專(zhuān)利名稱(chēng)：人造血細(xì)胞相關(guān)基因－1的制作方法
一.研究領(lǐng)域本研究涉及人造血細(xì)胞分化相關(guān)基因-1(以下稱(chēng)Hemagene-1)基因全長(zhǎng)cDNA的分子克隆及功能研究。通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化合適的原核宿主細(xì)胞獲得表達(dá)蛋白質(zhì)；通過(guò)構(gòu)建真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞，經(jīng)篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)Hemagene-1的細(xì)胞株，穩(wěn)定表達(dá)Hemagene-1的細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變，表明該基因具有轉(zhuǎn)化活性；該基因在白血病細(xì)胞高表達(dá)，可能應(yīng)用于白血病細(xì)胞的診斷，或成為篩選抗白血病藥物的新靶點(diǎn)。
二.國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究眾所周知，基因的選擇表達(dá)決定了細(xì)胞的分化、發(fā)育、增殖和死亡等最基本的生命現(xiàn)象，研究胚胎階段基因選擇性表達(dá)即基因特定時(shí)相的開(kāi)或關(guān)是了解不同發(fā)育階段生理功能調(diào)控的關(guān)鍵。在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中，肝臟有非常特殊的歷程。早期的胚胎肝臟具有非常旺盛的增殖和分化能力，同時(shí)又是人體重要的造血器官，大約在出生前人體才由肝臟轉(zhuǎn)為骨髓造血。因此，此階段的肝組織既表達(dá)豐富的造血調(diào)控基因，也表達(dá)肝臟生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控基因。以往的研究表明從四月齡人胎肝組織中可發(fā)現(xiàn)和分離許多重要基因如肝再生增強(qiáng)因子(1)，絲/蘇氨酸激酶(2)和其它未知基因(3)等?；谏鲜隼碛?，比較胚胎肝和成人肝基因表達(dá)差異有望發(fā)現(xiàn)重要調(diào)控基因。
三.本發(fā)明總結(jié)本發(fā)明通過(guò)代表性差異顯示分析技術(shù)(Represention DifferentialAnalysis，RDA)，比較了四月齡人胎肝組織及正常成人肝組織基因表達(dá)的差異，首次成功地分離出人胎肝特異表達(dá)基因，命名為Hemagene-1，全長(zhǎng)cDNA，Hemagene-1基因全長(zhǎng)2166bp，包括110bp 5’-非翻譯區(qū)序列，602bp 3’-非翻譯區(qū)序列。該基因編碼484氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量為55.3kd。該基因具有轉(zhuǎn)化活性，高豐度表達(dá)在白血病細(xì)胞，可能應(yīng)用于診斷和治療白血病。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新基因，利用分子生物學(xué)技術(shù)首次提供了Hemagene-1的全長(zhǎng)c DNA序列及其生物學(xué)功能。
本發(fā)明提供了Hemagene-1編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列。
本發(fā)明提供了一種重組生產(chǎn)人Hemagene-1的方法，提供了一種含有Hemagene-基因的原核表達(dá)載體，利用它可以大量得到Hemagene-1蛋白。
本發(fā)明提供了一種含有Hemagene-1基因的真核表達(dá)載體及獲得穩(wěn)定表達(dá)Hemagene-1的細(xì)胞株，利用它可以得到Hemagene-1多肽。
四.主要圖表說(shuō)明為了更好地理解本研究?jī)?nèi)容，下面對(duì)主要附圖加以說(shuō)明

圖1顯示Hemagene-1的基因組結(jié)構(gòu)圖2顯示構(gòu)建的體外翻譯載體；圖3顯示體外翻譯結(jié)果圖4顯示PCR檢測(cè)Hemagene-1mRNA在不同組織中的表達(dá)表5顯示PCR檢測(cè)Hemagene-1在白血病患者外周血細(xì)胞的表達(dá)圖6顯示Northern雜交檢測(cè)Hemagene-1mRNA在不同腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)圖7顯示GFP-Hema融合表達(dá)載體的構(gòu)建圖8顯示GFP-Hema融合蛋白在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)圖9顯示Hemagene-1真核表達(dá)載體的構(gòu)建圖10顯示Hemagene-1反義真核表達(dá)載體的構(gòu)建圖11顯示Hemagene-1缺失體真核表達(dá)載體的構(gòu)建圖12顯示檢測(cè)Hemagene-1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞后，Hemagene-1mRNA在不同細(xì)胞株中的表達(dá)圖13顯示經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的表型變化；圖14顯示穩(wěn)定表達(dá)Hemagene-1細(xì)胞株侵襲性增加圖15顯示融合表達(dá)載體的構(gòu)建圖16顯示Hemagene-1在大腸桿菌中的融合表達(dá)結(jié)果五.詳細(xì)描述1.RNA提取用Trizol(Life Technologies，Inc.)分別提取四月齡人胎肝組織和正常成人肝組織總RNA如下，50-100mg肝組織加1mlTrizol，勻漿后在25-30放置5min，加入0.2ml氯仿/1mlTrizol，劇烈震蕩15min，取上層水相移入一新的EP管，加入0.5ml/1mlTrizol異丙醇，15-30沉淀10min，然后2-8，1200g離心10min，加入1ml 75％乙醇/Trizol洗滌一次，2-8，7500g離心5min，半干燥RNA，加入50ul無(wú)RNA酶去離子水，紫外分光光度計(jì)下計(jì)OD260/OD280接近2.0。2.差異片段的分離利用RDA(4)(Clontech Laboratories，Inc.)富集胎肝特異基因片段。具體過(guò)程如，用cDNA合成引物5’-TTTTGTACAAGTTNN-3’將胎肝和正常成人肝組織mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用Rsal限制性?xún)?nèi)切酶37消化1.5小時(shí)，經(jīng)過(guò)兩輪雜交，雜交條件為98變性1.5min.68雜交8小時(shí)或過(guò)夜。然后取雜交產(chǎn)物1ul進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25ml，反應(yīng)條件為94℃ 5min，94℃ 10sec，68℃30sec，72 1.5min，共27個(gè)循環(huán)。2.0％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，將已經(jīng)富集了胎肝特異基因片段轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5，涂板后隨機(jī)挑取53株克隆，用T7，SP6引物測(cè)序(DNA測(cè)序儀)，然后進(jìn)行序列分析，GeneBank Blast及EST庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)其中有一個(gè)約300bp的克隆片段即本研究Hemagene-1基因的部分序列(圖1)，其核苷酸序列與任何已知序列無(wú)同源性，隨后對(duì)其進(jìn)行了全長(zhǎng)cDNA的克隆。1 GGATAGTGGT GGGAACAGAC AAATAAGGAA GCGGGGAGGA CTGGATAATT51 GGTTTTCCCC CCTAAGAACA TTTATTTACG TCTTAAGAGC AGATAAGTGA101 CTAAGACTGA ACACATACAT TTTGTGGAGT ATATAGTTTT CTTGTAAATG151 CTGTTCAATT ATTAATGTAA CAGTAGCATC AAAATTTTAT TCAGGCTTTA201 GTTGACTCTT TTGGTCAGTT TTAACAATTC TCCTTAAAAG ATATTTTGGA251 GTGATGAATG TAGTTTACTT圖1 Hemagene-1基因的部分序列3.全長(zhǎng)cDNA的分離A.篩選cDNA文庫(kù)以RDA獲得的Hemagene-1cDNA(300bp)片段為探針，32P隨機(jī)引物法(Promega)標(biāo)記，菌落原位雜交篩選人四月胚胎肝cDNA文庫(kù)(5)，獲得的陽(yáng)性克隆以T7、SP6進(jìn)行序列測(cè)定得到一個(gè)約1.6kb的核苷酸序列(圖2)。1 GAACACTTTT CTGAAATATG TCAAGAAAGT AACATATATC AGGAGAATTT51 TTCTGAGTAC CAAGAAATAG CAGTACAAAA CCATTCTTCT GAAACATGCC101 AACATGTGTC TGAACCTGAA GACCTCTCTC CTAAAATGTA CCAAGAAATA151 TCTGTACTTC AAGACAATTC TTCCAAAATA TGCCAAGACA TGAAGGAACC201 TGAAGACAAC TCTCCTAACA CATGCCAAGT AATATCTGTA ATTCAAGACC251 ATCCTTTCAA AATGTACCAA GATATGGCTA AACGAGAAGA TCTGGCTCCT301 AAAATGTGCC AAGAAGCTGC TGTACCCAAA ATCCTTCCTT GTCCAACATC351 TGAAGACACA GCTGATCTGG CAGGATGCTC TCTTCAAGCA TATCCAAAAC401 CAGATGTGCC TAAAGGCTAT ATTCTTGACA CAGACCAAAA TCCAGCAGAA451 CCAGAGGAAT ACAATGAAAC AGATCAAGGA ATAGCTGAGA CAGAAGGCCT501 TTTTCCTAAA ATACAAGAAA TAGCTGAGCC TAAAGACCTT TCTACAAAAA551 CACACCAAGA ATCAGCTGAA CCTAAATACC TTCCTCATAA AACATGTAAC601 GAAATTATTG TGCCTAAAGC CCCCTCTCAT AAAACAATCC AAGAAACACC651 TCATTCTGAA GACTATTCAA TTGAAATAAA CCAAGAAACT 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GGTGGGCCCC AAGGCCAGGA TCCTAAAGCA CACCAGGAAG ATGCTAAAGA1451 TGCTTATACT TTTCCTCAAG AAATGAAAGA AAAACCCAAA GAAGAGCCAG1501 GAATACCAGC AATTCTGAAT GAGAGTCATC CAGAAAATGA TGTCTATAGT1551 TATGTTTTGT TTTAACAATT CTCAACCATA AAGTTGTGGT CCAATGGAAC1601 ATACAGCTTA ATAGTTTATG CGTGATTTTC TCAAAATATT GTAAAACTTT1651 TGACAATGCT CATTAATATT ATTTTTTCTA TTTGTAGACC ATATCTGAAA1701 GAAATAACAT TTTTTAAGGC TCTACCACAT AGACAATATC ATGCTAGAAT1751 GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTAT GTATGTATAG GTCGGGGAGA1801 GGATAGTGGT GGGAACAGAC AAATAAGGAA GCGGGGAGGA CTGGATAATT1851 GGTTTTCCCC CCTAAGAACA TTTATTTACG TCTTAAGAGC AGATAAGTGA1901 CTAAGACTGA ACACATACAT TTTGTGGAGT ATATAGTTTT CTTGTAAATG1951 CTGTTCAATT ATTAATGTAA CAGTAGCATC AAAATTTTAT TCAGGCTTTA2001 GTTGACTCTT TTGGTCAGTT TTAACAATTC TCCTTAAAAG ATATTTTGGA2051 GTGATGAATG TAGTTTACTT TTGTATTTGA ATTTTGATTT TCTATTTTTA2101 TTTTTTAAAT ATTGTATTTG TGCACAATGT ACATTAAATC ATTATTACAT2151 GAAAAAAAAA AAAAAA圖4顯示Hemagene-1全長(zhǎng)cDNA序列C.分析cDNA克隆用DNA Tools，BLAST等軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，序列分析揭示該基因含編碼484個(gè)氨基酸組成蛋白的開(kāi)放讀框，完整的核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列見(jiàn)圖5。起始密碼ATG位于111-113核苷酸，起始ATG起-3為A，+4為G，屬典型的Kozak序列，其上游同一編碼框有2個(gè)終止密碼，3’序列含2拷貝ATTTA序列，此元件表明該mRNA有較短的半衰期(6)，3’未發(fā)現(xiàn)AATAAA保守加尾序列’。BLAST檢索表明該基因定位于9號(hào)染色體的長(zhǎng)臂，其基因含四個(gè)內(nèi)含子(附圖1)。編碼的484個(gè)氨基酸組成蛋白質(zhì)不含已知的功能結(jié)構(gòu)域見(jiàn)圖5。4.體外翻譯將Hemagene-1編碼區(qū)cDNA亞克隆到pSP70質(zhì)粒(Promega)的SP6 RNA聚合酶啟動(dòng)子下游(附圖2)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒(Promega Kit)，然后根據(jù)試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行coupled reticulocyte lysate system(Promega)體外翻譯，用L-35Smethionine(Amersham)標(biāo)記，SDS-PAGE電泳，放射自顯影顯示結(jié)果。Luciferase SP6 control DNA(Promega)作對(duì)照。實(shí)驗(yàn)證實(shí)該基因確編碼分子量為55.3KD的蛋白質(zhì)，分子量與推測(cè)蛋白相符(附圖3)。Longost ORFs in extract from sequence NEW_FILE.001All frames 2166 base pairs Posltion1 to 2166. . . . . .1 GGT TAT GAA GAT AGG TAC TGT GGG TGT TAG AAA GAT TCA CGG CAA AAC AGG GAA GCA GCA TCT 6061 AGG CTG CTT GTG GAA GTC AGA CCA AAA TAG CAG GAA GGT ATT GCA GCA AGA TGG ATT TGG120M D 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E S H P E N D V P H Y V A F1561 TTT AAC AAT TCT CAA CCA TAA AGT TGT GGT CCA ATG GAA CAT ACA GCT TAA TAG TTT ATG 1620*1621 CGT GAT TTT CTC AAA ATA TTG TAA AAC TTT TGA CAA TGC TCA TTA ATA TTA TTT TTT CTA 16801681 TTT GTA GAC CAT ATC TGA AAG AAA TAA CAT TTT TTA AGG CTC TAC CAC ATA GAC AAT ATC 17401741 ATG CTA GAA TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTA TGT ATG TAT AGG TCG GGG AGA 18001801 GGA TAG TGG TGG GAA CAG ACA AAT AAG GAA GCG GGG AGG ACT GGA TAA TTG GTT TTC CCC 18601861 CCT AAG AAC ATT TAT TTA CGT CTT AAG AGC AGA TAA GTG ACT AAG ACT GAA CAC ATA CAT 19201921 TTT CTG GAG TAT ATA GTT TTC TTG TAA ATG CTG TTC AAT TAT TAA TGT AAC AGT AGC ATC 19801981 AAA ATT TTA TTC AGG CTT TAG TTG ACT CTT TTG GTC AGT TTT AAC AAT TCT CCT TAA AAG 20402041 ATA TTT TGG ACT GAT GAA TGT AGT TTA CTT TTG TAT TTG AAT TTT GAT TTT CTA TTT TTA 21002101 TTT TTT AAA TAT TGT ATT TGT GCA CAA TGT ACA TTA AAT CAT TAT TAC ATG AAA AAA AAA 21602161 AAA AAA 2166圖5顯示Hemagene-1的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列5.PCR檢測(cè)Hemagene-1基因在不同組織中的分布為研究Hemagene-1在不同組織的分布情況，采用經(jīng)多種管家基因標(biāo)定的Multiple tissue cDNA(Clontech)作模板，以PCR檢測(cè)Hemagene-1 mRNA，PCR擴(kuò)增于PCR擴(kuò)增儀GeneAmp PCR System 9700上進(jìn)行，反應(yīng)體積為94℃ 1min，55℃1min，72℃ 1min，共30個(gè)循環(huán)，在同一條件下，以G3PDH作內(nèi)對(duì)照。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖中電泳，凝膠成像儀掃描成像。結(jié)果見(jiàn)附圖4，可見(jiàn)在正常成人的腦、心、腎、肝、肺、肌肉、扁桃體、外周血細(xì)胞等多種組織中表達(dá)量極低或不表達(dá)，而在骨髓、胚胎肝組織中呈高豐度表達(dá)。檢測(cè)10例急性白血病病人和1例淋巴瘤病人Hemagene-1的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中7例急性淋巴細(xì)胞白血病病人的骨髓和外周血中均有高豐度Hemagene-1的表達(dá)，而3例急非淋白血病病人外周血中則未檢出Hemagene-1的表達(dá)(表1)。
表1白血病患者外周血Hemagene-1表達(dá)編號(hào) 診斷 Hemagene-1表達(dá)1 急淋 ++2 急淋 +3 非急淋-4 急淋 +++5 非急淋-6 急淋 ++7 急淋 ++8 非急淋-9 急淋 +++10 正常人-11 正常人-12 正常人-6.Northern雜交檢測(cè)Hemagene-1在不同腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)K562，HL60和MO7e(人白血病細(xì)胞株)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于含10％新生牛血清(GiBco)的RPMI1640培養(yǎng)液，MO7e另加G-CSF(5ng/ml)；KBV細(xì)胞(人喉癌細(xì)胞株)，HTC細(xì)胞(鼠肝癌細(xì)胞株)，HepG2細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞株)，HLE細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞株)，Hep2細(xì)胞(人喉癌細(xì)胞株)，NIH3T3細(xì)胞(小鼠成纖維細(xì)胞株)，7402細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞株)均貼壁培養(yǎng)于含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)液均含各100mg/L的氨芐青霉素和鏈霉素，37℃，5％CO2完全飽和濕度下培養(yǎng)。
用Trizol TM試劑盒提取各種細(xì)胞總RNA。1mlTrizol裂解1×107細(xì)胞，然后加入氯仿200ml抽提一次，1200g4離心15min，取上清，用0.5ml無(wú)水乙醇沉淀，75％乙醇洗2次，干燥后用DEPC處理的無(wú)菌去離子水溶解RNA。紫外分光光度儀測(cè)定其濃度。
取總RNA20μg進(jìn)行1％甲醛變性凝膠電泳，轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，膜在80℃烘干2h，加入6×SSC，5×Denhardt’s，0.5％SDS，100μg/ml鮭精DNA，在68℃預(yù)雜交1h，加入變性探針，68℃雜交過(guò)夜；以含0.5％SDS的2×SSC室溫下洗膜2次，再用含0.5％SDS的0.5％×SSC 50℃洗膜2次，室溫干燥后-70℃下放射自顯影。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hemagene-1僅在K562和MO7e細(xì)胞中高表達(dá)，而在其余多種細(xì)胞株中不表達(dá)(附圖5)。7.Hemagene-1的細(xì)胞定位 以構(gòu)建的pGEM-Hemagene-1質(zhì)粒模扳，利用PCR擴(kuò)增Hemagene-1編碼區(qū)cDNA，PCR引物為P15’CGG AAT TCA TGG ATT TGGGAA AGG AC-3’；P25’-GGG GTA CCT AAA ACA AAA CAT AAC TAT AG-3；PCR條件為94℃ 30sec，50℃ 60sec，72℃ 90sec，共25循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI，Kpen I酶切后亞克隆到pGFP-C1質(zhì)粒(附圖6)，質(zhì)粒經(jīng)序列分析確認(rèn)無(wú)誤后，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染cos-7細(xì)胞，細(xì)胞在含10％FCS DMEM，5％CO237℃條件下培養(yǎng)24-48小時(shí)，熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白表達(dá)情況。同時(shí)，轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄因子ETS GFP表達(dá)載體及荷空pGFP-C1載體作為對(duì)照。發(fā)現(xiàn)發(fā)綠色熒光的表達(dá)產(chǎn)物主要集中在細(xì)胞核，與已知表達(dá)在細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄因子ETS-1一致(7)，而GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光為彌漫性(附圖7)，提示Hemagene-1基因表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞核內(nèi)。8.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 利用PCR擴(kuò)增Hemagene-1編碼區(qū)cDNA，條件同上，將其亞克隆于pcDNA3.1(+)CMV啟動(dòng)子下游，構(gòu)建成真核表達(dá)載體(附圖8)，同時(shí)將cDNA反向插入pcDNA3.1(+)CMV啟動(dòng)子下游，構(gòu)建成反向真核表達(dá)載體(附圖9)；此外，利用PCR構(gòu)建成N端缺失175個(gè)氨基酸的缺失體表達(dá)載體(Hemagene-)(附圖10)。上述質(zhì)粒均經(jīng)序列分析確認(rèn)后用于實(shí)驗(yàn)。H-ras-V12-pBabe表達(dá)載體由Huibin Sun博士惠贈(zèng)(7)。9.細(xì)胞培養(yǎng)及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株建立 將構(gòu)建的不同載體(各20μg)以脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，細(xì)胞在含10％FCS的DMEM，5％CO237℃條件下培養(yǎng)24小時(shí)，以G418(400μg/ml)篩選2周后挑取單克隆，繼續(xù)在含G418(200μg/ml)條件下培養(yǎng)。10.穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的鑒定 提取轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒細(xì)胞的RNA，以RT-PCR檢測(cè)Hemagene-1mRNA表達(dá)情況。以O(shè)ligo(dT)為起始引物，加入總RNA 1ug，72℃10mins后，依次加入無(wú)RNase水，10×RT buffer，25mM MgCl2，250uM dNTPs，RNasin和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)體系為20ul，42℃保溫15mins后，加去離子水至100ul。并以此為模板進(jìn)行PCR。PCR引物為P1 5’-ATG TAC CAA GAA ATA TCTGTA-3；P25’-TAA AAC AAA ACA TAA CTA TAG-3’。PCR反應(yīng)體積為25ul，循環(huán)條件為94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min，共30循環(huán)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳，凝膠成像儀掃描成像。特異擴(kuò)增帶分子量為1.0kb.將成功構(gòu)建的Hemagene-1正向、反向及N-端缺失175個(gè)氨基酸缺失體的真核表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，G418篩選4周后，PCR法檢測(cè)不同細(xì)胞株Hemagene-1 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NIH3T3細(xì)胞本身不表達(dá)Hemagene-1，但在轉(zhuǎn)染特定質(zhì)粒后細(xì)胞表達(dá)Hemagene-1 mRNA(附圖11)。細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染正向表達(dá)載體的細(xì)胞株(兩株)發(fā)生明顯的形態(tài)改變(附圖12)，細(xì)胞表面變得平滑而折光性增加，并失去了正常成纖維細(xì)胞平行生長(zhǎng)的走向及接觸抑制現(xiàn)象，細(xì)胞之間相互交叉并形成多層，而轉(zhuǎn)染反向、缺失體及荷空載體的細(xì)胞株形態(tài)無(wú)明顯的變化，提示Hemagene-1可能具有使細(xì)胞轉(zhuǎn)化的活性。
11.軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)將G418篩選后分別轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的NIH3細(xì)胞用胰酶消化，通過(guò)25G 5/8的無(wú)菌注射針頭分散成單個(gè)細(xì)胞，以每35mm直徑培養(yǎng)皿種植1×103個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞均勻分布于1ml作為頂層的含20％FCS、0.3％超純瓊脂的DMEM培養(yǎng)液中，隨后均勻鋪在已鋪好1ml作為底層的含0.6％超純瓊脂、20％FCS的DMEM上，兩層瓊脂中均含G418(400ug/ml)，每組各三皿。每4-5天添加一次新的頂層瓊脂，兩周后在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)集落超過(guò)50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。將所建不同細(xì)胞株接種軟瓊脂，培養(yǎng)14天后計(jì)數(shù)超過(guò)50個(gè)細(xì)胞集落數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2，兩株正向克隆細(xì)胞株，軟瓊脂形成獨(dú)立克隆效率分別為32.5％和33.6％，而轉(zhuǎn)染反向、缺失體、荷空載體的細(xì)胞株則無(wú)錨定獨(dú)立生長(zhǎng)的能力，不能形成獨(dú)立的克隆。
表2不同細(xì)胞軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成數(shù)細(xì)胞 克隆形成(％)pcDNA3.1 0Hemagene-132.5Hemagene-233.6Hemagene-as 0Hemagene- 0H-RasV12-pBabe50.212.鼠成瘤實(shí)驗(yàn)分別將轉(zhuǎn)染有不同質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞(1×106)注射到4周雌性裸鼠的背部皮下，每組三只，每周觀察兩次，至接種后20周。成瘤鼠照相后處死，取瘤作病理組織學(xué)檢查。四周后六只注射高表達(dá)Hemagene-1 NIH3T3細(xì)胞株的裸鼠均形成腫瘤(附圖13)，并迅速長(zhǎng)大。病理組織學(xué)檢查顯示該瘤具有纖維細(xì)胞瘤樣特性，提示該腫瘤源于轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞。其它各組觀察20周未見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)(表3)。
表3裸鼠腫瘤形成細(xì)胞 腫瘤形成pcDNA 0/3Hemagene-1 3/3Hemagene-2 3/3Hemagene-as 0/3Hemagene- 0/313.侵襲實(shí)驗(yàn)(8)分別將轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞以1.0×105/ml的密度接種在含0.1％BSA DMEM的0.gum孔徑包被基質(zhì)膠的培養(yǎng)杯(購(gòu)自BectonDickinsono)中，下層為無(wú)血清DMEM，5％CO2、37℃條件培養(yǎng)12小時(shí)后，刮去內(nèi)層細(xì)胞，外層用含1％結(jié)晶紫的甲醇染色，倒置培養(yǎng)杯，光鏡下觀察穿越底膜的細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將建立的不同NIH3T3細(xì)胞株接種0.8um孔徑包被基質(zhì)膠的培養(yǎng)杯，培養(yǎng)12小時(shí)后觀察細(xì)胞透膜能力以評(píng)價(jià)細(xì)胞的侵襲性，結(jié)果顯示穩(wěn)定表達(dá)Hemagene-1細(xì)胞株較荷空載體的細(xì)胞株侵襲性增強(qiáng)約10倍左右，而轉(zhuǎn)染反向、缺失體及荷空載體的細(xì)胞株之間侵襲性無(wú)顯著性差異(附圖14)。14.Hemagene-1在大腸桿菌中的表達(dá)利用PCR擴(kuò)增Hemagene-1編碼區(qū)DNA，將其亞克隆到PGEX-4T-2質(zhì)粒的KpnI和EcoRI位點(diǎn)(附圖15)，轉(zhuǎn)化EcoliDH5α，利用酶切，PCR鑒定重組質(zhì)粒，其序列用核苷酸序列分析確定。將含重組質(zhì)粒的細(xì)菌在含100Ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液過(guò)液培養(yǎng)，次日按1∶10稀釋用新鮮含100Ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)至OD600＝0.8，加IPTG至終濃度為1.0mM，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，收集細(xì)菌，用SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)蛋白，結(jié)果表明表達(dá)蛋白約占細(xì)菌總蛋白的42％(圖16)。
總之，本發(fā)明克隆了一種新的基因序列，并確認(rèn)其具有轉(zhuǎn)化活性。通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化合適的原核宿主細(xì)胞獲得表達(dá)蛋白質(zhì)；通過(guò)構(gòu)建真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞，經(jīng)篩選后獲得了穩(wěn)定表達(dá)Hemagene-1的細(xì)胞株。穩(wěn)定表達(dá)Hemagene-1的NIH3T3細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變，表明該基因具有轉(zhuǎn)化活性；該基因在白血病細(xì)胞高表達(dá)，可能應(yīng)用于白血病細(xì)胞的診斷，或成為篩選抗白血病藥物的新靶點(diǎn)。
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1.一種具有轉(zhuǎn)化活性基因—人造血細(xì)胞分化相關(guān)基因-1(Hemagene-1)，具有以下核苷酸序列1 GGTTATGAAG ATAGGTACTG TGGGTGTTAG AAAGATTCAC GGCAAAACAG51 GGAAGCATCT AGGCTGCTTG TGGAAGTCAG ACCAAAATAG CAGGAAGGTA101 TTGCAGCAAG ATGGATTTGG GAAAGGACCA ATCTCATTTG AAGCACCATC151 AGACACCTGA CCCTCATCAA GAAGAGAACC ATTCTCCAGA AGTCATTGGA201 ACCTGGAGTT TGAGAAACAG AGAACTACTT AGAAAAAGAA AAGCTGAAGT251 GCATGAAAAG GAAACATCAC AATGGCTATT TGGAGAACAG AAAAAACGCA301 AGCAGCAGAG AACAGGAAAA GGAAATCGAA GAGGCAGAAA GAAACAACAA351 AACACAGAAT TGAAGGTGGA GCCTCAGCCA CAGATAGAAA AGGAAATAGT401 GGAGAAAGCA CTGGCACCTA TAGAGAAAAA AACTGAGCCA CCTGGGAGCA451 TAACCAAAGT ATTTCCTTCA GTAGCCTCCC CGCAAAAAGT TGTGCCTGAG501 GAACACTTTT CTGAAATATG TCAAGAAAGT AACATATATC AGGAGAATTT551 TTCTGAGTAC CAAGAAATAG CAGTACAAAA CCATTCTTCT GAAACATGCC601 AACATGTGTC TGAACCTGAA GACCTCTCTC CTAAAATGTA CCAAGAAATA651 TCTGTACTTC AAGACAATTC TTCCAAAATA TGCCAAGACA TGAAGGAACC701 TGAAGACAAC TCTCCTAACA CATGCCAAGT AATATCTGTA ATTCAAGACC751 ATCCTTTCAA AATGTACCAA GATATGGCTA AACGAGAAGA TCTGGCTCCT801 AAAATGTGCC AAGAAGCTGC TGTACCCAAA ATCCTTCCTT GTCCAACATC851 TGAAGACACA GCTGATCTGG CAGGATGCTC TCTTCAAGCA TATCCAAAAC901 CAGATGTGCC TAAAGGCTAT ATTCTTGACA CAGACCAAAA TCCAGCAGAA951 CCAGAGGAAT ACAATGAAAC AGATCAAGGA ATAGCTGAGA CAGAAGGCCT1001 TTTTCCTAAA ATACAAGAAA TAGCTGAGCC TAAAGACCTT TCTACAAAAA1051 CACACCAAGA ATCAGCTGAA CCTAAATACC TTCCTCATAA AACATGTAAC1101 GAAATTATTG TGCCTAAAGC CCCCTCTCAT AAAACAATCC AAGAAACACC1151 TCATTCTGAA GACTATTCAA TTGAAATAAA CCAAGAAACT CCTGGGTCTG1201 AAAAATATTC ACCTGAAACG TATCAAGAAA TACCTGGGCT TGAAGAATAT1251 TCACCTGAAA TATACCAAGA AACATCCCAG CTTGAAGAAT ATTCACCTGA1301 AATATACCAA GAAACACCGG GGCCTGAAGA CCTCTCTACT GAGACATATA1351 AAAATAAGGA TGTGCCTAAA GAATGCTTTC CAGAACCACA CCAAGAAACA1401 GGTGGGCCCC AAGGCCAGGA TCCTAAAGCA CACCAGGAAG ATGCTAAAGA1451 TGCTTATACT TTTCCTCAAG AAATGAAAGA AAAACCCAAA GAAGAGCCAG1501 GAATACCAGC AATTCTGAAT GAGAGTCATC CAGAAAATGA TGTCTATAGT1551 TATGTTTTGT TTTAACAATT CTCAACCATA AAGTTGTGGT CCAATGGAAC1601 ATACAGCTTA ATAGTTTATG CGTGATTTTC TCAAAATATT GTAAAACTTT1651 TGACAATGCT CATTAATATT ATTTTTTCTA TTTGTAGACC ATATCTGAAA1701 GAAATAACAT TTTTTAAGGC TCTACCACAT AGACAATATC ATGCTAGAAT1751 GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTAT GTATGTATAG GTCGGGGAGA1801 GGATAGTGGT GGGAACAGAC AAATAAGGAA GCGGGGAGGA CTGGATAATT1851 GGTTTTCCCC CCTAAGAACA TTTATTTACG TCTTAAGAGC AGATAAGTGA1901 CTAAGACTGA ACACATACAT TTTGTGGAGT ATATAGTTTT CTTGTAAATG1951 CTGTTCAATT ATTAATGTAA CAGTAGCATC AAAATTTTAT TCAGGCTTTA2001 GTTGACTCTT TTGGTCAGTT TTAACAATTC TCCTTAAAAG ATATTTTGGA2051 GTGATGAATG TAGTTTACTT TTGTATTTGA ATTTTGATTT TCTATTTTTA2101 TTTTTTAAAT ATTGTATTTG TGCACAATGT ACATTAAATC ATTATTACAT2151 GAAAAAAAAA AAAAAA
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述核苷酸序列，它包括所列DNA序列的互補(bǔ)鏈，以及類(lèi)似的人工合成序列；
3.權(quán)利要求1所述DNA序列，它編碼人造血細(xì)胞分化相關(guān)蛋白-1(Hemagene-1)，具有以下氨基酸序列1 MDLGKDQSHL KHHQTPDPHQ EENHSPEVIG TWSLRNRELL RKRKAEVHEK51 ETSQWLFGEQ KKRKQQRTGK GNRRGRKKQQ NTELKVEPQP QIEKEIVEKA101 LAPIEKKTEP PGSITKVFPS VASPQKVVPE EHFSEICQES NIYQENFSEY151 QEIAVQNHSS ETCQHVSEPE DLSPKMYQEI SVLQDNSSKI CQDMKEPEDN201 SPNTCQVISV IQDHPFKMYQ DMAKREDLAP KMCQEAAVPK ILPCPTSEDT251 ADLAGCSLQA YPKPDVPKGY ILDTDQNPAE PEEYNETDQG IAETEGLFPK301 IQEIAEPKDL STKTHQESAE PKYLPHKTCN EIIVPKAPSH KTIQETPHSE351 DYSIEINQET PGSEKYSPET YQEIPGLEEY SPEIYQETSQ LEEYSPEIYQ401 ETPGPEDLST ETYKNKDVPK ECFPEPHQET GGPQGQDPKA HQEDAKDAYT451 FPQEMKEKPK EEPGIPAILN ESHPENDVYS YVLF*
4.一種重組生產(chǎn)權(quán)利要求3所述蛋白的方法，其特征是將權(quán)利要求1-2所述DNA序列置于合適載體，轉(zhuǎn)化原核或真核宿主細(xì)胞，得到Hemagene-1多肽；
全文摘要
通過(guò)比較四月齡人胎肝組織及成年人肝組織基因表達(dá)差異,成功分離一種新基因,命名為造血細(xì)胞分化相關(guān)基因－1(Hemagene－1)。該基因mRNA全長(zhǎng)2166bp核苷酸,包括110bp5’－非翻譯序列,602bp3’－非翻譯序列,Hemagene－1基因編碼484氨基酸組成,分子量為55.3kd的蛋白質(zhì)。該基因具有轉(zhuǎn)化活性,高豐度表達(dá)在白血病細(xì)胞,與造血細(xì)胞分化密切相關(guān)。該基因可能用于診斷和治療白血病。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1388130SQ0111826
公開(kāi)日2003年1月1日 申請(qǐng)日期2001年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月25日
發(fā)明者楊曉明, 閭軍, 許望翔, 江巖, 李長(zhǎng)燕 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所