòng)子在正常人體細(xì)胞中并無(wú)活性。將AD/GT-Bax或AD/GT-LacZ單獨(dú)轉(zhuǎn)入人體細(xì)胞，或?qū)D/GT-Bax或AD/GT-LacZ與不含GAL4/VP16基因的對(duì)照腺病毒載體同時(shí)轉(zhuǎn)入人體細(xì)胞，Bax基因或LacZ基因都不表達(dá)。而將AD/GT-Bax或AD/GT-LacZ與AD/CEA-GV16載體同時(shí)轉(zhuǎn)入人體細(xì)胞時(shí)，就出現(xiàn)兩種不同的情況。在癌胚抗原陽(yáng)性的細(xì)胞中，CEA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GAL4/VP16基因的表達(dá)，其產(chǎn)物GAL4/VP16蛋白又激活GT啟動(dòng)子，使其驅(qū)動(dòng)Bax基因或LacZ基因的表達(dá)。Bax基因或LacZ基因的表達(dá)水平又與CEA啟動(dòng)子在細(xì)胞中的活性強(qiáng)弱有關(guān)。在一些CEA陽(yáng)性的癌細(xì)胞中，CEA啟動(dòng)子活性較強(qiáng)，GAL4/VP16表達(dá)較多，結(jié)果Bax基因或LacZ基因的表達(dá)也較高。而在癌胚抗原陰性的細(xì)胞中，CEA啟動(dòng)子無(wú)活性，GAL4/VP16基因不表達(dá)，GT啟動(dòng)子仍無(wú)活性，結(jié)果Bax基因或LacZ基因也不表達(dá)，或表達(dá)很低。
LacZ基因是一常用的報(bào)告基因，可以通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)半乳糖甘酶的活性而得到基因的表達(dá)水平。為比較目的基因由CEA啟動(dòng)子直接驅(qū)動(dòng)，或由CEA啟動(dòng)子經(jīng)GAL4/VP16--GT啟動(dòng)子間接驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)水平，我們也構(gòu)建了由CEA啟動(dòng)子直接驅(qū)動(dòng)LacZ基因的腺病毒載體(AD/CEA-LacZ)。當(dāng)用相同的總載體劑量轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，在體外培養(yǎng)的癌胚抗原陽(yáng)性的細(xì)胞中(如肺細(xì)胞A549，結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1和Lovo細(xì)胞)，用AD/GT-LacZ加AD/CEA-GV16轉(zhuǎn)染細(xì)胞組的半乳糖甘酶的活性比用AD/CEA-LacZ轉(zhuǎn)染細(xì)胞組的半乳糖甘酶的活性高27-45倍(表1)。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)表明兩組處理之間有顯著差別(p＜0.005)。證明應(yīng)用本發(fā)明所述的技術(shù)可大大提高由CEA啟動(dòng)子控制的目的基因的表達(dá)水平。表1，腺病毒載體感染細(xì)胞后半乳糖甘酶的活性
在癌胚抗原陰性的細(xì)胞中，盡管報(bào)告基因的表達(dá)水平也有增加，但增加幅度遠(yuǎn)低于癌胚抗原陽(yáng)性的細(xì)胞。說(shuō)明應(yīng)用這一技術(shù)在提高CEA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因表達(dá)水平的同時(shí)并不喪失CEA啟動(dòng)子本身的特異性。
上述結(jié)果也在體內(nèi)的實(shí)體瘤中得到證實(shí)。將人肺癌細(xì)胞(A549)注入裸鼠皮下，建立實(shí)體瘤動(dòng)物模型，再將同樣總劑量(5×1010病毒顆粒/裸鼠)而不的腺病毒載體直接注入實(shí)體瘤內(nèi)，兩天后取出腫瘤，用組織化學(xué)或生物化學(xué)的方法分析半乳糖甘酶活性(圖1)。結(jié)果表明，注入腺病毒載體AD/GT-LacZ，或注入腺病毒載體AD/CEA-GV16，與注入生理鹽水組的結(jié)果一樣，都只有本底水平的LacZ基因表達(dá)(約2×102酶活性單位/微克細(xì)胞蛋白)。當(dāng)注入腺病毒載體AD/CEA-LacZ時(shí)，LacZ基因表達(dá)水平為1.9×105酶活性單位/微克細(xì)胞蛋白，而當(dāng)注入腺病毒載體AD/CEA-GV16加AD/GT-LacZ時(shí)，LacZ基因表達(dá)水平為(2.0×107酶活性單位/微克細(xì)胞蛋白。兩者差別為100多倍。陽(yáng)性對(duì)照組注入腺病毒載體AD/CMV-LacZ，其LacZ基因表達(dá)水平為7.02×106酶活性單位/微克細(xì)胞蛋白。這一結(jié)果也說(shuō)明，應(yīng)用CEA啟動(dòng)子經(jīng)GAL4/VP16間接驅(qū)動(dòng)LacZ基因時(shí)，該基因的表達(dá)水平也超過(guò)應(yīng)用強(qiáng)啟動(dòng)子(如CMV啟動(dòng)子)驅(qū)動(dòng)時(shí)的表達(dá)水平。實(shí)施例二應(yīng)用CEA啟動(dòng)子經(jīng)GAL4/VP16融合蛋白基因間接驅(qū)動(dòng)治療基因(人Bax基因)，以達(dá)到選擇性殺死CEA陽(yáng)性癌細(xì)胞的目的。
人Bax基因是一與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因(Brady，H.J.and Gil-Gomez，G.，International Journal of Biochemistry & Cell Biology，30647-650，1998；Jurgensmeier，J.M.，Xie，Z.，Deveraux，Q.，Ellerby，L.，Bredesen，D.，and Reed，J.C.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，954997-5002，1998)。當(dāng)其蛋白產(chǎn)物Bax含量在細(xì)胞中增高時(shí)，可直接引導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C。細(xì)胞色素C釋放到胞漿后可激活一系列細(xì)胞內(nèi)蛋白裂解酶原，引起各種細(xì)胞蛋白的裂解，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，細(xì)胞核碎裂。這一過(guò)程也稱細(xì)胞凋亡(Brady，H.J.and Gil-Gomez，G.，Intenrational Journal of Biochemistry &Cell Biology，30647-650，1998；Jurgensmeier，J.M.，Xie，Z.，Deveraux，Q.，Ellerby，L.，Bredesen，D.，and Reed，J.C.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，954997-5002，1998)。許多證據(jù)表明，癌癥的發(fā)生也與細(xì)胞凋亡功能紊亂有關(guān)。我們?cè)谧罱囊恍?shí)驗(yàn)中證明，直接將表達(dá)Bax基因的腺病毒感染癌癥細(xì)胞或注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物瘤中，可提高Bax基因在癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，抑制實(shí)體瘤生長(zhǎng)(Chresta，C.M.，Arriola，E.L.，and Hickman，J.A.，Behring Institute Mitteilungen，97232-40，1996；Miyashita，T.，Krajewski，S.，Krajewska，M.，Wang，H.G.，Lin，H.K.，Liebermann，D.A.，Hoffman，B.，and Reed，J.C.，Oncogene，91799-805，1994)。而且，Bax基因能殺死p53基因敏感與不敏感的細(xì)胞，說(shuō)明Bax基因的應(yīng)用范圍比p53基因大(Kagawa，S.，Gu，J.，Swisher，S.G.，Lin，J.，Roth，J.A.，Lai，D.，Stephens，L.C.，and Fang，B.，Cancer Res，601157-1161，2000)。但是，將Bax基因的載體加到正常細(xì)胞中時(shí)也引起正常細(xì)胞的凋亡，造成毒性副作用(Kagawa，S.，Pearson，S.A.，Ji，L.，Xu，K.，McDonnell，T.J.，Swisher，S.，Roth，J.A.，and Fang，B.，Gene Ther，775-79，2000)。因此，應(yīng)用細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子將Bax基因的表達(dá)限制在特定的靶細(xì)胞中是應(yīng)用Bax基因治療腫瘤的關(guān)鍵。
為檢測(cè)能否應(yīng)用CEA啟動(dòng)子經(jīng)GAL4/VP16間接驅(qū)動(dòng)Bax基因在CEA陽(yáng)性的細(xì)胞中表達(dá)，我們比較了CEA啟動(dòng)子經(jīng)GAL4/VP16間接驅(qū)動(dòng)Bax基因表達(dá)與PGK(3-磷酸甘油酸激酶)基因啟動(dòng)子經(jīng)GAL4/VP16間接驅(qū)動(dòng)Bax基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞的殺傷作用(Koch，P.，Guo，Z.S.，Kagawa，S.，Gu，J.，Roth，J.A.，and Fang，B.，Molecular Therapythe Journal of the AmericanSociety of Gene Therapy，3278-283，2001)。PKG啟動(dòng)子在極大多數(shù)細(xì)胞中都有活性。我們最近的研究表明，用腺病毒作載體應(yīng)用PGK啟動(dòng)子經(jīng)GAL4/VP16間接驅(qū)動(dòng)Bax基因表達(dá)(即用腺病毒載體AD/PGK-GV16與AD/GT-Bax同時(shí)感染細(xì)胞)，可殺死p53基因敏感與不敏感的癌細(xì)胞。但因PGK啟動(dòng)子在大多數(shù)正常細(xì)胞中也有活性，將AD/PGK-GV16與AD/GT-Bax同時(shí)注入小鼠尾靜脈時(shí)，就導(dǎo)致小鼠肝臟的大面積細(xì)胞死亡(Kagawa，S.，Gu，J.，Swisher，S.G.，Lin，J.，Roth，J.A.，Lai，D.，Stephens，L.C.，and Fang，B.，Cancer Res，601157-1161，2000；Kagawa，S.，Pearson，S.A.，Ji，L.，Xu，K.，McDonnell，T.J.，Swisher，S.，Roth，J.A.，and Fang，B.，Gene Ther，775-79，2000)。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物肝臟60％以上的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而注入相同劑量的對(duì)照腺病毒載體僅引起＜1％的肝細(xì)胞凋亡。
為比較腺病毒載體AD/PGK-GV16加AD/GT-Bax，與AD/CEA-GV16加AD/GT-Bax對(duì)CEA陽(yáng)性癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的殺傷作用，我們應(yīng)用同樣劑量與比例的AD/PGK-GV16加AD/GT-Bax，與AD/CEA-GV16加AD/GT-Bax處理CEA陽(yáng)性的人結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo，肺癌細(xì)胞A549，及CEA陰性的正常成纖維細(xì)胞(NHFB)，然后檢測(cè)細(xì)胞的存活率。上述細(xì)胞同時(shí)也用對(duì)照腺病毒載體AD/GT-LacZ加AD/PGK-GV16，或AD/GT-Bax加AD/CMV-GFP進(jìn)行處理，最后與經(jīng)磷酸緩沖液處理的細(xì)胞存活率進(jìn)行比較，獲得各組細(xì)胞的相對(duì)存活率。如圖2所示，應(yīng)用對(duì)照腺病毒載體處理上述三種細(xì)胞時(shí)，并不影響細(xì)胞的存活率。而當(dāng)細(xì)胞經(jīng)AD/PGK-GV16加AD/GT-Bax處理后48小時(shí)，上述三種細(xì)胞的存活率都明顯降低，與經(jīng)磷酸緩沖液處理的細(xì)胞或經(jīng)對(duì)照腺病毒載體處理的細(xì)胞相比有顯著差異(p＜0.001)。說(shuō)明應(yīng)用PGK啟動(dòng)子經(jīng)GAL4-VP16間接驅(qū)動(dòng)Bax基因表達(dá)對(duì)CEA陽(yáng)性的癌細(xì)胞與CEA陰性的正常細(xì)多有殺傷作用。但當(dāng)細(xì)胞經(jīng)AD/CEA-GV16加AD/GT-Bax處理后48小時(shí)，只有Lovo細(xì)胞及A549細(xì)胞的存活率有明顯降低，與經(jīng)磷酸緩沖液處理的細(xì)胞或經(jīng)對(duì)照腺病毒載體處理的細(xì)胞相比有顯著差異(p＜0.001)。而在正常成纖維細(xì)胞中，應(yīng)用AD/CEA-GV16加AD/GT-Bax處理并不影響細(xì)胞的存活率，說(shuō)明應(yīng)用CEA啟動(dòng)子經(jīng)GAL4/VP16間接驅(qū)動(dòng)Bax基因的表達(dá)，可選擇性地殺死CEA陽(yáng)性的癌細(xì)胞。
應(yīng)用CEA啟動(dòng)子經(jīng)GAL4/VP16間接驅(qū)動(dòng)Bax基因的表達(dá)對(duì)CEA陽(yáng)性癌細(xì)胞的殺傷作用也在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物瘤中得到證實(shí)。將CEA陽(yáng)性的人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞注入裸鼠皮下建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物瘤模型，再將各種腺病毒載體注入腫瘤內(nèi)，我們發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用腺病毒載體AD/CEA-GV16加AD/GT-Bax治療，與應(yīng)用腺病毒載體AD/PGK-GV16加AD/GT-Bax治療，所得的效果一樣。兩者都能明顯地抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物瘤生長(zhǎng)。與經(jīng)磷酸緩沖液或?qū)φ障俨《据d體治療組相比，它們的抑制作用非常顯著(p＜0.01)(圖3)。
日本Kyo教授的實(shí)驗(yàn)室首先報(bào)道了對(duì)人TERT啟動(dòng)子測(cè)序與功能分析(Takakura M，Kyo S，Kanaya T，Hirano H，Takeda J，Yutsudo M，and InoueM，Cancer Res.，59551-557，1999)。TERT啟動(dòng)子的核心成份位于轉(zhuǎn)錄起始部位上游約200-400鹼基對(duì)處。該啟動(dòng)子富含GC序列，但不含TATA及CAAT序列。該啟動(dòng)子也能被Myc蛋白所激活。
以腺病毒為載體，LacZ基因?yàn)閳?bào)告基因，我們分析了TERT啟動(dòng)子在五種不同來(lái)源的人癌細(xì)胞及兩種正常人細(xì)胞(正常人成纖維細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞)中的活性，并與CMV啟動(dòng)子比較(Gu，J.，Kagawa，S.，Takakura，M.，Kyo，S.，Inoue，M.，Roth，J.A.，and Fang，B.，Cancer Res.，605359-5364，2000)。我們發(fā)現(xiàn)，TERT啟動(dòng)子在五種癌細(xì)胞中都有較高的活性，而在正常細(xì)胞中活性極低。在癌細(xì)胞中，TERT啟動(dòng)子活性約低于CMV啟動(dòng)子活性2-10倍。而在正常細(xì)胞中，TERT啟動(dòng)子活性比CMV啟動(dòng)子低500多倍。將由人TERT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的，表達(dá)LacZ基因的腺病毒載體(AD/TERT-LacZ)，或由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的，表達(dá)LacZ基因的腺病毒載體(AD/CMV-LacZ)分別注入小鼠尾靜脈，再分析LacZ基因在各臟器中的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)，注入腺病毒載體(AD/CMV-LacZ)的小鼠的大多數(shù)肝臟細(xì)胞(＞90％)及一脾臟細(xì)胞(約10％)有較高的LacZ基因表達(dá)。而注入腺病毒載體(AD/TERT-LacZ)的小鼠的肝臟細(xì)胞及脾臟細(xì)胞中并無(wú)LacZ基因表達(dá)，報(bào)告基因的表達(dá)水平與用磷酸緩沖液或?qū)φ障俨《据d體治療的小鼠相同。說(shuō)明TERT啟動(dòng)子在體內(nèi)的正常細(xì)胞中也無(wú)活性。因?yàn)榻?jīng)靜脈注入的腺病毒在小鼠中很少感染除肝臟，脾臟以外的器官，在其他各臟器中，無(wú)論注入哪種腺病毒載體，報(bào)告基因的表達(dá)水平都與用磷酸緩沖液治療的小鼠相同。
為檢驗(yàn)?zāi)芊裼帽景l(fā)明所述的技術(shù)提高TERT啟動(dòng)子的表達(dá)水平而不失去其腫瘤特異性，我們構(gòu)建了腺病毒載體AD/TERT-GV16(由TERT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GAL4-VP16基因的表達(dá))，并比較了由TERT啟動(dòng)子直接驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因LacZ，或由TERT啟動(dòng)子經(jīng)GAL4/VP16間接驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因LacZ時(shí)，LacZ基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平。人肺癌細(xì)胞A549，H460和H1299，人結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo，及正常人成纖維細(xì)胞(NHFB)分別用腺病毒載體AD/TERT-LacZ，或AD/TERT-GV16加AD/GT-LacZ處理，48小時(shí)后分析LacZ基因產(chǎn)物半乳糖甘酶的活性。當(dāng)應(yīng)用相同總載體劑量時(shí)，在各種癌細(xì)胞中，應(yīng)用AD/TERT-GV16加AD/GT-LacZ處理后的半乳糖甘酶的活性比應(yīng)用AD/TERT-LacZ處理后的半乳糖甘酶的活性高170-380倍，盡管前者TERT與LacZ的基因劑量是后者的一半(表2，圖4)。應(yīng)用AD/TERT-GV16加AD/GT-LacZ處理也提高半乳糖甘酶在正常人成纖維細(xì)胞中的水平，但提高幅度遠(yuǎn)低于癌細(xì)胞(表2)。說(shuō)明本發(fā)明所述的技術(shù)可以大大提高TERT啟動(dòng)子的活性而不影響其腫瘤特異性。表2，腺病毒載體感染細(xì)胞后半乳糖甘酶的活性
應(yīng)用TERT啟動(dòng)子經(jīng)GAL4/VP16間接驅(qū)動(dòng)Bax基因的表達(dá)對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用也在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物瘤中得到證實(shí)。將人肺癌H1299細(xì)胞注入裸鼠皮下建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物瘤模型，再將各種腺病毒載體注入腫瘤內(nèi)，我們發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用腺病毒載體AD/TERT-GV16加AD/GT-Bax治療，與應(yīng)用腺病毒載體AD/PGK-GV16加AD/GT-Bax治療，所得的效果一樣。兩者都能明顯地抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物瘤生長(zhǎng)。與經(jīng)磷酸緩沖液或?qū)φ障俨《据d體治療組相比，它們的抑制作用非常顯著(p＜0.01)(圖7)。
為檢驗(yàn)?zāi)芊駪?yīng)用TERT啟動(dòng)子減少Bax基因在體內(nèi)治療時(shí)的毒性作用，我們比較了經(jīng)尾靜脈注入腺病毒載體AD/TERT-GV16加AD/GT-Bax，或腺病毒載體AD/PGK-GV16加AD/GT-Bax對(duì)肝臟的損傷作用。當(dāng)注入AD/PGK-GV16加AD/GT-Bax(總量為5×1010病毒顆粒/小鼠，兩載體的比例為1∶1)時(shí)，小鼠的肝臟細(xì)胞發(fā)生大面積(＞60％)的死亡(圖8)，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶，谷草轉(zhuǎn)氨酶活性比正常高出100多倍，說(shuō)明肝臟有嚴(yán)重?fù)p傷。多數(shù)小鼠在2-3天內(nèi)死亡。而當(dāng)注入相同總量與比例的腺病毒載體AD/TERT-GV16加AD/GT-Bax時(shí)，小鼠的肝臟與注入磷酸緩沖液或?qū)φ障俨《据d體組相同，肝組織并無(wú)明顯的變化(圖8)。血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶，谷草轉(zhuǎn)氨酶活性也在正常范圍。這一結(jié)果表明，應(yīng)用TERT啟動(dòng)子可以防止Bax基因?qū)φ＜?xì)胞的毒性作用。
在上述實(shí)施例中，表達(dá)GAL4/VP16融合蛋白基因的各種成份(啟動(dòng)子、基因及多聚A信號(hào)序列)與表達(dá)治療基因(或報(bào)告基因)的各種成份分別置于兩個(gè)不同的遺傳載體中。當(dāng)兩個(gè)載體同時(shí)感染靶細(xì)胞時(shí)，治療基因(或報(bào)告基因)才得以表達(dá)。但是，表達(dá)GAL4/VP16融合蛋白基因的各種成份與表達(dá)治療基因(或報(bào)告基因)的各種成份也可放在同一載體中。例如，我們構(gòu)建的由TERT啟動(dòng)子經(jīng)GAL4間接表達(dá)人TRAIL基因與碌色熒光蛋白(green fluorescent protein，簡(jiǎn)稱GFP)基因的融合基因的載體就是將兩組基因的表達(dá)成份放在同一載體上。
TRAIL基因又稱腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-relatedapoptosis-inducing ligand，簡(jiǎn)稱TRAIL)基因(Ashkenazi，A.，Pai，R.C.，F(xiàn)ong，S.，Leung，S.，Lawrence，D.A.，Marsters，S.A.，Blackie，C.，Chang，L.，McMurtrey，A.E.，Hebert，A.，DeForge，L.，Koumenis，I.L.，Lewis，D.，Harris，L.，Bussiere，J.，Koeppen，H.，Shahrokh，Z.，and Schwall，R.H.，Journal ofClinical Investigation，104155-162，1999；Degli-Esposti，M.To die or not todie--the quest of the TRAIL receptors.，Journal of Leukocyte Biology，65535-542，1999；Griffith，T.S.and Lynch，D.H.，Current Opinion inImmunology，10559-563，1998)。TRAIL與腫瘤壞死因子有很大的同源性，兩者都是細(xì)胞膜蛋白，兩者都能引起腫瘤細(xì)胞的死亡。但與腫瘤壞死因子不同，TRAIL在多數(shù)正常細(xì)胞中(肝、腦、睪丸細(xì)胞除外)都表達(dá)，并且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性作用(Ashkenazi，A.，Pai，R.C.，F(xiàn)ong，S.，Leung，S.，Lawrence，D.A.，Marsters，S.A.，Blackie，C.，Chang，L.，McMurtrey，A.E.，Hebert，A.，DeForge，L.，Koumenis，I.L.，Lewis，D.，Harris，L.，Bussiere，J.，Koeppen，H.，Shahrokh，Z.，and Schwall，R.H.，Journal of ClinicalInvestigation，104155-162，1999)。然而，最近的研究表明，TRAIL蛋白可能對(duì)人的肝臟細(xì)胞有毒性(Jo，M.，Kim，T.H.，Seol，D.W.，Esplen，J.E.，Dorko，K.，Billiar，T.R.，and Strom，S.C.，Nature Medicine，6564-567，2000)。我們?cè)谧罱难芯恐凶C明，將TRAIL基因或GFP/TRAIL融合基因直接轉(zhuǎn)入癌細(xì)胞，可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤生長(zhǎng)。不僅如此，將TRAIL基因或GFP/TRAIL融合基因轉(zhuǎn)入癌細(xì)胞后還可引起轉(zhuǎn)染細(xì)胞周圍的癌細(xì)胞凋亡，此現(xiàn)象也稱旁觀者效應(yīng)(bystander effect)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，人TRAIL基因?qū)π∈蟮母闻K無(wú)毒性作用(Kagawa，S.，He，C.，Gu，J.，Koch，P.，Rha，S.J.，Roth，J.A.，Curley，S.A.，Stephens，L.C.，and Fang，B.，CancerRes，613330-3338，2000)。但體外培養(yǎng)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，人TRAIL基因?qū)φＨ烁渭?xì)胞有殺傷作用。為防止肝細(xì)胞毒性作用，我們構(gòu)建了由TERT啟動(dòng)子經(jīng)GAL4/VP16間接表達(dá)GFP/TRAIL融合基因的腺病毒載體(稱AD/gTRAIL)。在這一載體中，表達(dá)GAL4/VP16融合蛋白基因的各種成份與表達(dá)治療基因(GFP/TRAIL融合基因)的各種成份都放在同一載體中(圖9)。
在腺病毒載體AD/gTRAIL中，治療基因?yàn)镚FP/TRAIL融合蛋白，其表達(dá)水平可通過(guò)流式細(xì)胞分析檢測(cè)GFP陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量。如圖10所示，用相同總量的腺病毒載體感染人肺癌細(xì)胞H460(1500病毒顆粒/細(xì)胞)，兩天后收獲細(xì)胞并將樣品分成兩份，一份經(jīng)流式細(xì)胞分析檢測(cè)GFP陽(yáng)性的細(xì)胞，另一份用DNA染料染色后分析凋亡細(xì)胞，即分別得到GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比及凋亡細(xì)胞百分比。當(dāng)細(xì)胞用磷酸緩沖液治療時(shí)，即得本底GFP陽(yáng)性細(xì)胞為0.88％，本底凋亡細(xì)胞為4.42％。而當(dāng)細(xì)胞用表達(dá)GFP蛋白的對(duì)照腺病毒載體AD/CMV-GFP治療時(shí)，即得GFP陽(yáng)性細(xì)胞為71.1％，凋亡細(xì)胞為4.0％。說(shuō)明AD/CMV-GFP可導(dǎo)致GFP在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，但GFP的表達(dá)對(duì)細(xì)胞無(wú)殺傷作用。當(dāng)細(xì)胞用腺病毒載體AD/gTRAIL治療時(shí)，GFP陽(yáng)性細(xì)胞為61.3％，凋亡細(xì)胞為32.4％。說(shuō)明用AD/gTRAIL感染細(xì)胞時(shí)，GFP/TRAIL融合蛋白在癌細(xì)胞種表達(dá)，并將癌細(xì)胞殺死。當(dāng)細(xì)胞用腺病毒載體AD/GT-TRAIL加腺病毒載體AD/PGK-GV16治療時(shí)，GFP陽(yáng)性細(xì)胞為3.7％，凋亡細(xì)胞為34.3％。說(shuō)明當(dāng)癌細(xì)胞表達(dá)TRAIL基因時(shí)，因無(wú)GFP成份存在，細(xì)胞仍然是GFP陰性，但TRAIL基因的表達(dá)即可將癌細(xì)胞殺死。用同樣的方法，我們可檢測(cè)上述的治療方法對(duì)不同來(lái)源的癌細(xì)胞或正常細(xì)胞進(jìn)行分析。所得結(jié)果見(jiàn)表3。表3治療后GFP陽(yáng)性與凋亡細(xì)胞數(shù)
表3中Lovo與DLD1為人結(jié)腸癌細(xì)胞，A549與H460為人肺癌細(xì)胞，NHPH為正常人原代肝細(xì)胞，NHFB為正常人成纖維細(xì)胞。上表說(shuō)明，TRAIL基因?qū)Π┘?xì)胞Lovo，DLD1，A549，H460以及正常人原代肝細(xì)胞有殺傷作用，而對(duì)正常人成纖維細(xì)胞無(wú)毒性作用。當(dāng)用TERT啟動(dòng)子經(jīng)GAL4/VP16間接驅(qū)動(dòng)GFP/TRAIL融合基因時(shí)，該融合基因在癌細(xì)胞中表達(dá)較高，并將癌細(xì)胞殺死。但在正常人原代肝細(xì)胞及正常人成纖維細(xì)胞中，該基因不表達(dá)，腺病毒載體AD/gTRAIL對(duì)這兩種正常細(xì)胞都無(wú)毒性作用。
為檢驗(yàn)腺病毒載體AD/gTRAIL在腫瘤治療上可用性，我們檢測(cè)了它在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物瘤中對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。將人結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1注入裸鼠皮下建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物瘤模型。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)到直徑為0.5厘米時(shí)，再將5×1010腺病毒載體顆粒注入腫瘤內(nèi)，每四天一次，共三次。然后跟宗腫瘤大小的變化。我們發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用腺病毒載體AD/PGK-GV16加AD/GT-TRAIL治療，與應(yīng)用腺病毒載體AD/gTRAIL治療，所得的效果一樣。兩者都能明顯地抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物瘤生長(zhǎng)。與經(jīng)磷酸緩沖液或?qū)φ障俨《据d體AD/CMV-GFP治療組相比，它們的抑制作用非常顯著(p＜0.01)(圖11)。說(shuō)明應(yīng)用腺病毒載體AD/gTRAIL治療與應(yīng)用表達(dá)TRAIL基因的雙腺病毒載體AD/PGK-GV16加AD/GT-TRAIL治療一樣，都能達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果。
權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)細(xì)胞特異性目的基因表達(dá)的方法，包括(a)將細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄激活蛋白的基因相連；(b)將能夠被所述的轉(zhuǎn)錄激活蛋白激活的啟動(dòng)子與目的基因相連；(c)將步驟(a)中得到的與細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子相連的轉(zhuǎn)錄激活蛋白的基因和步驟(b)中得到的與能夠被所述的轉(zhuǎn)錄激活蛋白激活的啟動(dòng)子相連的目的基因同時(shí)導(dǎo)入靶細(xì)胞；(d)使所述的轉(zhuǎn)錄激活蛋白的基因和目的基因在靶細(xì)胞中表達(dá)。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子是酪氨酸酶基因的啟動(dòng)子，癌胚抗原基因的啟動(dòng)子，粘液蛋白基因的啟動(dòng)子，前列腺特異抗原基因的啟動(dòng)子，甲胚蛋白基因的啟動(dòng)子，E2F因子基因的啟動(dòng)子，端粒酶基因的啟動(dòng)子，或者它們的組合。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述的它們的組合是低氧誘導(dǎo)啟動(dòng)子與甲胚蛋白基因的啟動(dòng)子相連接而得到的組合啟動(dòng)子，或者甲胚蛋白基因的啟動(dòng)子或前列腺特異抗原基因的啟動(dòng)子與別的啟動(dòng)子的增強(qiáng)子序列相連接得到的組合啟動(dòng)子。
4.按照權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述的別的啟動(dòng)子的增強(qiáng)子是SV40增強(qiáng)子。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的轉(zhuǎn)錄激活蛋白是，SP1蛋白，AP-1族轉(zhuǎn)錄因子，STAT蛋白質(zhì)，CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)族轉(zhuǎn)錄因子，NF-kapaB/Rel族轉(zhuǎn)錄因子，Myc-Max-Mad族轉(zhuǎn)錄因子，酵母的GAL4蛋白，細(xì)菌LexA蛋白，p53蛋白，或者M(jìn)yc蛋白。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，轉(zhuǎn)錄激活蛋白的基因是一種將編碼一轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)的基因片段與編碼一轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的基因片段相組合得到的人工融合基因。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述的人工融合基因是將GAL4蛋白的DNA結(jié)合區(qū)與其轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合即得GAL4-GAL4融合蛋白，將GAL4蛋白的DNA結(jié)合區(qū)與泡疹病毒VP16蛋白的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合得到的GAL4-VP16融合蛋白，GAL4蛋白的DNA結(jié)合區(qū)與Myc蛋白的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合得到的GAL4-Myc融合蛋白，LexA蛋白的DNA結(jié)合區(qū)與泡疹病毒VP16蛋白的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合得到的LexA-VP16融合蛋白，四環(huán)素抑制子蛋白的DNA結(jié)合區(qū)與泡疹病毒VP16蛋白的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合得到的四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄激活蛋白。
8.按照權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述的四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄激活蛋白還含有四環(huán)素結(jié)合區(qū)，在GAL4-VP16融合蛋白上還含有激素受體蛋白的激素結(jié)合區(qū)。
9.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，用于控制目的基因的能夠被所述的轉(zhuǎn)錄激活蛋白激活的啟動(dòng)子含有能被GAL4蛋白識(shí)別的序列5’-CGGAGTACTGTCCTCCG-3’或5’-CGGAGGACTGTCCTCCG-3’，或含有四環(huán)素抑制子(tetR)蛋白的識(shí)別序列TCCCTATCAGTGATAGAGA，或含有LexA蛋白的識(shí)別序5’-GTCGAGTACTGTATGTACATACAGTAC-3’。
10.按照權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述的用于控制目的基因的能夠被所述的轉(zhuǎn)錄激活蛋白激活的啟動(dòng)子含有如下序列cggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccg(N)ntatataa其中N是a，t，c或g，n是0-100的整數(shù)。
11.按照權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述的用于控制目的基因的能夠被所述的轉(zhuǎn)錄激活蛋白激活的啟動(dòng)子含有的酵母GAL4蛋白的識(shí)別序列5’-CGGAGTACTGTCCTCCG-3’或5’-CGGAGGACTGTCCTCCG-3的拷貝數(shù)是一個(gè)，兩個(gè)，三個(gè)，四個(gè)，五個(gè)，六個(gè)，七個(gè)，八個(gè)，九個(gè)，或十個(gè)。
12.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的治療基因或目的基因是用于腫瘤(癌癥)治療的基因，用于治療心血管疾病的基因，用于治療傳染性疾病的基因，用于治療代謝性疾病的基因，用于治療遺傳性疾病的基因，用于治療肝臟疾病，腎臟疾病，和/或自身免疫性疾病的基因。
13.按照權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述的用于腫瘤(癌癥)治療的基因是致死基因，細(xì)胞凋亡基因，細(xì)胞毒性基因，毒性藥物激活蛋白基因，免疫調(diào)節(jié)蛋白或免疫因子基因，和/或血管生長(zhǎng)抑制蛋白基因。
14.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的治療基因或目的基因是胰島素基因，泡疹病毒胸腺嘧啶激酶基因，胞嘧啶脫氨酶基因，Bax，Bik，Bak，Bid，TRAIL，F(xiàn)as，F(xiàn)as配體基因，白喉?xiàng)U菌類毒素基因，白介素(interleukin)-2，白介素-4，白介素-12，GM-CSF，腫瘤壞死因子，或者干擾素基因。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)細(xì)胞特異性目的基因表達(dá)的方法。該方法以細(xì)胞、組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因的表達(dá),被表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活蛋白又作用于該蛋白特異的啟動(dòng)子,通過(guò)這一連鎖反應(yīng),從而達(dá)到增強(qiáng),放大原細(xì)胞或腫瘤特異性啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。本發(fā)明的方法可提高治療基因在靶細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)中的表達(dá)水平,增強(qiáng)其在靶細(xì)胞中的活性,同時(shí)減少在非靶細(xì)胞中的副作用。
文檔編號(hào)C12N15/52GK1388247SQ0111852
公開(kāi)日2003年1月1日 申請(qǐng)日期2001年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月30日
發(fā)明者方炳良 申請(qǐng)人:方炳良