專利名稱：：一種可溯源酶校準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是一種用于檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的、具良好互換性的可溯源酶校準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)體外診斷試劑的
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：酶活力的測定是臨床檢驗(yàn)中最頻繁的測定項(xiàng)目，意義重要。但由于現(xiàn)存的臨床檢驗(yàn)體系和酶反應(yīng)的特點(diǎn)，在實(shí)際工作中存在很多的問題。首先酶活性濃度的測定是通過間接推算法獲得的；其次，影響酶濃度正確測定的因素很多；另外，臨床檢驗(yàn)中由于檢測樣本的取樣量小，每份樣本可能需做多項(xiàng)檢驗(yàn)；結(jié)果需要及時(shí)報(bào)告等原因，在一定程度上犧牲了方法特異性和準(zhǔn)確性。致使同一種酶存在多種參考范圍，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測的結(jié)果缺乏可比性，病人每到一個(gè)醫(yī)院都要重新化驗(yàn)。重復(fù)檢測浪費(fèi)了大量的社會資源。提高和保證臨床檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性，使不同方法、廠家、實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)結(jié)果具有可比性，檢測結(jié)果可以溯源，即臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化，一直是臨床檢驗(yàn)界及有關(guān)行業(yè)與部門的重要課題。建立和保證檢驗(yàn)結(jié)果的溯源性在國際上也已成為法律要求。例如歐盟指令(Directive98/79/EC)/國際標(biāo)準(zhǔn)化組織ISO17511等要求臨床檢驗(yàn)產(chǎn)品必須保證其結(jié)果的溯源性。參考物質(zhì)需要提供給診斷試劑生產(chǎn)者以使其能夠溯源到參考方法。必須將校準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)控物質(zhì)定值的計(jì)量學(xué)溯源性用于室內(nèi)質(zhì)控以及試驗(yàn)系統(tǒng)的評價(jià)。圖1為從參考物質(zhì)到常規(guī)檢測結(jié)果的溯源鏈。顯然酶參考物質(zhì)的應(yīng)用可以改進(jìn)方法間的符合程度，使優(yōu)良檢測體系所測定的結(jié)果具有溯源性?，F(xiàn)在國際的參考物質(zhì)來自于各種動物或者人的組織，其下一級產(chǎn)品校準(zhǔn)物質(zhì)主要為國外的大公司根據(jù)本身產(chǎn)品特點(diǎn)生產(chǎn)，缺乏溯源性分析，不同產(chǎn)品的定值存在矛盾。另外，校準(zhǔn)物質(zhì)的互通性也存在問題，數(shù)據(jù)顯示室間質(zhì)量評價(jià)/能力驗(yàn)證中用到的質(zhì)控品、校準(zhǔn)品也常有基質(zhì)效應(yīng)，研制互通性良好、具有溯源性的校準(zhǔn)物質(zhì)是臨床檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的必要保證。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種可以溯源至國際(國家一級)參考物質(zhì)的與人各種血清標(biāo)本具良好互換性的酶校準(zhǔn)物質(zhì)，用于臨床檢驗(yàn)中常規(guī)診斷試劑的校準(zhǔn)物質(zhì)的配備以及醫(yī)院的日常質(zhì)量控制；為完成整個(gè)溯源鏈的建立提供技術(shù)支撐，促進(jìn)中國醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)事業(yè)的規(guī)范發(fā)展的可溯源酶校準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法。本發(fā)明通過如下技術(shù)方案完成可溯源酶校準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法包括1、人源性血清酶基因克隆以及表達(dá)；2、高純度基因重組血清酶的純化；3、互換性良好的基質(zhì)物質(zhì)制備；4、校準(zhǔn)物質(zhì)候選物互換性驗(yàn)證；5、分裝后均一性測定；6、冷凍干燥。所述的人源性血清酶基因克隆以及表達(dá)是酶基因表達(dá)載體pET21b-HMCK具體構(gòu)建過程以及蛋白質(zhì)優(yōu)化表達(dá)。所述的高純度基因重組血清酶的純化主要通過三個(gè)反應(yīng)步驟完成酶的高純度蛋白第一分級分離；陰離子交換層析；第三分子篩凝膠層析；然后測定并去除雜酶。所述的互換性良好的基質(zhì)物質(zhì)制備是以健康人血清為基質(zhì)原料制備各種血清酶的校準(zhǔn)物質(zhì)，希望得到與臨床各種血清樣本互換性好的較準(zhǔn)物質(zhì)；它包括基質(zhì)物質(zhì)制備和酶血清基質(zhì)物質(zhì)評估。所述的校準(zhǔn)物質(zhì)候選物互換性驗(yàn)證主要包括血清基質(zhì)成分酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和校準(zhǔn)物質(zhì)候選物互換性分析所述的分裝及均一性測定，它是在無菌條件下，以經(jīng)過計(jì)量的移液槍進(jìn)行定量分裝，分裝后隨即取樣20瓶，用cfas作為校準(zhǔn)品，采用Roche-7170系統(tǒng)常規(guī)方法進(jìn)行測定；分別測定20瓶樣本的混合瓶樣本以及單瓶樣本；其中混合瓶樣本測定40次，單瓶樣本各測定2次。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)后確定分裝樣本是否均勻；所述的冷凍干燥是在確認(rèn)樣本均一性良好的基礎(chǔ)上，于-80。C預(yù)凍10小時(shí)，立即轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行冷凍干燥，完畢后進(jìn)行在位壓蓋并于-20。C下保存。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，具有方法可靠，用途廣泛，有良好互換性和可溯源性等特點(diǎn)。具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)的介紹可溯源酶校準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法包括1、人源性血清酶基因克隆以及表達(dá)；2、高純度基因重組血清酶的純化；3、互換性良好的基質(zhì)物質(zhì)制備；4、校準(zhǔn)物質(zhì)候選物互換性驗(yàn)證；5、分裝后均一性測定；6、冷凍干燥。所述的人源性血清酶基因克隆以及表達(dá)是酶基因表達(dá)載體pET21b-HMCK具體構(gòu)建過程以及蛋白質(zhì)優(yōu)化表達(dá)。所述的高純度基因重組血清酶的純化主要通過三個(gè)反應(yīng)步驟完成酶的高純度蛋白第一分級分離；陰離子交換層析；第三分子篩凝膠層析；然后測定并去除雜酶。所述的互換性良好的基質(zhì)物質(zhì)制備是以健康人血清為基質(zhì)原料制備各種血清酶的校準(zhǔn)物質(zhì)，希望得到與臨床各種血清樣本互換性好的較準(zhǔn)物質(zhì)；它包括基質(zhì)物質(zhì)制備和酶血清基質(zhì)物質(zhì)評估。所述的校準(zhǔn)物質(zhì)候選物互換性驗(yàn)證主要包括血清基質(zhì)成分酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和校準(zhǔn)物質(zhì)候選物互換性分析所述的分裝及均一性測定，它是在無菌條件下，以經(jīng)過計(jì)量的移液槍進(jìn)行定量分裝，分裝后隨即取樣20瓶，用cfas作為校準(zhǔn)品，采用Roche-7170系統(tǒng)常規(guī)方法進(jìn)行測定；分別測定20瓶樣本的混合瓶樣本以及單瓶樣本；其中混合瓶樣本測定40次，單瓶樣本各測定2次。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)后確定分裝樣本是否均勻；所述的冷凍干燥是在確認(rèn)樣本均一性良好的基礎(chǔ)上，于-80。C預(yù)凍10小時(shí)，立即轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行冷凍干燥，完畢后進(jìn)行在位壓蓋并于-20。C下保存。實(shí)施例以肌酸激酶為例一.人源性血清酶基因克隆以及表達(dá)1.肌酸激酶基因表達(dá)載體pET21b-HMCK具體構(gòu)建過程以人肌肌酸激酶全長的cDNA(Genbank:NM-001824)為模板，分別設(shè)計(jì)肌酸激酶上、下游引物，上游弓I物為GATTATTCATATGCCATTCGGTAACACC;下游引物為AAGGATCCTACTTCTGGGCGGG;用相應(yīng)的引物擴(kuò)增出目的片段后，用Ndel和BamHI雙酶切后，克隆至pET21b質(zhì)粒中，構(gòu)建表達(dá)載體pET21b-HMCK。分別用單酶切以及多種雙酶切進(jìn)行鑒定，并測序，與預(yù)期結(jié)果一致。2.蛋白質(zhì)優(yōu)化表達(dá)將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)至BL21菌種中，于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37'C振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌生長到OD值0.60.8時(shí)，加入IPTG至終濃度至0.1~0.8mM，發(fā)現(xiàn)大量的包涵體，進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)后，得到相對高量的肌酸激酶產(chǎn)物。二、高純度基因重組血清酶的純化1.通過主要的三個(gè)反應(yīng)步驟完成肌酸激酶的高純度蛋白。分級分離將超聲破碎后的上清首先經(jīng)過37%硫酸銨對肌酸激酶蛋白質(zhì)粗提液進(jìn)行分級分離，得到純度約60%以上的初級產(chǎn)物。陰離子交換層析將以上初級產(chǎn)物上樣至DEAEfastflow陰離子交換柱中，0~0.6M的NaCl梯度進(jìn)行梯度洗脫，對洗脫組分進(jìn)行分步收集，測定CK的活性，收集具有CK活性的、純度>95%的樣品用PEG20000進(jìn)行濃縮(10ml左右)。分子篩凝膠層析洗脫后，收集具有CK活性的蛋白樣品，行SDS-PAGE電泳，收集純度>99%的樣品用PEG20000進(jìn)行濃縮。結(jié)果發(fā)現(xiàn)純度最高的肌酸激酶在SDS-PAGE電泳己經(jīng)看不到任何雜帶。蛋白為單一條帶，純度大于99%。2.測定并去除雜酶用常規(guī)的生物化學(xué)方法測定其他酶例如丙氨酸轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶含量，未見有明顯的雜酶存在。以此高純度的肌酸激酶作為兩種基質(zhì)參考物質(zhì)的添加物。三、互換性良好的基質(zhì)物質(zhì)制備本發(fā)明以健康人血清為基質(zhì)原料制備各種血清酶的校準(zhǔn)物質(zhì)，希望得到與臨床各種血清樣本互換性好的較準(zhǔn)物質(zhì)。1.基質(zhì)物質(zhì)制備由于酶特性的差別，每一種酶的基質(zhì)物質(zhì)制備方法略有差異。肌酸激酶血清基質(zhì)物質(zhì)制備方法如下選擇健康獻(xiàn)血志愿者(HBsAg，HCV抗體、HIV抗體陰性)樣本，篩選肌酸激酶活性在正常值范圍內(nèi)的樣本，作為基質(zhì)物質(zhì)制備的原料。將已經(jīng)篩選的血清…去顆?！ブ?-穩(wěn)定性…測試分析主要成分等幾個(gè)歩驟后確定最后的基質(zhì)物質(zhì)。2.肌酸激酶血清基質(zhì)物質(zhì)評估分別評價(jià)血清基質(zhì)物質(zhì)的重要生化指標(biāo)總蛋白、白蛋白、各種血清酶的活力、常見離子K、Na、Cl、Ca、Mg、P濃度，并與正常的血清進(jìn)行比較。最后以最接近正常血清指標(biāo)，且澄清度、穩(wěn)定性高的基質(zhì)物質(zhì)2作為參考物質(zhì)制備的候選血清基質(zhì)物質(zhì)?；|(zhì)物質(zhì)2與原血清成分的比較見表1。表12種血清基質(zhì)物質(zhì)與原血清成分的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>CI90mmol/L93.1/90.8mmol/L92.5mmol/LCa1.87mmol/L2.02/1.87mmol/L1.92mmol/LMg0.8mmol/L0.94/0.88mmol/L0.81mmol/LP1.49mmol/L1.40/1.43m歸l/L1.46mmol/L四、校準(zhǔn)物質(zhì)候選物互換性驗(yàn)證1.血清基質(zhì)成分肌酸激酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)將高純度的肌酸激酶，稀釋2000倍左右，分別添加至血清基質(zhì)成分中，使肌酸激酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的酶濃度范圍在250IU/L左右，即為正常人范圍的2倍左右。2校準(zhǔn)物質(zhì)候選物互換性分析分別用IFCC參考方法和4種常規(guī)方法對同樣的樣本進(jìn)行測試，比較肌酸激酶校準(zhǔn)物質(zhì)與各種血清樣本的互換性。測定方法-CK候選參考物質(zhì)20次/每份，l類對照物質(zhì)正常人以及患者標(biāo)本。2次/份；2類對照物質(zhì)國際參考物質(zhì)ERM;3次/份3類對照物質(zhì)Olympus校準(zhǔn)品、Roche高、低值質(zhì)控血清、Cfas2次/份。表2是以IFCC參考方法以及常規(guī)方法在7170全自動生化分析儀分別用Roche和Olympus系統(tǒng)測試以上各種樣本的結(jié)果。7600全自動生化分析儀分別用Roche和Olympus系統(tǒng)測試以上各種樣本的結(jié)果略。表2IFCC方法與兩種常規(guī)方法檢測各種樣本的結(jié)果編號IFCC/SD/CVRoche7170/SD/CV01vm應(yīng)7170/ERM102.0/0.91924/0.9097.3/0.91924/0.95102.5/0.6364/0.62Roche質(zhì)檸471.4/0.07071/0.02454.6/2.286545/0.50486.9/3.275664/0.67Roche質(zhì)檸156.9/1.27279/0.81153.0/0.98995/0.65157.9/0.77782/0.49Roche校準(zhǔn)345.3/0.56569/0.16333.0/1.83848/0.55352.4/1.41421/0.40Olvmmis校156.7/0.28284/0.18154.1/0.28284/0.18148.2/0.77782/0.53HERUM-CK257.9/2.31121/0.90256.0/1.05177/0.40271.2/1.40536/0.50158.4/0.35355/0.6157.6/0.49497/0.8661.0/0.70711/1.16259.3/0.28284/0.4850.3/0.14142/0.2853.0/0.98995/1.873218.5/0.49497/0.23172.7/1.69706/0.98186.7/0.14142/0.08470.8/0.70711/1.0064.3/0.21213/0.3368.1/0.70711/1.047565.0/0.14142/0.2254.7/1.13137/2.0757.3/0.21213/0.37683.2/1.41421/1.7062.0/0.6364/1.0365.7/0.6364/0.97779.3/0.84853/1.0767.7/1.83848/2.7271.4/0.6364/0.89895.6/0.35355/0.3785.1/0.84853/1.0089.9/0.91924/1.02995.2/1.20208/1.2690.2/1.06066/1.1894.7/0.42426/0.451096.3/0.63640/0.6688.7/0.91924/1.0493.3/0.21213/0.2311101.6/1.69706/1.6775.5/0.77782/1.0377.8/0.07071/0.0912104.7/0.4142/0.1494.1/0.21213/0.2399.0/1.06066/1.0713167.3/0.07071/0.04126.9/1.3435/1.06133.1/1.48492/U214127.8/0.49497/0.39124.6/1.3435/1.08131.1/0.91924/0.7015118,4/1.3435/0.14101.0/1.06066/1.05100.8/1.48492/1.4716258.0/0.84853/0.33230.9/2.47487/1.07245.7/2.47487/1.0117238.7/1.20208/0.50226.1/1.69706/0.75239.1/1.62635/0.6818214.5/0.91924/0.4382.6/2.54558/1.39194.2/2.47487/1.2719137.1/0.28284/0.21〗30.7/1.06066/0.81135.9/0.91924/0.6820139.6/0.21213/0.15115.8/1.41421/1.22121.8/0.84853/0.7021214.1/0/0.00221.6/0.49497/0.22241.0/0.35355/0.1522226.6/0.49497/0.22217.0/0.35355/0.16234.9/1.55563/0.6623207.9/0.49497/0.2497.4/0.84857/0.43212.7/1.69706/0.8024242.2/0.07071/0.03231.2/0.07071/0.03247.2/0.91924/0.3725240.5/1.3435/0.56231.4/1.48492/0.64249.7/0.6364/0.2526298.5/0.42426/0.14286.3/0.6364/0.22311.5/1.06066/0.3427329.6/1.41421/0.43317.4/0.49497/0.16340.2/1.06066/0.3128394.7/1.06066/0.27378.4/0.42426/0.11412.9/0.14142/0.03.29368.2/0.49497/0.13365.1/1.69706/0.46402.1/1.06066/0.26301350.0/5.79829/0.431357.8/2.96985/0.221414.7/4.73762/0.3331394.9/0.21213/0.05384.6/3.25269/0.85409.4/4.17193/1.0232423.7/0.35355/0.09401.5/0.84853/0.21433.3/1.48492/0.3433526.7/1.3435/0.26495.2/0.2〗213/0,04543.2/1.41421/0.2634565.8/0.77782/0.14561.0/0.84853/0.15571.4/2.75772/0.4835638.0/2.96985/0.47608.8〃細(xì)36/1.15673.3/0.84853/0.1336672.1/0.70711/0.11667.1/3.33345/0.35707.9/5.44472/0.7737741.7/2.47487/0.33713.6/1.48492/0.21771.8/3.53553/0.4638989.6/3.18198/0.321019.4/5.72756/0.561071.9/2.82843/0.2639178.5/1.41421/0.79176.2/0.84853/0.48187.1/2.33345/1.2540215.7/1.06066/0.49206.6/0.56569/0.27222.2/0.49497/0.22評估方法按照國際通行的有關(guān)文件EP-9對參考方法和2臺7170、7600生化儀的4種常規(guī)方法(Roche/OLYMPUS系統(tǒng))的做方法學(xué)比較。以IFCC參考方法測試的結(jié)果與各種常規(guī)方法測試結(jié)果作圖，判斷兩種方法的回歸方式，并求出方程。具體結(jié)果見以下的圖表。用IFCC的參考方法和4種常規(guī)方法對血清樣本進(jìn)行測試后的回歸曲線顯示本實(shí)驗(yàn)肌酸激酶較準(zhǔn)物質(zhì)候選物的測試結(jié)果均可落在回歸曲線上，即肌酸激酶候選物與血清樣本有很好的互換性。五、分裝及均一性測定在無菌條件下，以經(jīng)過計(jì)量的移液槍進(jìn)行定量分裝，分裝后隨即取樣20瓶，用cfas作為校準(zhǔn)品，采用Roche-7170系統(tǒng)常規(guī)方法進(jìn)行測定。分別測定20瓶樣本的混合瓶樣本以及單瓶樣本。其中混合瓶樣本測定40次，單瓶樣本各測定2次。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)后確定分裝樣本是否均勻。六、冷凍干燥確認(rèn)樣本均一性良好的基礎(chǔ)上，于-80。C預(yù)凍IO小時(shí)，立即轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行冷凍干燥，完畢后進(jìn)行在位壓蓋并于-20。C下保存。權(quán)利要求1、一種可溯源酶校準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于它包括1、人源性血清酶基因克隆以及表達(dá)；2、高純度基因重組血清酶的純化；3、互換性良好的基質(zhì)物質(zhì)制備；4、校準(zhǔn)物質(zhì)候選物互換性驗(yàn)證；5、分裝后均一性測定；6、冷凍干燥。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的可溯源酶校準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于所述的人源性血清酶基因克隆以及表達(dá)是酶基因表達(dá)載體pET21b-HMCK具體構(gòu)建過程以及蛋白質(zhì)優(yōu)化表達(dá)。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的可溯源酶校準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于所述的高純度基因重組血清酶的純化主要通過三個(gè)反應(yīng)步驟完成酶的高純度蛋白第一分級分離；陰離子交換層析；第三分子篩凝膠層析；然后測定并去除雜酶。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的可溯源酶校準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于所述的互換性良好的基質(zhì)物質(zhì)制備是以健康人血清為基質(zhì)原料制備各種血清酶的校準(zhǔn)物質(zhì)，希望得到與臨床各種血清樣本互換性好的較準(zhǔn)物質(zhì)；它包括基質(zhì)物質(zhì)制備和酶血清基質(zhì)物質(zhì)評估。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的可溯源酶校準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于所述的校準(zhǔn)物質(zhì)候選物互換性驗(yàn)證主要包括血清基質(zhì)成分酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和校準(zhǔn)物質(zhì)候選物互換性分析。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的可溯源酶校準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于所述的分裝及均一性測定，它是在無菌條件下，以經(jīng)過計(jì)量的移液槍進(jìn)行定量分裝，分裝后隨即取樣20瓶，用cfas作為校準(zhǔn)品，采用Roche-7170系統(tǒng)常規(guī)方法進(jìn)行測定；分別測定20瓶樣本的混合瓶樣本以及單瓶樣本；其中混合瓶樣本測定40次，單瓶樣本各測定2次；經(jīng)過統(tǒng)計(jì)后確定分裝樣本是否均勻；所述的冷凍干燥是在確認(rèn)樣本均一性良好的基礎(chǔ)上，于-80。C預(yù)凍10小時(shí)，立即轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行冷凍干燥，完畢后進(jìn)行在位壓蓋并于-20。C下保存。全文摘要一種可溯源酶校準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，它包括1.人源性血清酶基因克隆以及表達(dá)；2.高純度基因重組血清酶的純化；3.互換性良好的基質(zhì)物質(zhì)制備；4.校準(zhǔn)物質(zhì)候選物互換性驗(yàn)證；5.分裝后均一性測定；6.冷凍干燥；所述的人源性血清酶基因克隆以及表達(dá)是酶基因表達(dá)載體pET21b-HMCK具體構(gòu)建過程以及蛋白質(zhì)優(yōu)化表達(dá)；所述的高純度基因重組血清酶的純化主要通過三個(gè)反應(yīng)步驟完成酶的高純度蛋白第一分級分離；陰離子交換層析；第三分子篩凝膠層析；然后測定并去除雜酶；具有方法可靠，用途廣泛，有良好互換性和可溯源性等特點(diǎn)。文檔編號C12Q1/25GK101532047SQ20091009784公開日2009年9月16日申請日期2009年4月20日優(yōu)先權(quán)日2009年4月20日發(fā)明者周海夢,孟凡國,李海龍,胡衛(wèi)江申請人:嘉興博泰生物科技發(fā)展有限公司