專利名稱：制備失活的米糠脂肪酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備失活的米糠脂肪酶的方法，特別是涉及一種用苯硼酸(benzene boronic acid)制備失活的米糠脂肪酶的方法。
由于酶在很多方法中的應用，對其需求量正不斷增長。酶的使用領(lǐng)域很廣泛，例如營養(yǎng)學、食品科學和臨床醫(yī)學。在以上領(lǐng)域，近年已經(jīng)開始大量關(guān)注脂肪酶。
脂肪酶屬于水解酶類，能夠催化甘油三酸酯、甘油二酸酯和甘油單酸酯中的酯鍵的斷裂。脂肪酶的天然底物是具有很低水溶解性的甘油三酸酯?，F(xiàn)在，脂肪酶是有機化學家、藥劑師、生物化學家、生物技術(shù)人員、微生物學家、食品技術(shù)人員和生物化學工程人員所選擇的酶。
在食品領(lǐng)域不希望有的酶如脂肪酶需要被失活，因此需要一種為生產(chǎn)食品級米糠油而穩(wěn)定米糠的改進方法。米糠中含有10-26％的食用油，然而由于在米糠中存在大量的脂肪酶，使得大規(guī)模地、成功利用該原料以制備食用油受到阻礙。人們已經(jīng)試驗了許多物理和化學方法降低米糠中的脂肪酶活性，其成功的程度各不相同。米糠的穩(wěn)定化，換句話說，通過化學抑制劑特別是競爭性抑制劑使米糠脂肪酶失活有望增加國家對食用油的供應量。
測試幾種蛋白質(zhì)如蜂毒肽、β-乳球蛋白A、血清白蛋白、卵白蛋白和肌紅蛋白的使胰脂肪酶和微生物脂肪酶失活的效果。這種抑制效果可能是由于界面性質(zhì)的變化使得脂肪酶自底物被解吸的結(jié)果(Gargouri，Y，等人1984，“蛋白質(zhì)對胰脂肪酶和微生物脂肪酶的抑制”，生物化學與生物物理學報，795，326-331)。
來自人乳的膽汁酸鹽依賴性的脂肪酶催化水溶性以及水不溶性底物的水解，其受到苯硼酸的競爭性抑制，其結(jié)合在具有15折的絲氨酸活性位點上或附近。因此，苯硼酸類似于底物而非四面體中間體類似物(Abouakil，N和Lombardo，D.，1989.“硼酸對人乳膽汁酸鹽依賴性脂肪酶的抑制，膽汁酸鹽活化劑作用的本質(zhì)”，生物化學與生物物理學報，1004，215-220)。
在硅化玻璃珠存在下測量溶解的三丙酸菌素的水解的時候，十八烷硼酸對豬胰脂肪酶的抑制作用是競爭性的。據(jù)信硼酸是脂肪酶作用中四面體中間體的類似物(Garner，C.W.，1980.“豬胰脂肪酶的硼酸抑制劑”，生物化學雜志，255(11)，5064-5068)。
脂蛋白脂肪酶受苯硼酸抑制的研究說明在酶的活性位點存在絲氨酸和組氨酸。據(jù)信該抑制是由于形成抑制劑—酶的復合物的緣故。載脂蛋白C-II的存在逆轉(zhuǎn)脂蛋白脂肪酶的抑制(Vainio，P，Virtanen，J.A.和Kinnunen，P.K.J.，1982.“苯硼酸對脂蛋白脂肪酶的抑制，載脂蛋白C-II的作用”，生物化學與生物物理學報，711，386-390)。
除非存在清蛋白，在脂蛋白和合成乳劑中水解甘油三酸酯的脂蛋白脂肪酶隨所形成的產(chǎn)物的量的增加而急劇降低。這是由于酶與脂肪酸的直接相互作用以及活化劑蛋白的脂解激動作用的失去(Bengtsson，G.和Olivecrona，T.，1980.“脂蛋白與脂肪酶，產(chǎn)品抑制的機理”，歐洲生物化學雜志，106，577-562)。
盡管有大量的關(guān)于一般的酶，特別是脂肪酶的抑制的信息，但關(guān)于植物脂肪酶的抑制的信息仍不足。
參見Bremer，Klaus-Dieter，Sawlewicz和Pavel(2000)的臺灣專利381025B，其中使用了脂肪酶抑制劑如四氫一制胰脂菌素、一制胰脂菌素、纈基內(nèi)酯、抑酯酶素、抑脂酶免疫酮A和抑脂酶免疫酮B作為活性物質(zhì)和普通的藥物載體。
參見Takahashi和Hidehiko(1996)的美國專利5503831，其中通過在室溫下用水提取脫脂的稻胚芽，制備具有脂肪酶抑制活性的組合物，該組合物用于預防肥胖并且可以被摻入食品中。
參見Stoddart，Barry和Narinx，Emmanuel(1999)的WIPO專利9948471A1，其中記載了利用平均分子量至少為400的具有聚烷氧主鏈(包括至少一個支鏈烷氧基單元和至少一個直鏈烷氧基單元)的共聚化合物，制備用于降低脂肪酶，特別是微生物脂肪酶活性的化合物，以及減少皮疹或皮膚刺激、皮屑形成以及身體惡臭，以及用于保藏食品和飲料產(chǎn)品。
參見Uchino Keijiro，Mizuno Takashi和Kawaguchi Kiyomi(1997)的日本專利9040689A2，其中通過混合作為活性成分的三萜化合物及其衍生物如它們的鹽或乙?；?，包括齊墩果酸、烏宋酸和它們的鹽和乙?；铮玫揭种苿?，該抑制劑用于抑制脂肪酶活性并能夠防止含有油脂的食品由于脂肪酶而產(chǎn)生的變質(zhì)，并且降低食品的熱量，甚至可用于預防成人的疾病。
參見Kawaguchi Kiyomi，Mizuno Takashi和Uchino keijiro(1996)的日本專利8268882A2，其中利用含有作為活性成分的扁柏酚的抑制劑，它能夠表現(xiàn)出極好的抗脂肪酶活性，安全性高，并且有助于防止由于含油脂的食品中的脂肪酶而產(chǎn)生的食品變質(zhì)以及預防成人的疾病等。成人的每天劑量優(yōu)選為0.5-3000毫克，在口服或粘膜吸收情況下，混合的活性成分的量為0.3-15wt％，在非腸道給予的情況下，該量為0.01-10wt％。但是當將該抑制劑被摻入食品中時，其優(yōu)選的量為0.001-10wt％。
所有上述方法的主要缺陷是使用不可逆的抑制劑以使酶失活，從而防止食品由于脂肪酶的變質(zhì)。
本發(fā)明的主要目的是提供一種在原料被加工獲得食用級油之前而使脂肪酶失活的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供更高穩(wěn)定性的米糠。
本發(fā)明提供一種制備失活的米糠脂肪酶的方法，包括a)從米糠中提取脂肪酶，用鹽析劑純化所述脂肪酶，得到活性脂肪酶；b)以蛋白質(zhì)與配體的摩爾比為1∶10、1∶100、1∶250、1∶750和1∶1500的比例制備配體；c)將所述活性脂肪酶與配體混合，添加到底物中，然后添加濃度為0.1摩爾/升的活化劑如氯化鈣；d)將這樣獲得的混合物保溫4小時以檢驗活性；e)從混合物中分離失活的脂肪酶。
在本發(fā)明的一個實施方案中，鹽析劑選自硫酸銨和氯化鈣。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，該方法步驟(a)中的脂肪酶的純化是通過透析和尺寸排阻色譜法進行的。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，底物選自三乙酸甘油酯和三丁酸甘油酯。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，添加到底物中的活性脂肪酶和配體的混合物的濃度至少為5％。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所用的配體包括芳香族硼化合物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，以蛋白質(zhì)與配體的摩爾比為1∶10、1∶100、1∶250、1∶750和1∶1500的比例混合脂肪酶和配體。
在配體的存在下制備脂肪酶溶液所涉及的不同的操作單元和條件在

圖1和圖2中給出，其中圖1是在配體的存在下制備脂肪酶溶液的一種流程；圖2是在配體的存在下制備脂肪酶溶液的另一種流程。
向大約2毫克在0.05摩爾/升，pH7.4的磷酸鈉緩沖液中的米糠脂肪酶中，添加不同濃度的配體，其濃度在蛋白質(zhì)與配體摩爾比為1∶10至1∶1500的范圍內(nèi)，在InnovaTM4000恒溫箱搖動器中于150轉(zhuǎn)/分鐘、30℃下保溫1小時。通過pH-stat方法，使用MettlerToledoDL12滴定器并用5％的三乙酸甘油酯或三丁酸甘油酯溶液作為底物，檢驗反應混合物的酶活性。也使用相應的空白溶液，其中通過添加蒸餾醇使酶失活?；钚砸悦啃r每毫克蛋白質(zhì)消耗的堿的微克當量以對照活性表示。
向大約2毫克在0.05摩爾/升，pH7.4的磷酸鈉緩沖液中的米糠脂肪酶中，添加不同濃度的配體，其濃度在蛋白質(zhì)與配體摩爾比為1∶10至1∶1500的范圍內(nèi)，在InnovaTM4000恒溫箱搖動器中于150轉(zhuǎn)/分鐘、30℃下保溫1小時。通過pH-stat方法，使用MettlerToledoDL12滴定器并用5％的三乙酸甘油酯或三丁酸甘油酯溶液作為底物，檢驗反應混合物的酶活性。也使用相應的空白溶液，其中通過添加蒸餾醇使酶失活?；钚砸悦啃r每毫克蛋白質(zhì)消耗的堿的微克當量以對照活性表示。
含有不同濃度配體的酶溶液通過Sephadex G-25柱，該柱先用洗脫緩沖液平衡。收集空隙容積之后即刻洗脫的蛋白質(zhì)，分析其活性。
本發(fā)明方法的新穎性和獨特性在于由于用苯硼酸使米糠脂肪酶失活而使酶活性具有可逆性。
下面的實施例用以闡述本發(fā)明，因此不應被視為是對本發(fā)明范圍的限制。實施例1組分 含量脂肪酶濃度2毫克/毫升反應混合物中的配體(摩爾/摩爾) 1∶10底物(5％，w/v)4毫升氯化鈣(0.1摩爾/升)10微升為了了解抑制劑對米糠脂肪酶活性的影響，在不同的配體濃度下進行試驗。在蛋白質(zhì)與配體的摩爾比為1∶10的條件下測定米糠脂肪酶的活性。數(shù)據(jù)分析顯示，在蛋白質(zhì)與配體的摩爾比為1∶10的條件下，酶損失初始活性的35％。實施例2組分含量脂肪酶濃度 2毫克/毫升反應混合物中的配體(摩爾/摩爾) 1∶1500底物(5％，w/v) 4毫升氯化鈣(0.1摩爾/升) 10微升在蛋白質(zhì)與配體的摩爾比為1∶1500的條件下測定米糠脂肪酶的活性，數(shù)據(jù)顯示酶損失初始活性的近77％。在Sephadex G-25柱上通過凝膠過濾去除配體之后，還檢驗了酶的初始活性的可逆性。實施例3組分含量脂肪酶濃度 2毫克/毫升反應混合物中的配體(摩爾/摩爾) 1∶10底物(5％，w/v) 4毫升氯化鈣(0.1摩爾/升) 10微升在1∶10的條件下使用Sephadex G-25柱色譜法檢驗可逆性。結(jié)果表明酶能夠恢復初始活性。實施例4組分含量脂肪酶濃度 2毫克/毫升反應混合物中的配體(摩爾/摩爾) 1∶1500底物(5％，w/v) 4毫升氯化鈣(0.1摩爾/升) 10微升在1∶1500摩爾比的條件下，在Sephadex G-25柱上通過凝膠過濾去除配體之后，酶幾乎恢復了其初始活性。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)使用特定的可逆性抑制劑制備失活的米糠脂肪酶，其能靶向于酶的活性位點而不是非活性位點；(2)所需的抑制劑的濃度很低；(3)除去抑制劑后，失活的方法是可逆的；(4)除了活性，脂肪酶的其他性質(zhì)如功能屬性沒有變化。
權(quán)利要求
1.一種制備失活的米糠脂肪酶的方法，所述方法包括a)從米糠中提取脂肪酶，用鹽析劑純化所述脂肪酶，得到活性脂肪酶；b)以蛋白質(zhì)與配體的摩爾比為1∶10、1∶100、1∶250、1∶750和1∶1500的比例制備配體；c)將所述的活性脂肪酶與配體混合，添加到底物中，然后添加濃度為0.1摩爾/升的活化劑如氯化鈣；d)將這樣獲得的混合物保溫4小時以檢驗活性；e)從混合物中分離失活的脂肪酶。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的鹽析劑選自硫酸銨和氯化鈣。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法的步驟(a)中的脂肪酶的純化是通過透析和尺寸排阻色譜法進行的。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的底物選自三乙酸甘油酯和三丁酸甘油酯。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中添加到底物中的活性脂肪酶和配體的混合物的濃度至少為5％。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所用的配體包括芳香族硼化合物。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中的芳香族硼化合物是苯硼酸。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中以蛋白質(zhì)與配體的摩爾比為1∶10、1∶100、1∶250、1∶750和1∶1500的比例混合脂肪酶和配體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種制備失活的米糠脂肪酶的方法,包括:a)從米糠中提取脂肪酶,用鹽析劑純化所述脂肪酶,得到活性脂肪酶;b)以蛋白質(zhì)與配體的摩爾比為1∶10、1∶100、1∶250、1∶750和1∶1500的比例制備配體;c)將所述活性脂肪酶與配體混合,添加到底物中,然后添加濃度為0.1摩爾/升的活化劑如氯化鈣;d)將這樣獲得的混合物保溫4小時以檢驗活性;e)從混合物中分離失活的脂肪酶。
文檔編號C12N9/18GK1379089SQ01117358
公開日2002年11月13日 申請日期2001年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月29日
發(fā)明者拉加文德里·馬尼卡納哈里·帕潘內(nèi)戈沃得, 普拉卡什·維什韋什瓦拉 申請人:科學工業(yè)研究院