專利名稱：海洋低溫α-淀粉酶基因工程菌、重組酶及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程領域。涉及一種低溫a-淀粉酶基因的表達載體；本發(fā)明 還涉及其基因工程菌株大腸埃希氏菌Escherichia coli EGPS230 ;本發(fā)明還涉及該菌株產(chǎn) 重組低溫a-淀粉酶的方法與產(chǎn)品。
背景技術：
a -淀粉酶為a -1 ， 4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(a -1 ， 4-glucan-4-glucanohydrolase EC.3.2丄1)，是最重要的工業(yè)酶制劑之一，已被廣泛應用在食品、發(fā)酵、紡織、造紙和制 藥等諸多行業(yè)。低溫淀粉酶一般來源于低溫微生物，F(xiàn)eller等人在1992年篩選到一株產(chǎn) 淀粉酶的南極嗜冷海豚毒素交替單胞菌Alteramonas haloplanctis A23，該菌在4°C生長良 好，在1『C細胞繁殖和酶分泌將會受到影響。在0-3(TC，該菌的淀粉酶活力比來自恒 溫的動物淀粉酶活力高7倍。通常情況下，在相對較低溫度范圍內(nèi)，低溫淀粉酶的活性 比相應的嗜溫淀粉酶要高。例如，嗜冷性海洋微生物中分離的淀粉酶在6(TC時活性約為 40°〇時的50%。最適反應溫度與嗜溫淀粉酶相比要低20-3(TC。當超過最適反應溫度 時，該酶極易失活。美國Genencor是開發(fā)用于工業(yè)應用的新酶的領先者，該公司宣稱其 Optisize(R)淀粉酶在低溫下有高活性。 低溫淀粉酶的特殊性質(zhì)使其在工業(yè)生產(chǎn)應用中具有一定的優(yōu)勢，食品行業(yè)是低 溫淀粉酶的一個重要應用領域，很多風味物質(zhì)為保持其風味不丟失，常常需要在低溫條 件下發(fā)酵。0-2(TC溫度范圍內(nèi)(此時同源的嗜溫型酶不活潑)，低溫微生物具有高生長速 率、高酶活力及高催化效率，可大大縮短處理過程的時間并省卻昂貴的加熱等系統(tǒng)，因 此在節(jié)能方面有相當大的優(yōu)勢。與此同時低溫發(fā)酵還能夠減少中溫菌的污染的危險，尤 其是在連續(xù)發(fā)酵操作中。 環(huán)境治理是低溫酶又一個應用領域，在低溫條件下來自低溫微生物的淀粉酶催 化速度較嗜溫型淀粉酶更快，低溫微生物及其產(chǎn)生的淀粉酶還可替代化學方法，這些特 點可以使廢水處理費用降到最低程度。另外在一些季節(jié)性變化幅度大的地區(qū)，溫度變化 很大，這就使微生物分解有機污染物如大分子碳水化合物和類脂的效率降低。將能夠分 泌低溫淀粉酶等酶類的低溫微生物接種到這種環(huán)境里去，則有助于提高對難處理化學物 質(zhì)的生物降解能力。這些微生物具有高催化活性酶及它們在較低溫度下的特殊專一性， 使得低溫微生物及其產(chǎn)生的低溫淀粉酶成為生物治理的理想工具。另外，由于低溫淀粉 酶在0-2(TC的溫度范圍內(nèi)具有高活性的特點，因此，其在飼料、紡織和洗滌工業(yè)的應用 方面同樣具有較大的潛力。 相信隨著研究的持續(xù)深入以及生物工程技術的充分利用，低溫淀粉酶工業(yè)應用 前景將會更廣闊。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種通過分子生物學技術將從海洋耐冷細菌中克隆的一種低溫a-淀粉酶的基因聯(lián)入表達載體，進行表達。
本發(fā)明是通過聚合酶鏈式反應(PCR)的方法獲得了海洋耐冷細菌 Pseudoalteromonas arctica GS230的a -淀粉酶基因，并通過分子生物學技術將上述低溫 a-淀粉酶基因與表達載體連接。 本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是提供一種基因工程菌株大腸埃希氏菌 EPGS230(Escherichia coli EPGS230)， CGMCC No.2700 。 本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是提供一種制備重組低溫a -淀粉酶的方法， 其包括用上述本發(fā)明表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，獲得重組的低溫a-淀粉酶。
本發(fā)明涉及的低溫a -淀粉酶基因來源于海洋細菌Pseudoalteromonas arctica GS230,其基因序列已在GenBank公開，登錄號為EU849122,公眾如果需要，淮海工學 院海洋學院可以對外提供。 本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細胞，只要它能夠表達重組表達載體即可，優(yōu) 選大腸桿菌，進一步優(yōu)選大腸桿菌BL21(DE3)。 以上技術方案中所有基本分子生物操作均參照"分子克隆實驗指南"(第三版， 科學出版社，2002年) 本發(fā)明的低溫a-淀粉酶不僅可以水解淀粉，對于由葡萄糖以a-l， 4糖苷鍵聚 合的多糖都有一定的催化能力。 本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明是一種 核苷酸序列的表達載體，其特點是，它是含有來源于海洋細菌Pseudoalteromonas arctica GS230的低溫a-淀粉酶基因序列的表達載體pEtac-Hivamy;它由下列方法制得將海 洋細菌Pseudoalteromonas arctiac GS230低溫a -淀粉酶基因的核苷酸序列擴增，與質(zhì)粒 pMD18-T載體連接，得到克隆載體pMD18-T-amy，再將克隆載體pMD18-T-amy和表達載 體pEtac-His6分別經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后連接得到表達載體pEtac-His6-amy。
本發(fā)明所要解決的技術問題還可以通過以下的技術方案來實現(xiàn)。本發(fā)明還公開 了一種用于表達海洋細菌Pseudoalteromonas arctica GS230的低溫a -淀粉酶的基因工程菌 株大腸埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCC No.2700。 該基因工程菌株 大腸埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCC No.2700是將前述的表達載體 pEtac-His6-amy轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中進行IPTG誘導表達得到。該基因工 程菌株大腸埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCC No.2700，已于2008年 10月13日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.2700，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所。
本發(fā)明所要解決的技術問題還可以通過以下的技術方案來實現(xiàn)。本發(fā)明還公開 了一種用前述的基因工程菌株大腸埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCC No.2700產(chǎn)重組低溫a-淀粉酶的方法，其特點是，其步驟如下， (l)將基因工程菌株以1X的接種量接入裝有50mLLB培養(yǎng)基的250mL三角 瓶中，在37t:， 180rpm下?lián)u床培養(yǎng)，當培養(yǎng)菌液的OD6。。達到1.0時，再加入濃度為 lmmol L—1誘導劑IPTG， 2(TC誘導16h，得發(fā)酵液；(2)將發(fā)酵液13000Xg離心5min后去掉上清，用3mL生理鹽水懸浮細胞， 13000Xg離心5min去掉上清，重復此操作一次；用3mL蒸餾水充分懸浮細胞，0"C水浴中經(jīng)超聲波破碎5min， 13000Xg離心10min取上清液即得重組低溫a -淀粉酶的粗酶 液； (3)將粗酶液用DEAE離子交換層析和Ni親和層析的方法對重組酶進行純化，即 得純化的重組低溫a-淀粉酶。 取上述的重組低溫a -淀粉酶，應用大腸桿菌工程菌MCA1表達的低溫蛋白經(jīng)活 性實驗鑒定，具有a-淀粉酶活性，證明該低溫蛋白即為所述的重組低溫a-淀粉酶。
以上所述方法得到的重組低溫a-淀粉酶具有以下特征該酶的分子量為 51.5KD;適合作用溫度3(TC，在0t:下有34.5X的酶活力；Ca2+有助于提高該酶的熱穩(wěn) 定性，酶液分別在2(TC保溫2.5h后，其殘余酶活為73% ;該酶的最適作用pH為7.5， 金屬離子Mn2+、 K+、 Na+對酶有激活作用，Hg2+、 pb2+、 Al3+、 Cu2+、 Fe3+和Zn2+能夠 抑制酶活性；1%的曲通對酶有激活作用，lmmol/L的N-溴代丁酰亞胺對酶有強烈抑制 作用，SDS、 EDTA、碘乙酸和三氯乙酸對酶有一定的抑制作用；該酶的Km為7.28mg/ mL， Vmax為13.07mg.mL、min1 ;該酶分解馬鈴薯淀粉為麥芽糖和麥芽二、三、四糖。
本發(fā)明所述的用基因工程菌株大腸埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230) CGMCC No.2700產(chǎn)重組低溫a -淀粉酶的方法制備工藝簡單，所得到的酶具有活力高、 作用溫度低等優(yōu)點。


圖1為pMD18-T-amy的構建圖。 圖2為本發(fā)明熱穩(wěn)定低溫酸性a -淀粉酶基因的PCR擴增圖譜，其中，1 : DNA
Marker; 2: a -淀粉酶基因的PCR擴增產(chǎn)物。 圖3為重組表達載體pEt-28a-His6-amy的構建圖。 圖4為本發(fā)明表達質(zhì)粒pEt-28a-His6-amy經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切分析圖譜，其 中，M: DNA Marker; 1: EcoRI&Sall; 2: pEt-28a-His6-amy/EcoR I。
圖5為本發(fā)明基因工程菌株表達產(chǎn)物重組熱穩(wěn)定低溫酸性a-淀粉酶的 SDS-PAGE電泳圖，其中，1 :為標準蛋白；2 :粗酶液；3 : DEAE離子交換層析；4 : Ni親和層析；5:活性帶。 圖6為溫度對重組熱穩(wěn)定低溫酸性a -淀粉酶酶活力的影響圖。 圖7為pH溫度對重組熱穩(wěn)定低溫酸性a -淀粉酶酶活力的影響圖。 圖8為重組熱穩(wěn)定低溫酸性a -淀粉酶的溫度穩(wěn)定性圖。 圖9為重組熱穩(wěn)定低溫酸性a -淀粉酶的pH穩(wěn)定性圖。 圖10為重組a -淀粉酶水解可溶性淀粉的Lineweaver-Burk圖。 圖11為重組熱穩(wěn)定低溫酸性a -淀粉酶水解馬鈴薯淀粉產(chǎn)物薄層層析圖；其 中，M : Marker ; Gl :葡萄糖；G2 :麥芽糖；G3 :麥芽三糖；G4 :麥芽四糖；G5 :
麥芽五糖；G6 :麥芽六糖；G7 :麥芽七糖。
具體實施例方式以下參照附圖，進一步描述本發(fā)明的具體技術方案，以便于本領域的技術人員
進一步地理解本發(fā)明，而不構成對其權利的限制。
下列實施例中的材料與方法為 所采用的分子克隆技術參見J.莎畝布魯克等編的《分子克隆實驗指南》。
所使用的工具酶購自大連寶生物公司和上海生工生物工程公司，具體的反應條 件和使用方法均參考商品說明書。 所使用的膠回收試劑盒購自大連寶生物公司，使用方法均參考商品說明書。
實施例l。
克隆質(zhì)粒pMD18-T-amy的構建。 設計低溫a-淀粉酶基的引物正向引物l和反向引物2。在引物l加上EcoRI酶 切位點，在引物2加上Sal I酶切位點。 引物1序列5' -GCGCGAATTCATGAACAGGGGTATAT-3 ，，劃線部分為 EcoRI位點。引物2序列5' -TAGTCGACTCAGCCCACCCCACAG-3，劃線部分為Sal I位點。 以Pseudoalteromonas arctica GS230的基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR
產(chǎn)物電泳，利用TaKaRa公司Gel Extraction Kit試劑盒割膠回收純化。與pMD18-T載體
連接，構建了克隆質(zhì)粒pMD18-T-amy(見圖l)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，通過藍白菌落
初步篩選陽性克隆，進一步將重組質(zhì)粒用EcoR I和Sal I同時進行雙酶切后電泳檢測，在
1.5kb左右處有一條特異性亮帶(見圖2)，證明所選重組子為陽性克隆，與已經(jīng)獲得的淀
粉酶基因序列對比表明序列完全正確。 實施例2。
表達載體pEtac-Hise-amy的構建。 重組T-載體(pMD18-T-amy)和pEt-28a-His6分別進行EcoR I和Sal I雙酶切，其
酶切反應體系(20iiL)如下 10 X buffer H 2 y LEcoR I(或Sal I)(IOU P L1) 1 y LpEtac-His6(或PCR產(chǎn)物) 14 y L 將pMD18-T-amy進行EcoR I和Sal I雙酶切，膠回收1.5kb條帶，對pEac質(zhì)粒 進行EcoR I和Sal I雙酶切，膠回收5.6kb的條帶；將前后兩次膠回收產(chǎn)物混合，16。C連 接18h(如圖3)，構建了 N端含有六個組氨酸標簽的表達載體pEtac-Hivamy。外源基因 在E.coli表達時，為了簡化表達產(chǎn)物的純化步驟，通常添加His、 MBP等標簽，使表達產(chǎn) 物可以通過Ni-NTA層析柱純化(Schlieben et al.， 2004)。 因此在構建表達載體時在N端 添加了 His6標簽。重組質(zhì)粒pEtac-His6-amy經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切，電泳驗證發(fā)現(xiàn)在 1.5kb左右處出現(xiàn)一條亮帶，證明重組正確，見圖4。 實施例3。 一種用于表達實施例2所述的重組低溫a -淀粉酶重組表達載體的基 因工程菌株大腸埃希氏菌EPGS230(Escherichia coli EPGS230)CGMCC No.2700，它是將實 施例2所述的表達載體pEtac-His6-amy轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)中得到 的基因工程菌株大腸埃希氏菌EPGS230(Escherichia coli EPGS230)CGMCC No.2700。
實施例4。 一種用實施例3所述的基因工程菌株大腸埃希氏菌 EPGS230(Escherichia coli EPGS230)CGMCC No.2700產(chǎn)重組低溫a -淀粉酶的制備方法， 其步驟如下 (1)將基因工程菌株以1%的接種量接入裝有50mL LB(蛋白胨，1% ;酵母粉，5〃頁
0.5% ; NaCl， 1% ; pH 7.0)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在37。C， 180rpm下?lián)u床培養(yǎng)， 當培養(yǎng)菌液的0D6。。達到1.0時，再加入濃度為lmmol 'L—1誘導劑IPTG， 2(TC誘導16h， 得發(fā)酵液；(2)將發(fā)酵液13000Xg離心5min后去掉上清，用3mL生理鹽水懸浮細胞， 13000Xg離心5min去掉上清，重復此操作一次；用3mL蒸餾水充分懸浮細胞，0"C水 浴中經(jīng)超聲波破碎5min， 13000Xg離心10min取上清液即得重組低溫a -淀粉酶的粗酶 液； (3)將制取的粗酶液用DEAE離子交換層析和Ni親和層析的方法對重組酶進行純 化，即得純化的重組低溫a-淀粉酶。見表l，在SDS-PAGE上a-淀粉酶的活性染色帶 與考馬斯亮藍染色帶一致，其分子量為51.7KDa(見圖5)。
表1粗酶液的純化
總,活 U總蛋白比活力 U,'mg魏ft倍數(shù) 儒回枚率 (%)
粗,液1232.8145.58.471.0l麵
離子交換柱M0.5l謹2.0譜
Nl親和柱3楊13,625.513,0128,1 實施例5。實施例4所制得的重組低溫酸性a -淀粉酶的酶學性質(zhì)研究。 [OO58] (1)溫度對酶活力的影響。 將酶分別在在(TC -50°〇水浴中進行酶活測定。用pH 7.5的Tris-HCl溶液配置的 1% (w v1)淀粉溶液作為作用底物。重組a -淀粉酶的最適作用溫度3(TC時，在0"仍 有34%的酶活力(見圖6)。
(2)pH對酶活力的影響。 將酶液與在不同pH的1% (w v1)的可溶性淀粉溶液中在3(TC下進行酶活力測 定。采用兩種方法配制不同pH的1 % (w w "的可溶性淀粉溶液，第一種方法為不同pH 值的緩沖液為50mmo1 L—1檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.0 4.0) ; 50mmo1 L—1檸檬酸-磷酸 氫二鈉緩沖液分別調(diào)節(jié)pH5-9，最適作用pH為7.5(見圖7)。
(3)溫度對酶熱穩(wěn)定性的影響。 將酶分別在20、 30和4(TC的水浴中保溫進行溫度對酶穩(wěn)定性的實驗，每個溫 度保溫2.5h，每隔lh取出一組樣品，迅速置于冰水中，待保溫結(jié)束后統(tǒng)一進行酶活力測 定，以未處理酶液作為對照。酶液分別在20、 30、 4(TC分別保溫5h后，其殘余活性分別 為73%、 28%和0% (見圖8)。
(4)pH對酶穩(wěn)定性的影響。 將20 ii L酶液與180 y L濃度為0.04mol/L的各種不同pH(4.5-9)的通用緩沖液 混合，分別在30°C的水浴中保溫lh后，取10 ii L保溫后的酶液測定殘余酶活，對照組為
720iiL酶液與180iiL蒸餾水混合物。，見圖9。
(5)金屬離子或化學試劑對酶活性的影響。 將各種金屬離子與酶液混合，使其最終濃度分別達到1 .Ommol L—1和 5.0mmol丄—、然后在9(TC下測酶活。將各種常用化學試劑與酶液混合，使其最終濃度分 別為lmmol L—1和5mmo1 L—1測酶活，均以未處理的酶液的酶活設為100% 。金屬離子 Mn2+、 K+、 Na+對酶有激活作用，Hg2+、 Pb2+、 Al3+、 Cu2+、 Fe3+和Zn2+等能夠強烈的抑 制酶活性。1%的曲通對酶有激活作用，lmmol/L的N-溴代丁酰亞胺對酶有強烈抑制作 用，SDS、 EDTA、碘乙酸和三氯乙酸對酶有一定的抑制作用，(見表2)。
表2金屬離子和化學試劑對重組低溫a -淀粉酶影響
離子相對酶活窗； ,丁化學試劍相對鷗潘
對照l猶OMg2*腳認對照wo,oo
168.85斷+132-54SDS68JS
Cu2+17,05LT雄1,4SEDTA70.73
Ba2494.CJ2Co"諷《三氣乙酸m詞
123.26ro2+39,31尿素(1%)雄認
33*5623.16*乙鐵73.85
155.37Zn2+32.29N-漠代丁二廳亜驗6.19
Ag+22.1455.鄉(xiāng)DTT腦.，fl
Ca》11，Hg2+li*3S,通《1%)137,20 (6)酶動力學研究。 以不同濃度(3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 8.0、 10、 15.0mg/mL)的可溶性淀粉作為底 物，對重組低溫淀粉酶進行酶動力學研究，測定底物不同濃度時的酶活，反應體系為取 190 L不同濃度的淀粉溶液加入淀粉酶lOii L，于9(TC下準確反應10min，取出后迅速 加入200 ii LDNS沸水浴5min，加入3mL蒸餾水，在520nm下測定吸光值。以不同濃度 的可溶性淀粉作為底物，對重組的純化淀粉酶進行酶動力學測定，根據(jù)Lineweaver-Burk 理論，由方程V1 = Km Vmax—1 S—VVmax—1求得該酶的7.28mg/mL， Vmax為13.07mg/ mL .min(見圖10)。 (7)重組熱穩(wěn)定低溫酸性a -淀粉酶水解產(chǎn)物特異性研究。 以1% (wv1)的馬鈴薯淀粉作為底物，每毫升底物溶液中加入lOOi!L稀釋的酶 液，置于2(TC水浴中，分別反應l、 4、 8和16h，取不同反應時間的產(chǎn)物進行高效薄層層 析，展劑使用正丁醇、乙酸和水的混合物，顯色劑為5%濃硫酸和乙醇溶液，使用噴霧器 將顯色劑均勻噴撒到干燥后的薄層板上，置于105t:下顯色20 30min。該重組超低溫 a-淀粉酶可以很好的水解馬鈴薯淀粉，在作用lh后既已將馬鈴薯淀粉糊精化，繼續(xù)反應 后形成含麥芽糖在內(nèi)的一系列寡糖，隨著水解時間的延長糊精逐漸減少，麥芽寡糖含量 逐漸升高，連續(xù)作用16h后層析圖中有少量葡萄糖生成(見圖11)，表明該重組a-淀粉酶分解馬鈴薯淀粉，其主要產(chǎn)物是麥芽糖和麥芽二、三和四糖c
權利要求
一種核苷酸序列的表達載體，其特征在于，它是含有來源于海洋細菌Pseudoalteromonas arctica GS230的低溫α-淀粉酶基因序列的表達載體pEtac-His6-amy；它由下列方法制得將海洋細菌Pseudoalteromonasarctiac GS230低溫α-淀粉酶基因的核苷酸序列擴增，與質(zhì)粒pMD18-T載體連接，得到克隆載體pMD18-T-amy，再將克隆載體pMD18-T-amy和表達載體pEtac-His6分別經(jīng)EcoRI和SalI雙酶切后連接得到表達載體pEtac-His6-amy。
2. —種用于表達海洋細菌Pseudoalteromonas arctica GS230的低溫a -淀粉酶的基因工 程菌株大腸埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCC No.2700，它是將權利 要求1所述的表達載體pEtac-Hise-amy轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進行IPTG誘導表達得到。
3. 根據(jù)權利要求2所述的基因工程菌株大腸埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCCNo.2700，其特征在于，所述的大腸桿菌為E.coli BL21(DE3)。
4. 一種用權利要求2或3所述的基因工程菌株大腸埃希氏菌EGPS230(Escherichia coli EGPS230)CGMCCNo.2700產(chǎn)重組低溫a-淀粉酶的方法，其特征在于，其步驟如下，(1) 將基因工程菌株以1X的接種量接入裝有50mLLB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在 37°C ， 180rpm下?lián)u床培養(yǎng)，當培養(yǎng)菌液的OD6。。達到1.0時，再加入濃度為lmmol丄—1誘 導劑IPTG， 20。C誘導16h，得發(fā)酵液；(2) 將發(fā)酵液13000Xg離心5min后去掉上清，用3mL生理鹽水懸浮細胞，13000Xg 離心5min去掉上清，重復此操作一次；用3mL蒸餾水充分懸浮細胞，0。C水浴中經(jīng)超聲 波破碎5min， 13000 Xg離心10min取上清液即得重組低溫a -淀粉酶的粗酶液；(3) 將粗酶液用DEAE離子交換層析和Ni親和層析的方法對重組酶進行純化，即得純 化的重組低溫a-淀粉酶。
5. —種如權利要求4所述方法得到的重組低溫a-淀粉酶，其特征在于該酶的分 子量為51.5KD;適合作用溫度3(TC，在0t:下有34.5X的酶活力；C^+有助于提高該酶 的熱穩(wěn)定性，酶液分別在2(TC保溫2.5h后，其殘余酶活為73%;該酶的最適作用pH為 7.5，金屬離子Mn2+、 K+、 Na+對酶有激活作用，Hg2+、 Pb2+、 Al3+、 Cu2+、 Fe3+和Zn2+能 夠抑制酶活性；1 %的曲通對酶有激活作用，lmmol/L的N-溴代丁酰亞胺對酶有強烈抑 制作用，SDS、 EDTA、碘乙酸和三氯乙酸對酶有一定的抑制作用；該酶的Km為7.28mg/ mL， Vmax為13.07mg.mL—1.min1 ;該酶分解馬鈴薯淀粉為麥芽糖和麥芽二、三、四糖。
6. —種如權利要求5所述重組低溫a -淀粉酶在淀粉水解中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程領域，涉及將一種低溫α-淀粉酶基因重組到表達載體上，并轉(zhuǎn)化至表達宿主構成的工程菌、利用工程菌表達的重組酶及該酶在工業(yè)中的應用。本發(fā)明采用分子操作技術，通過細菌基因組的提取確規(guī)定、目的基因的擴增、表達載體的構建及重組載體轉(zhuǎn)化受體細胞構建了一株工程菌EPGS230，工程菌經(jīng)過培養(yǎng)，誘導、離心、超聲破碎、離子交換和親和層析等步驟獲得純化的重組低溫α-淀粉酶。本發(fā)明所述制備工藝簡單、酶活力高、作用溫度低等優(yōu)點。
文檔編號C12N1/21GK101691579SQ20091003497
公開日2010年4月7日 申請日期2009年9月16日 優(yōu)先權日2009年9月16日
發(fā)明者劉姝, 劉紅飛, 呂明生, 房耀維, 李華鐘, 王淑軍, 陳麗 申請人:淮海工學院;江南大學