專利名稱：L-茶氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及L-茶氨酸的酶法轉(zhuǎn)化制備方法。
二背景技術(shù)：
L-茶氨酸(L-Theanine)是一種存在于茶葉中的天然氨基酸，其結(jié)構(gòu)式為 CH3CH2NHCOCH2CH2CH(NH2)COOH。它是茶葉中的主要游離氨基酸和主要呈 味物質(zhì)。由于L-茶氨酸具有降低血壓，松弛神經(jīng)，減肥，抗疲勞，提高免疫力 等多種生理功能，所以在食品、保健品及藥品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。
根據(jù)目前文獻(xiàn)報導(dǎo)，L-茶氨酸的制備方法主要有以下三種
1、 從茶葉中提取
茶葉中L-茶氨酸含量較為豐富。該法用幵水浸泡茶葉，然后用有機溶劑萃 取和離子交換分離來提取L-茶氨酸。目前該法存在的主要問題是工序多，得率 比較低，成本較高。
2、 化學(xué)合成法
1942年，以色列人N. Lichtenstein (J. Am. Chem.Soc., 1942， 64, 1021-1022)
首次在實驗室用吡咯烷酮酸和33%乙胺水溶液反應(yīng)得到茶氨酸，該方法收率較 低。
2004年，陳新等(CN 1280261C， 2004)用L-吡咯烷酮酸與無水乙胺，在 抗氧化劑存在或用干燥乙胺氣體排盡空氣環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)，L-茶氨酸收率達(dá) 58%。
2005年，焦慶才等(CN 1228314C， 2005)用鄰苯二甲酰基作為保護(hù)基， 脫水生成N-鄰苯二甲酰-L-谷氨酸酐，與2mol/L乙胺水溶液反應(yīng)生成中間產(chǎn)物 N-鄰苯二甲酰-L-茶氨酸，以水合肼反應(yīng)除保護(hù)基，L-茶氨酸收率超過50%。
雖然化學(xué)合成法比從茶葉中直接提取步驟更簡單，但化學(xué)合成過程中需要 對活性基團進(jìn)行保護(hù)和去保護(hù)，并且合成出來的茶氨酸常含有D型產(chǎn)物，需要 經(jīng)拆分才能得到L型茶氨酸。
3、 酶法合成
近年來微生物酶法合成L-茶氨酸發(fā)展迅速，常用的酶有谷氨酰胺酶、谷氨酰胺合成酶和Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。
2002年，日本人H. Suzuki等(Enzyme and Microbial Technology, 2002, 31 (6), 884-889)首次利用從轉(zhuǎn)基因大腸桿菌SH642 (含有重組質(zhì)粒pUC18-GGT)中 得到的Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶作催化劑，以L-谷氮酰胺和乙胺混合溶液為底物生物催 化合成L-茶氨酸，底物轉(zhuǎn)化率為60%。
2005年，日本太陽化學(xué)株式會社立木隆等(CN 1688705A， 2005)利用從 土壤中分離的具有谷氨酰胺酶活性的香茅醇假單胞菌GEA作為L-茶氨酸產(chǎn)生 菌，以L-谷氨酰胺和乙胺為底物合成L-茶氨酸。
2007年，王賢波等(茶葉科學(xué)，2007， 27 (1)， 61~66)利用轉(zhuǎn)基因大腸 桿菌(含有重組質(zhì)粒pET-GGT)，催化L-谷氨酰胺和鹽酸乙胺反應(yīng)生成L-茶氨 酸，L-谷氨酰胺轉(zhuǎn)化率為48.22%。
2007年，日本人SenbaHisao等(JP 2007185132 A)利用谷氨酰胺酶催化 L-谷氨酸-Y -乙酯和乙胺反應(yīng)生成L-茶氨酸，L-谷氨酸-Y -乙酯轉(zhuǎn)化率為71%。
2008年，賈曉鶴等(食品工業(yè)科技，2008， 29 (2), 166~169)利用轉(zhuǎn)基 因大腸桿菌(含有重組質(zhì)粒pET28a-GGT)粗酶液作為催化劑，催化L-谷氨酰 胺和乙胺合成L-茶氨酸，L-谷氨酰胺轉(zhuǎn)化率達(dá)到57.8%。
2008年，江波等(CN 101343618A， 2008)利用具有Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性 的枯草芽孢桿菌SKI 1.004 (CCTCC NO: M 208083),催化L-谷氨酰胺和乙胺合 成L-茶氨酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)80%以上。
2008年，姚忠等(CN 101270376A， 2008)利用具有，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性 的枯草芽孢桿菌NX-2 (CGMCCNo. 0833)，催化L-谷氨酰胺和乙胺合成L-茶 氨酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)57.5%以上。
由于酶法合成L-茶氨酸與化學(xué)合成法相比不會產(chǎn)生消旋現(xiàn)象，而且轉(zhuǎn)化率 較高，所以受到了廣泛重視和研究，并已經(jīng)進(jìn)入工業(yè)化應(yīng)用領(lǐng)域。
到目前為止，利用微生物來源或基因工程來源的Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶作為催化 劑，以L-谷氨酸-Y -烷基酯或L-谷氨酰肼和乙胺為底物，酶法制備L-茶氨酸的 方法還未見文獻(xiàn)報導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題是提供一種高效、低成本的制備L-茶氨酸的方法。目前受技術(shù)和成本的限制，我國氨基酸工業(yè)中L-茶氨酸的產(chǎn)量不能滿足國 內(nèi)外市場的需求。本發(fā)明采用廉價的L-谷氨酸-Y-烷基酯或L-谷氨酰肼和乙胺 為起始原料，利用Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶作催化劑制備L-茶氨酸，反應(yīng)條件溫和，底 物轉(zhuǎn)化率高。
本發(fā)明可以通過以下的技術(shù)方案來達(dá)到 L-茶氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其步驟為
(1 )將含有Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的菌體細(xì)胞或該酶提取液與含有L-谷氨酸-Y -烷基 酯或L-谷氨酰肼和乙胺的水溶液混合，加入表面活性劑和金屬離子，在pH9 11，溫度25'C 60。C條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)；
(2)通過等電點結(jié)晶法或等電點結(jié)晶與離子交換樹脂相結(jié)合的方法對反應(yīng)生成 物進(jìn)行分離，得到高純度的L-茶氨酸。
上述步驟(1)所用的Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶來源于現(xiàn)己報道的微生物菌株或基因 工程菌枯草芽孢桿菌NX-2 (CGMCC No. 0833)或枯草芽孢桿菌SK11.004
(CCTCC NO: M 208083)或大腸桿菌SH642 (含有重組質(zhì)粒pUC18-GGT)或 基因工程菌GGT (含有重組質(zhì)粒pET28a-GGT)。所用底物為L-谷氨酸-Y -烷基 酯或L-谷氨酰肼和乙胺的混合水溶液，其濃度分別為0.1mol/L 0.8mol/L和 0.1mol/L 14mol/L，反應(yīng)液中L-谷氨酸-Y-烷基酯或L-谷氨酰肼和乙胺摩爾比 為1 :3~ 1 : 18，最適摩爾比為1 : 6~ 1 : 10，溶液pH為9 11，調(diào)溶液pH所用 的無機酸為鹽酸或硫酸或磷酸。所述的表面活性劑為吐溫-80或十六垸基三甲基 溴化銨或聚乙二醇辛基苯基醚，其濃度為0.05g/L 50g/L;所述的金屬離子為 鉀離子或鈉離子或鈣離子或鎂離子或錳離子，其濃度為5xlO—Vol/L 5xl0"mol/L。酶促反應(yīng)中反應(yīng)溫度為25。C 6(TC，最適反應(yīng)溫度為30°C 45 °C。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比其有益效果是
本發(fā)明的主要特點在于利用廉價的L-谷氨酸-y-烷基酯或L-谷氨酰肼代替 L-谷氨酰胺作為酶促反應(yīng)的底物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，可以降低生產(chǎn)成本， 解決了現(xiàn)有技術(shù)以L-谷氨酰胺和乙胺為制備原料成本較高的問題。L-茶氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其具體^驟如下
1、 將1000mL發(fā)酵液離心得到的大腸打菌SH642 (含有重組質(zhì)粒pUC18-GGT) 菌體15 g加入到1000mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液含60g L-谷氨酸-Y-丙酯，112g乙 胺，20mL 1%聚乙二醇辛基苯基醚，10mL lmol/L氯化^丐，30%鹽酸調(diào)pH至10， 35'C反應(yīng)26h。反應(yīng)液中L-茶氨酸濃度(g/mL)為3.98%，底物L(fēng)-谷氨酸-Y-丙酯的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到72%。
2、 將反應(yīng)液離心去菌體，用30%鹽酸調(diào)上清液pH到3，酸化液升溫到70 80°C ， 加入活性炭脫色，將脫色液通過732型陽離子交換樹脂杜吸附。用3%氨水洗脫 L-茶氨酸飽和吸附柱，收集含L-茶氨酸的洗脫液980mL，真空減壓濃縮到 400mL，保溫60 70。C，加入活性炭脫色，繼續(xù)將脫色液真空減壓濃縮到130mL 左右，趁熱加入二倍量95°/。酒精，冷卻到l(TC左右結(jié)晶6小吋，真空過濾，75% 酒精洗滌，烘干得29.1g精品，結(jié)晶母液回收酒精后循壞套用。
實施例四
L-茶氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其具體步驟如下
1、 將1000mL發(fā)酵液離心得到的基因工程菌GGT(含有重組質(zhì)粒pET28a-GGT) 菌體17g加入到1000mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液含80gL-谷氨酸-Y-丁酯，120g乙 胺，20mL 1%聚乙二醇辛基苯基醚，10mL lmol/L氯化鎂，30%鹽酸調(diào)pH至10， 35匸反應(yīng)30h。反應(yīng)液中L-茶氨酸濃度(g/mL)為4.88%，底物L(fēng)-谷氨酸-Y-丁酯的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到71%。
2、 將反應(yīng)液離心去菌體，用30%鹽酸調(diào)上清液pH到3，酸化液升溫到70~80°C ， 加入活性炭脫色，將脫色液通過732型陽離子交換樹脂杜吸附。用3%氨水洗脫 L-茶氨酸飽和吸附柱，收集含L-茶氨酸的洗脫液1200mL，真空減壓濃縮到 450mL，保溫60 7(TC,加入活性炭脫色，繼續(xù)將脫色液真空減壓濃縮到200mL 左右，趁熱加入二倍量95%酒精，冷卻到l(TC左右結(jié)晶8小B寸，真空過濾，75% 酒精洗滌，烘干得35.5g精品，結(jié)晶母液回收酒精后循環(huán)套用。
實施例五
L-茶氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其具體步驟如下1、 將lOOOmL發(fā)酵液離心得到的枯草芽孢桿菌NX-2菌體23 g加入到1000mL 轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液含40g L-谷氨酰肼，90g乙胺，20mL 0.5%吐溫-80， 10mL lmol/L氯化鉀，30。/。鹽酸調(diào)pH至10， 45'C反應(yīng)22h。反應(yīng)液中L-茶氨酸濃度
(g/mL)為3.22%，底物L(fēng)-谷氨酰肼的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到74。/。。
2、 將反應(yīng)液離心去菌體，用30%鹽酸調(diào)上清液pH到3，酸化液升溫到70~80°C， 加入活性炭脫色，將脫色液通過732型陽離子交換樹脂柱吸附。用3%氨水洗脫 L-茶氨酸飽和吸附柱，收集含L-茶氨酸的洗脫液650mL，真空減壓濃縮到 310mL，保溫60 7(TC，加入活性炭脫色，繼續(xù)將脫色液真空減壓濃縮到lOOmL 左右，趁熱加入二倍量95%酒精，冷卻到l(TC左右結(jié)晶6小時，真空過濾，75% 酒精洗滌，烘干得23.6g精品，結(jié)晶母液回收酒精后循環(huán)套用。
實施例六
L-茶氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其具體步驟如下
1、 將1000mL發(fā)酵液離心得到的枯草芽孢桿菌SK11.004菌體20 g加入到 1000mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液含60g L-谷氨酰肼，150g乙胺，10mL 1%十六烷基 三甲基溴化銨，10mL lmol/L氯化鈉，30%鹽酸調(diào)pH至10， 40。C反應(yīng)28h。反 應(yīng)液中L-茶氨酸濃度(g/mL)為4.67°/。，底物L(fēng)-谷氨酰肼的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到 72%。
2、 將反應(yīng)液離心去菌體，用30%鹽酸調(diào)上清液pH到3，酸化液升溫到70 8(TC， 加入活性炭脫色，將脫色液通過732型陽離子交換樹脂柱吸附。用3%氨水洗脫 L-茶氨酸飽和吸附柱，收集含L-茶氨酸的洗脫液950mL，真空減壓濃縮到 500mL，保溫60 7(TC，加入活性炭脫色，繼續(xù)將脫色液真空減壓濃縮到140mL 左右，趁熱加入二倍量95%酒精，冷卻到IO'C左右結(jié)晶7小時，真空過濾，75% 酒精洗滌，烘干得34.5g精品，結(jié)晶母液回收酒精后循環(huán)套用。
實施例七
L-茶氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其具體步驟如下 1、將lOOOmL發(fā)酵液離心得到的大腸桿菌SH642 (含有重組質(zhì)粒pUCl8-GGT) 菌體15g加入到1000mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液含80gL-谷氨酰肼，200g乙胺，20mL1%十六烷基三甲基溴化銨，10mL lmol/L氯化鈣，30%鹽酸調(diào)pH至10, 40°C 反應(yīng)33h。反應(yīng)液中L-茶氨酸濃度(g/mL)為6.48%，底物L(fēng)-谷氨酰肼的摩爾 轉(zhuǎn)化率達(dá)到75%。
2、將反應(yīng)液離心去菌體，用30。/。鹽酸調(diào)上清液pH到3，酸化液升溫到70~80°C ， 加入活性炭脫色，將脫色液通過732型陽離子交換樹脂柱吸附。用3%氨水洗脫 L-茶氨酸飽和吸附柱，收集含L-茶氨酸的洗脫液1100mL，真空減壓濃縮到 550mL，保溫60 7(TC，加入活性炭脫色，繼續(xù)將脫色液真空減壓濃縮到200mL 左右，趁熱加入二倍量95%酒精，冷卻到l(TC左右結(jié)晶8小時，真空過濾，75% 酒精洗滌，烘干得47.9g精品，結(jié)晶母液回收酒精后循環(huán)套用。
實施例八
L-茶氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其具體步驟如下
1、 將1000mL發(fā)酵液離心得到的基因工程菌GGT(含有重組質(zhì)粒pET28a-GGT) 菌體18 g加入到1000mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液含100g L-谷氨酰肼，250g乙胺， 20mL P/。聚乙二醇辛基苯基醚，20mL lmol/L氯化鎂，30%鹽酸調(diào)pH至10，42°C 反應(yīng)38h。反應(yīng)液中L-茶氨酸濃度(g/mL)為8.43%，底物L(fēng)-谷氨酰肼的摩爾 轉(zhuǎn)化率達(dá)到78%。
2、 將反應(yīng)液離心去菌體，用30%鹽酸調(diào)上清液pH到3，酸化液升溫到70~80°C， 加入活性炭脫色，將脫色液通過732型陽離子交換樹脂柱吸附。用3%氨水洗脫 L-茶氨酸飽和吸附柱，收集含L-茶氨酸的洗脫液1400mL，真空減壓濃縮到 700mL，保溫60 7(TC，加入活性炭脫色，繼續(xù)將脫色液真空減壓濃縮到250mL 左右，趁熱加入二倍量95%酒精，冷卻到l(TC左右結(jié)晶10小時，真空過濾， 75%酒精洗滌，烘干得62.4g精品，結(jié)晶母液回收酒精后循環(huán)套用。
權(quán)利要求
1、一種L-茶氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征是由以下步驟構(gòu)成(1)將含有γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的菌體細(xì)胞或該酶提取液與含有L-谷氨酸-γ-烷基酯或L-谷氨酰肼和乙胺的水溶液混合，加入表面活性劑和金屬離子，在pH9～11，溫度25℃～60℃條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)；(2)通過等電點結(jié)晶法或等電點結(jié)晶與離子交換樹脂相結(jié)合的方法對反應(yīng)生成物進(jìn)行分離，得到高純度的L-茶氨酸。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所還的L-茶氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于步驟(1) 所用的y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶來源于具有y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性的微生物菌株或基因 工程菌株枯草芽孢桿菌NX-2或枯草芽孢桿菌SK11.004或大腸桿菌SH642或 基因工程菌GGT。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-茶氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于步驟(1) 所用的底物L(fēng)-谷氨酸-y -垸基酯為L-谷氨酸-y -甲酯或L-谷氨酸-y -乙酯或L-谷 氨酸-y -丙酯或L-谷氨酸-y -丁酯。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-茶氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于步驟(1) 所用的底物是L-谷氨酸-y-烷基酯或L-谷氨酰肼和乙胺，溶液pH為9 11，調(diào) 溶液pH所用的無機酸為鹽酸或硫酸或磷酸。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-茶氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于步驟(1) 所述的表面活性劑為吐溫-80或十六烷基三甲基溴化銨或聚乙二醇辛基苯基醚， 其濃度為0.05g/L 50g/L;所述的金屬離子為鉀離子或鈉離子或鈣離子或鎂離子 或錳離子，其濃度為5xl(r4mol/L 5xlO-'mol/L。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-茶氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于步驟(1) 中底物L(fēng)-谷氨酸-y -垸基酯或L-谷氨酰肼與乙胺的摩爾比為1 : 3 ~ 1 18，最適 摩爾比為1 : 6~ 1 : 10。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-茶氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于步驟(1) 中酶促反應(yīng)溫度為25。C 6(TC，最適反應(yīng)溫度為3CTC 45。C。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及L-茶氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法。該制備方法以L-谷氨酸-γ-烷基酯或L-谷氨酰肼和乙胺作為原料，將含有γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的菌體細(xì)胞或該酶提取液與含有L-谷氨酸-γ-烷基酯或L-谷氨酰肼和乙胺的水溶液混合，在25℃～60℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)，利用等電點結(jié)晶或等電點結(jié)晶與離子交換樹脂相結(jié)合的方法分離轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，得到高純度的L-茶氨酸。該方法以L-谷氨酸-γ-烷基酯或L-谷氨酰肼為主要原料，具有原料價格低廉，操作簡便，轉(zhuǎn)化時間短，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。
文檔編號C12P13/00GK101560532SQ20091002719
公開日2009年10月21日 申請日期2009年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月25日
發(fā)明者茜 劉, 劉均忠, 飛 張, 焦慶才, 熊吉濱 申請人:南京大學(xué) 被以下專利引用 (1),