專利名稱：一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的不依賴于組織培養(yǎng)的棉花轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的不依賴于組織培養(yǎng)的棉花轉(zhuǎn)基因方法，專用于農(nóng)
作物(棉花)遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因新品種的選育，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
(二)
背景技術(shù)：
棉花是主要的紡織原料之一。經(jīng)過多年的系統(tǒng)選育，棉花品種的遺傳基礎(chǔ)相當(dāng)狹窄。通過轉(zhuǎn)基因方法將有用的外源基因?qū)胧荏w材料并使其穩(wěn)定表達(dá)，是增加棉花遺傳多樣性有效途經(jīng)之一。棉花遺傳轉(zhuǎn)化的報道始于1987年，轉(zhuǎn)基因棉花也在二十世紀(jì)九十年代進入商業(yè)化生產(chǎn)。至今，轉(zhuǎn)基因棉花是商業(yè)化推廣最成功的作物之一。但棉花的遺傳轉(zhuǎn)化至今仍是個難題。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的依賴于組織培養(yǎng)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化是目前應(yīng)用最廣的棉花轉(zhuǎn)基因方法，但該法受限于棉花基因型。到目前為止，只有少數(shù)的棉花品種基因型能通過組織培養(yǎng)再生。培育轉(zhuǎn)基因棉花只能先把外源基因?qū)胍子诮M織培養(yǎng)再生的棉花品種中，獲得外源基因純合的中間品種，然后以中間品種與推廣品種進行雜交培育轉(zhuǎn)基因棉花。該法需進行雜交育種，延長了轉(zhuǎn)基因棉花的培育過程，并且由于性狀連鎖的原因，中間品種本身的一些不良農(nóng)藝性狀隨外源目的基因進入培育品種之中。棉花遺傳轉(zhuǎn)化常用的另一方法是花粉管通道法，即以微量注射器把DNA注入開花受粉20-24h后的幼齡子房中。該法主要為我國研究者采用，并以取得一定成果。但該法該法操作的經(jīng)驗性很強，需要一定的技巧，操作如果不熟練，會影響到轉(zhuǎn)化效率甚至難以獲得轉(zhuǎn)化植株。由于其重復(fù)性不理想，外源基因整合和遺傳機理不明確，尚存在著較多的爭議。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的機理相對清楚，為植物遺傳轉(zhuǎn)化的首選方法。本發(fā)明借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化的整合機制和花粉管通道法的便捷手段，建立了農(nóng)桿菌浸蘸棉花花柱的整株活體轉(zhuǎn)化體系，即在棉花自花授粉后的當(dāng)天下午和次日上午，以農(nóng)桿菌滴涂棉花花柱，多次獨立試驗都獲得轉(zhuǎn)基因植株，證明該轉(zhuǎn)化體系的可行性。該轉(zhuǎn)化方法利用自然繁殖過程和花粉管通道的原理，借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA整合特性和優(yōu)勢，避免了棉花傳統(tǒng)的花粉管通道法即子房注射法采用裸露DNA進行轉(zhuǎn)化而整合機理不清、遺傳機理不明等缺點。到目前為止，未見在棉花授粉后采取農(nóng)桿菌-蔗糖溶液滴涂棉花花柱進行遺傳轉(zhuǎn)化的報道。
(三)

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是建立新的不依賴于組織培養(yǎng)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系，從
而突破棉花遺傳轉(zhuǎn)化受基因型限制的瓶頸，為棉花轉(zhuǎn)基因育種和棉花分子生物學(xué)研究建
立技術(shù)平臺。 技術(shù)方案 —種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的不依賴于組織培養(yǎng)的棉花轉(zhuǎn)基因方法，包括 l)在棉花授粉當(dāng)天下午17:00-19:00或授粉次日上午9:00-11:00，以附加體積比0.05%表面活性劑Silwet L-77和40mg I—1乙酰丁香酮、含有目的基因的基因工程農(nóng)桿菌-蔗糖溶液滴涂棉花花柱；
2)套袋遮光保濕兩天； 3)種子成熟收獲后進行轉(zhuǎn)基因功能鑒定和分子檢測； 4)PCR和Southern雜交驗證目的基因已整合至目標(biāo)棉花基因組中，從而獲得轉(zhuǎn)基因棉花植株。
上述方法用于抗除草劑基因轉(zhuǎn)化棉花的方法，其特征在于 1)選擇泗棉3號，在7、 8月份棉花開花期，選擇次日將要開花的花蕾做自交以備轉(zhuǎn)化之用； 2)農(nóng)桿菌株為EHA105，質(zhì)粒為pKFlll，該質(zhì)粒T-DNA區(qū)含有Basta除草劑抗性的bar基因，含有bar基因的工程農(nóng)桿菌保存于附加50mg I—1卡那霉素和20mg l—1利福平的固體LB培養(yǎng)基上，挑取工程農(nóng)桿菌2-3個克隆于含50mg l—1卡那霉素的液體LB中，28t:培養(yǎng)過夜，4000rpm室溫離心5min，棄上清，以質(zhì)量體積比10%蔗糖重懸并把工程農(nóng)桿菌細(xì)胞濃度調(diào)至OD600 = 2.0 ;在農(nóng)桿菌-蔗糖溶液中加入0.05%體積比SilwetL-77和40mgl—1乙酰丁香酮備用； 3)開花次日上午9:00-11:00，抹去花柱，用上述附加體積比0.05 %表面活性劑SilwetL-77和40mgl—1乙酰丁香酮的農(nóng)桿菌-蔗糖溶液滴涂棉花花柱傷口處；或開花當(dāng)天下午17:00-19:00，農(nóng)桿菌-蔗糖溶液滴涂柱頭；或開花當(dāng)天下午17:00-19:00，摘除柱頭，農(nóng)桿菌-蔗糖溶液滴涂花柱傷口處；處理后的花和幼齡套袋遮光保濕；
4)收獲種子經(jīng)過消毒后在含有體積比0.05% Basta除草劑培養(yǎng)基發(fā)芽，表現(xiàn)除草劑抗性的幼苗移栽并正常管理；3個月后，以體積比0.15X和0.3XBasta除草劑處理，選擇正常顯綠色無除草劑傷害癥狀的抗除草劑棉花植株；5)抗除草劑棉花植株提取DNA，進行bar基因的PCR、 Southern blot檢測，PCR
產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳證明除草劑抗性植株均含有430bpbar基因片段。所獲得的除草劑抗性植株轉(zhuǎn)bar基因泗棉3號，屬陸地棉(Gossypiumhirsutum)，于2009年9月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCN0.3275。
有益效果 本發(fā)明以長江流域推廣品種泗棉3號為試驗受體，研究發(fā)現(xiàn)所獲得的抗除草劑轉(zhuǎn)基因棉花可抵抗體積比0.3XBasta除草劑，對比之下，非轉(zhuǎn)基因棉花抵抗不了體積比0.05% Basta除草劑。PCR和Southern雜交驗證也證明抗除草劑的bar基因已整合至這些抗除草劑棉花基因組中。多次獨立處理獲得了轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率從0.05%到0.65%不等，證明了農(nóng)桿菌浸蘸棉花花柱的轉(zhuǎn)化體系的可重復(fù)性和可靠性。兩個處理時間段中，授粉當(dāng)天下午17:00-19:00進行轉(zhuǎn)化比授粉次日上午9:00-11:00進行轉(zhuǎn)化更容易獲得轉(zhuǎn)基因棉花種子，并且在授粉當(dāng)天下午17:00-19:00去除棉花柱頭后再進行轉(zhuǎn)化比不去除柱頭直接轉(zhuǎn)化的效率又高出數(shù)倍。 本發(fā)明所提供的方法可以遺傳轉(zhuǎn)化多個棉花品種，不受棉花基因型限制，并且可在棉花生長的當(dāng)季獲得轉(zhuǎn)基因種子，與傳統(tǒng)的依賴于組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因方法相比，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體系更為簡便、經(jīng)濟和高效，同時還避免了組織培養(yǎng)過程當(dāng)中產(chǎn)生的體細(xì)胞無性系變異等問題。(四)


圖1農(nóng)桿菌浸蘸柱頭的部位示意圖及田間轉(zhuǎn)化展示圖(a)農(nóng)桿菌-蔗糖溶液施用部位示意圖(B:開花次日上午9:00-11:00抹去花柱后滴涂農(nóng)桿菌-蔗糖溶液部位，C :授粉當(dāng)天下午17:00-19:00滴涂農(nóng)桿菌-蔗糖溶液部位，D:授粉當(dāng)天下午17:00-19:00切除柱頭后滴涂農(nóng)桿菌-蔗糖溶液部位)；(b， c)田間套袋保濕情況。 圖2抗除草劑植株篩選和鑒定 (a)非轉(zhuǎn)化種子在Basta除草劑苗培養(yǎng)基培養(yǎng)7天后的情況(從左至右依次為體積比0%、 0.0005%、 0.0025%、 0.005%、 0.01%、 0.015%、 0.025%、 0.035%、 0.05%、0.075%、 0.1% Basta)。 體積比0.05% Basta為有效篩選濃度。(b)在體積比0.05% Basta培養(yǎng)基上篩選的抗性苗。(c)葉片在施用體積比0.3% Basta七天后的表現(xiàn)(從左至右依次為施用Basta的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ杖~片、未施用Basta的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ杖~片、抗Basta植株葉片)。 圖3Basta抗性植株bar基因的PCR和Southern雜交檢測(a)PCR檢測Basta抗性植株bar基因；M : DL2000plus markers ; P :質(zhì)粒對照；C:非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?-13: Basta抗性植株。所檢測的抗性植株均有符合目的基因430bp大小的條帶，而非轉(zhuǎn)基因植株中未檢測到該特異條帶。 (b)Southern檢測Basta抗性植株bar基因；M : lambda DNA/(EcoRI+HindIII)markers; P:質(zhì)粒對照；C:非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?-13: Basta抗性植株。以質(zhì)粒載體T-DNA區(qū)段中具單酶切位點的EcoRI酶切基因組DNA，雜交探針為地高辛標(biāo)記的430bp bar基因片段。所檢測的抗性植株均顯示已整合一個或多個拷貝的bar基因，而非轉(zhuǎn)基因植株沒雜交信號
(五)
具體實施例方式
1)以長江流域推廣品種泗棉3號為試驗受體，在7、 8月份開花期，選擇次日將要開花的花蕾做自交以備轉(zhuǎn)化之用。 2)農(nóng)桿菌株為EHA105，質(zhì)粒為pKFl 11(公知公用，Ni M， Tepperman J，Quail P.PIF3， a Phytochrome-lnteracting Factor Necessary for Normal Photoinduced SignalTransduction, Is a Novel Basic Helix-Loop-Helix Protein.Cell, 1998， 95: 657-668)。 該質(zhì)粒T-DNA區(qū)含有Basta除草劑抗性的bar基因。含bar基因的工程農(nóng)桿菌保存于附加50mgl—1卡那霉素和20mg l—1利福平的固體LB培養(yǎng)基上。挑取工程農(nóng)桿菌2-3個克隆于含50mgl—1卡那霉素的50ml液體LB中，28t:培養(yǎng)過夜。4000rpm室溫離心5min，棄上清，以0.5ml質(zhì)量體積比10%蔗糖重懸農(nóng)桿菌沉淀，用分光光度計測定蔗糖溶液中農(nóng)桿菌的濃度(質(zhì)量體積比10%蔗糖作為空白對照)，直至把農(nóng)桿菌細(xì)胞濃度調(diào)至OD600 二2.0。在農(nóng)桿菌-蔗糖溶液(農(nóng)桿菌濃度OD600 = 2.0蔗糖濃度10% (w/v))中加入終濃度為0.05% (v/v)Silwet L-77和40mg 1"乙酰丁香酮備用。 3)開花次日上午9:00-11:00，抹去花柱，用上述附加體積比0.05 %表面活性劑Silwet L-77和40mg I—1乙酰丁香酮的農(nóng)桿菌-蔗糖溶液滴涂棉花花柱傷口處(圖l-a-B);或開花當(dāng)天下午17:00-19:00，農(nóng)桿菌-蔗糖溶液滴涂柱頭(圖l-a-C);或開花當(dāng)天下午
517:00-19:00，摘除柱頭，農(nóng)桿菌-蔗糖溶液滴涂花柱傷口處(圖l-a-D)。處理后的花和幼 齡套袋遮光保濕(圖lb， lc)。 4)收獲種子經(jīng)過消毒后在含有0.05% (v/v)Basta除草劑培養(yǎng)基發(fā)芽，表現(xiàn)除草劑 抗性的幼苗移栽并正常管理。3個月后，以0.15%和0.3% (v/v)Basta除草劑處理，轉(zhuǎn)基
因植株都正常顯綠色無除草劑傷害癥狀(圖2)。 5)以CTAB法提取抗除草劑棉花植株DNA，具體步驟如下 A.取5g嫩葉置于研缽中以液氮研磨，轉(zhuǎn)至50ml的離心管中，加入15ml新鮮配
制的DNA提取緩沖液(表2)，渦旋混勻，冰浴保存10min， 4000rpm 4t:離心20min，棄上清。 B.于沉淀中加入15ml65t:預(yù)熱的DNA裂解緩沖液(表3)，并用銅絲攪松混勻， 65。C水浴30min。 C.加入15ml氯仿異戊醇(24 : 1)混合液，翻轉(zhuǎn)50次以上，靜置10min， 4000rpml5。C離心20min。 D.將上清轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加等體積的預(yù)冷異丙醇，緩慢翻轉(zhuǎn)50次，混勻， 靜置10min，將DNA絮狀沉淀轉(zhuǎn)至10ml離心管中離心沉淀，棄上清，于沉淀中加入2ml 70%的乙醇洗滌，倒掉乙醇，通風(fēng)干燥DNA。 E.加3ml TE緩沖液溶解DNA，力B 3 ii 1 RNaseA(10mg/ml)37。C培養(yǎng)30 60min ; 補加TE至5ml，加等體積的苯酚，緩慢翻轉(zhuǎn)50次，混勻，室溫靜置10min， 10,000rpm、 15。C離心10min。 R上清液轉(zhuǎn)入10ml離心管中，加入等體積氯仿異戊醇(24 : 1)混合液，翻轉(zhuǎn) 50次以上，靜置10min， 10,000rpm、 15。C離心10min。 G.上清液轉(zhuǎn)入10ml離心管中，加0.1體積的3M醋酸鈉(pH5.2)，加等體積的預(yù) 冷異丙醇后翻轉(zhuǎn)50次，靜置30min， 10,000rpm、 15。C離心5min，棄上清液，加lml70X 乙醇洗DNA小團，轉(zhuǎn)入1.5ml的離心管中，10,000rpm、 15。C離心5min;棄上清液，通風(fēng) 干燥DNA。H.加200 ii 1 TE緩沖液溶解DNA(4。C ， 30min以上)，-20°。保存?zhèn)溆谩?
表1DNA提取緩沖液組成
感分 _ _ 腦:_
0.35 M Glucose 34.68 g
U. 1 M Tris-i 50 ral of 1,0 M Tris-HCl(pH 10) stock solution
5 mM Na-t:::)TA 5 mi of 0,5 M EOTA(pH 8鄰stoek soMion
2% PVP 10 g
l%《V/V)p-Me 5 ml
dd Water 柳ml
Total 500 m直
表2DNA裂解緩沖液組成
成分_______
1.4MNaCl 4(.!.9()Sg 0,1 M Tris,HCl 50靈i of i .0 M Tris-HCi《pH 8,0) stock solution 20證M Na,edta20 ml of 0,5 M EDTA《jjH 8,0) stock solution
2%CTAB 10 g 2%pvp10 g 〗％(V/V》p"Me 5 ml Water425 m! Total____500 mi_ _ _ 以上溶液清亮，提取緩沖液在4t:保存，裂解緩沖液室溫保存。使用前按 1 : IOO加入e-Me(P-巰基乙醇)。 6)除草劑抗性植株進行bar基因的PCR檢領(lǐng)U。 Bar基因PCR引物為 5-ACCATCGTCAACCACTACATC-3禾卩5-GCTGCCAGAAACCCACGTCAT-3，目的片段大 小為430bp， PCR擴增程序如下95。C預(yù)變性5min; 94。C變性30s， 56。C退火40s， 72°C 延伸50s， 30個循環(huán)；72t:延伸5min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，證明除草劑抗 性植株均含有與bar基因片段大小一致的特異條帶430bp(圖3a)。 7)除草劑抗性植株進行Southern blot檢測(圖3b)。 方法如下取20 y g基因 組DNA以限制性內(nèi)切酶EcoRI(Fermentas公司)37"酶切12小時后，取1 P 1以0.6%瓊脂 糖凝膠電泳檢測其酶切是否完全，如未酶切完全則繼續(xù)酶切2-3h直至基因組DNA完全酶 切，如酶切已完全，以等體積氯仿異戊醇(24 : l)抽提后，等體積異丙醇沉淀DNA， 70%乙醇洗滌，吹干沉淀，加50iU無菌水溶解。酶切DNA經(jīng)0.6X瓊脂糖凝膠電泳(電 壓30v， 12h)分離后按Sambrook(Sambrook J， Fritsch， E.M.and Maniatis， T.Molecular cloning : a laboratory manual, 2nd edition : Cold Spring Harbor Laboratory press, New York. 1989)介紹的毛細(xì)轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至Hybond-N+尼龍膜(Amersham公司)，雜交探針為地 高辛標(biāo)記的430bp bar基因。探針的標(biāo)記及雜交過程參考試劑盒說明書DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I(Roche公司)。所有抗性植株都檢測到雜交信號， 整合bar基因的拷貝數(shù)有單拷貝的，如孔道l，有低拷貝數(shù)的，如孔道13可能為兩個拷 貝，也有高拷貝數(shù)的，如孔道4可能有七個拷貝(圖3b)。8)開花次日上午9:00-11:00抹去花柱后滴涂175朵棉花花柱，收獲148個棉桃， 共計4076粒種子，篩選到2株轉(zhuǎn)基因棉花(轉(zhuǎn)bar基因泗棉3號)，轉(zhuǎn)化率(轉(zhuǎn)基因棉花 株數(shù)/收獲種子數(shù)X 100 % )0.05 % ; 開花當(dāng)天下午17:00-19:00，農(nóng)桿菌滴涂245朵棉花柱頭，收獲132個棉桃，共計 3349粒種子，篩選到4株轉(zhuǎn)基因棉花(轉(zhuǎn)bar基因泗棉3號)，轉(zhuǎn)化率0.12%;
開花當(dāng)天下午17:00-19:00摘除柱頭后，農(nóng)桿菌滴涂124朵棉花花柱，收獲44個 棉桃，共計1085粒種子，篩選到7株轉(zhuǎn)基因棉花(轉(zhuǎn)bar基因泗棉3號)，轉(zhuǎn)化率0.65%。
本實施例所獲得的轉(zhuǎn)基因棉花品種(轉(zhuǎn)bar基因泗棉3號)自交可育，收獲種子已送交中國微生物菌種保藏中心保藏。 綜上所述，開花當(dāng)天下午17:00-19:00摘除柱頭后農(nóng)桿菌-蔗糖溶液滴涂花柱傷口 的轉(zhuǎn)化率最高，轉(zhuǎn)化率分別為開花當(dāng)天下午17:00-19:00農(nóng)桿菌-蔗糖溶液滴涂柱頭和開 花次日上午9:00-11:00抹去花柱后農(nóng)桿菌-蔗糖溶液滴涂花柱傷口的5倍和12倍。三個 轉(zhuǎn)化處理獲得的轉(zhuǎn)基因植株都在2株或2株以上，增加處理樣本數(shù)可獲得更多的轉(zhuǎn)基因植 株。與傳統(tǒng)的依賴于組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因方法相比，農(nóng)桿菌浸蘸棉花花柱的轉(zhuǎn)化方法更為 簡便、經(jīng)濟和高效，同時還避免了組織培養(yǎng)過程當(dāng)中產(chǎn)生的體細(xì)胞無性系變異等問題。
權(quán)利要求
一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的不依賴于組織培養(yǎng)的棉花轉(zhuǎn)基因方法，包括1)在棉花授粉當(dāng)天下午17:00-19:00或授粉次日上午9:00-11:00，以附加體積比0.05％表面活性劑Silwet L-77和40mg l-1乙酰丁香酮、含有目的基因的基因工程農(nóng)桿菌-蔗糖溶液滴涂棉花花柱；2)套袋遮光保濕兩天；3)種子成熟收獲后進行轉(zhuǎn)基因功能鑒定和分子檢測；4)PCR和Southern雜交驗證目的基因已整合至目標(biāo)棉花基因組中，從而獲得轉(zhuǎn)基因棉花植株。
2. 權(quán)利要求1所述方法用于抗除草劑基因轉(zhuǎn)化棉花的方法，其特征在于1) 選擇泗棉3號，在7、 8月份棉花開花期，選擇次日將要開花的花蕾做自交以備轉(zhuǎn) 化之用；2) 農(nóng)桿菌株為EHA105，質(zhì)粒為pKFlll，該質(zhì)粒T-DNA區(qū)含有Basta除草劑抗性的 bar基因，含目的基因bar基因的工程農(nóng)桿菌保存于附加50mg I—1卡那霉素和20mg I—1利福 平的固體LB培養(yǎng)基上，挑取工程農(nóng)桿菌2-3個克隆于含50mg I—1卡那霉素的液體LB中， 28t:培養(yǎng)過夜，4000rpm室溫離心5min，棄上清，以質(zhì)量體積比10%蔗糖重懸并把工程 農(nóng)桿菌細(xì)胞濃度調(diào)至OD600 = 2.0 ;在農(nóng)桿菌-蔗糖溶液中加入體積比0.05%表面活性劑 Silwet L-77和40mg 1"乙酰丁香酮備用；3) 開花次日上午9:00-11:00，抹去花柱，用上述附加體積比0.05%表面活性劑Silwet L-77和40mg I—1乙酰丁香酮的農(nóng)桿菌-蔗糖溶液滴涂棉花花柱傷口處；或開花當(dāng)天下午 17:00-19:00，農(nóng)桿菌-蔗糖溶液滴涂柱頭；或開花當(dāng)天下午17:00-19:00，摘除柱頭，農(nóng)桿 菌-蔗糖溶液滴涂花柱傷口處；處理后的花和幼齡套袋遮光保濕；4) 收獲種子經(jīng)過消毒后在含有體積比0.05% Basta除草劑培養(yǎng)基發(fā)芽，表現(xiàn)除草劑抗 性的幼苗進行移栽并正常管理；3個月后，以體積比0.15X和0.3XBasta除草劑處理，選 擇正常顯綠色無除草劑傷害癥狀的抗除草劑棉花植株；5) 抗除草劑棉花植株提取DNA，進行bar基因的PCR、 Southern blot檢測，所獲得 的除草劑抗性植株轉(zhuǎn)bar基因泗棉3號，屬陸地棉(Gossypium hirsutum)，于2009年9 月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC N0.3275。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的不依賴于組織培養(yǎng)的棉花轉(zhuǎn)基因方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。在棉花授粉當(dāng)天下午或次日上午，以附加0.05％表面活性劑Silwet L-77和40mgl-1乙酰丁香酮的農(nóng)桿菌-蔗糖溶液滴涂花柱，保濕兩天，收獲種子進行抗性鑒定；提取DNA，進行PCR、Southern blot檢測。多次處理獲得了轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率從0.05％到0.65％不等，證明了農(nóng)桿菌浸蘸棉花花柱的轉(zhuǎn)化體系的可重復(fù)性和可靠性。與傳統(tǒng)的依賴于組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因方法相比，農(nóng)桿菌浸蘸棉花花柱的轉(zhuǎn)化方法更為簡便、經(jīng)濟和高效，同時還避免了組織培養(yǎng)過程中受棉花基因型限制和容易產(chǎn)生體細(xì)胞無性系變異等問題。
文檔編號C12N15/82GK101691583SQ200910035360
公開日2010年4月7日 申請日期2009年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月25日
發(fā)明者張?zhí)煺? 郭旺珍, 陳天子 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)