專利名稱：一種鑒別水稻低谷蛋白基因Lgc1的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒別水稻低谷蛋白基因Lgcl的分子標(biāo)記方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程，專用于含Z取7基因的低谷蛋白水稻品種的鑒定和選育。
二背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)是稻米胚乳中第二大貯藏物質(zhì)，同時也是人類植物蛋白消費的主要來源。依
據(jù)其溶解特性的不同可分為4種谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白以及清蛋白，其中谷蛋白
含量較高，約占種子蛋白的60-80%，它是稻米蛋白中可供人體吸收的主要成分(Shewryand Casey, 1999， Seed proteins, In: Shewry P.R.， Casey R. (eds.), Kl而er academicpublishers, Dordrecht, The Netherlands, pp.l-lO)，所以稻米營養(yǎng)價值的改善可通過提高谷蛋白含量得以實現(xiàn)。然而，對于腎臟病患者來說，谷蛋白的大量吸收會導(dǎo)致人體蛋白代謝的紊亂，進(jìn)而造成病情惡化。因此，為滿足腎臟病人對低可吸收蛋白的特定需求，培育綜合性狀優(yōu)良的低谷蛋白新品種已成為當(dāng)前功能性水稻育種的一個重要方向(Iidaetal., A rice mutant having a low content of glutelin and a high content of prolamine, Theor.Appl. Genet., 1993, 87(3): 374-378)。
低谷蛋白突變體是進(jìn)行低谷蛋白水稻品種選育的重要遺傳資源，其主要特點為谷蛋白含量的大大降低以及醇溶蛋白含量的提高。Iida等(Iida et al.， A rice mutant having alow content of glutelin and a high content of prolamine, Theor. Appl. Genet, 1993， 87(3):374-378)通過化學(xué)誘變劑乙烯亞胺處理日本優(yōu)種子，獲得了低谷蛋白突變體NM67,利用它與原始親本進(jìn)行回交，選育出第一個低谷蛋白水稻品種LGC-1。 Miyaham等(Miyahara et al., Analysis of glutelin gene in rice low glutelin line LGC隱l, Breeding Sci"1996, 46(Supply. 1): 42; Miyahara et al., Analysis of LGC-1, low glutelin mutant of rice,Gamma Field Symposia, 1999, 38:43-52)對LGC-1進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)LGC-1中的低谷蛋白性狀受單個顯性基因控制，并將其定位在水稻第2染色體標(biāo)記XNpb243和G365之間。通過類似物理和化學(xué)誘變的方法，Iida和曲樂慶等(Iida et al., Mutants lackingglutelin subunits in rice: mapping and combination of mutated glutelin genes, Theor. App.Genet., 1997, 94(2): 177-183;曲樂慶等，水稻種子貯藏谷蛋白2亞基減少突變體，植物學(xué)報，2001, 4311): 1167-1171)還相繼獲得了多個低谷蛋白突變體，其中type-l、 type-2和type-3分別受隱性單基因g/w-/、 和控制，RFLP分析的結(jié)果進(jìn)一步表明，
g/w-J位于水稻第2染色體并與￡取7等位，而和則分別位于第10和第1染色體。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)理論和技術(shù)的快速發(fā)展，LGC-1低谷蛋白變異的遺傳機制得以 闡明。Kusaba等(Kusaba et al., Zow g7trfe/z'" co加e"〃 A dominant mutation that suppresses the glutelin multigene family via RNA silencing in rice, The plant cell, 2003, 15(6》 1455-1467)研究認(rèn)為LGC-1發(fā)生低谷蛋白突變是RNA沉默的結(jié)果，在正常粳稻品種 日本優(yōu)中，兩個核苷酸序列相似性達(dá)99.8%的G/w5亞族基因-G/w^/和G/wB5通過一段 DNA序列尾尾相連；而在LGC-1突變體中，基因的3'端及其下游一段3.5 Kb的 DNA發(fā)生缺失，喪失了終止子的在轉(zhuǎn)錄時發(fā)生通讀，從而與—起形成RNA 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并通過RNAi特異降解B亞族的谷蛋白基因，導(dǎo)致LGC-1表現(xiàn)低谷蛋白 特性。
目前，LGC-1是應(yīng)用較成功的低谷蛋白突變體之一。日本水稻育種家已利用該突 變體育成了大量品質(zhì)優(yōu)良、谷蛋白含量偏低的水稻品種，如LGC-Katsu和LGC-Jun等 (Nishimura et al., New rice varieties with low levels of easy-to-digest protein, 'LGC-Katsu， and 'LGC-Jun'， Breeding Sci., 2005, 55: 103-105)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于DNA變 異的分子標(biāo)記在水稻遺傳改良中發(fā)揮了巨大的作用，并在產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性育種等方面 的取得了重要的研究進(jìn)展(鄧化冰等，馬來西亞普通野生稻增產(chǎn)QTL的分子標(biāo)記輔助 選擇及其育種效果，中國水稻科學(xué)，2007, 21(6): 605-611;王才林等，通過分子標(biāo)記輔助 選擇培育優(yōu)良食味水稻新品種，中國水稻科學(xué),2009, 23(1): 25-30;周宇爝等，利用MAS 技術(shù)改良四個水稻恢復(fù)系及其抗病性分析，分子植物育種,2008, 6(3): 480-490)。因此， 若能獲得與目的基因緊密連鎖或共分離分子標(biāo)記，不僅能有效鑒定含基因的低谷 蛋白水稻種質(zhì)資源，同時也能加速腎臟病人專用低谷蛋白水稻品種的選育。 三
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明針對上述情況，根據(jù)LGC-1突變體與正常水稻品種在兩個谷蛋白基因G/t^4 和間存在的堿基差異設(shè)計合成與目的基因共分離的分子標(biāo)記，并通過簡單的檢測 方法，快速鑒定含Zg"突變基因的低谷蛋白水稻種質(zhì)資源，同時還能進(jìn)一步應(yīng)用于分 子標(biāo)記輔助育種。
技術(shù)方案
1、 一種鑒定水稻低谷蛋白基因Zgd的分子標(biāo)記引物，包括
引物InDel-Zg"-l:
正向引物序列5'-TTCTACAATGAAGGCGATGC-3' 反向引物序列5'-CTGGGCTTTAACGGGACT-3'和引物InDel-丄gc7-2:
正向引物序列5'-ACCGTGTTATGGCAGTTT-3' 反向引物序列5'-ATTCAAGGGCTATCGTCT-3'
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述一種鑒定水稻低谷蛋白基因丄取/的分子標(biāo)記引物方法，其主要 特征步驟包括
(1) 水稻基因組DNA的提??；
(2) 將權(quán)利要求1所述的兩對分子標(biāo)記引物InDekLg"-l和InDd-Zgc/-2加入同一 PCR 反應(yīng)體系，并對水稻種質(zhì)資源或育種群體植株的DNA進(jìn)行擴增。
20 nLPCR反應(yīng)體系包括10 ng/ 的DNA 2.0 ^L， 4 pmo1/ nL的引物2.0pL (引物 InDel-丄gc7-l和InDel-Zgc7-2各1.0pL)， 10xBuffer 2.0 ^L， 2.5腿ol/L的dNTP 0.4 ^L， 25 mmol/L的MgCl2 1.2 pL， 5 U/pL的Taq 0.2 pL和ddH20 12.2 PCR反應(yīng)程序包括95。C預(yù)變性5min;然后95。C變性30s、 56。C復(fù)性30s、 72'C延伸 lmin,循環(huán)35次；然后72'C延伸7min， l(TC冷卻10min后，將擴增產(chǎn)物加上樣緩沖 液終止反應(yīng)。
(3) 反應(yīng)產(chǎn)物在質(zhì)量比濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳，經(jīng)溴化乙錠染色并于凝膠成 像系統(tǒng)下觀察，記載。如果只能擴增出881bp的一條特征條帶，說明該植株是低谷蛋白 突變基因Zgc/的純合體；如果只能擴增出509bp的一條特征條帶，說明該植株是不含 丄取/突變基因的純合體；如果能同時擴增出881bp和509bp的兩條特征條帶，則說明 該植株是低谷蛋白突變基因的雜合體。
有益效果
本發(fā)明利用分子生物學(xué)的方法獲得兩個與水稻低谷蛋白基因丄取7直接相關(guān)的插入-
缺失標(biāo)記，其優(yōu)點具體歸納如下
(1) 本發(fā)明所獲得的分子標(biāo)記是依據(jù)LGC-1突變體在兩個谷蛋白基因G/wS4和 G/"S5間存在的堿基缺失設(shè)計合成的，因此不存在遺傳的交換，也不需要表型的 進(jìn)一步驗證。
(2) 明確突變基因來源是進(jìn)行低谷蛋白水稻品種選育的重要前提，利用本發(fā)明所獲得 的兩個基因標(biāo)記可以對大量水稻品種資源進(jìn)行篩選，從而準(zhǔn)確鑒定出含Z取/突 變基因的低谷蛋白材料。
(3) 通常低谷蛋白性狀的確定必須等到種子成熟以后才能進(jìn)行，而利用和丄g"基因 直接相關(guān)的分子標(biāo)記對其葉片DNA進(jìn)行檢測，可以在苗期鑒定出Zgc7位點的 谷蛋白基因型，進(jìn)而大大提高品種選擇的效率。
5四

圖1用于低谷蛋白突變基因丄取7檢測的PCR引物設(shè)計策略
(注黑色方格代表基因的外顯子；虛線代表LGC-l低谷蛋白突變體中3.5Kb的DNA缺失；單箭 頭代表基因的轉(zhuǎn)錄方向；雙箭頭代表引物設(shè)計的區(qū)域)
圖2不同親本和F,雜交種的全蛋白SDS-PAGE檢測
(1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，14.3-97.2KDa; 2-7: W3360,日本晴、武育粳3號、02428、 9311和南京 11; 8-11: W3660/日本晴、日本晴/W3660、 W3660/02428、 02428/W3660 圖3 InDel-Lgcl-l標(biāo)記對不同親本和雜種F,植株的分子檢測
(1: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，100-2，000bp; 2-7: W3660，日本晴、武育粳3號、02428、 9311和南京11; 8-11: W3660/日本晴、日本晴/W3660、 W3660/02428、 02428/W3660 圖4 InDel-丄取7-2標(biāo)記對不同親本和雜種Fi植株的分子檢測
(注:1: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，100-2，000bp; 2-7: W3360,日本晴、武育粳3號、02428、 9311和南 京ll; 8-11: W3660/日本晴、日本晴/W3660、 W3660/02428、 02428/W3660 圖5 InDel-丄g"-l和InDel-丄gc7-2標(biāo)記對不同親本和雜種F！植株的分子檢測
(1: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，100-2,000bp; 2-7: W3360,日本晴、武育粳3號、02428、 9311和南京11; 8-11: W3660/日本晴、日本晴/W3660、 W3660/02428、 02428/W3660
五具體實施例方式
試驗材料包括含低谷蛋白基因丄gW的粳稻品種W3660，該品種是以低谷蛋白品種 LGC-1作母本與日本主栽品種越光雜交，并以越光為輪回親本進(jìn)行連續(xù)回交轉(zhuǎn)育而成早 熟粳稻品種。正常水稻品種包括常規(guī)粳稻品種日本晴、武育粳3號、粳型廣親和品種 02428以及常規(guī)秈稻品種9311和南京11。 ^是以W3660為親本分別與谷蛋白含量正常 的水稻品種日本晴和02428正反交獲得的4個F"
以上材料均為公知公用材料，國家或江蘇省種質(zhì)資源平臺均可免費提供。具體參考 文獻(xiàn)為萬建民等，功能性專用水稻品種W3660的選育，作物雜志，2004， 5: 58; http:〃ineWeb.narCC.affrc.go.jp/;江祺祥等，中粳稻新品種武育粳3號的選育及其利用，江 蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，1993， 3: 8-10;鄒江石等，廣親和選系"02428"在秈粳亞種間雜交的初步利 用，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1989， 22(1): 6-14;戴正元等，利用核輻射育成優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)水稻新品種 揚稻6號，核農(nóng)學(xué)報，1999, 13(6): 377-379;林世成，閔紹楷主編中國水稻品種及其系 譜，上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991， 56-58 (1)與低谷蛋白基因Zgc/直接相關(guān)分子標(biāo)記的獲得根據(jù)Kusaba等的研究結(jié)果(Kusaba et al.,丄ow g/w,e/z'w cowfewf/: A dominant mutation that suppresses the glutelin multigene family via RNA silencing in rice, The plant cell, 2003, 15(6): 1455-1467)，利用G/mB5基因完整的核苷酸序列在水稻基因組注釋網(wǎng)站
(http:〃rice.plantbiology.msu.edu/)進(jìn)行BLAST分析，獲得該基因的位點名稱 LOC—Os02g 16820.1以及所在的噬菌體人工染色體克隆(PI-derived artificial chromosome, PAC)序列號P0693E08;同時利用已獲得的PAC克隆序列號在Gene Bank
(www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載相應(yīng)的核苷酸序列，并對序列進(jìn)行分析；然后，利用Primer Premier 5.0 (http:〃www.premierbiosoft.com)在LGC-1突變體3.5Kb缺失的區(qū)域附近設(shè) 計相應(yīng)的分子標(biāo)記，并將合成的標(biāo)記引物分別命名為InDekLgd-l和InDekLgc7-2。 InDel-￡gc/-7的正向序列為5'-TTCTACAATGAAGGCGATGC-3'，反向序列為 5'-CTGGGCTTTAACGGGACT-3' ， InDel-丄gd-2 的 正 向 序 列 為 5'-ACCGTGTTATGGCAGTTT-3'，反向序列為5'-ATTCAAGGGCTATCGTCT-3',退火溫 度均為56'C (圖1)。
(2) 基因組DNA的提取
取水稻苗期葉片，在-20'C預(yù)冷的研缽中用液氮研磨并裝入1.5ml離心管；加入 600ul提取液(20%SDS， lMTris-HCl， 0.5MEDTA， 5MNaCl， 65。C預(yù)熱)，搖勻，65°C 溫浴30min,中間振蕩3 4次；加入1/4體積5M KAC,搖勻后置冰上30min;加入氯 仿-異戊醇(24:1) 300~400ul，在搖床上充分振蕩，120卬m， 30min; 8000~10000rpm離 心15分鐘，液面分層，下層顏色較深，上層微帶黃綠色，取上清(400ul左右)至另一 離心管；加入等體積氯仿-異戊醇(24:1)，搖床上充分振蕩，80 90rpm， 30min; 8000rpm 離心15分鐘，轉(zhuǎn)移上清(400ul左右)至新的離心管；加入2倍體積-2(TC預(yù)冷的無水 乙醇，輕輕搖勻直到有絮狀物產(chǎn)生，12000rpm離心6min;棄無水乙醇，加入4°C70% 乙醇，放置10min，棄上清，超凈工作臺上風(fēng)干lh;加入100 200ulTE， -20°<:保存。
(3) PCR擴增和瓊脂糖電泳
20 pL PCR反應(yīng)體系包括DNA (10 ng/ pL) 2.0 ^L， Primer(4 pmo/ ^L)2.0hL (引物 InDel-丄gc7-l和InDel-丄gc7-2各l.O[aL)， 10xBuffer(free MgCl2) 2.0 nL，dNTP(2.5麵ol/L) 0.4 nL， MgCl2(25匪ol/L) 1.2 ^L， Taq (5 U/^iL) 0.2 |iL和ddH20 12.2pL。反應(yīng)程序包括 95'C預(yù)變性5min;然后95。C變性30s、 56。C復(fù)性30s、 72。C延伸lmin，循環(huán)35次后, 72'C延伸7min， l(TC冷卻10min后，將擴增產(chǎn)物加上樣緩沖液終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物在 質(zhì)量比濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳，經(jīng)溴化乙錠染色并于凝膠成像系統(tǒng)下觀察， 記載。
(4) 成熟種子總蛋白的提取以及SDS-PAGE電泳檢測成熟種子總蛋白的提取參照Cagampang等的方法(Cagampan et al., Studies on the extraction and composition of rice proteins, Cereal Chem, 1966, 43: 145-55)，單粒種子脫殼 去胚后用研缽研磨成極細(xì)的粉末，裝入1.5mL的eppendorf管，加入700uL SDS-UREA 提取緩沖液(8mol/L脲，4%SDS， 5%|3-巰基乙醇，20%丙三醇，50 mmoI/LTris-HCl， PH6.8),振蕩混勻，25°C保溫過夜后，7000g離心5分鐘，并取5|uL上清液用于 SDS-PAGE。
SDS-PAGE根據(jù)Laemmli的方法進(jìn)行(Laemmli U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 1970, 227(5259): 680-685)，采 用15%的分離膠和7.5%的濃縮膠，電泳后采用考馬斯亮藍(lán)R250染色。
(5) 水稻成熟種子的全蛋白SDS-PAGE分析
從水稻種子總蛋白SDS-PAGE的電泳條帶可以看出，與谷蛋白含量正常的水稻品 種日本晴、武育粳3號、02428、 9311以及南京ll相比，低谷蛋白品種W3660醇溶蛋 白(13KDa)的含量相對較高，而成熟谷蛋白酸性亞基(22-23KDa)和堿性亞基(37-39 KDa)的含量則相對較低；以W3660為父、母本，分別與日本晴和02428相互雜交獲 得的4個Fi雜交種的蛋白條帶與W3660完全相同，這表明W3660中的低谷蛋白性狀 呈顯性遺傳，且不存在胚乳的劑量效應(yīng)(圖2)，這與前人的研究結(jié)論完全一致(Miyahara et al.， Analysis of LGC-1, low glutelin mutant of rice,Gamma Field Symposia, 1999， 38:43-52)。
(6) 分子標(biāo)記InDel-丄gc7-l的PCR檢測
利用設(shè)計合成的InDel-￡gc/-l標(biāo)記引物對10份親本和雜種Fi材料進(jìn)行PCR檢測， 結(jié)果表明在LGC-1衍生的低谷蛋白品種W3660以及由W3660為父、母本，分別與 日本晴和02428相互雜交的4個植株中均能穩(wěn)定擴增出一條約881bp大小的DNA片 段，而在5個正常谷蛋白水稻品種日本晴、武育粳3號、02428、 9311和南京11中則 不能進(jìn)行有效擴增(圖3)。這樣的檢測結(jié)果與引物擴增的理論結(jié)果并不完全一致，因 為正常水稻品種在和基因之間并不存在3.5Kb的缺失，所以對這些材料 進(jìn)行PCR擴增應(yīng)會出現(xiàn)一條約4，381bp的條帶，而也應(yīng)同時出現(xiàn)881bp和4，381bp 兩條帶。然而在本試驗過程中，4，381bp大小的DNA片段始終沒有得到有效擴增，分 析其原因可能是由于普通Taq酶對長片段DNA的擴增能力有限造成的。因而， InDekLgc7-l在這里是一個顯性標(biāo)記。 (7 ) 分子標(biāo)記InDel-Lgc 1 -2的PCR檢測
為更好地區(qū)分純合和雜合低谷蛋白基因型，同時在3.5Kb的缺失區(qū)域內(nèi)設(shè)計合成了 一對InDd-Zgc7-2標(biāo)記引物，并利用上述相同的親本和雜種F!材料對其進(jìn)行了驗證。
8結(jié)果表明在5個正常的谷蛋白水稻品種以及4個Fi中均能穩(wěn)定擴增出一條約509bp 大小的DNA片段，而在LGC-l衍生的低谷蛋白水稻品種W3660中則不能進(jìn)行有效擴 增(圖4)。因此，該顯性標(biāo)記可以作為InDekLgc7-l的有效補充，用于準(zhǔn)確鑒定丄g" 位點的谷蛋白基因型。 (8) 分子標(biāo)記InDel-Lgcl-l和InDel-Lgcl-2的雙重PCR檢測
由于InDd-Lgcl-l和InDel-Lgcl-2具有相同的退火溫度以及不同的產(chǎn)物長度，為簡 化試驗操作，節(jié)省成本，將兩對引物加入同一PCR反應(yīng)體系，并期望通過兩個顯性標(biāo) 記的一次使用就達(dá)到區(qū)分純合和雜合谷蛋白基因型的目的。從電泳檢測的結(jié)果我們不難 看出，在LGC-1衍生的低谷蛋白水稻品種W3660中能穩(wěn)定擴增出一條約881bp的單一 條帶，同樣在5個正常的水稻品種日本晴、武育粳3號、02428、 9311和南京11中也 能擴增出一條509bp的條帶，而在由W3660為父、母本，分別與日本晴和02428相互 雜交的4個雜種Fi中卻能同時擴增出509bp和881bp的兩條目的條帶(圖5)。這與預(yù) 期結(jié)果完全相符，兩對引物的雙重PCR檢測可以達(dá)到鑒定丄取/低谷蛋白種質(zhì)資源以及 標(biāo)記輔助育種的目的。序列表
<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
<120> —種鑒別水稻低谷蛋白基因Lgcl的分子標(biāo)記方法
<130>說明書
<140> 00
<141> 2009-09-01
<160> 4
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> 引物InDel-Lgcl-l正向
<222> G)..(20) <223>
<400> 1
ttctacaatg aaggcgatgc 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213>人工
<220>
<221> 引物InDel-Lgcl-l反向
<222> (1)..(18) <223>
<400> 2
ctgggcttta acgggact 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工<220>
<221> 引物InDel-Lgcl-2正向
<222> (1)..(18) <223>
<400> 3
accgtgttat ggcagttt 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> 引物InDel-Lgel-2反向
<222> (1)..(18) <223>
<400> 4
attcaagggc tatcgtct 18
權(quán)利要求
1、一種鑒定水稻低谷蛋白基因Lgc1的分子標(biāo)記引物，包括引物InDel-Lgc1-1正向引物序列5′-TTCTACAATGAAGGCGATGC-3′反向引物序列5′-CTGGGCTTTAACGGGACT-3′和引物InDel-Lgc1-2正向引物序列5′-ACCGTGTTATGGCAGTTT-3′反向引物序列5′-ATTCAAGGGCTATCGTCT-3′
2、 一種鑒定水稻低谷蛋白基因丄g"的分子標(biāo)記方法，其特征是將權(quán)利要求1所述的兩對分子標(biāo)記引物InDeUgc7-l和InDel-￡gc7-2加入同一 PCR反應(yīng)體系，對水稻種質(zhì)資源或育種群體植株的DNA進(jìn)行擴增，反應(yīng)產(chǎn)物在質(zhì)量比濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳，經(jīng)溴化乙錠染色并于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，記載，如果只能擴增出881bp的一條特征條帶，說明該植株是低谷蛋白突變基因丄gc/的純合體；如果只能擴增出509bp的一條特征條帶，說明該植株是不含丄gd突變基因的純合體；如果能同時擴增出881bp和509bp的兩條特征條帶，則說明該植株是低谷蛋白突變基因丄gc7的雜合體。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述鑒定水稻低谷蛋白基因丄g"的分子標(biāo)記方法，其特征是20 ^LPCR反應(yīng)體系包括10 ng/ 的DNA 2.0 pL， 4 pmo1/ pL的引物InDel-Zgc/-l1 .OpL和4 pmo1/ 的引物InDel-Z取7-2 1 .OpL， 1 OxBuffer 2.0 pL， 2.5譲ol/L的dNTP0.4 ^L， 25 mmol/L的MgCl2 1.2 pL， /5 U/pL的Taq 0.2 和ddH20 12.2 ^L;PCR反應(yīng)程序包括95'C預(yù)變性5min;然后95'C變性30s、 56'C復(fù)性30s、 72'C延伸lmin，循環(huán)35次；然后72。C延伸7min， l(TC冷卻10min后，將擴增產(chǎn)物加上樣緩沖液終止反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及水稻低谷蛋白突變基因Lgcl的分子標(biāo)記方法，屬于農(nóng)業(yè)生物工程技術(shù)領(lǐng)域。根據(jù)正常水稻品種與低谷蛋白品種LGC-1在谷蛋白基因Lgcl核酸序列上的差異，設(shè)計合成了兩對插入-缺失標(biāo)記(Insert/Deletion)，InDel-Lgcl-1和InDel-Lgcl-2。將兩對引物加入同一PCR反應(yīng)體系并對待測水稻植株的DNA進(jìn)行擴增，分析標(biāo)記的特征條帶就能準(zhǔn)確鑒定水稻低谷蛋白種質(zhì)資源或育種群體中是否含有Lgcl基因。該標(biāo)記方法能區(qū)分Lgcl基因的純合體和雜合體，預(yù)測后代基因型，大大提高對低谷蛋白基因的選擇效率，加速育種進(jìn)程。
文檔編號C12Q1/68GK101643784SQ200910035090
公開日2010年2月10日 申請日期2009年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月15日
發(fā)明者周麗慧, 張亞東, 鎮(zhèn) 朱, 靜 林, 王才林, 凌 趙, 趙慶勇, 濤 陳 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院