專利名稱：可用于防治栗疫病的含有弱毒性病毒chv1-cn280的菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為可用于防治栗疫病的含有弱毒性病毒CHV1-CN280的菌株 CHV1-CN280，簡(jiǎn)稱菌株CN280，是一種存在于栗疫病菌菌株細(xì)胞質(zhì)中的dsRNA病 毒及其應(yīng)用于生物防治栗疫病的方法，屬于植物保護(hù)領(lǐng)域，專用于板栗樹栗疫病的防 治。
二背景技術(shù)：
板栗疫病由一種稱作寄生隱叢赤殼(Co^/zow"n'"para甜/ca)的真菌危害引起栗 樹枝干病害，有的地區(qū)又稱栗胴枯病、栗干枯病，是一種世界性栗樹病害，苗木及大 樹均可受害，主要危害主干及枝條，使栗實(shí)產(chǎn)量和質(zhì)量明顯下降，嚴(yán)重時(shí)造成全株枯 死。
栗樹疫病于上世紀(jì)初自亞洲傳播到歐美，引起歐美三十年代的栗樹疫病大流行， 由于病害發(fā)生在樹皮的韌皮部，藥液很難滲透進(jìn)去，美國(guó)使用了大量殺菌劑試圖撲滅 栗疫病的蔓延都?xì)w于無效，最終毀滅了美國(guó)的數(shù)十億株栗樹，并使與其相關(guān)的化工、 制革、建筑木材工業(yè)從繁榮迅速走向衰敗。我國(guó)是栗樹疫病的起源地，分布廣泛。我 國(guó)的板栗曾被認(rèn)為是高度抗病的，但不少省、市，如遼寧、河北、河南、山東、安徽、 浙江、江西、廣東、廣西、湖南等省均有發(fā)生，有的地方還十分嚴(yán)重，甚至造成大片 板栗失收林毀，被列為國(guó)內(nèi)外檢疫對(duì)象。近年來隨著各地種植栗樹面積迅速擴(kuò)大，栗 疫病己成為影響板栗產(chǎn)量的重要限制因素，因此，栗疫病流行規(guī)律的研究和有效防治 顯得十分重要。
隨著人們對(duì)化學(xué)農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染以及病菌抗藥性發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識(shí)，綠色食品 和有機(jī)農(nóng)業(yè)的大力推廣，研制生物防治病蟲害的生物農(nóng)藥已成為生產(chǎn)實(shí)際和農(nóng)林產(chǎn)品 出口的迫切需求。
六十年代，意大利的栗樹疫病由于發(fā)生了弱毒力菌系的擴(kuò)展而得到有效控制，瀕 臨滅絕的意大利栗林逐漸得到恢復(fù)。法國(guó)科學(xué)家將意大利恢復(fù)生長(zhǎng)的栗樹上分離到的 栗疫病菌弱毒力菌株成功地應(yīng)用于生產(chǎn)上進(jìn)行生物防治，也有效地控制住了法國(guó)栗樹 疫病的蔓延。經(jīng)研究，發(fā)現(xiàn)栗疫病菌的這種弱毒性特征是由于菌株感染了一種裸露的 雙鏈核糖核酸病毒(double-stranded RNA，dsRNA)引起的，這種dsRNA病毒存在于 病菌的細(xì)胞質(zhì)中，可依賴真菌菌株間的菌絲融合進(jìn)行傳播，也可通過分生孢子傳遞給 下一代?，F(xiàn)共鑒定出的四種栗疫菌弱毒性病毒(CHV1、 CHV2、 CHV3禾nCHV4)，屬 新建立的弱毒性病毒科(場(chǎng)pow'nW^單屬科)。
CHV1病毒的基因組結(jié)構(gòu)含有兩個(gè)ORF: ORFA和ORFB。 ORFA編碼一個(gè)多聚 蛋白p69，它可以自我剪切成兩個(gè)蛋白p29和p40，實(shí)施這一剪切功能的是位于p29多肽鏈中的木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。ORFB編碼一個(gè)更大的多肽，其表達(dá)中也涉及到一個(gè)自我剪切的過程，在此過程中產(chǎn)生一個(gè)48kD的蛋白質(zhì)，p48，它具有另外一個(gè)木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶位點(diǎn)；另外ORFB還編碼兩個(gè)比較保守的蛋白，RNA聚合酶和解鏈酶。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是針對(duì)我國(guó)部分地區(qū)板栗栗疫病不能有效進(jìn)行化學(xué)防
治的情況，篩選一種栗疫病菌弱毒性病毒CHV1-CN280毒株用于生物防治，含有該
病毒的弱毒力菌株能安全有效地將弱毒性病毒傳播給毒力菌株，并由此控制和防治栗
樹林中栗疫病的危害和蔓延，安全、無污染，有效期長(zhǎng)。其內(nèi)容和實(shí)施方案如下
可用于防治栗疫病的含有弱毒性病毒CHV1-CN280的菌株，其特征在于該栗疫病菌菌株CHV1-CN280含有CHV1-CN280病毒，分類上屬于寄生隱叢殼(0>p/w"e"n'ap"raW!'ca)，現(xiàn)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)(北京)，保藏日期2009年6月29日，保藏號(hào)CGMCC No. 3136。
所含有的弱毒性病毒CHV1-CN280，分類上屬于弱毒性病毒科(/fy/xmWAe)，弱毒性病毒屬(H^pow'rt^)，栗疫病菌弱毒性病毒(Co^/w"ecWa/7>7 oWn ) 1號(hào)禾中。所述菌株和病毒均可在生物防治栗疫病方面的應(yīng)用。其用于生物防治栗疫病的方法為利用含有CHV1-CN280弱毒性病毒的栗疫病菌菌株的菌絲或孢子接種栗樹的栗疫病病斑周圍從而使病斑愈合，栗樹恢復(fù)正常生長(zhǎng)。有益效果
CHV1-CN280來自我國(guó)北方的CHV1病毒，其部分29基因序列經(jīng)分析屬于亞型I ，與歐洲CHV1病毒的遺傳距離為0.352，差異很大；而且該病毒對(duì)毒性菌株的平均轉(zhuǎn)化率高，離體防治栗疫病效果較好。目前，國(guó)內(nèi)尚無有關(guān)利用弱毒性病毒進(jìn)行生物防治栗疫病的研究報(bào)道，而該生物防治菌劑的開發(fā)將有極為顯著的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效

nrft.。
(1) 樹上病毒傳播率顯著高于室內(nèi)培養(yǎng)皿中測(cè)定結(jié)果
實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室條件下不能傳遞低毒力的供、受體菌，在田間配對(duì)接種或者已經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株與供體菌的野生型后代配對(duì)接種后表現(xiàn)的毒力都與供體菌相當(dāng)，表現(xiàn)低毒力或中等毒力，再分離后測(cè)定表明，在栗樹組織上可以發(fā)生低毒力的傳遞。這可能由于室內(nèi)轉(zhuǎn)化時(shí)間太短而降低了弱毒力的轉(zhuǎn)換率，田間接種延長(zhǎng)了菌株間的接觸時(shí)間，可以提高弱毒力的轉(zhuǎn)化率，這就大大提高了利用低毒力菌株進(jìn)行栗疫病生物防治
的潛力。樹上接種的病毒傳播率(林間一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)的病毒傳遞率可達(dá)90%以上)更能代表弱毒力菌株的防治栗疫病的實(shí)際效果。
(2) 無農(nóng)藥污染；無副作用
利用化學(xué)防治雖可收到一定的防效，但這種方法需要多次樹體噴射、用藥濃度高，板栗樹體高大，以致防治困難、費(fèi)力，并且容易產(chǎn)生抗藥性，從而限制了化學(xué)防治。Jaynes等發(fā)現(xiàn)在樹干內(nèi)注射內(nèi)吸性殺菌劑多菌靈可收到一定的防治效果。但這種方法需要多次注射，而且用藥濃度高，不僅容易引起藥害，而且栗疫病菌也會(huì)產(chǎn)生抗藥性。針對(duì)這種情況，Elkins等在栗樹根系附近的土壤中注射多菌靈防效也較佳，這種方法可以降低藥害和減少施藥次數(shù)。趙云琴等報(bào)道，病株在刮除病部腐朽組織后再涂以抗菌劑401的400倍藥液，對(duì)此病有明顯的防治效果。王萬章等報(bào)道，碳酸鈉和波爾多液亦有效。由于每年產(chǎn)生新病斑，長(zhǎng)期使用農(nóng)藥會(huì)造成藥害，病菌也會(huì)產(chǎn)生抗藥性，從而限制了化學(xué)防治的應(yīng)用。
應(yīng)用弱毒力菌株進(jìn)行生物防治在意大利和法國(guó)的效果較好，尤其是在意大利，有些原來疫病為害非常嚴(yán)重的地區(qū)，現(xiàn)在已難找到正常的潰瘍斑。意大利菌株的VCG數(shù)量較少，毒力菌株較易轉(zhuǎn)化成功，利用弱毒力進(jìn)行防治，問題比較簡(jiǎn)單。
在法國(guó)，弱毒力菌株雖然不能迅速擴(kuò)散，但毒力菌株的VCG不復(fù)雜，很少產(chǎn)生子囊孢子，使VCG的數(shù)量很難增加，而且毒力菌株每年擴(kuò)展速度比較緩慢，因此，通過人工接種弱毒力菌株，可使其擴(kuò)展和轉(zhuǎn)化進(jìn)程與毒力菌株的擴(kuò)展和侵染同步。經(jīng)過一段時(shí)間后，栗樹園里即能有效地建立起一定數(shù)量的弱毒力菌株群體，使整個(gè)栗樹園得到保護(hù)。
(3) 長(zhǎng)期效果積累效應(yīng)明顯
弱毒力菌株的自然擴(kuò)散以及意大利栗樹條件的相應(yīng)改善，可能是可傳遞性弱毒力的生物防治潛力的最好說明。自意大利第一次發(fā)現(xiàn)栗疫病的40年后，由于弱毒力菌株的自然擴(kuò)散，該病害已不再成為當(dāng)?shù)乩鯓湓耘嗟闹饕獑栴}。在對(duì)弱毒力菌株的治療性質(zhì)進(jìn)行論證之后，以及證明60年代以來，意大利的栗疫病明顯受到這種現(xiàn)象的自然控制后，Grente制定了與法國(guó)農(nóng)部合作的相當(dāng)規(guī)模的栗疫病生物防治計(jì)劃，計(jì)劃中采用人工引入弱毒力菌株到法國(guó)栗樹種植園中。操作程序包括前三年每公頃成功處理10個(gè)潰瘍斑，以后2 3年每公頃處理5個(gè)潰瘍斑，在10年內(nèi)完成對(duì)所有栗樹種植園的病害控制。
歐洲栗疫病由于栗疫病菌低毒力菌株的自然擴(kuò)散(意大利)或人工應(yīng)用(法國(guó))得以成功防治的報(bào)導(dǎo)，激起人們?nèi)ヅυ囼?yàn)這可傳播的低毒性因子能否有效防治北美的栗疫病?？的铱宿r(nóng)業(yè)試驗(yàn)站的研究者證實(shí)，在控制條件下，歐洲的弱毒力菌株可以治療北美毒力菌株引起的潰瘍。接著又發(fā)現(xiàn)北美幾個(gè)不同的地區(qū)存在當(dāng)?shù)氐娜醵玖辏?976年，首先在密歇根州的存活美洲栗上分離到弱毒力菌株。Fulbright及其同事證實(shí)在整個(gè)密歇根州的不同地方都存在當(dāng)?shù)氐娜醵玖辏⑻峁┝瞬粩喟l(fā)展的生物控制的證據(jù)。
(4) 安全、經(jīng)濟(jì)、體現(xiàn)生態(tài)保護(hù)理念接種操作不會(huì)威脅工作人員的安全，不會(huì)發(fā)生使用農(nóng)藥會(huì)發(fā)生的中毒事件；每年接種一次生防菌，幾年后可使弱毒力菌株成為栗樹林中優(yōu)勢(shì)菌群而不再需要
實(shí)施栗疫病防治的其他措施，不像化學(xué)防治，每年需多次進(jìn)行，永無寧日，因而經(jīng)濟(jì)效益可觀；接種弱毒力菌株防治栗疫病，對(duì)栗樹林中有益昆蟲、微生物無害，保護(hù)了生態(tài)系統(tǒng)的平衡性，防止了生態(tài)環(huán)境的破壞與污染。 一些小動(dòng)物、鳥類、昆蟲和節(jié)肢動(dòng)物在栗林中弱毒力菌株傳播到其他栗樹栗疫病病斑上的過程中起到極大的幫助作用。
四

圖1栗疫菌弱毒性病毒CHV1-CN280 cDNA全序列(A)及氨基酸序列(B)與其他已測(cè)序的CHV1
病毒同源性比較圖2 CN280菌株(左)及其脫毒菌株(右)的培養(yǎng)特征圖3栗疫菌弱毒性病毒CHV1-CN280的電泳圖譜特征
M:分子量標(biāo)記；1， CHV1-CN280; 2, CHV1-354;
3， CHV1-EP713; 4， CHV1-238; 5， CHV1-250.圖4培養(yǎng)皿中栗疫菌菌株間弱毒性病毒傳播試驗(yàn)
A:野生型菌株；B:弱毒力菌株；C:病毒傳播區(qū)圖5 CN280菌株及其脫毒菌株的生長(zhǎng)曲線
五具體實(shí)施例方式
含有CHV1-CN280病毒的栗疫病菌菌株CHV1-CN280是我實(shí)驗(yàn)室采集我國(guó)遼寧省栗樹疫病標(biāo)本后分離得到，分類上屬于子囊菌門Ascomycota;糞殼菌綱Sordariomycetes;腐皮殼菌目Diaporthales; 隱叢赤殼菌禾斗Cryphonectriaceae; 隱叢赤殼菌屬Cryphonectria; 寄生隱叢赤殼菌CV7/ /zo"g"r/a戸ra誠(chéng)ca。 PDA培養(yǎng)基上含有CHV1-CN280病毒的栗疫病菌菌株的菌落呈白色(黑暗培養(yǎng))或淡黃色(光照培養(yǎng))，菌絲體表面生，菌絲有隔、分枝，氣生菌絲較多；PDA培養(yǎng)不產(chǎn)生或極少產(chǎn)生分生孢子器(圖2)，少量分生孢子由菌絲分枝生成，分生孢子單細(xì)胞無色，卵形或橢圓形，3 4nmxl.5 2(am。
dsRNA病毒CHV1-CN280其部分29基因序列經(jīng)分析屬于亞型I ，與歐洲CHV1病毒的遺傳距離為0.352，差異很大。CHV1-CN280病毒分類上屬于弱毒性病毒科(Hypoviridae )，弱毒性病毒屬(Hypovirus )，栗疫病菌弱毒性病毒1號(hào)種(0;^/rawe"Wa/^; OT/ms l)，該病毒存在于栗疫病菌細(xì)胞質(zhì)中，分子序列為12.730kb，含有兩個(gè)開放閱讀框架(ORF): ORFA和ORFB; ORFA可編碼p69蛋白，并可自動(dòng)裂解為p29和p40蛋白；ORFB編碼一聚合酶基因和一解旋酶基因；序列的3'端為一polyC尾(圖l)。 CHV1-CN280病毒的一個(gè)獨(dú)特特征是在兩個(gè)閱讀框(ORFs)連接處的編碼在CHV1-EP713、 CHV1- Euro7、 CHV1-EP721和CHV2-NB58的ORFA和ORFB連接處為UAAUG，而在CHV1-CN280中卻是AUGUAUAA。
將上述含有CHV1-CN280弱毒性病毒的栗疫病菌菌株CHV1-CN280用于生物防治栗疫病的方法為在栗樹的栗疫病病斑周圍用打孔器打出孔洞(至形成層下，孔洞數(shù)量視病斑大小定)，將含有上述菌株菌絲體(菌絲及孢子)的瓊脂塊填進(jìn)孔洞，以膠帶封閉孔口即可。
(一)栗疫病菌菌株間不同弱毒性病毒傳遞率的測(cè)定在對(duì)板栗疫病菌的遺傳群體進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究中，發(fā)現(xiàn)和鑒定出50余株含有dsRNA病毒的菌株，室內(nèi)和林間的研究結(jié)果明確了 CHV1-CN280弱毒性病毒對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)體親和群(相差l 4個(gè)w基因)的菌株的傳遞感染率最高，室內(nèi)平板上培養(yǎng)2星期的傳遞率平均可達(dá)68.75%,而其他弱毒性病毒的傳遞率平均只有38.75% (表l)。林間一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)的病毒傳遞率可達(dá)90%以上，可以有效地控制林中板栗疫病的發(fā)生與流行，顯示出該病毒具有應(yīng)用于田間生物防治栗疫病的較大潛力。
目前，國(guó)內(nèi)尚沒有有關(guān)利用弱毒性病毒進(jìn)行栗疫病生物防治的研究報(bào)道，本發(fā)明得到的弱毒性病毒CHV1-CN280毒株在不同營(yíng)養(yǎng)體親和群的菌株間傳播能力也比歐洲毒株CHV1-EP713和CHVl-Euro7高。
表1室內(nèi)栗疫病菌菌株間不同弱毒性病毒傳遞率的測(cè)定
Vc基因差異傳遞率％EP713EP43267CN280
0薩100100100
1658085 85
24052.582.5卯
3252040
4001060
平均(l-4 vc差異)27.5039.3849.3868.75
注本表及附圖中的EP155 (ATCC38755)、 EP713 (ATCC 52571)和EP43 (ATCC 38767)菌株為美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌株收藏中心保存(American Type Culture Collection, Rockville， Md.);其他中國(guó)菌株(267、354、 238和250也為公知公用，見文獻(xiàn)(徐陳賢，劉福秀,周曉云，王克榮.2004，中國(guó)東部栗疫病菌dsRNA群體的多樣性.生物多樣性，12(3):370-376)。菌株CN280為本發(fā)明含有弱毒性病毒CHV1-CN280的菌株CHV1-CN280。
(二) 含有CHV1-CN280病毒的栗疫病菌菌株與野生型菌株的毒力比較取直徑為3.5 5.0cm、長(zhǎng)50cm的1 2年生板栗枝段，在自來水下沖洗枝段表面，
自然晾千后用融化的白蠟將枝段兩端及側(cè)枝傷口處密封，防止水分散失和外來污染。在枝段兩側(cè)每隔12cm處用滅菌的打孔器(直徑0.5cm)打孔，深達(dá)形成層下部。在孔中接入同樣大小的幼嫩菌絲塊，菌絲體朝內(nèi)，并以少量滅菌濕棉球保濕，外用透明膠帶封閉，標(biāo)明菌株編號(hào)。每個(gè)菌株重復(fù)數(shù)個(gè)，并處不同板栗枝段上，以美國(guó)強(qiáng)毒力菌株EP155(ATCC 38755)為陽性對(duì)照，以PDA無菌瓊脂塊為空白對(duì)照。接種后的栗樹枝段放入密封容器中，以濕紗布覆蓋保濕。置于25'C室溫下45天，取出測(cè)量病斑的長(zhǎng)和寬，利用橢圓形面積公式計(jì)算病斑面積，以其病斑面積除以陽性菌株EP155的病斑面積并乘以IOO，得出其相對(duì)毒力。
野生型CN280菌株在栗樹枝上可形成35 40cm2大小的病斑，而含有CHV1-CN280的弱毒力菌株形成的病斑只有10 14cr^的面積。
(三) CHVl-CN280病毒dsRNA的提取與電泳
用于提取dsRNA的菌絲體制備在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株至長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，在皿中加入10ml滅菌水，用刮刀刮取全部菌絲體，將全部繁殖體懸浮液倒入裝有200ml馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(PDB)的500ml三角瓶中，將三角瓶放在振蕩培養(yǎng)搖床上以250rpm的轉(zhuǎn)速、25'C下培養(yǎng)4天，將強(qiáng)韌性濾紙鋪在平底瓷質(zhì)漏斗中，將漏斗連結(jié)好抽氣三角瓶，三角瓶連接上負(fù)壓水流，倒入菌絲體懸浮液，打開自來水開關(guān)，刮下濾紙上的菌絲體，放入50ml離心管中，置于一2(TC下過夜，旋松離心管蓋子，放入真空干燥機(jī)中干燥，置于一20'C下備用(或直接粉碎)，用金屬桿攪碎菌絲體成粉末備用或一2(TC下保存?zhèn)溆?。dsRNA的提取和檢測(cè)
dsRNA的分離純化方法是根據(jù)纖維素對(duì)核酸的親和吸附作用原理，采用柱層析法進(jìn)行的。在15%-17%乙醇存在的條件下，纖維素CF-ll對(duì)dsRNA有特異性吸附作用，從而使dsRNA與其它類型的核酸(DNA和單鏈RNA)分離開來，達(dá)到純化的目的。溶液(Solutions) : 10xSTE: 1MNaCl
0.5MTris pH8.010mM EDTAlxSTE2xSTE
Column Wash Buffer: 500ml 2xSTE
170ml EtOH330ml dH20
Extraction Buffer (per 10 ml): 2xSTE 1 ml 10xSTE
0.01%NaDIECA O扁g2% SDS 0.02g
A. 制備層析用CF-11纖維素將30 g CF-11纖維素粉加入250 ml層析柱洗脫緩沖液使之充分膨脹，4"C下保存；
B. 制備層析柱將膨脹后的纖維素加入層析管中達(dá)2cm左右高度；
C. 平衡數(shù)分鐘。
(1)稱取0.5g菌絲粉，加入10ml提取緩沖液，振蕩混勻，加入8ml酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)，輕微振蕩，3500rpm離心15分鐘，將上層水相移入潔凈的10ml刻度試管中，準(zhǔn)確地計(jì)量體積，加入(邊低速振蕩邊滴入)無水乙醇至其濃度為17%，裝入層析柱，靜置，使dsRNA充分吸附到纖維素CF-ll上，至少用60ml洗柱緩沖液進(jìn)行洗脫，當(dāng)柱上端只有2mm的緩沖液留下時(shí)，暫停洗脫，加入50pl溴酚藍(lán)，將洗柱緩沖液全部放空，接著加入lxSTE7ml，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)層析柱的底部時(shí)，開始收集流下的液體于一個(gè)10ml的刻度試管，加入1/10體積的3M NaAc和兩倍體積的無水乙醇，在-7(TC下放置15分鐘，在4。C下，8000rpm離心1小時(shí)，用500pl H20重懸浮沉淀。加入50pl3mol/lNaAc和2倍體積的無水乙醇，-20"下過夜。12000rpm離心沉淀，70%酒精洗滌一次，晾干，滅菌雙蒸水溶解。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)dsRNA。栗疫病菌dsRNA瓊脂糖凝跤電泳檢測(cè)比較結(jié)果見圖3，電泳圖像表明，在分子量為12.7kb處，歐洲病毒CHV1-EP713和中國(guó)各病毒均有一明顯的核酸帶，
8CHV1-CN280在2.5kb, 2.7kb,2.9kb和3.2kb處還各有一條副帶。
(四) CHV1病毒的傳播測(cè)定
(1) 培養(yǎng)皿中試驗(yàn)
將活化好的含有弱毒性病毒的弱毒力菌株和無病毒感染的毒力菌株的菌絲塊移 至PDA平板上配對(duì)培養(yǎng)，兩菌絲塊相距0.5cm以內(nèi)，置于25i:條件下，3 5天后檢 查傳播結(jié)果。傳播成功的結(jié)果驗(yàn)證將PDA上病毒傳播成功的生長(zhǎng)區(qū)域(圖4-C)挑 取小塊菌絲塊，移至新鮮PDA平板上培養(yǎng)，根據(jù)其菌落的形態(tài)特征初步確定是否傳 播成功；將初步認(rèn)為傳播成功的菌株液體培養(yǎng)后提取dsRNA,電泳后明確其傳播結(jié)果。
一般在兩菌株菌絲接觸后兩三天，橘黃色菌落的毒力菌株靠近弱毒力菌株的菌絲 體會(huì)發(fā)生白化現(xiàn)象，并逐漸擴(kuò)展直至蔓延整個(gè)毒力菌株以后形成的菌落。將白化菌落 挑取小塊培養(yǎng)，可形成穩(wěn)定的白色菌落；將其菌絲體提取dsRNA電泳，可形成 CHV1-CN280特征性電泳條帶，即在分子量為12.7kb處有一明顯的核酸帶，在2.5kb， 2.7kb, 2.9kb和3.2kb處還各有一條副帶。
(2) 板栗樹上試驗(yàn)
春季栗樹發(fā)芽時(shí)，在低于五年生的健康樹干上用打孔器打出相鄰0.5cm的孔洞， 深至形成層下，在兩孔洞中各填入一塊含有弱毒性病毒的弱毒力菌株和無病毒感染的 毒力菌株的菌絲塊，無菌濕棉球保濕，外用透明膠帶封閉，做好接種菌株記錄。秋季 及第二年秋季落葉時(shí)，進(jìn)行病斑擴(kuò)展測(cè)量，并在接種毒力菌株的病斑邊緣取樣分離， 觀察其是否被轉(zhuǎn)化。
第二年在毒力菌株形成的病斑周圍有愈傷組織形成，表明毒力菌株已被轉(zhuǎn)化為弱 毒力菌株；將其病斑邊緣取樣分離，得到白色菌落的栗疫病菌，也表明了毒力菌株已 被轉(zhuǎn)化為弱毒力菌株。
(五) CN280弱毒力菌株及其脫毒菌株的生長(zhǎng)率比較 ' 采用單孢分離法，利用野生型菌株和弱毒力菌株的培養(yǎng)特征差異，在CN280弱
毒力菌株的單孢后代菌落中分離得到脫毒菌株，在PDA平板培養(yǎng)基上比較二者的生 長(zhǎng)速率。采用內(nèi)徑5mm的打孔器切取菌絲塊，置于PDA平板培養(yǎng)基中心處，五皿重 復(fù)結(jié)果表明(圖5):弱毒力菌株培養(yǎng)7天的生長(zhǎng)速率稍大于脫毒菌株。
(六) CN280弱毒力菌株林間防治試驗(yàn) 在林中有栗疫病的樹干上的病斑邊緣，用打孔器打出孔洞，深達(dá)韌皮部下，將預(yù)
先制備好的菌絲塊植入孔洞中，以膠帶封閉；同時(shí)選擇同等大小的病斑不作任何處理 作為對(duì)照。深秋后或一年后測(cè)量處理病斑和對(duì)照病斑的大小，計(jì)算防治效果病斑抑 制率=(對(duì)照病斑面積一處理病斑面積)/對(duì)照病斑面積xlOOX。
防治效果與接種菌和被轉(zhuǎn)化菌間的營(yíng)養(yǎng)體親和性基因差異數(shù)量也有關(guān)系。 一般相 差l-2個(gè)vc基因的防治效果都較好，病斑轉(zhuǎn)化率可達(dá)100%;如果菌株間vc基因差
異太多，防治效果要差些(參見表l)，因此在進(jìn)行田間防治試驗(yàn)和推廣防治時(shí)，還要
注意接種菌株的vc基因型搭配。
權(quán)利要求
1.可用于防治栗疫病的含有弱毒性病毒CHV1-CN280的菌株，其特征在于該栗疫病菌菌株CHV1-CN280含有CHV1-CN280病毒，分類上屬于寄生隱叢殼(Cryphonectria parasitica)，現(xiàn)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)(北京)，保藏日期2009年6月29日，保藏號(hào)CGMCC No.3136。
2. 權(quán)利要求1所述菌株含有的防治栗疫病的含有弱毒性病毒CHV1-CN280，其 特征在于所述CHV1-CN280病毒分類上屬于弱毒性病毒科(7fy/wwWc/ae)，弱毒 性病毒屬(ify/ww'nw)，栗疫病菌弱毒性病毒(07/ /w從"〃'a/^/xm'n/51) 1號(hào)禾中。
3. 權(quán)利要求l所述菌株在生物防治栗疫病方面的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求2所述病毒在生物防治栗疫病方面的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求1所述菌株用于生物防治栗疫病的方法利用權(quán)利要求1所述含有 CHV1-CN280弱毒性病毒的栗疫病菌菌株的菌絲或孢子接種栗樹的栗疫病病斑周圍 從而使病斑愈合，栗樹恢復(fù)正常生長(zhǎng)。
全文摘要
本發(fā)明為可用于防治栗疫病的含有弱毒性病毒CHV1-CN280的菌株，屬于植物保護(hù)領(lǐng)域。弱毒性栗疫病菌菌株(CHV1-CN280)含有12.7kb的dsRNA病毒。該菌株的菌絲或孢子接種栗樹的栗疫病病斑周圍從而使病斑愈合，栗樹恢復(fù)正常生長(zhǎng)。CHV1-CN280病毒在栗疫病菌的不同菌株間的傳播率高于其他同類病毒，在相差1～4個(gè)VC基因的菌株間的平均傳播率為74％(培養(yǎng)皿，14天)，而其他同類病毒的傳播率平均為48％(34～65％)；而在栗樹上病斑上的傳播率兩年后可達(dá)95％。因而對(duì)目標(biāo)栗樹上栗疫病的病斑防治效果可以達(dá)到95％以上。
文檔編號(hào)C12N1/14GK101649294SQ200910034989
公開日2010年2月17日 申請(qǐng)日期2009年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月17日
發(fā)明者平 丁, 蘭春能, 包小梅, 華朝暉, 云 葉, 張林巧, 濤 李, 林少波, 王東龍, 王克榮, 肖江濤, 鄧清超, 坤 高 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)