專利名稱：活體珊瑚共生藻的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及水生生物的活體采集領域，具體涉及一種活體珊瑚共生藻的制 備方法。
背景技術：
珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動快捷高速，生物多樣性豐富，對于 調(diào)節(jié)、優(yōu)化和維持熱帶海洋環(huán)境作用顯著，具有重要的生態(tài)功能和應用意義。 但是，隨著全球氣候變化和近岸人類活動加劇，近岸珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)正遭遇前 所未有的挑戰(zhàn)，只有對珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)有更深入的了解，對造礁石珊瑚開展深 入的研究才能更好的保護和維持健康的珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)。
珊瑚絢麗多彩的色澤一直是它吸引人目光的焦點所在，而珊瑚的體色取決 于其體內(nèi)的共生植物一單細胞蟲黃藻，這種以寄宿方式生存的藻類，我們稱之 為"共生藻"，共生藻不但賦予珊瑚絢麗的色澤，而且它憑借光照、二氧化碳 等物質(zhì)以及珊瑚體表在水中滲透吸收的所有可能物質(zhì)(包括氨基乙酸、氨基 丙酸、白胺酸等氨基酸和硝酸鹽)就可以提供充足的養(yǎng)分給珊瑚，更為重要的 是，它還能將珊瑚體內(nèi)積聚的廢物進行分解處理，所以，共生藻的作用對珊瑚 的生長存活是極其重要的。
目前導致珊瑚死亡的原因有很多，但是在珊瑚的白化過程中都伴隨著共生 藻濃度的降低，即白化。引起珊瑚白化的原因有很多，比如全球氣候變暖導致 的海水溫度升高、海洋酸化、水體中高懸浮顆粒物、水體富營養(yǎng)化等。通過監(jiān) 測珊瑚共生藻的濃度、珊瑚體內(nèi)葉綠素含量能夠很好的反映珊瑚的生理狀態(tài)，而珊瑚共生藻分類鑒定需要借助于分子生物學的方法，其DNA的提取需要大 量純凈的共生藻樣品，開展珊瑚共生藻離體培養(yǎng)和生理實驗能夠揭開珊瑚白化 過程中石珊瑚與共生藻共生關系解體的機理，而開展以上研究工作都離不開純 凈活體珊瑚共生藻樣品，因此，獲得大量實驗用純凈活體珊瑚共生藻是開展石 珊瑚基礎研究的前提，具有重要的意義。
巨大合葉珊瑚黏液的采集方法(CN 1792164A)指出珊瑚蟲分泌的黏液覆 蓋在珊瑚蟲所形成的礁塊表面，這層黏液是珊瑚抵抗病菌的第一道門戶，因此， 在活體珊瑚共生藻制備過程中會摻雜大量珊瑚黏液，珊瑚黏液的存在使得所制 備的活體珊瑚共生藻不夠純凈，對后期的研究工作帶來困擾，如何有效去除珊 瑚黏液是能否獲得純凈活體珊瑚共生藻的關鍵。
目前國內(nèi)外的文獻所提到的制備珊瑚共生藻的方法中均未對如何去除大 量珊瑚黏液進行介紹，如Fitt等(Fitt WK, McFarland FK, Warner ME, Chilcoat GC. Seasonal patterns of tissue biomass and densities of symbiotic dinoflagellates in reef corals and relation to coral bleaching. Limnol Oceanogr, 2000, 45(3), 2000, 677-685)研究了珊瑚體內(nèi)共生藻濃度與珊瑚組織生物量的季節(jié)變化以及與珊 瑚白化的關系，但是實驗方法中沒有介紹如何去除共生藻洗出液中的大量黏 液，從而快速獲取純凈共生藻樣品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種可有效快速去除珊瑚黏 液，從珊瑚體中獲得大量的純凈的活體珊瑚共生藻的方法。
本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的 本發(fā)明的活體珊瑚共生藻，其制備方法包括如下步驟(1) 從海底采集健康珊瑚；
(2) 高壓沖洗上述珊瑚表面，并收集沖洗珊瑚所得洗出液；
(3) 將上述收集起來的洗出液采用直徑為300 500um的尼龍網(wǎng)過濾，所 得濾液再用直徑為40 80 U m的尼龍網(wǎng)過濾，過濾后將所得濾液再次用直徑為 15~25um的尼龍網(wǎng)過濾；
(4) 將上述過濾后的濾液置于離心管中，進行多次離心，離心條件依次為 140~160g離心4 6分鐘、300~400g離心8 12分鐘、500~600g離心8 12分鐘 和1000 1200g離心8 12分鐘，每次離心后棄去上清液，最后一次離心后，管 底所得沉淀物即為活體珊瑚共生藻。
上述步驟(1)中，從海底所采集的健康珊瑚是珊瑚體生長正常，群體顏 色較為一致，沒有出現(xiàn)任何發(fā)白現(xiàn)象的。
上述步驟(2)中，高壓沖洗珊瑚，珊瑚的面積一般選擇25 36cm2，這樣 既方便操作且容易測量洗出液的體積；高壓沖洗珊瑚可選擇市售的各種沖洗 器，如美國潔碧(waterpik)沖洗器；高壓沖洗珊瑚，直到珊瑚表面完全變白， 收集沖洗珊瑚后得到的洗出液。
上述步驟(2)中，高壓沖洗珊瑚所用的沖洗液必須是海水，不能用淡水 代替，否則會造成共生藻的死亡，沖洗液需用過濾海水，如可將新鮮海水經(jīng)過 0.45 u m微孔濾膜過濾，過濾所得的海水即可用來高壓沖洗珊瑚。
上述步驟(3)和步驟(4)的目的主要是將沖洗珊瑚所得洗出液中的大量 黏液去除掉，從而獲得純凈且有活力的共生藻。
正常的珊瑚共生藻的直徑一般為3 10um，因此步驟(3)中采用3種孔 徑的尼龍網(wǎng)，第一次采用直徑為300-500ym的尼龍網(wǎng)過濾，從而去除掉洗出液中的大量黏液，然后再依次用直徑為40-80 ix m和15~25 P m的尼龍網(wǎng)過濾， 從而去除掉洗出液中殘留的黏液。這3種孔徑尼龍網(wǎng)的搭配不但能夠快速有效 地去除掉珊瑚分泌的大量黏液，而且可以讓珊瑚共生藻順利通過網(wǎng)孔；每次過 濾后，最好再用過濾海水(制備方法同上)沖洗下網(wǎng)孔，把黏附在網(wǎng)上的未順 利通過網(wǎng)孔的共生藻再沖洗出來，和之前的濾液合并，進行下一步的過濾。
上述步驟(4)主要是將過濾后的液體(既經(jīng)過三步過濾后不含有黏液的 洗出液)再進一步地離心分離，從而獲得純凈的活體珊瑚共生藻，這里離心力 和離心時間的選擇是個重點，因為離心力過大會導致共生藻體的破碎和死亡， 無法獲得完整有活力的共生藻，而離心力過小則無法全部沉積過濾液中的共生 藻，造成后續(xù)測量珊瑚共生藻密度和葉綠素含量值變小，因此本發(fā)明經(jīng)過摸索 發(fā)現(xiàn)采用先140 160g離心4 6分鐘，再依次300~400g離心8~12分鐘、 500 600g離心8 12分鐘，1000 1200g離心8 12分鐘，則可獲得完整且純凈 的活體珊瑚共生藻。
上述步驟(4)中，140~160g離心4~6分鐘、300 400g離心8 12分鐘和 500 600g離心8 12分鐘，這三步每次離心棄去上清液后，需要向管內(nèi)沉淀中 加入過濾海水，充分搖勻后再進行下一步的離心，這樣可更加有效地去掉黏附 在共生藻表面的珊瑚粘液，從而獲得純凈的活體珊瑚共生藻。
本發(fā)明方法制備所得活體珊瑚共生藻可按后續(xù)實驗要求的不同，分別對應 不同的方法進行保存，如若后續(xù)對制備所得珊瑚共生藻進行分子標記實驗和葉
綠素含量測定，則需要將該珊瑚共生藻置于-2crc保存；若后續(xù)對珊瑚共生藻
進行濃度計數(shù)，則需要將該珊瑚共生藻用5%~10%的甲醛固定；還可以光照下 對該珊瑚共生藻進行離體培養(yǎng)和其他生理實驗。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果
1. 本發(fā)明在高壓沖洗珊瑚時采用過濾過的新鮮海水， 一方面不會堵塞沖洗 器的出口，造成機械損壞，另一方面則不會對珊瑚共生藻造成傷害，影響共生 藻的活力；
2. 本發(fā)明的方法可以快速獲得純凈、完整且具有活力的珊瑚共生藻，其操 作步驟經(jīng)過優(yōu)化精簡后，減少了操作過程中珊瑚共生藻量的損耗和活力的降
低；
3. 本發(fā)明的方法采用合理地過濾及離心條件，將珊瑚表面的大量黏液去除 掉，從而制備得到純凈的活體珊瑚共生藻，該共生藻可滿足各種后續(xù)實驗的材 料要求，如可以估算珊瑚共生藻濃度、葉綠素含量和進行分子生物學研究，還 可以在光照下進行離體培養(yǎng)，開展室內(nèi)生理實驗等。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步地描述，但具體實施例并不對本發(fā) 明做任何限定。 實施例l
本實施例制備活體珊瑚共生藻的方法，其具體步驟如下
(1)從中科院南海海洋研究所熱帶海洋生物實驗站附近海域珊瑚礁區(qū)3 m 水深處，采集美麗鹿角珊瑚^coraporam/〃^ora，截取長度8cm，面積28 cm2
(用鋁鉬紙覆蓋其表面測量表面積)；取新鮮海水用0.45um微孔濾膜過濾， 過濾所得的海水即為過濾海水；
(2)沖洗液為上述過濾海水，用美國潔碧(waterpik)沖洗器沖洗珊瑚的 表面至全部變白，收集沖洗珊瑚后得到的洗出液；(3) 將上述收集起來的洗出液用直徑為425um的尼龍網(wǎng)過濾，所得濾液 再用直徑為53 u m的尼龍網(wǎng)過濾，得到的濾液再次用18 U m的尼龍網(wǎng)過濾， 三步過濾去除洗出液中的黏液，18um的尼龍網(wǎng)過濾所得的濾液經(jīng)量筒測量后 為35ml;
(4) 將上述濾液35ml置于離心管中，150g離心4分鐘，丟棄上面的液體， 加入50ml過濾海水，充分搖勻，350g離心8分鐘，棄去液體，加入50ml過 濾海水，充分搖勻，550g離心8分鐘，棄去液體，再次加入50ml過濾海水， 充分搖勻，1100g離心8分鐘，離心后棄去液體，離心管底所得沉淀物即為本 實施例的活體珊瑚共生藻。
向上述制備所得活體珊瑚共生藻中加入45ml過濾海水和5ml甲醛，固定 樣品，顯微鏡下取樣10次計數(shù)，取均值測算珊瑚共生藻的密度為2.23X106個. cm. 0
實施例2
本實施例制備活體珊瑚共生藻的方法，其具體步驟如下
(1)從中科院南海海洋研究所熱帶海洋生物實驗站附近海域珊瑚礁區(qū)2.5 m 水深采集鼻形鹿角珊瑚Awopora woswto，截取長度8cm，面積26 cm2 (用鋁 鉑紙覆蓋其表面測量表面積)；取新鮮海水用0.45um微孔濾膜過濾，過濾所 得的海水即為過濾海水；
(2) 沖洗液為上述過濾海水，用美國潔碧(waterpik)沖洗器沖洗珊瑚的 表面至全部變白，收集沖洗珊瑚后得到的洗出液；
(3) 將上述收集起來的洗出液用直徑為380"m的尼龍網(wǎng)過濾，所得濾液 再用直徑為62 u m的尼龍網(wǎng)過濾，得到的濾液再次用23 u m的尼龍網(wǎng)過濾，三步過濾去除洗出液中的黏液，23 ii m的尼龍網(wǎng)過濾所得的濾液經(jīng)量筒測量后 為32ml;
(4)將上述32ml濾液置于離心管中，150g離心6分鐘，丟棄上面的液體， 加入50ml過濾海水，充分搖勻，320g離心12分鐘，棄去液體，加入50ml過 濾海水，充分搖勻，540g離心12分鐘，棄去液體，再次加入50ml過濾海水， 充分搖勻，1000g離心12分鐘，離心后棄去液體，離心管底所得沉淀物即為 本實施例的活體珊瑚共生藻。
將本實施例制備所得活體珊瑚共生藻取少許過濾在孔徑為0.45的濾膜上， 應用超便攜式調(diào)制熒光儀Mini-PAM(Walz, Germany)測量離體共生藻的活力， 其最大光合作用效率(Fv/Fm)為0.6S，與在珊瑚體內(nèi)共生藻活力無差異。
實施例3
本實施例制備活體珊瑚共生藻的方法，其具體步驟如下
(1)從三亞小東海海域珊瑚礁區(qū)6 m水深采集叢生盔形珊瑚(C^toc^ /as"'w/a^)，截取一塊珊瑚，表面積32 cm2 (用鋁鉑紙覆蓋其表面測量表面 積)；取新鮮海水用0.45ixm微孔濾膜過濾，過濾所得的海水即為過濾海水；
(2) 沖洗液為上述過濾海水，用美國潔碧(waterpik)沖洗器沖洗珊瑚的 表面至全部變白，收集沖洗珊瑚后得到的洗出液；
(3) 將上述收集起來的洗出液用直徑為355 Pm的尼龍網(wǎng)過濾，所得濾液 再用直徑為58 u m的尼龍網(wǎng)過濾，得到的濾液再次用25 u m的尼龍網(wǎng)過濾， 三步過濾去除洗出液中的黏液，25 ii m的尼龍網(wǎng)過濾所得的濾液經(jīng)量筒測量后 為45ml;
(4) 將上述45ml濾液置于離心管中，160g離心5分鐘，丟棄上面的液體，加入50ml過濾海水，充分搖勻，400g離心10分鐘，棄去液體，加入50ml過 濾海水，充分搖勻，600g離心10分鐘，棄去液體，再次加入50ml過濾海水， 充分搖勻，1200g離心10分鐘，離心后棄去液體，離心管底所得沉淀物即為
本實施例的活體珊瑚共生藻。
將本實施例制備所得活體珊瑚共生藻置于-2(TC保存，待后續(xù)用于分子生
物學實驗。
權(quán)利要求
1、一種活體珊瑚共生藻的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)從海底采集健康珊瑚；(2)高壓沖洗珊瑚表面，并收集沖洗珊瑚所得洗出液；(3)將上述洗出液依次用直徑為300～500μm、40～80μm和15～25μm的尼龍網(wǎng)過濾；(4)將上述過濾后的濾液置于離心管中，進行多次離心，離心條件依次為140～160g離心4～6分鐘、300～400g離心8～12分鐘、500～600g離心8～12分鐘和1000～1200g離心8～12分鐘，每次離心后棄去上清液，最后一次離心后，管底所得沉淀物即為活體珊瑚共生藻。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述高壓沖 洗珊瑚的沖洗液為過濾海水。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述多次離 心的每一次離心棄去上清液后，先向管中沉淀中加入過濾海水，充分搖勻后再 進行下一步的離心。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述每次過 濾后先用過濾海水沖洗尼龍網(wǎng)，將沖洗所得液體合并濾液再進行下一步過濾。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述高壓沖 洗珊瑚，珊瑚的面積選擇25 36cm2。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于，所述過濾海水為新鮮海 水經(jīng)0.45 u m微孔濾膜過濾所得。
全文摘要
本發(fā)明公開一種活體珊瑚共生藻的制備方法，該方法是高壓沖洗海底采集的健康珊瑚后，洗出液依次用直徑為300～500μm、40～80μm和15～25μm的尼龍網(wǎng)過濾，所得濾液再140～160g離心4～6分鐘、300～400g離心8～12分鐘、500～600g離心8～12分鐘和1000～1200g離心8～12分鐘，離心所得管底沉淀物即為活體珊瑚共生藻。本發(fā)明采用過濾海水高壓沖洗珊瑚，即不會堵塞沖洗器的出口，又不會影響共生藻的活力。本發(fā)明采用優(yōu)化后的過濾及離心條件，即減少了操作過程中珊瑚共生藻量的損耗和活力的降低，又去除掉大量黏液，制備得到純凈的活體珊瑚共生藻，可滿足計算共生藻濃度、葉綠素含量、開展分子生物學實驗和光照下離體培養(yǎng)等后續(xù)實驗的材料要求。
文檔編號C12N1/12GK101538535SQ20091003885
公開日2009年9月23日 申請日期2009年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月21日
發(fā)明者豐 尤, 李秀保, 練健生, 雷新明, 暉 黃, 黃良民 申請人:中國科學院南海海洋研究所