專(zhuān)利名稱(chēng)：卵巢癌的檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域。更具體的，本發(fā)明涉及鑒別真核起始抑制5A2(eIF-5A2)的擴(kuò)增，該擴(kuò)增是多種癌癥的良好診斷指示物。此外，本發(fā)明還提供了對(duì)eIF-5A2特異的探針和試劑盒。
卵巢癌是婦女泌尿生殖癌癥中主要的導(dǎo)致死亡的病因，約1％美國(guó)婦女在其一生中受到卵巢癌的影響。如果沒(méi)有被早期診斷的話(huà)，卵巢癌的預(yù)后很差，五年生存率不到10％。與其他一些實(shí)體瘤相比，人們至今對(duì)卵巢癌的分子發(fā)病機(jī)理及其發(fā)展過(guò)程了解甚少。
染色體異常通常與遺傳疾病、退化性疾病和癌癥相關(guān)。具體地，整個(gè)染色體或染色體片斷拷貝的缺失或復(fù)制，以及基因組特定區(qū)域的更高等級(jí)的擴(kuò)增，通常發(fā)生于癌癥中。事實(shí)上，含有原癌基因和腫瘤抑制基因的DNA序列的擴(kuò)增和缺失經(jīng)常是腫瘤發(fā)生所特有的。很明顯，對(duì)擴(kuò)增和缺失區(qū)域的鑒定以及對(duì)相關(guān)基因的克隆，對(duì)于研究腫瘤發(fā)生和開(kāi)發(fā)癌癥診斷技術(shù)都是至關(guān)重要的。
檢測(cè)擴(kuò)增或缺失的染色體區(qū)域，通常通過(guò)細(xì)胞遺傳學(xué)進(jìn)行。因?yàn)镈NA經(jīng)復(fù)雜折疊形成染色體，因此細(xì)胞遺傳技術(shù)的分辨率被局限于大于約10MB的區(qū)域；這幾乎是Giemsa染色的染色體中條帶的寬度。在復(fù)雜的具有多個(gè)轉(zhuǎn)座和其他遺傳變化的核型中傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳分析方法的用途很有限，因?yàn)槿狈诵托畔⒒螂y以被解釋。此外常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)條帶分析法是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的，而且經(jīng)常十分困難或不可能。
最近，克隆探針已用于通過(guò)Southern印跡法評(píng)估給定DNA序列在染色體中的數(shù)量。即使在基因組是高度重排，以致于消除有用的核型信息的情況下，該方法也是有效的。然而Southern印跡法僅僅給出了有關(guān)DNA序列拷貝數(shù)的大致估算并不能給出該序列在染色體中位置的任何信息。
比較染色體雜交法(CGH)是更新的一種鑒別擴(kuò)增/缺失序列存在與否及其位置的方法。與Southern印跡法一樣，CGH可揭示擴(kuò)增和缺失，而不受基因組重排的影響。此外，CGH提供了比Southern印跡法更定量的對(duì)拷貝數(shù)的估計(jì)，而且還可以提供擴(kuò)增或缺失序列在正常染色體中的位置信息。
最近，用比較基因組雜交技術(shù)(CGH)，在原發(fā)性卵巢癌中鑒別出了3q25-qter中的一個(gè)頻繁擴(kuò)增的區(qū)域。最小的重迭擴(kuò)增區(qū)被定位于3q26。
鑒別出經(jīng)常擴(kuò)增的染色體區(qū)域以及所述區(qū)域中相應(yīng)癌基因，對(duì)于了解腫瘤發(fā)生的分子機(jī)理是絕對(duì)必要的。最近，編碼磷脂酰肌醇3-激酶的催化亞基的PIK3CA，已被暗示是3q26區(qū)的候選癌基因(Shayesteh，L.，et al.，Nat.Genet.，2199-102，1999)。因?yàn)樵谝恍┎±袃H有低水平的PIK3CA擴(kuò)增，并且卵巢癌細(xì)胞系UACC-1598在3q26區(qū)含有高水平的雙微體形式的擴(kuò)增(Brooks，D.J.，etal.，Br.J.Cancer，741518-1525，1996)，所以在該區(qū)域可能還有另一癌基因。
因此，本領(lǐng)域迫切需要尋找與卵巢癌有關(guān)的癌基因，尤其是在3q26區(qū)中的癌基因。然而，在本申請(qǐng)之前，還沒(méi)有報(bào)道并證實(shí)過(guò)其他與卵巢癌有關(guān)的癌基因。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測(cè)人染色體異常的方法，它包括步驟在探針與靶序列會(huì)形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將待測(cè)對(duì)象的染色體樣品與含有一種或多種核酸探針的組合物接觸，其中所述的探針含有全長(zhǎng)eIF-5A2或其片段的核苷酸序列；和檢測(cè)所述的雜交復(fù)合體。
較佳地，所述的檢測(cè)雜交復(fù)合體的步驟包括檢測(cè)靶序列的拷貝數(shù)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，所述的檢測(cè)雜交復(fù)合體是通過(guò)檢測(cè)熒光標(biāo)記物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，所述的染色體異常是擴(kuò)增。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，所述的全長(zhǎng)eIF-5A2及其片段包括DNA、cDNA和反義DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種檢測(cè)癌癥的試劑盒，它包括標(biāo)記的核酸探針，該探針可特異性地結(jié)合于人eIF-5A2的核苷酸序列，且該核酸含有全長(zhǎng)eIF-5A2及其片段的核苷酸序列。
較佳地，所述的試劑盒還含有對(duì)染色體3的端粒序列特異的參照探針。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種檢測(cè)腫瘤或腫瘤易感性的方法，將含有全長(zhǎng)eIF-5A2或其片段的核苷酸序列的探針，與待測(cè)個(gè)體的DNA樣品進(jìn)行雜交；和檢測(cè)形成的雜合體數(shù)目是否高于正常對(duì)照，其中形成的雜合體數(shù)目是否高于正常對(duì)照就表示該個(gè)體患有腫瘤或腫瘤易感性高于正常人群。
較佳地，所述的腫瘤選自下組卵巢癌、鼻咽癌、前列腺癌和輸卵管癌。
在本發(fā)明的又一方面，提供了一種檢測(cè)腫瘤或腫瘤易感性的方法，它包括步驟在適合形成抗體復(fù)合物的條件下，將含有特異性抗eIF-5A2蛋白的抗體與待測(cè)個(gè)體的DNA樣品進(jìn)行接觸；和檢測(cè)形成的抗體復(fù)合物數(shù)量是否高于正常對(duì)照，其中形成的抗體復(fù)合物數(shù)量高于正常對(duì)照就表示該個(gè)體患有腫瘤或腫瘤易感性高于正常人群。


圖1A，用CGH檢測(cè)出的3q25-q26在兩例原發(fā)性卵巢癌中的擴(kuò)增情況。腫瘤DNA和正常參照DNA用綠色和紅色標(biāo)出。B，將顯微解剖的3q26 DNA與正常的中期染色體雜交(顯示了部分中期)。C，G-條帶化的部分中期，其中箭頭指向3q26.2處的雜交。D，與圖1C相同的部分中期，然后用含eIF-5A2的BAC克隆(紅色)進(jìn)行FISH，位于3q26.2。
圖2推導(dǎo)的人eIF-5A2氨基酸序列與人eIF-5A以及雞eIF-5A的序列排列。相同的序列用黑色標(biāo)出。8-羥-2，7，10-三氨基癸酸(hppusine)修飾所需的eIF-5A的最小區(qū)域用框線(xiàn)標(biāo)出。星號(hào)表示在翻譯后被修飾成8-羥-2，7，10-三氨基癸酸的賴(lài)氨酸殘基。
圖3用Southern印跡法(圖3A)和用外顯子(204bp)內(nèi)的引物進(jìn)行PCR(圖3B)證實(shí)了BAC克隆含有eIF-5A2基因?；蚪MDNA是從正常胎盤(pán)制備的，而B(niǎo)AC克隆用EcoRI消化并與eIF-5A2 cDNA雜交。圖3C，用RT-PCR檢測(cè)eIF-5A2在6種正常組織中的表達(dá)。
圖4A，Southern印跡法顯示eIF-5A2在5種原發(fā)性卵巢癌和卵巢癌細(xì)胞系UACC-1598中有擴(kuò)增。15mg經(jīng)EcoRI消化的DNA，在0.8％瓊脂糖凝膠中分離并與1.2kb eIF-5A2 cDNA探針雜交。針對(duì)β-肌動(dòng)蛋白的探針被用作對(duì)照。
B，對(duì)4種原發(fā)性卵巢癌和UACC-1598的Northern印跡分析。在每個(gè)泳道中上樣10mg總RNA，并與1.2kb eIF-5A2 cDNA探針雜交。對(duì)于Northern印跡，將溴化乙錠染色的RNA分離凝膠作為對(duì)照。
圖5在兩個(gè)卵巢癌細(xì)胞系中用FISH檢測(cè)到的eIF-5A2擴(kuò)增。A，將含eIF-5A2的BAC克隆與卵巢癌細(xì)胞系UACC-1598中的雙微體進(jìn)行雜交。B，在卵巢癌細(xì)胞系OVACA3中觀察到6個(gè)拷貝的eIF-5A2。C，eIF-5A2被定位于3q26.2中的最小重迭擴(kuò)增區(qū)。
在本發(fā)明人的CGH研究中，在15/30(50％)原發(fā)性卵巢癌中檢測(cè)到3q擴(kuò)增(gain)。在4個(gè)病例(OV-4，OV-7，OV-13和OV27)中觀察到3q26中最小重迭區(qū)中3q的高拷貝擴(kuò)增。3q擴(kuò)增還經(jīng)常見(jiàn)于其他一些實(shí)體瘤，如鼻咽癌、前列腺癌和輸卵管癌等。這些研究強(qiáng)烈表明，在3q26區(qū)可能含有與各種實(shí)體瘤(包括卵巢癌)的發(fā)病和發(fā)展有關(guān)的癌基因。
本發(fā)明人利用eIF-5A2的DNA序列從細(xì)菌人工染色體(BAC)庫(kù)篩選出一個(gè)攜帶eIF-5A2的BAC克隆(PP11-115J24)，并應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)將其定位在3號(hào)染色體長(zhǎng)臂3q26帶。通過(guò)用Southern印跡和Northern印跡技術(shù)檢測(cè)，證明eIF-5A2在我們用CGH檢測(cè)的3q26帶擴(kuò)增的卵巢癌中都有不同程度的DNA擴(kuò)增及RNA過(guò)高表達(dá)。特別是在一種帶有雙微體(DM)的卵巢癌細(xì)胞株(UACC-1598)中，帶有eIF-5A2的BAC克隆雜交到雙微體上。雙微體是一種染色體外的小片段DNA，被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞中基因擴(kuò)增在細(xì)胞學(xué)上的表現(xiàn)之一。UACC-1598已被證實(shí)來(lái)自3q26帶。所以，eIF-5A2可被認(rèn)為是該例卵巢癌最主要的致癌相關(guān)基因之一。
eIF-5A2基因用于惡性腫瘤的臨床診斷和預(yù)后 本發(fā)明人利用組織芯片技術(shù)對(duì)近200例原發(fā)性卵巢癌患者進(jìn)行eIF-5A2擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)eIF-5A2的擴(kuò)增與卵巢癌的預(yù)后密切相關(guān)。被檢出有eIF-5A2擴(kuò)增的病人，其5年生存率明顯低于無(wú)eIF-5A2擴(kuò)增的病人。所以，eIF-5A2擴(kuò)增與否可以作為判斷卵巢癌病人預(yù)后的重要指標(biāo)之一。此外，由于3q擴(kuò)增常見(jiàn)于鼻咽癌、前列腺癌和食道癌等惡性腫瘤，所以，eIF-5A2擴(kuò)增還可作為這些腫瘤預(yù)后的依據(jù)之一。
定義如本文所用，“染色體樣品”指制備的用于標(biāo)準(zhǔn)原位雜交的組織或細(xì)胞樣品。在制備的該樣品中各個(gè)染色體基本保持完好并且通常含有根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備的分裂中期的擴(kuò)展(spread)和間期核。
“核酸”指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。除非另外說(shuō)明該術(shù)語(yǔ)已包括能夠與天然核苷酸類(lèi)似方式發(fā)揮作用的天然核苷酸的類(lèi)似物。
“亞序列”指含有更長(zhǎng)序列核酸中一部分核酸的核酸序列。
“探針”或“核酸探針”指一種或多種核酸片斷的集合，可檢測(cè)它們與靶目標(biāo)的雜交。探針被如下所述的標(biāo)記，使得可檢測(cè)它與靶目標(biāo)的結(jié)合。探針是用一種或多種特定部分的基因組制備的，例如一種或多種克隆分離的完整染色體或染色體片斷或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物。探針可以用某種方式進(jìn)行加工，例如通過(guò)封閉或去除重復(fù)的核酸或富含獨(dú)特的核酸。因此術(shù)語(yǔ)“探針”不僅指可檢測(cè)的核酸，還指應(yīng)用于靶目標(biāo)的可檢測(cè)核酸。
“雜交”指通過(guò)互補(bǔ)堿基的配對(duì)而使兩個(gè)單鏈核酸結(jié)合在一起。
“基本結(jié)合于”或“特異結(jié)合”或“選擇性結(jié)合”或“特異性雜交于”，指在寡核苷酸和靶序列之間的互補(bǔ)雜交反應(yīng)，并可包括微小的錯(cuò)配，這些錯(cuò)配可通過(guò)降低雜交介質(zhì)的嚴(yán)緊度來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)所需靶多核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還指在嚴(yán)緊條件下，一分子結(jié)合、復(fù)合或雜交與特定核苷酸序列，當(dāng)該序列存在于復(fù)合的混合物中(如總細(xì)胞NDA或RNA)時(shí)。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)緊條件”指探針雜交于靶定亞序列而不雜交于其他序列的條件。嚴(yán)緊條件是依賴(lài)于序列的，并且在不同情況下是不同的。較長(zhǎng)的序列可在更高的溫度下特異性雜交。通常，選定的嚴(yán)緊條件是比在限定的離子強(qiáng)度和pH下推定序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5℃。該Tm是在達(dá)到平衡時(shí)，有約50％與靶序列互補(bǔ)的探針與靶序列雜交時(shí)的溫度(在限定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)。通常，對(duì)于短探針而言，嚴(yán)緊條件是這樣的條件，其中鹽濃度至少約0.02Na離子濃度(或其他鹽)，pH7.0-8.3，且溫度至少約60℃。嚴(yán)緊條件還可通過(guò)添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺而實(shí)現(xiàn)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，此處所述的具體探針的確切序列可以被一定程度地修改(修飾)，以產(chǎn)生與所公開(kāi)的探針“基本相同”但保留基本結(jié)合于靶序列能力的探針。這些修改被本文各探針?biāo)采w。術(shù)語(yǔ)多核苷酸的“基本相同”指，與參照序列相比，一個(gè)序列有至少90％，更佳地至少95％序列相同性。
兩個(gè)核苷酸序列被認(rèn)為“相同”，如果以最大對(duì)應(yīng)性排列時(shí)，兩個(gè)序列中的核苷酸序列是相同的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”指互補(bǔ)序列與參照序列的全部或一部分是序列的。
兩個(gè)(或多個(gè))多核苷酸之間的序列比較，通常是將兩個(gè)序列的序列在“比較窗”范圍內(nèi)進(jìn)行比較，以鑒別和比較局部區(qū)域的序列相同性。如本文所用，“比較窗”指至少約20個(gè)鄰接位置，通常約50-200，更通常約為100-150個(gè)鄰接位置，其中在兩個(gè)序列被最佳排列后，將一個(gè)序列與具有相同數(shù)目鄰接位點(diǎn)的參照序列進(jìn)行比較。
“序列相同性百分比”的確定，是通過(guò)將兩個(gè)最佳排列的序列在比較窗內(nèi)進(jìn)行比較而得出的。其中與參照序列(不含有插入或缺失)相比，為了獲得兩個(gè)序列的最佳排列，在比較窗中的多核苷酸序列可含有插入或缺失(即缺口)。百分比的計(jì)算如下通過(guò)確定在兩個(gè)序列中相同核酸堿基或氨基酸殘基的數(shù)目，得到匹配位置的數(shù)目。然后將匹配位置數(shù)目除以比較窗中位置數(shù)目的總數(shù)，并將結(jié)果乘以100％，從而得到序列相同性百分比。
另一種表明核苷酸序列是基本相同的方法，是判斷兩個(gè)分子是否在嚴(yán)緊條件下雜交于同一序列。嚴(yán)緊條件是依賴(lài)于序列的，并且在不同情況下是不同的。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，使用本文所公開(kāi)的序列信息和克隆，技術(shù)人員可以通過(guò)常規(guī)方法(如Southern或Northern印跡法)，從人基因組文庫(kù)中分離相同或相似的探針。
探針的標(biāo)記標(biāo)記核酸探針的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。優(yōu)選的探針是適用于原位雜交的探針。在雜交反應(yīng)之前，核酸探針可以被可檢測(cè)地標(biāo)記?；蛘?，使用結(jié)合于雜交產(chǎn)物的可檢測(cè)標(biāo)記物。這些可檢測(cè)標(biāo)記物是本領(lǐng)域熟知的，并且包括任何具有可檢測(cè)的物理或化學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)。
如本文所用，“標(biāo)記物”是任何一種可通過(guò)光譜法、光電法、生物化學(xué)法、免疫化學(xué)法、或化學(xué)法檢測(cè)的物質(zhì)。可用于本發(fā)明的標(biāo)記物包括放射性標(biāo)記物(如32P，125I，14C，3H，35S)，熒光染料(如熒光素、羅丹明)，電子致密試劑(如)金，酶(如ELISA中常用的酶)，比色標(biāo)記(如膠體金)，磁標(biāo)記(如DynabeadsTM)等。不直接檢測(cè)但可通過(guò)使用直接檢測(cè)標(biāo)記物而被檢測(cè)的標(biāo)記物例子，包括生物素、地高辛、以及已有標(biāo)記抗血清或單抗的半抗原和蛋白質(zhì)。
使用具體的標(biāo)記物對(duì)于本發(fā)明而言并不重要，只要它不干擾原位雜交的染色。然而，對(duì)于染色體雜交而言，用熒光標(biāo)記物(如熒光素-12-dUTP等)進(jìn)行直接染色是優(yōu)選的。
如本文所用，直接標(biāo)記的探針是附著有可檢測(cè)標(biāo)記物的探針。因?yàn)橹苯訕?biāo)記物已附著在探針上，因此隨后不需要步驟將探針與可檢測(cè)標(biāo)記物關(guān)聯(lián)起來(lái)。與之相反，間接標(biāo)記的探針是攜帶隨后(通常在探針與靶核酸雜交后)能結(jié)合可檢測(cè)標(biāo)記物的分子的探針。
此外，探針應(yīng)能檢測(cè)盡可能低的拷貝數(shù)，從而使分析的靈敏度最高，同時(shí)又能高于背景信號(hào)。最后，必需選擇可提供高局部信號(hào)的探針，從而在將染色結(jié)果與染色體進(jìn)行物理定位時(shí)可提供高空間分辨率，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法，將標(biāo)記物偶聯(lián)于探針。在優(yōu)選例子中，核酸探針是用缺口翻譯或隨機(jī)引物延伸法標(biāo)記的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，本發(fā)明的探針沒(méi)有必要對(duì)eIF-5A2絕對(duì)特異。相反，探針是用于產(chǎn)生“染色反差”的?！胺床睢笔怯稍诨蚪M靶區(qū)域中探針濃度與基因組其他區(qū)域中探針濃度之比確定的。
如上所述，檢測(cè)到eIF-5A2的擴(kuò)增是多種癌癥存在與否以及預(yù)后的標(biāo)志。這些癌癥包括(但并不限于)卵巢癌、鼻咽癌、前列腺癌和輸卵管癌。
在優(yōu)選實(shí)施例中，通過(guò)將本發(fā)明的探針與靶核酸(如染色體樣品)的雜交來(lái)檢測(cè)eIF-5A2的擴(kuò)增。合適的雜交方式是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括(但并不限于)各種Southern印跡法、原位雜交和定量擴(kuò)增方法(如定量PCR)。
在一優(yōu)選例中，eIF-5A2擴(kuò)增是通過(guò)原位雜交鑒別的。通常，原位雜交包括下列主要步驟(1)固定待分析的組織或生物結(jié)構(gòu)；(2)對(duì)生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)雜交以增加靶DNA的可接近性(acessibility)，并減少非特異性結(jié)合；(3)將核酸混合物與生物結(jié)構(gòu)或組織中的核酸進(jìn)行雜交；(4)進(jìn)行雜交后的洗滌以去除在雜交反應(yīng)中未雜交的核酸；和(5)檢測(cè)雜交的核酸片段。根據(jù)具體應(yīng)用，用于每一步驟的試劑及使用條件可以變化。
用于檢測(cè)染色體異常的FISH法，可用于納克數(shù)量的有關(guān)核酸。可以使用石蠟包埋的腫瘤切片，以及新鮮或冷凍的樣品。因?yàn)镕ISH可用于數(shù)量有限的材料，因此可使用從未培養(yǎng)的原發(fā)性腫瘤所制備接觸式制品(touch preparation)。例如，可使用來(lái)自腫瘤的少量活檢樣品以制備接觸式制品。還可以分析來(lái)自少量針吸活檢樣品或體液(如血液、尿液等)中的細(xì)胞。對(duì)于產(chǎn)前診斷，合適的樣品包括羊水等。
在Southern印跡法中，基因組或cDNA(通常是片段化并用電泳凝膠分離)與對(duì)靶區(qū)域特異的探針雜交。將來(lái)自針對(duì)靶區(qū)域的探針的雜交信號(hào)強(qiáng)度，與針對(duì)多種(非擴(kuò)增的)如著絲粒DNA的探針的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較，從而提供靶核酸的相對(duì)拷貝數(shù)的估測(cè)值。
eIF-5A2核酸、蛋白和抗體基于本發(fā)明所揭示的eIF-5A2與卵巢癌的相關(guān)性以及eIF-5A2的序列信息，利用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)來(lái)產(chǎn)生eIF-5A2蛋白或片段，并用相應(yīng)的eIF-5A2蛋白或片段來(lái)產(chǎn)生抗eIF-5A2的抗體。
本發(fā)明的人eIF-5A2核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中的各種DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明蛋白的片段除了可用重組法產(chǎn)生之外，還可用固相技術(shù)通過(guò)直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來(lái)自動(dòng)合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人eIF-5A2 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人eIF-5A2基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人eIF-5A2基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人eIF-5A2蛋白的分子，也包括那些并不影響人eIF-5A2蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人eIF-5A2基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來(lái)自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人eIF-5A2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人eIF-5A2或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來(lái)免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類(lèi)單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人eIF-5A2功能的抗體以及不影響人eIF-5A2功能的抗體。本發(fā)明的各類(lèi)抗體可以利用人eIF-5A2基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過(guò)常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人eIF-5A2基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而獲得。
基于特異性的抗eIF-5A2抗體，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)腫瘤或腫瘤易感性的方法，它包括步驟在適合形成抗體復(fù)合物的條件下，將含有特異性抗eIF-5A2蛋白的抗體與待測(cè)個(gè)體的DNA樣品進(jìn)行接觸；和檢測(cè)形成的抗體復(fù)合物數(shù)量是否高于正常對(duì)照，其中形成的抗體復(fù)合物數(shù)量高于正常對(duì)照就表示該個(gè)體患有腫瘤或腫瘤易感性高于正常人群。
試劑盒本發(fā)明還提供了診斷eIF-5A2異常的診斷試劑盒。在優(yōu)選例中，一種試劑盒包括一種或多種針對(duì)eIF-5A2的探針。該試劑盒還可含有封閉探針以及描述如何使用試劑盒來(lái)檢測(cè)eIF-5A2的說(shuō)明材料。試劑盒還可含有下組中的一種或多種用于協(xié)助檢測(cè)探針的各種標(biāo)記物或標(biāo)記試劑；用于雜交的試劑(包括緩沖液、中期鋪展劑(metaphase spread)，BSA和其他封閉試劑)；采樣裝置，包括細(xì)針頭等；以及陽(yáng)性和陰性雜交對(duì)照等。
與現(xiàn)行用于惡性腫瘤臨床診斷和預(yù)后的其他方法比較，本發(fā)明的優(yōu)越性主要表現(xiàn)在鑒于eIF-5A2與卵巢癌的密切相關(guān)性，本發(fā)明方法在檢出的靈敏度，準(zhǔn)確性都顯著優(yōu)于現(xiàn)有的卵巢癌基因診斷方法，不僅填補(bǔ)了檢測(cè)的盲區(qū)，而且操作簡(jiǎn)便。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例材料腫瘤樣品和細(xì)胞系原發(fā)性卵巢癌樣品是在手術(shù)時(shí)通過(guò)癌癥研究所(中國(guó)，廣州)獲得。卵巢癌細(xì)胞系UACC-1588和UACC-2727是從University of Arizona Comprehensive CancerCenter的Tissue Culture Core Serivce處獲得。
卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3是從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得。
方法染色體顯微解剖染色體顯微解剖和顯微解剖的DNA的PCR擴(kuò)增，按Guan，X.-Y.et al.，Hum.Mol.Genet.，21117-1121，1993中所述的方法進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，從正常中期染色體的G-條帶中解剖出5個(gè)拷貝的3q26條帶。解剖的DNA片段用拓?fù)洚悩?gòu)酶I處理，然后用UN1引物(5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
cDNA合成和文庫(kù)構(gòu)建根據(jù)制造商(RiboClone cDNA Synthesis System，Promega)的方案，在噬菌體1GEM4中構(gòu)建隨機(jī)引發(fā)的cDNA文庫(kù)。對(duì)于雜交體(雜交復(fù)合體)選擇，用SMARTPCR cDNA Library構(gòu)建試劑盒(Clontech)，從OV-4 mRNA制備隨機(jī)引物合成的cDNA。
雜交體選擇按Guan，X.-Y.et al.，Cancer Res.，563446-3450，1996中所述的方法進(jìn)行雜交體選擇。該方法是使用隨機(jī)引物從含3q26擴(kuò)增的卵巢癌OV-4合成的cDNA，從而從顯微解剖的3q26 DNA片段中選出編碼區(qū)序列。簡(jiǎn)而言之，將5mg隨機(jī)引物延伸的cDNA固定在直徑7mm的尼龍膜上，并與從3q26區(qū)顯微解剖DNA片段擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物，在200毫升雜交溶液(5XSSC，5X Denhardt′s溶液，0.1％SDS，100mg/ml鮭精DNA，和100mg/ml人Cot-1 DNA)中，于65℃和輕微晃動(dòng)下雜交過(guò)夜。在嚴(yán)緊洗滌后，對(duì)雜交的顯微解剖DNA進(jìn)行洗脫，并用PCR回收。
cDNA文庫(kù)篩選將PCR回收的、選定的DNA片段(100ng)，通過(guò)隨機(jī)引物法(Gibco BRL)用32P進(jìn)行標(biāo)記，然后在Sephadex G50上純化。將探針與100mg人Cot-1 DNA在65℃預(yù)雜交1小時(shí)，然后用標(biāo)準(zhǔn)方法與cDNA文庫(kù)噬斑進(jìn)行雜交。
染色體定位將通過(guò)BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)檢索而選出的BAC克隆，用光譜橙-dUTP(Spectrum-orange-dUTP)(Gibco BRL)，通過(guò)缺口翻譯法進(jìn)行標(biāo)記。然后按Guan，X.-Y.et al.，Cancer Res.，563446-3450，1996中所述，用FISH法將標(biāo)記的探針與預(yù)條帶化(prebanded)的正常淋巴細(xì)胞中期染色體雜交。
Southern和Northern印跡分析將來(lái)自人胎盤(pán)、原發(fā)性卵巢癌樣品、和卵巢癌細(xì)胞系的基因組DNA，用SDS/酚/氯仿法進(jìn)行分離。用EcoRI消化DNA，然后在1％瓊脂糖凝膠上分級(jí)，再轉(zhuǎn)移至尼龍膜(Zeta-probe，Bio-Rad)，與32P標(biāo)記的針對(duì)eIF-5A2和PIK3CA基因的探針，在42℃雜交過(guò)夜。用Trizol/氯仿法制備總細(xì)胞RNA，在1％瓊脂糖/2.2M甲醛凝膠上進(jìn)行大小分級(jí)，再轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，與32P標(biāo)記的針對(duì)eIF-5A2和PIK3CA基因的探針進(jìn)行雜交。
FISH探針的制備和FISH實(shí)驗(yàn)方法1.隨機(jī)引物標(biāo)記法(BioPrime DNA Labeling System)此方法使用隨機(jī)引物來(lái)標(biāo)記DNA分子，通過(guò)標(biāo)記反應(yīng)可以產(chǎn)生數(shù)倍于初始DNA量的標(biāo)記探針。因此，此標(biāo)記法特別適用于僅有少量DNA的標(biāo)記，如BAC和PAC的DNA標(biāo)記。另外，如DNA的純度不高(如含太多RNA)，則容易產(chǎn)生較多的非特異信號(hào)，故此標(biāo)記法對(duì)DNA的純度要求較高。一般可以使用LifeTechnologies公司的隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒。
(1)將100mg DNA溶入24μl水中，置于冰上，加入20μl隨機(jī)引物溶液(2.5X)。將混合后的DNA煮沸變性5分鐘，立即置于冰上。
(2)加入5μl 10XdNTP溶液，輕輕地將離心管內(nèi)試劑徹底混勻，再加入1μl的酶溶液。
(3)混勻后，將反應(yīng)物在37℃中培養(yǎng)1小時(shí)，取2μl做凝膠電泳檢查。如果被標(biāo)記的DNA探針片段在200-2000bp之間，標(biāo)記效果最佳。
(4)終止反應(yīng)可通過(guò)加熱到75℃，10分鐘，或加5μl反應(yīng)終止緩沖液。
2.雜交前處理及原位雜交(1)、染色體玻片前期處理雜交前，將載有上期染色體的玻片進(jìn)行RNA酶處理。在玻片上加200微升RNA酶溶液(100μg/ml，溶解在2XSSC中)，蓋一載玻片，置37℃孵箱內(nèi)消化30-60分鐘，然后在2XSSC溶液中洗10分鐘，經(jīng)70％、85％、100％梯度酒精脫水，置空氣中干燥。
(2)、染色體變性將已制備好載有分裂中期染色體的玻片放入變性液中(70％ Formanide，2XSSC)75℃變性2分鐘，經(jīng)70％、85％、100％梯度酒精脫水，空氣中干燥。
(3)、探針變性及雜交加入50-200mg的探針于雜交緩沖液中(共10μl雜交液)7μl雜交緩沖液(70％甲酰氨2X SSC，10％硫酸葡聚糖)，2μl探針，1μl阻斷DNA(Cot-1 DNA)。將混勻后的雜交液放入75℃變性5分鐘，然后轉(zhuǎn)入37℃。預(yù)雜交20-30分鐘。將探針滴在玻片上，加蓋玻片，立即用橡膠粘固劑封好四周，放入濕盒內(nèi)，置于37℃恒溫箱內(nèi)雜交過(guò)夜。
3.雜交后處理及顯微觀察(1)、洗片先除去封片的橡膠粘固劑和蓋玻片，將玻片放在45℃的FISH洗液I(50％甲酰氨，2XSSC)中洗三次，每次5-10分鐘。然后將玻片放入FISH洗液II(4XSSC，0.05％吐溫20)中。洗三次，每次2分鐘。最后放入FISH洗液III(4XSSC)中洗2分鐘。后二步洗片均在室溫中進(jìn)行。
(2)、卵白素(Avidin)處理處理前，先用1％牛血清白蛋白(BSA)封閉非特異性抗體結(jié)合點(diǎn)，從而減少非特異性雜交信號(hào)。加100微升1％BSA在載玻片上，37℃中封閉30分鐘，然后在洗液III中洗2分鐘。使用前臨時(shí)配制卵白素及抗卵白素抗體溶液，將卵白素及抗卵白素抗體分別溶解于PNM緩沖液(5μg/ml)。閉光保存。PNM緩沖液配制如下(100ml)將95ml 0.1M磷酸緩沖液，pH7，0.1ml NP40，20mg疊氮鈉和5g脫脂奶粉，混均后置37℃水浴箱中孵育2小時(shí)，待奶粉完全溶解后，分裝至1.5ml小管中，儲(chǔ)存于-20℃中，每次使用前將PNM緩沖液溶解，14,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取出上清液備用。加40μl卵白素(5μg/ml)于玻片上，加蓋玻片，37℃，孵育20分鐘。然后，將玻片放入洗液II中洗3次，洗液III中洗1次，每次2分鐘。隨后再加40μl抗卵白素抗體(5μg/ml)于玻片上，加蓋玻片，37℃，孵育20分鐘。然后，將玻片放入洗液II中洗3次，洗液III中洗1次，每次2分鐘。最后再進(jìn)行一次卵白素處理，過(guò)程同上。
(3).封片用含有DAPl(0.5-1mg/ml)的抗褪色液封片。
實(shí)施例1染色體顯微解剖在該實(shí)施例中，為了確定在3q26擴(kuò)增區(qū)中的候選癌基因，對(duì)正常的中期染色體進(jìn)行3q26染色體顯微解剖。在原位雜交中，用于作為FISH探針的是整個(gè)BAC克隆。該BAC克隆的名稱(chēng)是RP11-110-0-7。(其中，RP11是該克隆所在的文庫(kù)名，-110是盤(pán)名，-0是該克隆所在的橫坐標(biāo)，-7是該克隆所在的縱坐標(biāo)。)該BAC克隆含有eIF-5A2基因序列。熒光顯示顯微解剖的DNA序列與3q26有特異性雜交(圖1B)，雜交的位置在染色體3q26.2。
實(shí)施例2雜交體選擇通過(guò)雜交體選擇，從顯微解剖的DNA中選出3q26區(qū)特異表達(dá)的序列。通過(guò)篩選5×104個(gè)噬斑，31個(gè)陽(yáng)性cDNA克隆被分離出并被測(cè)序。
測(cè)序結(jié)果顯示，4/31 cDNA克隆(大小為0.5-2.1kb)代表了一個(gè)新的基因，其開(kāi)放閱讀框編碼153個(gè)氨基酸(圖2)。數(shù)據(jù)庫(kù)檢索顯示，該cDNA與真核起始因子5A(eIF-5A)有顯著的序列特異性(82％(126/153)氨基酸相同性)(圖2)。序列相同性包括了進(jìn)行8-羥-2，7，10-三氨基癸酸修飾的結(jié)構(gòu)域和lys-50殘基，其中8-羥-2，7，10-三氨基癸酸是通過(guò)翻譯后修飾而形成的(Kyrpides，N.C.etal.，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)95224-228，1998)。eIF-5A是唯一已知含有8-羥-2，7，10-三氨基癸酸(一種非常見(jiàn)氨基酸)殘基的細(xì)胞蛋白，而8-羥-2，7，10-三氨基癸酸殘基是通過(guò)對(duì)lys-50殘基的翻譯后修飾而形成(Park，M.H.et al.，Trends Biochem.Sci.，18475-479，1993)。已表明，eIF-5A的8-羥-2，7，10-三氨基癸酸化對(duì)于某些腫瘤發(fā)生細(xì)胞系的生長(zhǎng)是關(guān)鍵的。
本發(fā)明的新基因被命名為真核起始因子5A2(eIF-5A2)。eIF-5A2的Genbank登錄號(hào)為AF262027。eIF-5A2的核苷酸序列和氨基酸序列分別示于SEQ ID NO1和2。
實(shí)施例3eIF-5A2的表達(dá)譜為了確定eIF-5A2在正常組織中的表達(dá)譜，使用基于eIF-5A2序列的引物，對(duì)正常卵巢組織以及肝、胎盤(pán)、乳房、皮膚、腦和大腸組織進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果表明，eIF-5A2在所有這些組織中都表達(dá)(圖3C)。
通過(guò)BLAST法對(duì)EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，揭示eIF-5A2在人的睪丸、子宮、淋巴細(xì)胞和肺組織中也表達(dá)。
實(shí)施例4eIF-5A2定位于3q26.2為了證實(shí)染色體定位定位，用BLAST法分離出含eIF-5A2序列的BAC克隆。用全長(zhǎng)eIF-5A2 cDNA作為探針進(jìn)行Southern印跡法(圖3A)。此外，使用位于外顯子(204bp)中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增((圖3B)。兩者都證實(shí)了該BAC克隆含有eIF-5A2。
然后，用FISH法，將該BAC克隆定位與3q26.2(圖1C和1D)。
實(shí)施例5eIF-5A2在卵巢癌中存在擴(kuò)增用Southern印跡法，對(duì)30例原發(fā)性卵巢癌中eIF-5A2的DNA序列擴(kuò)增情況進(jìn)行了研究。在15/30病例中檢測(cè)到了eIF-5A2擴(kuò)增，并且在4個(gè)病例(OV-4，OV-7，OV-13和OV27)中觀察到高拷貝擴(kuò)增(圖4A，探針是1.2kb的eIF-5A2基因的全長(zhǎng)cDNA)。在卵巢癌細(xì)胞系UACC-1598中也檢測(cè)到eIF-5A2的高拷貝擴(kuò)增，在卵巢癌細(xì)胞系UACC-1598中含有雙微體形式的3q26擴(kuò)增(圖4A)。
在4個(gè)原發(fā)性卵巢癌病例(OV-4，OV-7，OV-13和OV27)和卵巢癌細(xì)胞系UACC-1598中eIF-5A2的表達(dá)水平，還用Northern印跡法進(jìn)行分析，并都觀察到了eIF-5A2超表達(dá)(圖4B)。
實(shí)施例6在雙微體中存在eIF-5A2為了證實(shí)雙微體是否含有eIF-5A2，將中期UACC-1598與含eIF-5A2的BAC克隆用FISH法進(jìn)行雜交。結(jié)果顯示，BAC克隆與所有的雙微體雜交(圖5A)。用FISH法，還在另一卵巢癌細(xì)胞系(OVCAR3)中觀察到eIF-5A2的擴(kuò)增(圖5B)。根據(jù)本發(fā)明人的CGH結(jié)果，界定了位于3q26.1-3q26.2處的一個(gè)最小重迭擴(kuò)增子，而eIF-5A2正好被定位于該區(qū)域(圖5C)。
實(shí)施例7用組織芯片技術(shù)檢測(cè)eIF-5A2的擴(kuò)增情況在該實(shí)施例中，用組織芯片(tissue Microarray)技術(shù)對(duì)近200例卵巢癌標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約40％病例(76/192)有eIF-5A2擴(kuò)增。此外，有eIF-5A2基因擴(kuò)增的病人的預(yù)后都較差。
討論在本發(fā)明中，從卵巢癌的頻繁擴(kuò)增區(qū)域中分離出了eIF-5A家族的一個(gè)新成員eIF-5A2。eIF-5A2與eIF-5A的氨基酸序列相同性為82％，其中包括了進(jìn)行8-羥-2，7，10-三氨基癸酸修飾的結(jié)構(gòu)域和lys-50殘基，其中8-羥-2，7，10-三氨基癸酸是通過(guò)翻譯后修飾而形成的。這表明eIF-5A2是eIF-5A2家族的一個(gè)成員，并且可能具有類(lèi)似的功能。
已表明，eIF-5A在翻譯起始中起作用，然而在缺失eIF-5A的酵母細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成的缺失并沒(méi)有受到顯著影響。盡管eIF-5A的確切功能還不清楚，但是含8-羥-2，7，10-三氨基癸酸的eIF-5A對(duì)細(xì)胞增殖的必要性已被充分研究。已表明，由具有缺失而導(dǎo)致的完全胞內(nèi)缺失eIF-5A，會(huì)造成細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制。其他研究表明，抑制脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸酸合成酶(deoxyhypusinesynthase，DHS)(一種在eIF-5A的8-羥-2，7，10-三氨基癸酸化中涉及的酶)，可抑制CHO細(xì)胞增殖，并遏制HeLa細(xì)胞和v-src轉(zhuǎn)化的NIH3T3細(xì)胞的生長(zhǎng)(Shi，X.-P.et al.，Biochim.Biophys.Acta.，1310119-126，1996)。Hanauske-Abel等人暗示含8-羥-2，7，10-三氨基癸酸的eIF-5A可能在真核細(xì)胞中直接影響在細(xì)胞周期的G1至S轉(zhuǎn)變中所涉及的一組選擇性基因的表達(dá)，因?yàn)橥ㄟ^(guò)抑制eIF-5A 8-羥-2，7，10-三氨基癸酸修飾可使細(xì)胞周期停滯在G1-S邊界期(Hanauske-Abel et al.Biochim.Biophys.Acta.，122115-124)。
最近，Tome等人報(bào)道，過(guò)量的腐胺的積累以及用二氨基庚烷處理細(xì)胞而抑制eIF-5A 8-羥-2，7，10-三氨基癸酸修飾，也是一種誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制(Tome，M.E.et al.，Biochem.J.，328847-854，1997)。
最近的研究表明，8-羥-2，7，10-三氨基癸酸形成活性是血清反應(yīng)性的，并且在Ras癌基因轉(zhuǎn)化的HIH3T3細(xì)胞中顯著增加了30倍(Chen.，Z.P.et al.，Cancer Lett.，115235-241，1997)。所有這些研究強(qiáng)烈暗示eIF-5A與癌癥發(fā)生的相關(guān)性。
在本發(fā)明中，在15/30原發(fā)性卵巢癌和數(shù)種卵巢癌細(xì)胞系(包括UACC-1598)中檢測(cè)到eIF-5A2擴(kuò)增。并且在所有4種測(cè)試的具有3q26擴(kuò)增的原發(fā)性卵巢癌中觀察到eIF-5A2超表達(dá)。此外，含eIF-5A2的BAC克隆與卵巢癌細(xì)胞系UACC-1598中的雙微體雜交。因此，基于染色體定位、在卵巢癌中的擴(kuò)增情況、以及可能的與增殖有關(guān)的功能，eIF-5A2被認(rèn)為是位于卵巢癌3q26.2的最小重迭擴(kuò)增子中的推定的癌基因。
3q26擴(kuò)增區(qū)域可能含有一種以上重要基因(包括PIK3CA和eIF-5A2)，它們是卵巢癌擴(kuò)增事件中的生物靶目標(biāo)。eIF-5A2位于PIK3CA的端粒一側(cè)，并且在其之間的基因組距離是約7cM。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表<110>關(guān)，新元岑，信棠<120>卵巢癌的檢測(cè)方法和試劑盒<130>012374<160>2<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>2246<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(38)..(499)<400>1agttcccacg gaaaaactac catctcccct gcccacc atg gca gac gaa att gat 55Met Ala Asp Glu Ile Asp1 5ttc act act gga gat gcc ggg gct tcc agc act tac cct atg cag tgc 103Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser Thr Tyr Pro Met Gln Cys10 15 20tcg gcc ttg cgc aaa aac ggc ttc gtg gtg ctc aaa gga cga cca tgc 151Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys25 30 35aaa ata gtg gag atg tca act tcc aaa act gga aag cat ggt cat gcc 199Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala40 45 50aag gtt cac ctt gtt gga att gat att ttc acg ggc aaa aaa tat gaa 247Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu55 60 65 70gat att tgt cct tct act cac aac atg gat gtt cca aat att aag aga 295Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg75 80 85aat gat tat caa ctg ata tgc att caa gat ggt tac ctt tcc ctg ctg 343Asn Asp Tyr Gln Leu Ile Cys Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu90 95 100aca gaa act ggt gaa gtt cgt gag gat ctt aaa ctg cca gaa ggt gaa 391Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Lys Leu Pro Glu Gly Glu105 110 115cta ggc aaa gaa ata gag gga aaa tac aat gca ggt gaa gat gta cag 439Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Asn Ala Gly Glu Asp Val Gln120 125 130gtg tct gtc atg tgt gca atg agt gaa gaa tat gct gta gcc ata aaa 487Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu Tyr Ala Val Ala Ile Lys135 140 145 150ccc tgc aaa taa acggaaacat caggcatgaa cactgtttat gtctgaatca 539Pro Cys Lysactgcaaaaa taatttggtt ctaagttgtc accaaagcta tagccttcat aagcaacctc599atttcttttt ttaattgttt tcagattgtg ctgggttagt tttgcaagca attgataatt659tttaaaaaat tatcaatatg tataattttt tttgaatttt gtagatatgt ttcctataat719attcctgtgg ttttcagtat gtcagtccaa gaaacaaaca agatagcttc agcagatgtg779atttgtctga gcaaatcatt cctgtgtttt agttagatga taaaccaggg ttttaaatca839aacaatgtag cataaagtgg tattgaagta ccatatttaa gttgaactgc tctgcattaa899ttacagattt aatataaaat gaactgatta tatattggaa ttgttgcact ttcagcctgt959gtagggcaaa cacaaatcct taaacaaaaa tcatgttatc aaaaactgtc agttattttg 1019gtggccacat gcaaccatgt gattactttg gtcatactat ttaccaaatt gttggcaaac 1079ttgatgtaac cttatatggt ggttttagtc ccttcttatg gttggcagaa gggcactgaa 1139ctgttgggtg aaagttagtt agcaagtaag attataagga agacacaaaa gacagtggca 1199aagagggttg attaaatcta taagttttta tgtgaggact ttgtaagtca gcataaaaat 1259gaaaagttgt ttctcagttg tttttgcttt taactttgcc cccaacgttt aaagggagtg 1319atctgcttta catgatacta tgcaatgctt gttttccaac tatgttgaat aaatagtaat 1379atttatcagt aaatactcct ttccaacttc cttttttttt tttttttttg aggcatgaga 1439attgcttgaa cccgggaagt gaaggttgcc gtgagctgag atcacaccac tgccataaac 1499atgacaggct tttggacttt gtattacctg tatgttttat aatggatcat gcataatttc 1559tcaggagaat aaaatgagaa ttcatatata cgttcatctt tcaagtcaga gcaatgagtt 1619gggaaaagag gtggcatttc tgatcggata atggaatact ctcatttatt ttatgacatt 1679ctctgtctac tcagatcata gtgaaaactg gaaacaaaaa aaaaaacagc ctcttcttgg 1739aaagtgacag cagaaggtgg catggagctt gtgtccttgg acaacaaatc tggatatact 1799aggattaatt atcagaagac agctcaggcc aagttttgat cgttccatac agtaccttgt 1859ttatctgctt cttaaagaat cagccgagac accataaaag aaataggctt tttgtgcctt 1919ttgctgttaa tgtttaattt acaaactgtt ttggtaaatc tcttaatgta agtagctatt 1979tgactttgga attttgcatt cgaggtatac tgtcatttct tgaaatcttt ttctcgttta 2039gttgctctgt gggaaatgtg aggaagccta agtttgtatt tgtaaatttc ttatgccatc 2099ctctagtcaa attttttttc attgtttaaa aatacggaag tgttccaata taattttttc 2159ctgtactgga tggctaggat tctagagaat tgattataaa atattttcaa tacatcccaa 2219aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2246<210>2<211>153<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Ala Asp Glu Ile Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser1 5 10 15Thr Tyr Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val20 25 30Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr35 40 45Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe50 55 60Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp65 70 75 80Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Tyr Gln Leu Ile Cys Ile Gln Asp85 90 95Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu100 105 110Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Asn115 120 125Ala Gly Glu Asp Val Gln Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu130 135 140Tyr Ala Val Ala Ile Lys Pro Cys Lys145 150
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)人染色體異常的方法，其特征在于，它包括步驟在探針與靶序列會(huì)形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將待測(cè)對(duì)象的染色體樣品與含有一種或多種核酸探針的組合物接觸，其中所述的探針含有全長(zhǎng)eIF-5A2或其片段的核苷酸序列；和檢測(cè)所述的雜交復(fù)合體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的檢測(cè)雜交復(fù)合體的步驟包括檢測(cè)靶序列的拷貝數(shù)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的檢測(cè)雜交復(fù)合體是通過(guò)檢測(cè)熒光標(biāo)記物。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的染色體異常是擴(kuò)增。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的全長(zhǎng)eIF-5A2及其片段包括DNA、cDNA和反義DNA。
6.一種檢測(cè)癌癥的試劑盒，其特征在于，它包括標(biāo)記的核酸探針，該探針可特異性地結(jié)合于人eIF-5A2的核苷酸序列，且該核酸含有全長(zhǎng)eIF-5A2及其片段的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，它還含有對(duì)染色體3的端粒序列特異的參照探針。
8.一種檢測(cè)腫瘤或腫瘤易感性的方法，其特征在于，將含有全長(zhǎng)eIF-5A2或其片段的核苷酸序列的探針，與待測(cè)個(gè)體的DNA樣品進(jìn)行雜交；和檢測(cè)形成的雜合體數(shù)目是否高于正常對(duì)照，其中形成的雜合體數(shù)目是否高于正常對(duì)照就表示該個(gè)體患有腫瘤或腫瘤易感性高于正常人群。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的腫瘤選自下組卵巢癌、鼻咽癌、前列腺癌和輸卵管癌。
10.一種檢測(cè)腫瘤或腫瘤易感性的方法，其特征在于，它包括步驟在適合形成抗體復(fù)合物的條件下，將含有特異性抗eIF-5A2蛋白的抗體與待測(cè)個(gè)體的DNA樣品進(jìn)行接觸；和檢測(cè)形成的抗體復(fù)合物數(shù)量是否高于正常對(duì)照，其中形成的抗體復(fù)合物數(shù)量高于正常對(duì)照就表示該個(gè)體患有腫瘤或腫瘤易感性高于正常人群。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人染色體異常(尤其3q26.2異常)以進(jìn)行癌癥基因診斷和預(yù)后的方法,它包括步驟:在探針與靶序列會(huì)形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下,將待測(cè)對(duì)象的染色體樣品與含有一種或多種核酸探針的組合物接觸,其中所述的探針含有全長(zhǎng)eIF－5A2或其片段的核苷酸序列;和檢測(cè)所述的雜交復(fù)合體。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1384207SQ0111760
公開(kāi)日2002年12月11日 申請(qǐng)日期2001年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月30日
發(fā)明者關(guān)新元 申請(qǐng)人:關(guān)新元, 岑信棠