專利名稱：抗人卵巢癌抗人cd3雙特異性抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗癌基因工程雙特異性抗體，表達(dá)該雙特異性抗體的核苷酸序列，含有該核苷酸序列的載體，含有該載體的宿主細(xì)胞。
雙特異性抗體(BsAb)，為非天然抗體，其兩個(gè)抗原結(jié)合部位具有不同的特異性，因此，化學(xué)結(jié)構(gòu)上是雙價(jià)的，結(jié)合抗原的功能是單價(jià)的。將腫瘤相關(guān)抗原特異的抗體與具殺傷腫瘤細(xì)胞功能的效應(yīng)細(xì)胞的表面觸發(fā)分子特異的抗體偶聯(lián)構(gòu)成的雙特異性抗體，可高效地將體內(nèi)的免疫效應(yīng)細(xì)胞富集于腫瘤細(xì)胞周圍，激活免疫效應(yīng)細(xì)胞特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞，從而起到治療腫瘤的目的。目前雙特異性抗體的制備有化學(xué)偶聯(lián)法，雜交瘤法和基因工程法三種?；瘜W(xué)偶聯(lián)法是先采用還原劑，使不同的兩種單克隆抗體或其片段解鏈，獲得單價(jià)抗體或抗體片段，再采用異雙功能交聯(lián)劑把兩種具有不同抗原特異性的單價(jià)抗體或其片段交聯(lián)在一起。該方法可快速，大量制備BsAb，但是在交聯(lián)過(guò)程中抗體時(shí)有失活，而且難于保證產(chǎn)物的均質(zhì)性。雜交瘤法是通過(guò)細(xì)胞融合的方法，將分泌其中一種單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞與經(jīng)另一種抗原免疫的脾細(xì)胞融合，或兩種分泌不同單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞彼此融合。融合而成的細(xì)胞，前者稱三體瘤，后者稱四體瘤，兩者統(tǒng)稱二次雜交瘤。雜交瘤方法制備的BsAb生物活性高，但制備繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，且不易與同時(shí)產(chǎn)生的其他沒(méi)有活性或不需要的抗體分離。此外，人源雜交瘤技術(shù)尚未取得突破性進(jìn)展，該法獲得的BsAb在臨床應(yīng)用上面臨產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)問(wèn)題和分子量過(guò)大的問(wèn)題，且用該方法制備臨床級(jí)的BsAb成本很高，難以普及使用?；蚬こ谭ㄖ苽銪sAb是隨著基因工程抗體技術(shù)的發(fā)展，在小分子抗體的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，有其明顯的優(yōu)越性，如方法穩(wěn)定，可大量生產(chǎn)，且成本大大降低，操作簡(jiǎn)便等，正逐步取代化學(xué)偶聯(lián)法和二次雜交法。隨著基因工程技術(shù)的成熟，用不同的方法可將兩種不同的單鏈抗體(ScFv)連接構(gòu)成小分子的BsAb。根據(jù)連接方法不同有三種BsAb的構(gòu)成形式。(1)Mini-antibody利用一個(gè)寡聚化的結(jié)構(gòu)域(例如，F(xiàn)os或Jun亮氨酸拉鏈)將兩個(gè)ScFv組裝成一個(gè)異二聚體的分子。(2)Diabodies將兩個(gè)不同抗體的VH和VL用一個(gè)短的連接肽(例如，Gly4Ser)連接成兩條不同的單鏈VH1-VL2和VH2-VL1，在同一個(gè)細(xì)胞中共表達(dá)，由于短的連接肽使得同一條鏈的VH和VL難以配對(duì)，而僅與另外一條鏈的、但實(shí)際上卻是來(lái)源相同的V區(qū)相匹配，折疊形成一個(gè)具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的二聚體分子。(3)ScBsAb在同一個(gè)載體上將兩種特異性的scFv用一個(gè)域間連接肽(interlinker)相連構(gòu)成，其中構(gòu)成兩個(gè)scFv的鏈內(nèi)連接肽(intralinker)常用的是(Gly4Ser)3，而連接兩個(gè)scFv的域間連接肽有兩種設(shè)計(jì)，一種為短的肽鏈，一般不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基，常用的是Gly4Ser，這種設(shè)計(jì)主要目的是防止異源可變區(qū)之間的錯(cuò)配。另一種設(shè)計(jì)方案為長(zhǎng)的肽鏈，本實(shí)驗(yàn)室在采用Gruber在構(gòu)建抗TCR×抗熒光的scBsAb中設(shè)計(jì)了一個(gè)長(zhǎng)25aa的域間連接肽205c’的同時(shí)，也分別設(shè)計(jì)了經(jīng)改造的長(zhǎng)26aa的Fc片段和長(zhǎng)25aa的HSA片段作為域間連接肽，結(jié)果均顯示其同樣可使兩個(gè)scFv產(chǎn)生正確的蛋白折疊而形成兩個(gè)具有較強(qiáng)抗原結(jié)合活性位點(diǎn)的BsAb。域間連接肽設(shè)計(jì)總的原則是保證抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)域發(fā)生正確的配對(duì)和折疊并保持其生物學(xué)活性及穩(wěn)定性，其次還可根據(jù)需要賦予產(chǎn)物一些新的特性，如便于純化、增強(qiáng)其在體內(nèi)的半衰期等。
雙特異抗體介導(dǎo)的生物免疫導(dǎo)向治療在腫瘤的生物治療中有良好的臨床應(yīng)用前景。其特征在于其一，雙特異抗體介導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用是靠激發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)完成的，免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷是高度腫瘤特異性的，且不受MHC的限制。其二，雙特異抗體對(duì)正常組織是無(wú)害的。因此，應(yīng)用雙特異抗體治療腫瘤是手術(shù)，放療，化療等傳統(tǒng)方法的補(bǔ)充，其真正作用在于消除亞臨床病灶，減少乃至消滅腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。表現(xiàn)為既可以根治腫瘤，又可以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生和維持較長(zhǎng)時(shí)間的免疫保護(hù)作用。綜合小鼠及臨床研究結(jié)果，制備用于腫瘤治療的臨床級(jí)BsAb至少必須具備5種特性①對(duì)靶向的腫瘤抗原具有很高的特異性和親和力；②可單價(jià)結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞表面的細(xì)胞毒效應(yīng)觸發(fā)分子，并只在遭遇了腫瘤抗原后發(fā)生交聯(lián)，它們不含有Fc段；③可有效地啟動(dòng)高水平的靶向性細(xì)胞毒作用以及相應(yīng)的白細(xì)胞群有選擇性地在腫瘤局部產(chǎn)生炎癥反應(yīng)；④必須人源化，降低重復(fù)使用后發(fā)生的HAMA反應(yīng)；⑤BsAb應(yīng)小到足以滲透入腫瘤但又應(yīng)大到足以在循環(huán)中維持足夠的時(shí)間。
以上述幾點(diǎn)為依據(jù)，目前，人們開(kāi)發(fā)研究了多種激發(fā)不同免疫效應(yīng)細(xì)胞，針對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的雙特異性抗體，其中的免疫效應(yīng)細(xì)胞包括T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及LAK細(xì)胞(淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞)和TIL細(xì)胞(激活的腫瘤侵潤(rùn)性淋巴細(xì)胞)等。T淋巴細(xì)胞是特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞，是目前研究的最多的效應(yīng)細(xì)胞。CD3分子表達(dá)于所有成熟T細(xì)胞表面，是所有T細(xì)胞表面共同的表面標(biāo)志。CD3與TCR呈非共價(jià)結(jié)合，形成完整的TCR-CD3復(fù)合物，共同參于對(duì)抗原刺激的免疫應(yīng)答，是目前在雙特異性抗體中應(yīng)用最多且最成功的免疫效應(yīng)細(xì)胞表面的觸發(fā)分子。BsAb中的抗CD3抗體與T細(xì)胞表面的CD3分子結(jié)合后，可產(chǎn)生多種效應(yīng)功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。這些效應(yīng)功能包括(1)T細(xì)胞增殖分化BsAb首先可活化靜止型T細(xì)胞，CD4+、CD8+的前體效應(yīng)T細(xì)胞激活成為T(mén)h細(xì)胞和Tc細(xì)胞；其次活化大量記憶細(xì)胞，增殖和分化成為效應(yīng)性T細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行攻擊和殺傷。效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量直接與腫瘤消退的速度有關(guān)。(2)細(xì)胞因子分泌經(jīng)BsAb活化的CD4+Th細(xì)胞可大量分泌IL-2，IL-2一方面以自分泌方式刺激Th細(xì)胞的分裂增殖，另一方面以旁分泌方式激活CD8+前體細(xì)胞活化為T(mén)c，起到放大殺傷性T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。此外，IL-2又是活化T細(xì)胞的共刺激信號(hào)。因此，IL-2在BsAb介導(dǎo)的免疫效應(yīng)中占有很重要的地位。T細(xì)胞活化過(guò)程中還可釋放TNF-α和IFN-γ，它們可相互誘生并活化其它效應(yīng)細(xì)胞，還可通過(guò)細(xì)胞間介質(zhì)抑制旁觀腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)生旁觀者效應(yīng)。(3)細(xì)胞毒作用；體外研究顯示在BsAb的作用下，CD8+Tc細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞直接接觸，通過(guò)排粒作用釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)，可溶解靶細(xì)胞，其作用迅速，通常發(fā)生于著靶后4～6hr內(nèi)。細(xì)胞毒性物質(zhì)主要是穿孔素(perforin)和絲氨酸酯酶或稱顆粒酶(granzyme)。穿孔素可攻擊胞膜而形成離子通道，使大量離子和水進(jìn)入，導(dǎo)致細(xì)胞溶解壞死，而顆粒酶類似于淋巴毒素，可以活化靶細(xì)胞內(nèi)的DNA酶，導(dǎo)致核DNA的裂解，引起靶細(xì)胞的凋亡。
目前，構(gòu)建BsAb時(shí)所用的抗體一般為Fv片段，這是因?yàn)镕v片段是含有完整抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小單位，分子小(只有完整抗體的1/6)，不含F(xiàn)c段，免疫原性低，易于穿過(guò)血管壁和進(jìn)入實(shí)體瘤，而且還可以用大腸桿菌表達(dá)，發(fā)酵生產(chǎn)，大大地降低了生產(chǎn)成本，但由于Fv中VH和V1間不能形成共價(jià)鍵，在體內(nèi)不穩(wěn)定，很容易解離。為了提高Fv片段的穩(wěn)定性，在VH和VL間用一條多肽鏈即連接肽把它們連接起來(lái)形成所謂的單鏈抗體(ScFv)。連接肽通常為一條長(zhǎng)15個(gè)氨基酸的具有柔韌性的短肽，常用的是(Glg4Ser)3。在本發(fā)明中，兩種ScFv都采用此連接肽。如上所述，將兩種不同的ScFv連接構(gòu)成小分子的BsAb有幾種方法，本發(fā)明采用的是，用一個(gè)域間連接肽將兩個(gè)ScFv連接起來(lái)構(gòu)成單鏈雙特異抗體(ScBsAb)。設(shè)計(jì)域間連接肽時(shí)，總的原則是保證兩種抗體的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域分別正確地配對(duì)和折疊并保持其生物學(xué)活性及穩(wěn)定性，其次還可根據(jù)需要賦予產(chǎn)物一些新的特性，如便于純化、增強(qiáng)其在體內(nèi)的半壽期等。本發(fā)明所獨(dú)創(chuàng)設(shè)計(jì)的兩種域間連接肽Fc和HSA對(duì)此進(jìn)行了有益的嘗試和探索，為域間連接肽的設(shè)計(jì)提供了新的思路，同時(shí)，為了比較和驗(yàn)證本發(fā)明所設(shè)計(jì)的域間連接肽的效用以及該設(shè)計(jì)在抗人卵巢癌特異性BsAb中的利用價(jià)值，也采用了文獻(xiàn)報(bào)道的一種205c’作為一種域間連接肽。(1)Fc域間連接肽的設(shè)計(jì)為了減小免疫原性和分子大小，小分子抗體中不帶有抗體的Fc區(qū)段，因此，缺乏Fc段所介導(dǎo)的ADCC，CDC以及激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑等生物功能。為此我們嘗試通過(guò)域間連接肽的設(shè)計(jì)來(lái)彌補(bǔ)基因工程抗體的這一缺陷。在IgG的四種亞型中，以IgG1引發(fā)ADCC和CDC的能力最強(qiáng)，通過(guò)其CH2的C端一段序列與C1q結(jié)合，引發(fā)補(bǔ)體的經(jīng)典激活途徑，其中Gly318，Lys320和Lys322在空間構(gòu)象上最近成簇，位于Fc分子表面，直接與C1q結(jié)合。此外，在CH2的Asn297上存在一個(gè)IgG的糖基化位點(diǎn)對(duì)Fc引發(fā)的ADCC和CDC至關(guān)重要。由此，本發(fā)明選擇了人IgG的CH2中297-322的一個(gè)片段用于構(gòu)造ScBsA的域間連接肽，該肽段長(zhǎng)26aa，包含了糖基化位點(diǎn)Ash297，C1q結(jié)合位點(diǎn)Glu318，Lys320和Lys322等，以及為便于克隆，在5’端和3’端分別加上的EcoR I和Sac I酶切位點(diǎn)，期望由此構(gòu)建的ScBsAb具有延長(zhǎng)體內(nèi)半壽期和類似Fc引發(fā)CDC效應(yīng)的功能。(2)HSA域間連接肽小分子抗體由于分子量小極易經(jīng)腎臟過(guò)濾而被清除，因此，在體內(nèi)的半壽期短這雖有利于腫瘤的免疫顯像診斷，但在免疫治療中由于滯留時(shí)間短而難以達(dá)到理想的治療效果，由此，本發(fā)明期望通過(guò)域間連接肽的設(shè)計(jì)來(lái)延長(zhǎng)ScBsAb在體內(nèi)的半壽期，增強(qiáng)其穩(wěn)定性和可溶性。HSA(人血清白蛋白)是人血清中的重要成分，性質(zhì)穩(wěn)定，半壽期可長(zhǎng)達(dá)數(shù)周，本身不具有特異的酶學(xué)和免疫學(xué)活性，可經(jīng)肝臟緩慢清除，因此，作為一種穩(wěn)定的天然載體已得到了廣泛的應(yīng)用。研究表明，與HSA偶連的目的蛋白在動(dòng)物體內(nèi)的穩(wěn)定性增加了20-40倍。HSA分子全長(zhǎng)585aa，由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中第三個(gè)結(jié)構(gòu)域DIII單獨(dú)使用就具有HSA完整分子的載體功能，鑒于此，本發(fā)明采用HSA的DIII中不含cys且極性氨基酸較多的403-427長(zhǎng)25個(gè)氨基酸的片段作為構(gòu)建ScBsAB的另外一種域間連接肽，以提高產(chǎn)物的穩(wěn)定性及在體內(nèi)的半壽期。(3)205c’域間連接肽Gruber等人在構(gòu)建抗TCR×抗熒光素ScBsAb中采用的一個(gè)長(zhǎng)25aa的域間連接肽。引用它作為第三種域間連接肽的目的是為了比較和驗(yàn)證本發(fā)明所設(shè)計(jì)的域間連接肽的效果以及該設(shè)計(jì)在抗人卵巢癌特異性BsAb中的利用價(jià)值。
由于鼠源抗體在臨床應(yīng)用中所遇到的HAMA問(wèn)題，嚴(yán)重限制了抗體的使用次數(shù)和使用劑量，影響了療效，因此，降低抗體的異源性，對(duì)其進(jìn)行人源化改造是制備臨床使用抗體的當(dāng)務(wù)之急，本發(fā)明的ScBsAB中的抗CD3的ScFv即是經(jīng)過(guò)人源化改造后的改形抗體。改形抗體又稱為CDR移植抗體或人源化抗體，是將小鼠抗體的可變區(qū)的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRs)移植到人源抗體的骨架區(qū)(FR)而成?？贵w的抗原結(jié)合部位空間結(jié)構(gòu)主要是由可變區(qū)的六個(gè)CDRs決定。它們形成三個(gè)環(huán)型結(jié)構(gòu)在抗原抗體的識(shí)別中起決定作用，并由四個(gè)β片層結(jié)構(gòu)的FR區(qū)支撐于可變區(qū)的頂端，這種抗體在保留與抗原結(jié)合的同時(shí)又保留了人源抗體的大部分特征，極大限度地減少了HAMA。
卵巢癌死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首位，五年存活率僅在30％，雖手術(shù)方法不斷改進(jìn)，化療藥物不斷更新，放療措施逐步完善，其預(yù)后仍未從根本上改觀，主要原因在于卵巢癌深居盆腔，起病隱匿，臨床發(fā)現(xiàn)多屬晚期，且術(shù)后易復(fù)發(fā)，反復(fù)化療常產(chǎn)生毒副作用及耐藥性，嚴(yán)重影響了治療效果。因此，特異的早期診斷方法和殘余病灶的及時(shí)清除是改善預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。對(duì)卵巢癌細(xì)胞相關(guān)抗原特異的BsAb在臨床上有著廣闊的應(yīng)用前景。
抗體分子具有兩條相同的重鏈和輕鏈，每一條鏈由一個(gè)可變區(qū)(variable region)和一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)(constant region)組成，可變區(qū)主要負(fù)責(zé)與抗原結(jié)合，恒定區(qū)主要負(fù)責(zé)結(jié)合效應(yīng)分子。在每一個(gè)可變區(qū)內(nèi)有三個(gè)在序列和晶體結(jié)構(gòu)上都高度變化的柔性環(huán)區(qū)(loop)，它們主要負(fù)責(zé)抗原的識(shí)別，被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity-determiningregions，CDRs)，而可變區(qū)的其余部分相對(duì)穩(wěn)定，由較為剛性的β-折疊(β-sheet)組成，支撐著，被稱為框架區(qū)(framework regions，F(xiàn)Rs)，CDRs與FRs間隔排列而形成“三明治”結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明中，所使用的一些術(shù)語(yǔ)具有如下的含義“Fab抗體”是指由Fd段(重鏈VH+CH1構(gòu)成)和完整的輕鏈組成，二者通過(guò)一個(gè)鏈間二硫鍵連接，形成異二聚體，它是完整抗體分子的三分之一，僅有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。
“單鏈抗體(scFv)”是用基因工程構(gòu)建的一種抗體片段，由抗體重鏈可變區(qū)(VH) 和輕鏈可變區(qū)(VL)通過(guò)一連接肽連接而成的重組蛋白，約為完整抗體分子的六分之一。
“單域抗體”是由抗體重鏈可變區(qū)(VH)或輕鏈可變區(qū)(VL)構(gòu)成，這種抗體只有一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱為單域抗體，它是完整抗體分子的十二分之一。
“改形抗體(Reshaping antibody)”也叫做CDR移植抗體(CDR-graftedantibody)。用基因合成或定點(diǎn)突變的方法將鼠源CDRs置換人源抗體中的CDRs，從而保留鼠源抗體的抗原結(jié)合特異性。但在構(gòu)建時(shí)要考慮人源FRs中某些氨基酸殘基會(huì)影響鼠源CDRs構(gòu)成的抗原結(jié)合部位的構(gòu)象，因此需對(duì)FRs中個(gè)別氨基酸殘基進(jìn)行突變，才能獲得既具有高親和力又最大程度上達(dá)到人源化的抗體。
本發(fā)明的目的就是用基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā)一種低毒，高效，價(jià)廉的卵巢癌的生物治療制劑-抗人卵巢癌×抗人CD3雙特異性抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種編碼所述的BsAb的核苷酸序列。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種所述的核苷酸序列的載體。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
因而，本發(fā)明提供了一種抗卵巢癌的基因工程雙特異抗體。其抗體部分可以是完整的抗體分子，F(xiàn)ab，單域抗體或單鏈抗體(ScFv)。
抗卵巢癌基因工程雙特異抗體最好是由兩個(gè)不同的單鏈抗體構(gòu)成。
本發(fā)明的抗卵巢癌的基因工程雙特異抗體最好是由抗卵巢癌的單鏈抗體和抗人CD3改形單鏈抗體構(gòu)成的雜合蛋白。它是由抗卵巢癌的單鏈抗體和抗人CD3改形單鏈抗體通過(guò)三種不同的鏈間連接肽連接起來(lái)后在宿主中表達(dá)的產(chǎn)物，它能激活T淋巴細(xì)胞特異性地殺傷卵巢癌細(xì)胞。
本發(fā)明的雙特異性抗體中，所述的抗卵巢癌的單鏈抗體可以具有如下的重鏈可變區(qū)氨基酸序列1 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu11 Val Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Arg Ile21 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr31 Thr Ala Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Met41 Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Leu Gly Trp51 Ile Asn Thr Asn Ser Glu Val Pro Lys Tyr61 Ala Glu Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe71 Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr81 Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp91 Thr Ala Thr Phe Phe Cys Ala Arg Ser Phe101 Thr Trp Gly Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln111 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser本發(fā)明的雙特異性抗體中，所述的抗卵巢癌的單鏈抗體可以具有如下的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列1 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser11 Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser21 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Leu Val31 His Ser Ile Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp41 Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys51 Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe61 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser71 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile81 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val91 Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro101 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu111 Leu Lys本發(fā)明的雙特異性抗體中，所述的抗人CD3的改形單鏈抗體可以具有如下的重鏈可變區(qū)氨基酸序列1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu11 Val Arg Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg Val21 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr31 Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala41 Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr51 Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr61 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met71 Thr Thr Asp Lys Ser Phe Ser Thr Ala Ile81 Met Asp Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp91 Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr101 Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly111 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
本發(fā)明的雙特異性抗體中，所述的抗人CD3的改形單鏈抗體可以具有如下的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列1 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr11 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr21 Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser31 Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly41 Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr Asp Thr51 Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg61 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe71 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu81 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp91 Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly101 Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg本發(fā)明的雙特異性抗體中，連接兩個(gè)單鏈抗體的域間連接肽可以具有如下的氨基酸序列1 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu11 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly21 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys本發(fā)明的雙特異性抗體中，連接兩個(gè)單鏈抗體的域間連接肽可以具有如下的氨基酸序列1 Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr11 Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr21 Leu Val Glu Val Ser本發(fā)明的雙特異性抗體中，連接兩個(gè)單鏈抗體的域間連接肽可以具有如下的氨基酸序列1 Ala Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala11 Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Asp21 Ala Lys Lys Asp Leu本發(fā)明還提供了一種編碼所述雙特異性抗體的核苷酸序列。其中包括兩種單鏈抗體基因和兩種單鏈抗體基因之間的域間連接肽的核苷酸序列，該連接肽可以是任何一種使兩種單鏈抗體保持各自的抗體結(jié)構(gòu)域的折疊和生物學(xué)活性，并能夠賦予產(chǎn)物一些新的特性，但最好使用本發(fā)明設(shè)計(jì)構(gòu)建的Fc域間連接肽和HSA域間連接肽或本發(fā)明所引用的205c’域間連接肽。
本發(fā)明提供了可用于構(gòu)建和表達(dá)雙特異性抗體的通用的大腸桿菌質(zhì)粒及含有編碼本發(fā)明的雙特異性抗體的核苷酸序列的表達(dá)載體。在本發(fā)明的優(yōu)化實(shí)施方案中，一種質(zhì)粒為pALM，它是以pAL781為背景質(zhì)粒構(gòu)建而成的通用的雙特異性抗體表達(dá)質(zhì)粒。該質(zhì)粒具備如下特點(diǎn)在已構(gòu)建好的雙特異性抗體基礎(chǔ)上，置換任何一種單鏈抗體基因，就可以獲得不同類型的雙特異抗體。含有編碼本發(fā)明的雙特異抗體核苷酸序列的pALM命名為pAMAB。另一種質(zhì)粒為pET△E，是由pET16失活EcoRI位點(diǎn)得到的，它含有l(wèi)ac操縱子和T7啟動(dòng)子，是一種高效表達(dá)目的蛋白的載體。含有編碼本發(fā)明雙特異抗體核苷酸序列的pET△E命名為pEMAB。另一種質(zhì)粒為pTMF，它是以pET28a為背景質(zhì)粒，根據(jù)雙特異抗體的酶切位點(diǎn)和進(jìn)一步研究的需要，構(gòu)建而成的不僅限于雙特異抗體的高效表達(dá)質(zhì)粒。該質(zhì)粒除了具高效表達(dá)的特點(diǎn)外，還具備如下特點(diǎn)具有多種較稀少的酶切位點(diǎn)，便于插入各種外源基因使它們或共表達(dá)或成融合表達(dá)；在兩組酶切位點(diǎn)之間有一凝血酶的酶切位點(diǎn)，可將表達(dá)的融合蛋白純化后分開(kāi)；在多克隆位點(diǎn)的3’端有編碼六個(gè)組氨酸的密碼子，便于表達(dá)產(chǎn)物作金屬鰲合層析純化。含有編碼本發(fā)明雙特異抗體核苷酸序列的pTMF命名為pTMAB。
本發(fā)明還提供了含有上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。所述的宿主細(xì)胞最好是大腸桿菌。
本發(fā)明基因工程雙特異抗體可通過(guò)以下步驟生產(chǎn)1.設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊?，從分泌抗腫瘤單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株中分別擴(kuò)增和克隆出單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因；2.將得到的抗腫瘤的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因插入到通用的單鏈抗體表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建成單鏈抗體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行鑒定。
3.根據(jù)鼠源抗人CD3單克隆抗體OKT3的抗原結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分子模擬和改形設(shè)計(jì)，分別得到改形CD3的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，參照大腸桿菌常用密碼子，得到其核苷酸序列，分別化學(xué)合成重鏈和輕鏈可變區(qū)的基因片段，通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增出完整的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。
4.將得到的抗人CD3的改形重鏈和輕鏈可變區(qū)基因插入到通用的單鏈抗體表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建成單鏈抗體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行鑒定。
5.選用一種帶有強(qiáng)啟動(dòng)子的質(zhì)粒為背景質(zhì)粒，選擇在該質(zhì)粒，兩種ScFv，三種域間連接肽都沒(méi)有的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成含有這些酶切位點(diǎn)的DNA片段，取代背景質(zhì)粒中的多克隆位點(diǎn)，并在相應(yīng)的酶切位點(diǎn)間分別插入合成好的域間連接肽寡聚核苷酸序列，構(gòu)建成通用的含域間連接肽的雙特異抗體中間載體。
6.設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，用PCR方法從改形CD3單鏈抗體表達(dá)質(zhì)粒中擴(kuò)增出帶有合適酶切位點(diǎn)的單鏈抗體基因，把此基因插入到雙特異抗體中間載體，構(gòu)成抗人CD3-based ScBsAb通用表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)，鑒定不同域間連接肽對(duì)單鏈抗體表達(dá)的影響。
7.從帶有抗人腫瘤單鏈抗體基因的表達(dá)載體中，雙酶切下抗人腫瘤單鏈抗體基因，把此基因插入到已構(gòu)成的抗人CD3-based ScBsAb通用表達(dá)載體中的相應(yīng)酶切位點(diǎn)即構(gòu)建成雙特異性抗體表達(dá)載體。
8.用此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)雙特異抗體表達(dá)，用SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物的分子量，表達(dá)量和表達(dá)形式，用ELISA檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的抗腫瘤抗體活性，用FACS法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的抗人CD3抗體活性，用Jurkat細(xì)胞或人外周血淋巴細(xì)胞來(lái)檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物介導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力和殺傷特異性。
9.構(gòu)建高效表達(dá)的表達(dá)載體，將雙特異抗體基因插入該載體，構(gòu)建出高效的表達(dá)質(zhì)粒。
10.用構(gòu)建的高效表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
11.培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)使其表達(dá)所述的雙特異抗體。
12.分離表達(dá)的雙特異抗體。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1.質(zhì)粒pFUW80的物理2.抗卵巢癌單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列及所編碼的氨基酸序列圖3.ELISA法檢測(cè)抗卵巢癌scFv活性圖4.質(zhì)粒pROH80的物理5.抗CD3改形單鏈抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列及所編碼的氨基酸序列圖6.FACS法測(cè)定抗CD3改形scFv的抗原結(jié)合活性圖7.質(zhì)粒pAL-781的物理圖及合成的多克隆位點(diǎn)圖8.三種interlinker的核苷酸序列及所編碼的氨基酸序列圖9.質(zhì)粒pALM的物理10.質(zhì)粒pET△E的物理11.質(zhì)粒pTMF的物理12.ELISA法檢測(cè)BsAb的抗卵巢癌活性圖13.抗卵巢癌雙特異性抗體對(duì)卵巢癌細(xì)胞的殺傷活性圖14.雙特異性抗體在pTMF中表達(dá)的SDS-PAGE電泳結(jié)果實(shí)施例(一)抗卵巢癌單鏈抗體和抗人CD3單鏈抗體的構(gòu)建(1)抗卵巢癌單鏈抗體的構(gòu)建選用根據(jù)小鼠免疫球蛋白FR1區(qū)和FR4區(qū)設(shè)計(jì)的引物，利用RT-PCR和PCR技術(shù)分別克隆了抗人卵巢癌單抗.COC183B2的重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因，平端克隆到質(zhì)粒pUC19，測(cè)序驗(yàn)證確為抗體可變區(qū)基因后，用相應(yīng)的限制酶切下這兩個(gè)基因，插入到本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的單鏈抗體表達(dá)質(zhì)粒pFUW80中，VH在5’端，VL在3’端，兩者之間的Linker為(Gly4Ser)3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株Top10，挑取轉(zhuǎn)化子，用酶切鑒定，確證已構(gòu)建成單鏈抗體基因，該質(zhì)粒命名為pFVB2，用陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XL1-blue，經(jīng)輔助噬菌體M13K07援救，表達(dá)出噬菌體單鏈抗體，用間接ELISA方法測(cè)定單鏈抗體活性。結(jié)果見(jiàn)待測(cè)值高于陰性對(duì)照2.5倍，說(shuō)明抗卵巢癌單鏈抗體已構(gòu)建和表達(dá)成功。(2)抗人CD3改形單鏈抗體的構(gòu)建根據(jù)鼠源抗人CD3單克隆抗體OKT3的抗原結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分子模擬和改型設(shè)計(jì)，分別得到改形CD3的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，參照大腸桿菌常用密碼子，得到其核苷酸序列，分別化學(xué)合成重鏈和輕鏈可變區(qū)的基因片段，通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增出完整的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。將得到的抗人CD3的改形后的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因插入到通用的單鏈抗體表達(dá)質(zhì)粒pROH80中，VL在5’端，VH在3’端，兩者之間的Linker為(Gly4Ser)3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株Top10，挑取轉(zhuǎn)化子，用酶切鑒定，確證已構(gòu)建成單鏈抗體基因，該質(zhì)粒命名為pROCD3。挑取轉(zhuǎn)化子的單菌落于含相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，按1-5％轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)基中，37℃搖至OD550為0.5-1.0，加入終濃度為0.4mM的IPTG誘導(dǎo)，使表達(dá)目的蛋白。用FACS法測(cè)定CD3改形單鏈抗體活性，結(jié)果測(cè)得CD3改形單鏈抗體對(duì)CD3單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)抑制率為18％，說(shuō)明抗人CD3改形單鏈抗體已構(gòu)建和表達(dá)成功。(二)抗人卵巢癌×抗人CD3雙特異性抗體的構(gòu)建和表達(dá)(1)雙特異性抗體中間載體的構(gòu)建為了便于兩個(gè)單鏈抗體和域間連接肽的插入，需構(gòu)建一個(gè)具有適當(dāng)酶切位點(diǎn)的表達(dá)載體，選擇不含目的蛋白基因的pAL-781作為構(gòu)建雙特異性抗體的初始載體。本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成了一段長(zhǎng)約55bp的片段，替換pAL-781原有的多克隆位點(diǎn)(MCS)，構(gòu)建了中間載體pALM。新的MCS中包括起始密碼子ATG(包括在Nde I酶切位點(diǎn)中)；抗卵巢癌單鏈抗體插入位點(diǎn)Xho I-EcoR I；域間連接肽插入位點(diǎn)EcoR I-Sac I；抗CD3改形單鏈抗體插入位點(diǎn)Sac I-BamH I；編碼6個(gè)His的(CATCAC)3片段及終止密碼子TAA。對(duì)其中的元件都可以通過(guò)酶切隨意置換。將合成并純化的三種域間連接肽片段插入到pALM中相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，經(jīng)酶切及測(cè)序驗(yàn)證，已構(gòu)建成含不同域間連接肽的ScBsAb中間載體pALM-Fc；pALM-HSA；pALM-205c’。(2)CD3-based ScBsAb通用表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，用PCR方法從改形CD3單鏈抗體表達(dá)質(zhì)粒中擴(kuò)增出帶有5’Sac I酶切位點(diǎn)和3’BamH I酶切位點(diǎn)的單鏈抗體基因，把此基因插入到雙特異性抗體中間載體，構(gòu)成抗人CD3-based ScBsAb通用表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株GI724，誘導(dǎo)表達(dá)，鑒定不同域間連接肽對(duì)單鏈抗體表達(dá)的影響。結(jié)果表明三種域間連接肽對(duì)單鏈抗體的表達(dá)均無(wú)影響。(3)雙特異性抗體的構(gòu)建從帶有抗人卵巢癌單鏈抗體基因的表達(dá)載體中，Xho I-EcoR I雙酶切下抗人卵巢癌單鏈抗體基因，把此基因插入到已構(gòu)成的抗人CD3-basedScBsAb通用表達(dá)載體中的相應(yīng)酶切位點(diǎn)即構(gòu)建成雙特異性抗體表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株GI724，獲得了轉(zhuǎn)化株，并通過(guò)了酶切鑒定，從而構(gòu)建完成了抗卵巢癌的雙特異性抗體的表達(dá)質(zhì)粒。該質(zhì)粒命名為pAMAB。(4)雙特異性抗體在大腸桿菌中的表達(dá)將含有pAMAB的GI724單菌落接種到RM培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過(guò)夜，再按20％濃度轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD550為0.5-1.0，加入終濃度為100ug/ml的色氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，收集菌液，離心(3000rpm，10min，4℃)，棄上清，菌體重懸于1/2體積的PBS中，冰浴超聲(20S，間隔1min，共6-8次)，4℃離心，12000rpm，20min，保留上清，沉淀重懸于等體積的PBS中，超聲后的全菌，上清，沉淀跑12％SDS-PAGE，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況，以空載體pALM為空對(duì)照，在分子量約52Kda處有一明顯的表達(dá)帶，上清液的相應(yīng)位置也有同樣的表達(dá)帶，說(shuō)明有一部分表達(dá)產(chǎn)物是以可溶形式表達(dá)的，因此，可以直接用上清液鑒定雙特異性抗體的生物活性。(三)抗人卵巢癌×抗人CD3雙特異性抗體生物活性的鑒定(1)抗人卵巢癌單鏈抗體的抗原結(jié)合活性用直接ELISA測(cè)定雙特異性抗體中抗卵巢癌單鏈抗體的抗原結(jié)合活性。用雙特異性抗體包被ELISA板，陽(yáng)性對(duì)照用抗卵巢癌單克隆抗體包被，4℃包被過(guò)夜，用PBST(PBS-Tween)洗板三次，每次浸潤(rùn)5分鐘，每孔都加入用3％羊血清稀釋好的HRP-OC183B2抗原，使抗原抗體結(jié)合，37℃保溫1小時(shí)，PBST洗板三次，加入HRP底物，室溫下避光顯色20分鐘，加入2M H2SO4終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)OD492的讀數(shù)。結(jié)果表明，雙特異性抗體待測(cè)值均高于陰性對(duì)照2.5倍以上，且有梯度變化，表明雙特異性抗體中抗卵巢癌單鏈抗體具有與卵巢癌相關(guān)抗原結(jié)合的能力。
(2)抗人CD3改形單鏈抗體的抗原結(jié)合活性利用競(jìng)爭(zhēng)抑制的原理，用FACS測(cè)雙特異性抗體中抗人CD3改形單鏈抗體的抗原結(jié)合活性。在FACS管中，每管加入新鮮的Jurkat細(xì)胞1×106個(gè)，用含2％小牛血清和0.1％NaN3的PBS洗細(xì)胞三次，加入雙特異性抗體樣品，陽(yáng)性對(duì)照中加入PBS，4℃保溫45分鐘，用含2％小牛血清和0.1％NaN3的PBS洗細(xì)胞三次，加入適當(dāng)稀釋的CD3鼠源單抗，4℃保溫30分鐘，用含2％小牛血清和0.1％NaN3的PBS洗細(xì)胞三次，加入羊抗小鼠IgG-FITC(1∶50)，4℃避光保溫45分鐘，用含2％小牛血清和0.1％NaN3的PBS洗細(xì)胞兩次，細(xì)胞沉淀重懸于500ul的PBS中，在FACSort上進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，雙特異性抗體能夠顯著抑制CD3鼠源單抗的抗原結(jié)合活性，抑制率為18％，證明雙特異性抗體中的CD3改形單鏈抗體具有與相應(yīng)抗原結(jié)合的能力。因此，本發(fā)明所構(gòu)建的三種不同域間連接肽的雙特異性抗體中兩個(gè)單鏈抗體都保持了與相應(yīng)抗原的結(jié)合能力。(3)抗卵巢癌雙特異性抗體對(duì)卵巢癌細(xì)胞的殺傷活性將卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞(靶細(xì)胞)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100ul(約1×104個(gè)細(xì)胞)，雙特異性抗體包涵體復(fù)性樣品按三種不同量5ul，10ul，20ul加樣，在CO2孵箱中過(guò)夜，按不同效靶比加入Jurkat細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)，37℃，CO2孵箱培養(yǎng)48小時(shí)，每孔加入25ul MTT，再于37℃，CO2孵箱培養(yǎng)4小時(shí)，倒掉孔內(nèi)液體，每孔加入100ul酸性SDS(0.1NHCl，1％SDS)，37℃，孵育過(guò)夜，用酶標(biāo)儀測(cè)OD570。按如下公式計(jì)算細(xì)胞殺傷率。 如圖13所示，加雙特異性抗體后，效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率提高，且隨雙特異性抗體量的增加殺傷率也提高，說(shuō)明雙特異性抗體能夠引導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的定向殺傷。(四)高效表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)由于pALM的表達(dá)量不高，不適用于生產(chǎn)，需構(gòu)建一個(gè)高效表達(dá)雙特異性抗體的質(zhì)粒。以具有T7啟動(dòng)子的pET16失活EcoR I位點(diǎn)得到的pET△E，是一個(gè)高效的表達(dá)載體，用Xho I-BamH I從pAMAB中切下雙特異性抗體的基因，插入到經(jīng)同樣雙酶切的pET△E中即構(gòu)成pEMAB，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，誘導(dǎo)使其高表達(dá)目的蛋白。但由于在pET△E中目的蛋白與(His)10融合表達(dá)，而(His)10用IMAC(固定金屬螯合層析)的純化效率不如(His)6，故而，又以pET28a為背景質(zhì)粒構(gòu)建了質(zhì)粒pTMF，該質(zhì)粒具有T7啟動(dòng)子，可高效表達(dá)目的蛋白，同時(shí)，具有多種較稀少的酶切位點(diǎn)，便于插入各種外源基因使它們或共表達(dá)或成融合表達(dá)；在兩組酶切位點(diǎn)之間有一凝血酶的酶切位點(diǎn)，可將表達(dá)的融合蛋白純化后分開(kāi)；在多克隆位點(diǎn)的3’端有編碼六個(gè)組氨酸的密碼子，便于表達(dá)產(chǎn)物作金屬鰲合層析純化。
用Xho I-BamH I從pAMAB中切下雙特異性抗體的基因，插入到經(jīng)同樣雙酶切的pTMF中即構(gòu)成pTMAB，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)篩選和酶切鑒定后，挑選單克隆，培養(yǎng)至OD550為0.5，加入終濃度為0.4mM的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，3小時(shí)后收菌，超聲破菌，跑SDS-PAGE電泳。雙特異性抗體的表達(dá)量占菌體總蛋白的27％，其中以可溶形式表達(dá)的雙特異性抗體占可溶性蛋白的16％，這一表達(dá)量已能用于生產(chǎn)。(五)結(jié)論所構(gòu)建的抗人卵巢癌×抗人CD3雙特異性抗體具有同時(shí)結(jié)合T細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞并激活T細(xì)胞特異性殺傷卵巢癌細(xì)胞的功能，可發(fā)展成為卵巢癌的生物治療藥物。
權(quán)利要求
1.一種抗卵巢癌的雙特異性抗體，它是由抗卵巢癌的抗體，或其Fab片段、單域抗體或單鏈抗體；和抗人CD3的抗體或其Fab片段、單域抗體或單鏈抗體連接而成的。
2.按照權(quán)利要求1所述的雙特異性抗體，它是由抗卵巢癌的單鏈抗體，抗人CD3的單鏈抗體，且是經(jīng)過(guò)人源化改造后的改形抗體連接而成的。
3.按照權(quán)利要求2所述的雙特異性抗體，其特征在于，所述的抗卵巢癌的單鏈抗體具有如下的重鏈可變區(qū)氨基酸序列1 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu11 Val Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Arg Ile21 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr31 Thr Ala Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Met41 Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Leu Gly Trp51 Ile Asn Thr Asn Ser Glu Val Pro Lys Tyr61 Ala Glu Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe71 Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr81 Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp91 Thr Ala Thr Phe Phe Cys Ala Arg Ser Phe101 Thr Trp Gly Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln111 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
4.按照權(quán)利要求2所述的雙特異性抗體，其特征在于，所述的抗卵巢癌的單鏈抗體具有如下的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列1 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser11 Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser21 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Leu Val31 His Ser Ile Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp41 Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys51 Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe61 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser71 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile81 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val91 Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro101 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu111 Leu Lys
5.按照權(quán)利要求2所述的雙特異性抗體，其特征在于，所述的抗人CD3的改形單鏈抗體具有如下的重鏈可變區(qū)氨基酸序列1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu11 Val Arg Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg Val21 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr31 Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala41 Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr51 Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr61 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met71 Thr Thr Asp Lys Ser Phe Ser Thr Ala Ile81 Met Asp Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp91 Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr101 Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly111 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
6.按照權(quán)利要求2所述的雙特異性抗體，其特征在于，所述的抗人CD3的改形單鏈抗體具有如下的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列1 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr11 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr21 Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser31 Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly41 Gln Ala Pro Arg Arg Trp Ile Tyr Asp Thr51 Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg61 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe71 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu81 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp91 Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly101 Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
7.按照權(quán)利要求2所述的雙特異性抗體，其特征在于，連接兩個(gè)單鏈抗體的域間連接肽具有如下的氨基酸序列1 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu11 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly21 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
8.按照權(quán)利要求2所述的雙特異性抗體，其特征在于，連接兩個(gè)單鏈抗體的域間連接肽具有如下的氨基酸序列1 Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr11 Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr21 Leu Val Glu Val Ser
9.按照權(quán)利要求2所述的雙特異性抗體，其特征在于，連接兩個(gè)單鏈抗體的域間連接肽具有如下的氨基酸序列1 Ala Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala11 Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Asp21 Ala Lys Lys Asp Leu
10.一種編碼權(quán)利要求1至9中任何一項(xiàng)所述的雙特異性抗體的核苷酸序列。
11.一種含有權(quán)利要求10所述序列的表達(dá)載體。
12.按照權(quán)利要求11所述的載體，它是pALM。
13.按照權(quán)利要求11所述的載體，它是pET△E。
14.按照權(quán)利要求11所述的載體，它是pTMF。
15.一種含有權(quán)利要求11中所述的載體的宿主細(xì)胞。
16.按照權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞，它是大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗卵巢癌的雙特異性抗體,它是由抗卵巢癌的抗體,或其Fab片段、單域抗體或單鏈抗體;和抗人CD3的抗體,或其Fab片段、單域抗體或單鏈抗體連接而成的。本發(fā)明還提供了編碼這種抗體的DNA序列,含有這種DNA序列的表達(dá)載體和含有這種表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1388136SQ0111824
公開(kāi)日2003年1月1日 申請(qǐng)日期2001年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月24日
發(fā)明者黃華樑, 蔣欣, 方敏, 馮捷, 周萍, 余小淙, 林晴 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所, 北京安波特基因工程技術(shù)有限公司