專利名稱：具有高度延伸專一性的dna低溫循環(huán)延伸反應(yīng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程，更具體地說涉及DNA低溫循環(huán)延伸反應(yīng)。
一般加熱到95℃(高于其變性溫度Tm)時，雙鏈DNA就會變性，產(chǎn)生兩條互補的單鏈DNA片斷。在酶促DNA聚合反應(yīng)時，當引物結(jié)合到單鏈模板中的互補序列上后，會延伸產(chǎn)生新的DNA鏈。重新加熱到95℃時，新合成的DNA將和模板分離。單鏈模板在退火后又可與寡核苷酸引物結(jié)合，在有足夠活性的DNA聚合酶和四種dNTP的存在下，新一輪的酶促DNA聚合反應(yīng)得以進行。上述反應(yīng)通常選用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶一它能經(jīng)受95℃的高溫，并在55-72℃時有聚合活性。這樣在每次高溫變性之后不必加入額外的聚合酶。當一種過量的引物和模板混和，經(jīng)過若干次溫度循環(huán)后，單鏈DNA靶片斷的數(shù)目將以每次循環(huán)增加一倍的速度擴增。當反應(yīng)體系中存在鏈終止物，即四種ddNTP(包括ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP)或其類似物時，將產(chǎn)生許多長短不同的單鏈DNA片斷。這些片斷的5’端有相同的引物，3’端為特定的ddNTP或其類似物，ddNTP類似物可用熒光染料標記。以上就是利用熒光染料標記的DNA鏈終止物進行自動DNA測序的原理。
在上述體系中加入一對引物，即一個正向引物和一個反向引物，它們分別與雙鏈DNA靶序列的兩端互補，這樣，新合成的DNA鏈可作為后續(xù)聚合反應(yīng)的模板。當熱循環(huán)重復(fù)若干次時，靶片斷的拷貝數(shù)呈指數(shù)增長。以上就是聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)的原理。
實際操作時，不管是PCR反應(yīng)，還是利用熒光染料標記的DNA鏈終止物進行自動DNA測序，都使用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，比如棲熱水生菌(Thermusaquaticus)DNA聚合酶(Taq)，它能承受95℃的高溫。但熱穩(wěn)定聚合酶通常進行性較低，而且在某些條件下，特別是在待擴增或測序DNA模板存在GC富含區(qū)時，會喪失其序列特異的聚合酶活性。因此，有人嘗試用熱不穩(wěn)定DNA聚合酶進行低溫循環(huán)測序反應(yīng)(Fuller)和低溫PCR反應(yīng)(Iakobashvili和Lapidot)，熱不穩(wěn)定DNA聚合酶一般比熱穩(wěn)定DNA聚合酶有更高的忠實性和進行性。Fuller聲稱終濃度為40％(v/v)甘油或乙二醇可降低模板DNA的Tm值，使變性和延伸反應(yīng)得以在80℃以下進行，從而可以使用包括Bca和Klenow片斷的DNA聚合酶進行擴增反應(yīng)。同時，Iakobashvili和Lapidot發(fā)現(xiàn)即使在高濃度的甘油下，Klenow片段仍不適合低溫循環(huán)引物延伸反應(yīng)。但是如果反應(yīng)在37℃-70℃進行，在反應(yīng)體系中加入4.85M脯氨酸和17％(w/v)甘油，可以保護Klenow片斷的活性。然而，不管是Fuller還是Iakobashvili和Lapidot的低溫PCR方法，都沒有投入實際應(yīng)用，也沒有跡象表明它們能產(chǎn)生高質(zhì)量的序列特異PCR產(chǎn)物，或者可以產(chǎn)生適合測序的反應(yīng)產(chǎn)物。Iakobashvili和Lapidot并沒有證實低溫PCR產(chǎn)物是序列特異的，特別是使用20-25bp長的引物時。即使當引物長度為30-35bp時，Klenow片段可獲得低溫PCR產(chǎn)物，但也沒有證據(jù)表明其序列特異性。由于大多數(shù)用于PCR或測序反應(yīng)的引物小于30bp，所以迫切需要找到一種低溫DNA擴增體系，使得使用短于20bp的引物能得到有用的特異性產(chǎn)物，以供測序或其他進一步分析之需。
本發(fā)明的目的是提供一種低溫DNA擴增體系，使該體系能使用短于25bp的引物能得到有用的特異性產(chǎn)物，以供測序或其他分析之需。
本發(fā)明另一目的是提供穩(wěn)定的即用反應(yīng)預(yù)混和物，它可用于大規(guī)模高保真PCR和自動熒光DNA循環(huán)測序反應(yīng)。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種延伸專一性的DNA低溫循環(huán)延伸方法包括a.在反應(yīng)體系中含有低濃度的甘油或乙二醇，存在有一種模板，一對長度短于或長于25bp的引物和一種野生型或修飾后的中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶的即用型反應(yīng)混合物，當溫度在變性溫度(～70℃)和退火溫度(約37℃)之間循環(huán)時DNA聚合酶能重復(fù)延伸引物，得到序列特異性擴增產(chǎn)物；b.擴增雙鏈DNA片斷直接用于循環(huán)測序反應(yīng)，該循環(huán)測序反應(yīng)包括加入大大過量引物、四種標準熒光標記的ddNTP終止物、一種中等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、適量四種ddNTP混合物及含有15％(V/V)甘油的緩沖體系，在80℃以下重復(fù)環(huán)引物延伸反應(yīng)若干次，得熒光標記ddNTP終止的不同長度延伸產(chǎn)物；反應(yīng)在甘油的濃度為5-35％，最適濃度為15％的溶液中進行；中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶反應(yīng)溫度為37℃-70℃，最適反應(yīng)溫度為65±1℃；中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶與Bacillus stearothermophilus、Bacillus caldotenax或Bacillus caldolyticus的聚合酶的氨基酸至少存在95％同源性；正向引物和反向引物的長度可短于或長于25bp；反應(yīng)體系中重復(fù)熱循環(huán)多次，雙鏈DNA的指定區(qū)域得到擴增；反應(yīng)體系中存在ddNTP或其類似物時，用單一引物重復(fù)擴增，得不同長度的特異性延伸終止；中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶可為野生型或修飾后的源自Bacillusstearothermophilus、Bacillus caldotenax或Bacillus caldolyticus DNA聚合酶，或者氨基酸序列與Bacillus stearothermophilus、Bacilluscaldotenax或Bacillus caldolyticus的聚合酶的氨基酸序列至少95％同源的中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶；即用反應(yīng)混和物含有一種中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶，它與一部分或所有與酶促DNA引物延伸反應(yīng)有關(guān)的成分預(yù)先混合，在80℃以下進行低溫循環(huán)引物延伸反應(yīng)或含有ddNTP類似物的特異延伸終止反應(yīng)；即用反應(yīng)混和物中中等穩(wěn)定DNA聚合酶可為野生型或修飾后源自Bacillusstearothermophilus、Bacillus caldotenax或Bacillus caldolyticus的DNA聚合酶，或者氨基酸序列與Bacillus stearothermophilus、Bacilluscaldotenax或Bacillus caldolyticus的DNA聚合酶的氨基酸序列至少存在95％同源的中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶；即用反應(yīng)混和物為干粉或預(yù)先配制的溶液；即用混和物預(yù)先分裝在微離心管或多孔反應(yīng)板中；即用型混和物用于大規(guī)模自動PCR擴增或大規(guī)模自動DNA測序反應(yīng)。
本發(fā)明涉及中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶的應(yīng)用，以及引入低濃度的甘油或乙二醇作為降低雙鏈DNA的變性溫度的試劑，這樣能使引物低溫擴增得到序列特異性產(chǎn)物。具有高度進行性的中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶在70℃以上會快速失活，而且該酶促反應(yīng)的最適溫度在65℃，本反應(yīng)體系的循環(huán)溫度恰好在37℃到70℃之間。所以引入該酶既可以克服熱穩(wěn)定DNA聚合酶(如Taq及其突變型)的缺點，同時也可以克服一些熱不穩(wěn)定DNA聚合酶(如Klenow片斷)的缺點。
甘油和乙二醇降低DNA的變性溫度的程度一般與其終濃度成比例。例如溶液中甘油的濃度每升高一個百分點，雙鏈DNA的變性溫度約下降0.4到0.5℃。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在離體條件下，低濃度的甘油或乙二醇能增加中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶的序列專一性活性。在高濃度條件下，例如大于20％，無論甘油還是乙二醇對這些聚合酶的活性有明顯的抑制作用。通過合適的滴度實驗，獲得了甘油或乙二醇的最適濃度，使雙鏈DNA在70℃幾乎完全變性。這樣中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶的活性在低溫序列特異性循環(huán)引物延伸反應(yīng)時可得到保持。
本發(fā)明首先發(fā)現(xiàn)在最適酶促反應(yīng)溫度65℃，當甘油的最終濃度在20％(v/v)以下時，中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶的5’-3’聚合活性增強(圖1)；但高濃度的甘油會抑制其活性。當甘油濃度升高到40％，這類DNA聚合酶一般失去其2/3的聚合活性。
在反應(yīng)體系中存在40％甘油作為降低DNA變性溫度的試劑時，利用中等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進行低溫熱循環(huán)延伸反應(yīng)，產(chǎn)生了長短不一的非特異性擴增產(chǎn)物(圖2)。
在反應(yīng)體系中存在35％甘油作為降低DNA變性溫度的試劑時，利用中等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(比如突變的Bst或Bca)進行低溫熱循環(huán)延伸反應(yīng)，當靶片斷長度為250或400bp時，沒有獲得任何擴增產(chǎn)物；但對較長的靶片斷(1kb和2kb)，僅能得到非特異性的擴增產(chǎn)物(圖3)。
當反應(yīng)體系中存在低濃度的甘油(如15％，v/v)時，利用中等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(比如突變的Bst或Bca)進行低溫熱循環(huán)延伸反應(yīng)，能獲得長度從250bp到2kb的序列特異性擴增產(chǎn)物(圖3)。
由此可見，，當反應(yīng)體系中存在低濃度的甘油或乙二醇(如15％，v/v)作為降低DNA變性溫度的試劑時，利用中等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進行低溫熱循環(huán)延伸反應(yīng)，能獲得序列特異性擴增產(chǎn)物。中等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶包括野生型Bst、突變型Bst和Bca DNA聚合酶等，它們的最適反應(yīng)溫度在65℃左右，容易在70℃左右失活的聚合酶。在本低溫循環(huán)延伸反應(yīng)體系中，短于或長于25bp的引物都可獲得序列特異性的擴增產(chǎn)物(圖4)。但是Klenow片斷不能產(chǎn)生可用于進一步分析的足量PCR擴增產(chǎn)物(圖4)；而熱穩(wěn)定Taq酶的突變體(如AmpliTaqTM和ThermoSequenaseTM)在測序反應(yīng)時，無法獲得可用于進一步分析的序列特異性擴增產(chǎn)物。在最適條件下的高溫(95℃變性)循環(huán)擴增反應(yīng)中，這兩種酶一般能延伸退火在模板上的引物，但對富含GC的模板例外。與利用中等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進行的低溫循環(huán)延伸反應(yīng)相比，在高溫下的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的低進行性比較突出，特別是GC富含模板的測序反應(yīng)。熱穩(wěn)定的DNA聚合酶在模板GC富含區(qū)的下游無法產(chǎn)生序列特異性的ddNTP終止物，而中等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶能成功地克服相應(yīng)序列(圖5)。
當利用中等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進行上述低溫熱循環(huán)延伸反應(yīng)時，退火和延伸溫度可都在45℃進行，也可以分別在37℃和50℃進行(圖6)。因此，以下條件A和B都可用于低溫循環(huán)反應(yīng)，從而有效地獲得特異性擴增產(chǎn)物(A)70℃ 30秒，45℃ 4分鐘，共35個循環(huán)；
(B)70℃ 30秒，37℃ 20秒，50℃ 3分鐘，共35個循環(huán)。
在利用熒光染料標記的ddNTP終止物的自動循環(huán)測序反應(yīng)中，條件B更合適些。
當本發(fā)明用于DNA循環(huán)測序反應(yīng)時，反應(yīng)體系包括一個引物、含15％甘油的反應(yīng)體系，和一個中等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。在ddNTP或其類似物(可熒光標記)存在下，單鏈寡核苷酸引物延伸后產(chǎn)生長短不一的特異性終止。上述引物可以是純化的單鏈或雙鏈DNA片斷，也可以是未純化的上述雙鏈低溫PCR產(chǎn)物。由于應(yīng)用本發(fā)明獲得的產(chǎn)物具有高度序列特異性，所以用作測序模板時，沒必要從反應(yīng)混和物中分離PCR產(chǎn)物。
Bst-II DNA聚合酶是Bst-I DNA聚合酶的突變體，它無論以即用型混合液或以干粉形式，在室溫下都有高度穩(wěn)定性，至少可保存8周。因此本發(fā)明可應(yīng)用于大規(guī)模自動熒光DNA測序反應(yīng)。


圖1是甘油對Bst-II DNA聚合酶5′-3′聚合活性的影響縱軸為剩余活性％橫軸為甘油濃度％(V/V)。
圖2是在40％甘油下進行低溫擴增反應(yīng)M GeneRulerTMDNA Ladder(MBI，F(xiàn)ermentus)1、在40％甘油下低溫PCR(模板16ng/ul)2、在40％甘油下低溫PCR(模板160ng/ul)。
圖3是不同長度的模板在35％甘油(泳道1)或15％甘油(泳道2)中的低溫熱循環(huán)延伸反應(yīng)。
擴增產(chǎn)物長度A 250bp；B 400bp；C 1Kb；D 2Kb圖4中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶和Klenow片段在17聚和30聚引物下的低溫循環(huán)擴增反應(yīng)
A用17聚引物進行的反應(yīng)A1Klenow片段用lakobashvili和Lapidot體系，A2Klenow片段用Bst反應(yīng)體系，A3Bst-1用Bst反應(yīng)體系，A4Bst-11用Bst反應(yīng)體系，A5Bca用Bst反應(yīng)體系；B用30聚引物進行的反應(yīng)B1Klenow片段用lakobashvili和Lapidot體系，B2Klenow片段用Bst反應(yīng)體系，B3Bst-1用Bst反應(yīng)體系，B4Bst-11用Bst反應(yīng)體系，B5Bca用Bst反應(yīng)體系；圖5是利用定溫儲存的Bst-11 DNA聚合酶預(yù)混和液進行高得真低溫循環(huán)測序反應(yīng)。A和B表示使用相同引物的同一模板的兩種自動熒光DNA測序結(jié)果。
圖6是在不使用甘油或使用15％甘油時，中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶Bst-11在不同反應(yīng)溫度下進行低溫循環(huán)延伸反應(yīng)1、未使用甘油；70℃30秒，37℃4分鐘，共35個循環(huán)；2、未使用甘油；70℃30秒，37℃20秒，45℃3分鐘，共35個循環(huán)；3、未使用甘油；70℃30秒，37℃20秒，50℃3分鐘，共35個循環(huán)；4、未使用甘油；70℃30秒，37℃20秒，60℃3分鐘，共35個循環(huán)；5、使用15％甘油；70℃30秒，37℃4分鐘，共35個循環(huán)；6、使用15％甘油；70℃30秒，37℃20秒，45℃3分鐘，共35個循環(huán)；7、使用15％甘油；70℃30秒，37℃20秒，50℃3分鐘，共35個循環(huán)；
8、使用15％甘油；70℃30秒，37℃20秒，60℃3分鐘，共35個循環(huán)；9、使用15％甘油；70℃30秒，45℃4分鐘，共35個循環(huán)。
實施例1 甘油對Bst-II DNA聚合酶5’-3’聚合活性的影響用以下方法確定在不同濃度的甘油中Bst-II DNA聚合酶的剩余活性(聚合酶根據(jù)美國專利No.6,165,765制備)(A)在0.5ml離心管中加入

5x反應(yīng)緩沖液100mM Tris-Cl(pH 8.5)，100mM MgCl2；小牛胸腺DNA1.5μg/μl，經(jīng)Dnase I活化。
以上混和物先用Speed-Vacuum真空抽干，再將如下試劑加入上述離心管，以獲得不同濃度的甘油濃度(1)甘油

(B)上述離心管65℃溫育30分鐘，將反應(yīng)混和物分別滴加在DE-81濾膜上，干燥后用液閃測定每張濾膜的放射性活度(X1)。濾膜用0.3M Na2HPO4室溫清洗三次，每次10分鐘。室溫晾干后再次測定每張濾膜的放射性活度(X2)。摻入率即為X2/X1。
剩余活性％＝甘油存在時放射性活度摻入率/沒有甘油存在時放射性活度摻入率如圖1所示，當甘油濃度小于20％(v/v)時，能增加Bst-II DNA聚合酶的活性。但高濃度的甘油對酶活性有抑制作用。
實施例240％甘油(v/v)對利用中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶進行的低溫循環(huán)延伸反應(yīng)的影響本實驗選用Bst-II DNA聚合酶。
模板pBluescript(+)正向引物5’GTAAAACGACGGCCAGT 3’反向引物5’AACAGCTATGACCATG 3’反應(yīng)步驟(A)在0.2ml離心管中加入模板(16ng/ul或160ng/ul 1ul正向引物(10pmol/ul) 2.5ul反向引物(10pmol/ul) 2.5uldNTP(每種2.5mM) 4ul5x反應(yīng)緩沖液 5ul(B)上述溶液用Speed-Vacuum真空抽干，并將下列試劑加入ddH2O 11.75ul80％甘油 11.25ulBst-II DNA聚合酶(1U/ul) 2ul(C)如下操作低溫循環(huán)70℃ 30秒45℃ 4分鐘共35個循環(huán)。
用1％瓊脂糖膠電泳，溴化乙錠染色，檢測反應(yīng)產(chǎn)物。
圖2的結(jié)果表明，在僅存在40％甘油作為降低雙鏈DNA變性溫度的試劑時，無論是用高濃度或是低濃度的模板，只能獲得長度不一的非特異性循環(huán)擴增產(chǎn)物。
實施例3使用低濃度甘油對利用中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶的低溫循環(huán)反應(yīng)的影響本實驗旨在表明將甘油濃度降至15％(v/v)，也能有效降低DNA的變性溫度，從而可利用中等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶獲得特異性的循環(huán)延伸反應(yīng)產(chǎn)物。
本實驗選用Bst-II DNA聚合酶。
本實驗選用四套不同的模板和引物，用來代表不同長度的待擴增DNA片段模板A pBluescript(+)，10ng/ul正向引物5’GTAAAACGACGGCCAGT 3’反向引物5’AACAGCTATGACCATG 3’模板B 水稻基因組BAC DNA，10ng/ul正向引物5’CTTAATTTAAGGTTCCGTG 3’反向引物5’GCATTGGTAAGCAATGG 3’模板C 探針DNA，50ng/ul正向引物5’ACAAAGCACTGAACCTG 3’反向引物5’TGGGACCTATCGTGTTG 3’模板D 水稻基因組BAC的亞克隆，50ng/ul正向引物5’CGAATTCCTGCAGCC 3’反向引物5’GAACTAGTGGATCCCCC 3’低溫循環(huán)延伸反應(yīng)如下操作(A)在0.2ml離心管中加入以下試劑模板(A，B，C或D) 1ul
正向引物(A，B，C或D)(10pmol/ul) 2.5ul反向引物(A，B，C或D)(10pmol/ul) 2.5uldNTP(每種2.5mM) 4ul5x反應(yīng)緩沖液 5ul(B)上述混和物用Speed-Vacuum真空抽干，再在離心管中加入以下試劑，從而在反應(yīng)體系中獲得35％或15％終濃度的甘油1. 35％甘油的體系 2.15％甘油的體系ddH2O 12.1ul ddH2O 18.3ul80％甘油 10.9ul 80％甘油 4.7ulBst-II DNA聚合酶(1U/ul)2ulBst-II DNA聚合酶(1U/ul) 2ul(C)低溫熱循環(huán)反應(yīng)步驟如下70℃ 30秒45℃ 4分鐘共35個循環(huán)反應(yīng)產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上樣電泳，并用溴化乙錠染色。從35％甘油的體系中獲得的反應(yīng)產(chǎn)物上樣在泳道1，從15％甘油體系中獲得的反應(yīng)產(chǎn)物上樣在泳道2。
圖3的實驗表明，在反應(yīng)體系中存在35％甘油作為降低DNA變性溫度的試劑時，當擴增的靶DNA片段較小時(250bp或400bp)，無法獲得擴增產(chǎn)物(圖3-A1和B1)；當擴增的DNA靶片段較長的(1Kb或2Kb)，酶促熱循環(huán)反應(yīng)同時產(chǎn)生了特異性和非特異性的產(chǎn)物(圖3-C1和D1)。
在反應(yīng)體系中存在15％甘油作為降低DNA變性溫度的試劑時，擴增的靶DNA片段在250bp到2Kb的范圍內(nèi)，都能用中等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶通過低溫熱循環(huán)獲得特異性擴增產(chǎn)物(圖A2，B2，C2和D2)。
圖3.不同長度的模板在35％甘油(泳道1)或15％甘油(泳道2)中的低溫熱循環(huán)延伸反應(yīng)。
擴增產(chǎn)物長度A.250bp；B.400bp；C.1Kb；D.2Kb根據(jù)以上反應(yīng)的結(jié)果，反應(yīng)體系中使用低濃度的甘油(比如終濃度約15％)作為降低DNA變性溫度的試劑時，可以用中等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶獲得特異性延伸反應(yīng)。
實施例4利用幾種中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶進行雙鏈模板低溫熱循環(huán)延伸反應(yīng)設(shè)計本實驗旨在表明，本發(fā)明中的中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶及其低溫熱循環(huán)反應(yīng)體系可用于不同長度的引物的特異性延伸反應(yīng)，不管引物的長度大于或小于20bp。
本實驗選用的聚合酶是Bst-I(系野生型，根據(jù)美國專利5,834,254制備)、Bst-II和Bca(TaKaRa公司)。Klenow片段(Sigma Chemical公司)用作熱不穩(wěn)定DNA聚合酶的對照(Iakobashvili和Lapidot)。
模板為水稻基因組BAC B414f7。
兩對引物分別是A17聚正向引物5’TAG CTA TCT AAC TTA ATT TA3’，17聚反向引物5’TTG TTT CTC TGA TGC ATT GG3’，B30聚正向引物5’TAG CTA TCT AAC TTA ATT TAA GGT TCC GTG3’，30聚反向引物5’TTG TTT CTC TGA TGC ATT GGT AAG CAA TGG3’.
低溫反應(yīng)體系(以下稱Bst體系)如下操作(A)在0.2ml離心管中加入如下試劑模板(5ng/ul) 1ul正向引物(15pmol/ul) 2.5ul
反向引物(15pmol/ul) 2.5uldNTP(每種2.5mM) 4ul5x反應(yīng)緩沖液 5ul(B).將上述組分真空抽干，并將如下試劑加入離心管中80％甘油 4.7ulDNA聚合酶(4U/ul) 2ulddH2O 18.3ul(C)如下操作熱循環(huán)70℃ 30秒37℃ 20秒50℃ 3分鐘共35個循環(huán)。
用1％瓊脂糖凝膠上樣檢測反應(yīng)產(chǎn)物，并用溴化乙錠染色。
另外也采用了Iakobashvili和Lapidot建議的Klenow片段的反應(yīng)體系(含Tris-HCl緩沖液的4.5M脯氨酸和17％甘油，以下稱Iakobashvili和Lapidot體系)，它的反應(yīng)產(chǎn)物與Bst體系的反應(yīng)產(chǎn)物一起上樣檢測(圖4)。
圖4.中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶和Klenow片段在17聚和30聚引物下的低溫循環(huán)擴增反應(yīng)。
A用17聚引物進行的反應(yīng)A1Klenow片段用Iakobashvili和Lapidot體系，A2Klenow片段用Bst反應(yīng)體系，A3Bst-I用Bst反應(yīng)體系A(chǔ)4Bst-II用Bst反應(yīng)體系，A5Bca用Bst反應(yīng)體系；
B用30聚引物進行的反應(yīng)B1Klenow片段用Iakobashvili和Lapidot體系，B2Klenow片段用Bst反應(yīng)體系，B3Bst-I用Bst反應(yīng)體系B4Bst-II用Bst反應(yīng)體系，B5Bca用Bst反應(yīng)體系；分子量標準參照物M1λDNA/Hind III，M2DL 2,000(TaKaRa公司，DNA片段分別為2000，1000，750，500，250，100bp.)圖4表明中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶，即野生型的Bst-I、突變型的Bst-II和Bca，在Bst反應(yīng)體系中，不管用17聚(A3-A5)還是30聚(B3-B5)引物，都能產(chǎn)生特異性擴增產(chǎn)物；而熱不穩(wěn)定的Klenow片段不管用17聚還是用30聚引物，無論在Bst反應(yīng)體系(A2和B2)還是在Iakobashvili和Lapidot體系(A1和B1)中，都沒有特異性擴增產(chǎn)物。
實施例5利用室溫儲存的Bst-II DNA聚合酶預(yù)混和液進行高保真低溫循環(huán)測序反應(yīng)本發(fā)明可以利用遺傳修飾的中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶(象Bst-II)對有富含GC區(qū)的模板進行測序反應(yīng)，而常用的熱穩(wěn)定DNA聚合酶(如AmpliTaqTM和ThermoSequenaseTM)由于其低進行性，無法獲得可用于測序的擴增產(chǎn)物。并且含有或不含有引物的預(yù)配制反應(yīng)混和液能在微離心管或酶標板中25℃至少保存8個星期。
例(以下稱Bst-II循環(huán)測序反應(yīng))選用Bst-II作為DNA聚合酶。
模板bg08，存在GC富含區(qū)，為水稻基因組BAC 129的亞克隆引物R5’GAA TTG GAG CTC CAC CGC GG3’預(yù)混和熒光標記ddNTP包括適量的R6G-ddATP、ROX-ddCTP、TAMRA-ddUTP和Bodipy F1-14-ddGTP，購自NENTMLife Sciences Products。
測序反應(yīng)按以下步驟進行(A)將下列試劑加入0.2ml離心管，并在24℃以下用Speed-Vacuum真空抽干引物(10pmol/ul) 1.5uldNTP(每種2.5mM) 1ul5×RB 5ul預(yù)混和熒光標記ddNTP 4ulBst-II DNA聚合酶(10U/ul) 1ul(B)在上述離心管中加入ddH2O 16.3ul80％甘油 4.7ul在23℃-25℃保存含上述成份的離心管8星期。
(C)反應(yīng)前，在預(yù)混和液中加入2.5ul模板(150ng/ul)和1.5ul引物。
(D)充分混勻后進行如下熱循環(huán)反應(yīng)70℃ 30秒，37℃ 20秒，45℃ 4分鐘，總計35個循環(huán)。
(E)加入2.5ul 3M NaOAc(pH5.2)和55ul 95％乙醇。將離心管上下顛倒數(shù)次，室溫放置20分鐘，以沉淀延伸產(chǎn)物。
(F)在室溫下12,000g離心20分鐘。
(G)吸去上清，沉淀用120ul 70％乙醇洗滌。
(H)將離心管上下顛倒數(shù)次，室溫放置15分鐘，12,000g離心10分鐘。
(I)45℃烘干沉淀，并用1.2ul上樣緩沖液溶解(去離子甲酰胺∶溶有50mg/ml藍色葡聚糖的25mM EDTA(pH8.0)為5∶1).
(J)95℃變性3分鐘，立即放在冰上。
(K)將所有樣品加到4.5％測序膠(6M尿素)上，利用ABI PRISMTM377DNA測序儀收集數(shù)據(jù)。并用相應(yīng)的Instrument File分析。
作為對照，相同的模板和引物用常用的商品化測序試劑盒ABI PrismTMBigDyeTMterminator cycle sequencing kit(ABI公司，使用AmpliTaq DNA聚合酶)和DYEnamicTMET terminator cycle sequencing kit(Amersham公司，使用ThermoSequenaseTMDNA聚合酶)按各自公司提供的步驟進行反應(yīng)。
圖5的測序結(jié)果表明，用含有AmpliTaq DNA聚合酶的ABI PrismTMBigDyeTMterminator cycle sequencing kit對存在GC富含區(qū)的模板進行測序時，無法獲得特異性的終止(圖5A)。與之相反，已經(jīng)在25℃預(yù)混和液中保存8個星期的Bst-II DNA聚合酶能成功地產(chǎn)生特異性的熒光標記ddNTP終止，使測序反應(yīng)得以進行(圖5B)。與ABI AmpliTaq試劑盒相似，AmershamDYEnamicTMET terminator cycle sequencing kit同樣在自動熒光DNA測序時無法克服模板中的GC富含區(qū)。
總之，Bst-II循環(huán)測序反應(yīng)體系能以即用型混和物的形式在室溫下至少保持穩(wěn)定8周，最適合大規(guī)模高保真自動DNA測序，尤其適合模板中的GC富含區(qū)。
圖5 GC富含區(qū)的DNA測序——使用AmpliTaq的ABI PrismTMBigDyeTMTerminator Cycle Sequencing Kit(A)與Bst-II DNA聚合酶測序系統(tǒng)(B)測序效果的比較。
圖5A和B表示使用相同引物的同一模板的兩種自動熒光DNA測序結(jié)果。所有測序反應(yīng)使用ABI 377測序儀。圖5A的陰影區(qū)表示被計算機認為不合格的部分序列。A＝使用AmpliTaqTM的ABI PrismTMBigDyeTMTerminatorCycle Sequencing Ready Reaction Kit的測序結(jié)果；B＝使用Bst-II循環(huán)測序反應(yīng)的結(jié)果。
實施例6利用中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶進行的熱循環(huán)延伸反應(yīng)最適溫度的確定本實驗旨在確定在反應(yīng)混合液使用15％甘油作為降低DNA變性穩(wěn)定的試劑時，中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶循環(huán)引物延伸反應(yīng)的最適溫度。
本實驗選用Bst-II DNA聚合酶。
模板一個水稻基因組BAC DNA正向引物5’CTT AAT TTA AGG TTC CGT G 3’反向引物5’GCA TTG GTA AGC AAT GG 3’低溫PCR如下操作(A)在0.2ml離心管，加入模板(10ng/ul) 1ul正向引物(10pmol/ul) 2.5ul反向引物(10pmol/ul) 2.5uldNTP(每種2.5mM) 4ul5x反應(yīng)緩沖液5ul(B)上述混和物用Speed-Vacuum真空抽干，并在離心管中加入以下試劑

(C)如下操作熱循環(huán)引物延伸反應(yīng)

反應(yīng)產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠上樣電泳，并用溴化乙錠染色(圖6)。
圖6.在不使用甘油或使用15％甘油時，中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶Bst-II在不同反應(yīng)溫度下進行的低溫循環(huán)延伸反應(yīng)。
1.未使用甘油；70℃ 30秒，37℃ 4分鐘，共35個循環(huán)；2.未使用甘油；70℃ 30秒，37℃ 20秒，45℃ 3分鐘，共35個循環(huán)；3.未使用甘油；70℃ 30秒，37℃ 20秒，50℃ 3分鐘，共35個循環(huán)；4.未使用甘油；70℃ 30秒，37℃ 20秒，60℃ 3分鐘，共35個循環(huán)；5.使用15％甘油；70℃ 30秒，37℃ 4分鐘，共35個循環(huán)；6.使用15％甘油；70℃ 30秒，37℃ 20秒，45℃ 3分鐘，共35個循環(huán)；7.使用15％甘油；70℃ 30秒，37℃ 20秒，50℃ 3分鐘，共35個循環(huán)；8.使用15％甘油；70℃ 30秒，37℃ 20秒，60℃ 3分鐘，共35個循環(huán)；9.使用15％甘油；70℃ 30秒，45℃ 4分鐘，共35個循環(huán)；圖6表明，對于中等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(象Bst-II)，在使用15％甘油作為降低DNA變性溫度試劑的反應(yīng)體系中，最為有效的熱循環(huán)引物退火和延伸可都在45℃進行(泳道9)，也可以分別在37℃和40℃-45℃進行。盡管反應(yīng)步驟3和5都能獲得特異性產(chǎn)物，但對于熒光標記的自動DNA測序反應(yīng)終止物來說，步驟3(70℃ 30秒，37℃ 20秒，50℃ 3分鐘，共35個循環(huán))效果更好(泳道7)。
實施例7利用含有Bst-II DNA聚合酶的即用預(yù)混和液得到的低溫循環(huán)擴增產(chǎn)物進行直接測序本實驗表明低溫引物延伸反應(yīng)的預(yù)配混和物，其中包含一種中等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(有時也可加入引物)，能在使用前于23℃至25℃分別保存在微離心管或96孔板中至少8周。并且擴增反應(yīng)產(chǎn)物不經(jīng)純化能直接用于自動DNA測序反應(yīng)。
反應(yīng)采用Bst-II DNA聚合酶，模板H525d9，水稻基因組BAC DNA正向引物5’TTT CAG GGT CCC TTA TAT CTC 3’，反向引物5’TCG CTT CTC CTC ATA ATC GAT 3’。
預(yù)混和熒光標記ddNTP包括適量的R6G-ddATP、ROX-ddCTP、TAMRA-ddUTP和Bodipy F1-14-ddGTP，購自NENTMLife Sciences Products。
實驗按以下步驟進行(A)在0.2ml離心管中加入下列試劑，然后在24℃以下真空抽干正向引物(10pmol/μl) 2μl反向引物(10pmol/μl) 2μldNTP(每種2.5mM) 2μl5x反應(yīng)緩沖液 5μlBst-II DNA聚合酶(10U/μl) 1μl抽干后，在離心管中加入下述試劑ddH2O16.3μl80％甘油 4.7μl反應(yīng)預(yù)混和物可在23℃至25℃至少保存8周。
(B)使用時，將下述試劑加入到預(yù)混和物中模板(2.5ng/μl)1μl
ddH2O 3μl(C)充分混勻后，如下操作低溫熱循環(huán)反應(yīng)70℃ 30秒，37℃ 20秒，45℃ 4分鐘，共35個循環(huán)。
(D)將純化的擴增產(chǎn)物測序(1)熱循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物上樣在1％低熔點瓊脂糖膠上電泳；(2)電泳后，切下合適大小的瓊脂糖膠塊，稱重；(3)分別加入0.04倍質(zhì)量的25×Conc.緩沖液(Roche公司)，65℃熔化15分鐘；(4)再在45℃溫育5分鐘，按1U/100mg的酶量加入瓊脂糖酶(1U/μl，Roche公司)，繼續(xù)溫育；(5)1小時后，加入1/10體積3M NaOAc(pH5.2)。冰上放置15分鐘，12,000g在4℃離心15分鐘；(6)上清用等體積的酚—氯仿抽提兩次，再用等體積的氯仿再抽提一次。12,000g離心5分鐘；(7)收集水相上清，加入3體積95％乙醇，冰上放置15放置后，12,000g在4℃離心15分鐘，用250μl 70％乙醇清洗，抽干后溶于20μlddH2O。
(8)用正向引物按上述5(c)到(k)的方法，使用以即用型反應(yīng)預(yù)混和物形式保存的含Bst-II DNA聚合酶的高保真低溫循環(huán)測序系統(tǒng)測序。
另外，7.(c)的擴增產(chǎn)物可不經(jīng)回收，稀釋后直接用于Bst-II測序系統(tǒng)，如下所述。
(1)將下列試劑加入0.2ml離心管，并在24℃以下用Speed-Vacuum真空抽干dNTP(每種2.5mM) 1ul5×RB 5ul預(yù)混和熒光標記ddNTP(NENTM) 4ulBst-II DNA聚合酶(10U/ul)1ul抽干后，在離心管中加入下述試劑ddH2O 0.35ul80％甘油 4.7ul可在23℃至25℃保存含上述成份的離心管至少8星期。
(2)反應(yīng)前，在預(yù)混和液中加入以下試劑稀釋20倍的反應(yīng)產(chǎn)物[7.(c)] 1ul正向引物(10pmol/ul) 1.5ulddH2O1.5ul(3)充分混勻后進行如下熱循環(huán)反應(yīng)70℃ 30秒，37℃ 20秒，45℃ 3分鐘，總計35個循環(huán)。
反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物如《5.利用室溫儲存的Bst-II DNA聚合酶預(yù)混和液進行高保真低溫循環(huán)測序反應(yīng)》所述經(jīng)沉淀、洗滌后上樣分析。上述兩種方法的DNA序列相同。測序結(jié)果表明，利用中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶進行的低溫循環(huán)延伸反應(yīng)能得到高度特異性的擴增產(chǎn)物，可不經(jīng)純化直接測序。
權(quán)利要求
1.一種延伸專一性的DNA低溫循環(huán)延伸方法包括a.在反應(yīng)體系中含有低濃度的甘油或乙二醇，存在有一種模板，一對長度短于或長于25bp的引物和一種野生型或修飾后的中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶的即用型反應(yīng)混合物，當溫度在變性溫度(~70℃)和退火溫度(約37℃)之間循環(huán)時DNA聚合酶能重復(fù)延伸引物，得到序列特異性擴增產(chǎn)物；b.擴增雙鏈DNA片斷直接用于循環(huán)測序反應(yīng)，該循環(huán)測序反應(yīng)包括加入大大過量引物、四種標準熒光標記的ddNTP終止物、一種中等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、適量四種ddNTP混合物及含有15％(V/V)甘油的緩沖體系，在80℃以下重復(fù)環(huán)引物延伸反應(yīng)若干次，得熒光標記ddNTP終止的不同長度延伸產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的延伸專一性的DNA低溫循環(huán)延伸方法，其特征在于反應(yīng)在甘油的濃度為5-35％，最適濃度為15％的溶液中進行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的延伸專一性的DNA低溫循環(huán)延伸方法，其特征在于中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶反應(yīng)溫度為37℃-70℃，最適反應(yīng)溫度為65±1℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的延伸專一性的DNA低溫循環(huán)延伸方法，其特征在于中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶與Bacillus stearothermophilus、Bacillus caldotenax或Bacillus caldolyticus的聚合酶的氨基酸至少存在95％同源性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的延伸專一性的DNA低溫循環(huán)延伸方法，其特征在于正向引物和反向引物的長度可短于或長于25bp。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的延伸專一性的DNA低溫循環(huán)延伸方法，其特征在于反應(yīng)體系中重復(fù)熱循環(huán)多次，雙鏈DNA的指定區(qū)域得到擴增。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的延伸專一性的DNA低溫循環(huán)延伸方法，其特征在于反應(yīng)體系中存在ddNTP或其類似物時，用單一引物重復(fù)擴增，得不同長度的特異性延伸終止。
8.根據(jù)權(quán)利要求1b所述的延伸專一性的DNA低溫循環(huán)延伸方法，其特征在于中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶可為野生型或修飾后的源自Bacillusstearothermophilus、Bacillus caldotenax或Bacillus caldolyticus DNA聚合酶，或者氨基酸序列與Bacillus stearothermophilus、Bacilluscaldotenax或Bacillus caldolyticus的聚合酶的氨基酸序列至少95％同源的中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求1a所述的延伸專一性的DNA低溫循環(huán)延伸方法，其特征在于即用反應(yīng)混和物含有一種中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶，它與一部分或所有與酶促DNA引物延伸反應(yīng)有關(guān)的成分預(yù)先混合，在80℃以下進行低溫循環(huán)引物延伸反應(yīng)或含有ddNTP類似物的特異延伸終止反應(yīng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1a所述的延伸專一性的DNA低溫循環(huán)延伸方法，其特征在于即用反應(yīng)混和物中中等穩(wěn)定DNA聚合酶可為野生型或修飾后源自Bacillus stearothermophilus、Bacillus caldotenax或Bacilluscaldolyticus的DNA聚合酶，或者氨基酸序列與Bacillusstearothermophilus、Bacillus caldotenax或Bacillus caldolyticus的DNA聚合酶的氨基酸序列至少存在95％同源的中等熱穩(wěn)定DNA聚合酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求1a所述的延伸專一性的DNA低溫循環(huán)延伸方法，其特征在于即用反應(yīng)混和物為干粉或預(yù)先配制的溶液。
12.根據(jù)權(quán)利要求1a所述的延伸專一性的DNA低溫循環(huán)延伸方法，其特征在于即用混和物預(yù)先分裝在微離心管或多孔反應(yīng)板中。
13.如權(quán)利要求1a即用型混和物用于大規(guī)模自動PCR擴增或大規(guī)模自動DNA測序反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具有高度延伸專一性的DNA低溫循環(huán)延伸反應(yīng)的方法,該方法采用低溫DNA擴增體系,使用短于25bp的引物得到有用的特異性產(chǎn)物,供測序或其他分析之需,本發(fā)明可用于大規(guī)模高保真PCR和自動熒光DNA循環(huán)測序反應(yīng)。
文檔編號C12N9/22GK1384203SQ0111760
公開日2002年12月11日 申請日期2001年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月30日
發(fā)明者洪國藩, 楊永杰, 朱嘉 申請人:香港科技創(chuàng)業(yè)股份有限公司