專利名稱：：一種保健食品中去氫表雄酮的前處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于食品分析領(lǐng)域，特別涉及一種保健食品中去氫表雄酮固相萃取的前處理方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：去氫表雄酮是人體腎上腺素一種，對于預(yù)防和治療心血管疾病、增強免疫力等有一定效果，目前尚不準(zhǔn)添加于保健食品中。中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了保健食品中去氫表雄酮的測定方法，其主要采用了簡單提取方法后進行測定，但是保健食品的成分復(fù)雜，使用甲醇提取時會同時提取出許多干擾物質(zhì)，從而嚴重影響檢測的準(zhǔn)確度與靈敏度。因此需要對樣品進行凈化處理。凈化樣品常采用液液萃取、蛋白沉淀和固相萃取方法。液液萃取，該法操作繁瑣、費時，需要消耗大量的有機溶劑，導(dǎo)致成本高和對環(huán)境污染，并且常有乳化現(xiàn)象，使用這種凈化方法費時費力，不能進行即時檢測，已經(jīng)逐步被其他一些提取方法所取代。柱層析法，由于柱的裝填是即用即填，所以不同人員裝填的效果不同，對重現(xiàn)性有較大的影響，而且吸附劑顆粒較細，淋洗速度比較慢，因此商業(yè)上出現(xiàn)了固相萃取。固相萃取(SolidPhaseExtraction)是從八十年代中期開始發(fā)展起來的一項樣品前處理技術(shù)，由液固萃取和液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來，主要通過固相填料對樣品組分的選擇性吸附及解吸過程，實現(xiàn)對樣品的分離，純化和富集。主要目的在于降低樣品基質(zhì)干擾，提高檢測靈敏度。固相萃取(SPE)較常用的方法是使液體樣品通過一吸附劑，保留其中被測物質(zhì)，再選用適當(dāng)強度溶劑沖去雜質(zhì)，然后用少量良溶劑洗脫被測物質(zhì)，從而達到快速分離凈化與濃縮的目的；也可選擇性吸附干擾雜質(zhì)，而讓被測物質(zhì)流出；或同時吸附雜質(zhì)和被測物質(zhì)，再使用合適的溶劑選擇性洗脫被測物質(zhì)。相對傳統(tǒng)的液液萃取，固相萃取的優(yōu)點是它集樣品富集及精華與一身，提高檢測靈敏度，比液液萃取更快，節(jié)省有機溶劑的用量，且重現(xiàn)性好，方法穩(wěn)定。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明目的是提供一種保健食品中去氫表雄酮的前處理方法，并用于實際樣品檢測。本發(fā)明通過保留其中被測物質(zhì)去氫表雄酮，再選用適當(dāng)強度溶劑沖去雜質(zhì)，然后用少量溶劑洗脫被測物質(zhì)，從而達到快速分離凈化與濃縮的目的。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種保健食品中去氫表雄酮的前處理方法，包括如下步驟(1)保健食品中去氫表雄酮樣品的提取粉碎后的保健食品樣品0.5lg，加入510mL甲醇，超聲1020min，離心或者過濾，得到含有去氫表雄酮的樣品提取液，蒸干，用體積百分比為20%30%甲醇的ddH20復(fù)溶，得到復(fù)溶后的樣品提取液。(2)保健食品中去氫表雄酮固相萃取的凈化將復(fù)溶后的樣品提取液過C18固相萃取柱，將固相萃取柱活化、平衡后，上樣，等樣品提取液流出后，用體積百分比30%甲醇+體積百分比為12%氨水作為淋洗液淋洗，去除極性較大的基質(zhì)；抽干SPE(固相萃取)柱后，加入體積百分比為90%甲醇洗脫目標(biāo)物質(zhì)去氫表雄酮，并將其定容到10mL，得到凈化后樣品溶液。所述粉碎后的保健食品樣品過80目篩。凈化后樣品溶液的檢測可采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)或高效液相色譜法(HPLC)進行檢測。所述酶聯(lián)免疫吸附法檢測時將步驟(2)中凈化后樣品溶液稀釋IO倍，按照酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)程序進行檢測。采用包被抗原濃度為100ng/mL，酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為1/3000，在室溫下競爭反應(yīng)30min。洗板，顯色10min，終止反應(yīng)，測定A45o吸光值。所述高效液相色譜法將步驟(2)中凈化后樣品溶液過0.45pm濾膜直接上機檢測。采用紫外檢測器，其檢測波長為215nm，流動相為體積比為甲醇:水=70:30，流速為l.OmL/min。檢測結(jié)果用回收率來評價，回收率在80%120%表明檢測結(jié)果準(zhǔn)確，樣品前處理方法可靠、實用。所述保健食品中去氫表雄酮的前處理方法應(yīng)用于檢測食品中去氫表雄酮。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和積極效果1、本發(fā)明極大的降低了樣品基質(zhì)的干擾，在使用ELISA檢測時，使用較低的稀釋倍數(shù)便可實現(xiàn)檢測，使用HPLC時，檢測樣品的基線平穩(wěn)，出現(xiàn)的雜峰明顯減少，因此檢測的靈敏度明顯提高。2、本發(fā)明與液液萃取相比，減少了有機溶劑的用量，同時也減少了萃取過程中去氫表雄酮樣品的損失，使回收率更高，結(jié)果更可靠。3、本發(fā)明的方法不但適用于去氫表雄酮含量的高效液相法，也使用于ELISA檢測痕量分析，具有重要應(yīng)用價值。具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1一種保健食品中去氫表雄酮樣品的前處理方法，包括如下步驟(1)保健食品中去氫表雄酮樣品的提取取過80目篩粉碎后的減肥茶樣品lg于具塞容器中，加入10mL甲醇，置于KES-1000超聲波清洗機上，超聲20min，3000r/min離心3min，取上清液，反復(fù)提取三次，合并上清液，得到含有去氫表雄酮的樣品提取液，40。C旋轉(zhuǎn)蒸干，得到蒸干的樣品，備用。(2)保健食品中去氫表雄酮固相萃取的凈化:將蒸干的樣品使用5mL的體積百分比20n/。甲醇的ddH2O溶解，得到復(fù)溶后的樣品提取液；按照下面的程序過C18固相萃取柱進行固相萃取，具體方法為(a)活化加入5mL甲醇，使甲醇在柱子靜置2min，打開閥門，使甲醇自然流出；(b)平衡先加入5mLddH20，使其自然流出，當(dāng)剩余1mm時，再加入5mLddH20繼續(xù)平衡一次；(c)上樣將復(fù)溶后的樣品提取液加入到SPE柱中，使其慢慢流下，控制其流速〈lmL/min;(d)淋洗淋洗液為體積百分比30%的甲醇+體積百分比2%的NH3.H20，進行淋洗，所有的液體都流出且需要將柱子里殘留的溶液一并抽干；(e)洗脫使用體積百分比90%的甲醇將目標(biāo)物完全洗脫下來，并收集洗脫液；(f)蒸干定容到10mL，得到凈化后樣品溶液。(3)凈化后樣品的檢測定容到10mL的凈化后樣品溶液經(jīng)固相萃取后經(jīng)ELISA檢測，其檢測條件為采用包被抗原濃度為100ng/mL，酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為1/3000，在室溫下競爭反應(yīng)30min，洗板，顯色10min，終止反應(yīng)，測定A45。吸光值。按照直接競爭ELISA方法，對凈化后樣品溶液進行ELISA檢測，檢測得到的回收率在81%115%之間，其平均變異系數(shù)為7.25%。表1經(jīng)固相萃取后添加回收結(jié)果(ELISA)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由此可知，兩個樣品回收率都在80120%之間，且方法的變異系數(shù)<15%，因此該檢測方法準(zhǔn)確可靠，該樣品前處理方法極大的消除了基質(zhì)干擾，使檢測結(jié)果更可靠。實施例2一種保健食品中去氫表雄酮樣品的前處理方法，包括如下步驟(1)保健食品中去氫表雄酮樣品的提取取過80目篩粉碎后的減肥茶樣品lg于具塞容器中，加入5mL甲醇，置于KES-1000超聲波清洗機上，超聲10min，3000r/min離心3min，取上清液，反復(fù)提取三次，合并上清液，得到含有去氫表雄酮的樣品提取液，40'C旋轉(zhuǎn)蒸干，得到蒸干的樣品，備用。(2)保健食品中去氫表雄酮固相萃取的凈化:將蒸干的樣品使用5mL的體積百分比30。/。甲醇的ddH2O溶解，得到復(fù)溶后的樣品提取液，按照下面的程序過C18固相萃取柱進行固相萃取，具體方法為(a)活化加入5mL甲醇，使甲醇在柱子靜置2min,打開閥門，使甲醇自然流出；(b)平衡先加入5mLddH20，使其自然流出，當(dāng)剩余1mm時，再加入5mLddH20繼續(xù)平衡一次；(c)上樣將復(fù)溶后的樣品提取液加入到SPE柱中，使其慢慢流下，控制其流速<1mL/min;(d)淋洗淋洗液為體積百分比30%的甲醇+體積百分比2%NH3.H20，進行淋洗，所有的液體都流出，且需要將柱子里殘留的溶液一并抽干；(e)洗脫使用體積百分比90%的甲醇將目標(biāo)物完全洗脫下來，并收集洗脫液；(f)蒸干定容到10mL，得到凈化后樣品溶液。(3)凈化后樣品的檢測定容到10mL的凈化后樣品溶液經(jīng)固相萃取后經(jīng)HPLC檢測，檢測條件為采用紫外檢測器，其檢測波長為215nm，流動相為甲醇:水(體積比)=70:30，流速為1.0mL/min。按照HPLC檢測程序，對凈化后樣品溶液進行HPLC檢測，檢測得到的回收率在93.31%102%之間，其平均變異系數(shù)為7.8%。表2經(jīng)固相萃取后添加回收結(jié)果(HPLC)添加量(mg/g)測量值(mg/g)回收率(％)CV(%)0.050.049799.469.50.10扁393.318.40.50.5112102.255.5由此可知，樣品回收率都在93.31102.5%之間，且方法的變異系數(shù)<10%，因此該檢測方法準(zhǔn)確可靠，該樣品前處理方法極大的消除了基質(zhì)干擾，使檢測結(jié)果更可靠。實施例3一種保健食品中去氫表雄酮樣品的前處理方法，包括如下步驟(1)保健食品中去氫表雄酮樣品的提取取過80目篩粉碎后的減肥茶樣品0.5g于具塞容器中，加入8mL甲醇，置于KES-1000超聲波清洗機上，超聲15min，過濾，取上清液，反復(fù)過濾三次，合并上清液，得到含有去氫表雄酮的樣品提取液，40'C旋轉(zhuǎn)蒸干，得到蒸干的樣品，備用。(2)保健食品中去氫表雄酮固相萃取的凈化:將蒸干的樣品使用5mL的體積百分比25%甲醇的(1膽20溶解，得到復(fù)溶后的樣品提取液，按照下面的程序過C18固相萃取柱進行固相萃取，具體方法為(a)活化加入5mL甲醇，使甲醇在柱子靜置2min，打開閥門，使甲醇自然流出；(b)平衡先加入5mLddH20，使其自然流出，當(dāng)剩余1mm時，再加入5mLddH20繼續(xù)平衡一次；(c)上樣將復(fù)溶后的樣品提取液加入到SPE柱中，使其慢慢流下，控制其流速<1mL/min;(d)淋洗:淋洗液為體積百分比30%的甲醇+體積百分比1%NH3.H20，進行淋洗，所有的液體都流出，且需要將柱子里殘留的溶液一并抽干；(e)洗脫使用體積百分比90%的甲醇將目標(biāo)物完全洗脫下來，并收集洗脫液；(f)蒸干定容到10mL,得到凈化后樣品溶液。(3)凈化后樣品的檢測定容到IOmL的凈化后樣品溶液經(jīng)固相萃取后經(jīng)HPLC檢測，檢測條件為采用紫外檢測器，其檢測波長為215nm，流動相為甲醇:水=70:30，流速為1.0mL/min。按照HPLC檢測程序，對凈化后樣品溶液進行HPLC檢測，檢測得到的回收率在97.40%100.24%之間，其平均變異系數(shù)為4.21%。表2經(jīng)固相萃取后添加回收結(jié)果(HPLC)添加量(mg/g)測量值(mg/g)回收率(％)CV(%)0.050麓797.406.90.10細398.304.780.50.5012100.240.96由此可知，樣品回收率都在97.40%100.24%之間，且方法的變異系數(shù)<10%，因此該檢測方法準(zhǔn)確可靠，該樣品前處理方法極大的消除了基質(zhì)干擾，使檢測結(jié)果更可靠。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1、一種保健食品中去氫表雄酮的前處理方法，其特征在于包括如下步驟(1)保健食品中去氫表雄酮樣品的提取粉碎后的保健食品樣品0.5～1g，加入5～10mL甲醇，超聲10～20min，離心或者過濾，得到含有去氫表雄酮的樣品提取液，蒸干，用體積百分比為20％～30％甲醇的ddH2O復(fù)溶，得到復(fù)溶后的樣品提取液；(2)保健食品中去氫表雄酮固相萃取的凈化將復(fù)溶后的樣品提取液過C18固相萃取柱，將固相萃取柱活化、平衡后，上樣，等樣品提取液流出后，用體積百分比30％甲醇+體積百分比為1～2％氨水作為淋洗液淋洗固相萃取柱；抽干固相萃取柱后，加入體積百分比為90％甲醇洗脫去氫表雄酮，并將其定容到10mL，得到凈化后樣品溶液。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種保健食品中去氫表雄酮的前處理方法，其特征在于所述粉碎后的保健食品樣品過80目篩。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種保健食品中去氫表雄酮的前處理方法，其特征在于所述步驟(2)中凈化后樣品溶液采用酶聯(lián)免疫吸附法或高效液相色譜法進行檢測。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種保健食品中去氫表雄酮的前處理方法，其特征在于所述酶聯(lián)免疫吸附法是將步驟(2)中凈化后樣品溶液稀釋10倍，按照酶聯(lián)免疫吸附法程序進行檢測。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種保健食品中去氫表雄酮的前處理方法，其特征在于所述高效液相色譜法是將步驟(2)中凈化后樣品溶液過0.45pm濾膜直接上機檢測。6、權(quán)利要求15任一項所述的一種保健食品中去氫表雄酮的前處理方法應(yīng)用于檢測保健食品中去氫表雄酮。全文摘要本發(fā)明提供了一種保健食品中去氫表雄酮的前處理方法，屬于食品分析領(lǐng)域。該方法是稱取一定質(zhì)量的保健食品樣品加入一定體積甲醇，超聲10～20min，提取樣品中去氫表雄酮，采用C18固相萃取柱對提取的樣品進行處理，從而達到凈化的目的。經(jīng)過處理的樣品適用于保健食品中去氫表雄酮高效液相、酶聯(lián)免疫吸附法等檢測的樣品處理。本發(fā)明極大的降低了樣品基質(zhì)的干擾，使檢測的靈敏度明顯提高。文檔編號A23L1/015GK101536739SQ200910039019公開日2009年9月23日申請日期2009年4月27日優(yōu)先權(quán)日2009年4月27日發(fā)明者孫遠明,挺張,徐曉艷,楊金易,沈玉棟,弘王,敏石,雷紅濤申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)