專利名稱：：一種以動(dòng)物肝臟為原料同時(shí)制備過(guò)氧化氫酶和促肝細(xì)胞生長(zhǎng)液的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種以動(dòng)物肝臟為原料同時(shí)制備過(guò)氧化氫酶和促肝細(xì)胞生長(zhǎng)液的工藝，屬生物活性物質(zhì)的分離提取
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT),是一種高效、安全、環(huán)保、節(jié)能的生物催化劑，可迅速的將過(guò)氧化氫分解為水和氧，在紡織、食品等工業(yè)中具有廣泛的用途。目前市售的過(guò)氧化氫酶主要來(lái)源有三個(gè)從豬、牛等動(dòng)物肝臟中提取純化而得；由變種黑曲霉在通風(fēng)攪拌等條件下培養(yǎng)而得；由纖維蛋白小球菌經(jīng)深層發(fā)酵提取精致而得。2004年后，國(guó)內(nèi)從豬、牛等動(dòng)物肝臟中提取生產(chǎn)過(guò)氧化氫酶的關(guān)鍵技術(shù)有了很大突破。因?yàn)槌杀竞蛢r(jià)格上的優(yōu)勢(shì)，發(fā)展很快。目前，用該方法生產(chǎn)的過(guò)氧化氫酶因?yàn)閮r(jià)格上的優(yōu)勢(shì)，在紡織印染行業(yè)占領(lǐng)了大部分的市場(chǎng)份額。在紡織行業(yè)中，CAT應(yīng)用于紡織品氧漂后的生物脫氧凈化工藝，能在大幅度節(jié)約水和能源的情況下，清除氧漂后織物和水浴中對(duì)后續(xù)活性染料染色可能產(chǎn)生染料分解或染色疵病的殘留過(guò)氧化氫，縮短工序時(shí)間，提高染色質(zhì)量，減少印染廢水排放。該酶也適用于賓館、醫(yī)院、洗衣房等使用過(guò)氧化氫進(jìn)行漂白或消毒的紡織品，以防止由于織物中殘留過(guò)氧化氫的存在而造成使用者皮膚過(guò)敏、引發(fā)炎癥等不良后果，減少有害廢水的排放，可避免織物氧化脆損，從而延長(zhǎng)使用期限在食品工業(yè)中，CAT能迅速有效地分解食品加工后殘留過(guò)氧化氫(雙氧水)，適用于在食品加工過(guò)程中使用過(guò)氧化氫(雙氧水)作為漂白劑、氧化劑、淀粉變性劑、防腐劑的食品除氧，可用于紙塑無(wú)菌包裝材料殺菌后在包裝之前的除氧；以及用于消除牛奶、蛋制品、干酪等生產(chǎn)中因紫外線照射產(chǎn)生過(guò)氧化氫而造成的特異臭味，是一種用于食品加工的新型除氧酶；產(chǎn)品也可用作烘焙食品的膨松劑；具有保護(hù)食品營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不被過(guò)氧化氫破壞，避免因過(guò)氧化氫隨食品進(jìn)入人體內(nèi)造成對(duì)人體傷害的作用。目前，CAT已經(jīng)得到廣泛的普及應(yīng)用，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)需求量在紡織行業(yè)已經(jīng)達(dá)到每年1萬(wàn)噸以上；在食品行業(yè)也已達(dá)到近千噸的需求量，且隨著對(duì)食品安全嚴(yán)格要求和過(guò)氧化氫酶應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓寬，這個(gè)量還在成倍地增長(zhǎng)。CAT酶為節(jié)能減排，減少紡織、食品行業(yè)的環(huán)境污染做出了積極的貢獻(xiàn)。隨著我國(guó)產(chǎn)業(yè)調(diào)整的力度不斷加大，環(huán)境保護(hù)政策的落實(shí)到位，作為紡織行業(yè)和食品行業(yè)實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)的必需產(chǎn)品之一，CAT的市場(chǎng)需求量將進(jìn)一步加大。事實(shí)上提取CAT時(shí)所用原料一-動(dòng)物的肝臟中，除了CAT之外，還有輔酶A、促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素、肝肽、人體必需氨基酸、優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)等許多可供開(kāi)發(fā)利用的附加值極高的生物活性因子。"促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素"(H印atocyteGrowth-PromottingFactors)簡(jiǎn)稱HGF，是從動(dòng)物提取的肝源性的多肽類活性物質(zhì)，分子量大部分在2萬(wàn)以下，高效液相色譜(HPLC)分析表明本品含有多個(gè)協(xié)同作用的活性組分，內(nèi)含16種氨基酸和微量元素，特異性作用于肝臟器官，能直接促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷腺苷水平，從而促進(jìn)肝細(xì)胞再生，修復(fù)損傷的肝細(xì)胞，也可改善肝細(xì)胞膜脂質(zhì)流動(dòng)性，通過(guò)保護(hù)相關(guān)轉(zhuǎn)移酶活性維持細(xì)胞內(nèi)外離子平衡，起到抗肝纖維化作用。對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷有較好的保護(hù)作用，降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶，促使病變細(xì)胞恢復(fù)的功能。一般應(yīng)用是將其制成注射液藥物，應(yīng)用于肝病，尤其是亞急性重癥肝炎(病毒性，肝功衰竭早期或中期)的輔助治療；對(duì)各種肝臟損傷及疾病都有預(yù)防和治療作用。促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液在我國(guó)首先由湖南醫(yī)科大學(xué)數(shù)位教授歷經(jīng)十幾年研究而獲得應(yīng)用于臨床的新一代純生物制劑的促肝類藥物。在"促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素"出現(xiàn)以前，人們對(duì)重癥肝炎患者的治療束手無(wú)策，重癥肝炎成為臨床上死亡率極高的病種。在動(dòng)物中，繁殖能力較強(qiáng)、容易獲得且價(jià)廉的是乳豬肝，具備用其進(jìn)行規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)的條件。在國(guó)內(nèi)醫(yī)學(xué)和生物界及醫(yī)藥廠的共同努力下，第一個(gè)來(lái)源于動(dòng)物肝臟的促肝細(xì)胞素類的藥物-注射用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素于1992年被國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)用于臨床，其試用效果很快被證實(shí)。真正在工業(yè)上實(shí)現(xiàn)是在2001年以后的事。目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)有幾十家生產(chǎn)廠家。本發(fā)明是在提取過(guò)氧化氫酶時(shí)，通過(guò)分析檢測(cè)及摸索發(fā)現(xiàn)工藝中產(chǎn)生的廢水、廢渣經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶幚?，可以提取許多種對(duì)人體有益的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。如將廢渣經(jīng)不同的蛋白酶水解，過(guò)濾除渣后，與工藝廢水合并，再經(jīng)一步或幾步不同截留分子量的超濾、納濾或反滲透膜處理，便可加工成不同的目的產(chǎn)物。"促肝細(xì)胞生長(zhǎng)液"為其中的一種。該液體經(jīng)過(guò)氨基酸譜檢測(cè)證實(shí)，其中富含人體所需的17種氨基酸，總氨基酸達(dá)到62.91g/100g;經(jīng)原子吸收法測(cè)定證實(shí)，內(nèi)含豐富的對(duì)人體有益的微量元素，尤其是鐵、鋅、、鎂、鈣；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)毒性低，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該液體與對(duì)照組相比，對(duì)大鼠纖維化肝細(xì)胞有明顯的修復(fù)作用；經(jīng)藥物活性檢測(cè)(MTT法)刺激指數(shù)可達(dá)2，3，從而進(jìn)一步說(shuō)明該液體具有保肝、護(hù)肝功能。該液體經(jīng)提純后，可加工成藥物一-促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液，也可明經(jīng)簡(jiǎn)單的低溫干燥處理，加工成具保肝功能的功能食品原料，有極高的附加值。能夠在分離提取過(guò)氧化氫酶的同時(shí)，聯(lián)產(chǎn)促肝細(xì)胞生長(zhǎng)液，不但提高了原料的利用率，而且在消除廢水和廢渣的同時(shí)實(shí)現(xiàn)企業(yè)的增值和增收，形成可實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益與資源環(huán)境效益共贏的新工藝國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)任何報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明發(fā)明了一種以動(dòng)物肝臟為原料同時(shí)制備過(guò)氧化氫酶和促肝細(xì)胞生長(zhǎng)液的工藝。尤為獨(dú)特的是，它充分考慮了原料的充分利用和"三廢"減排對(duì)過(guò)氧化氫酶加工生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展的意義，在不影響過(guò)氧化氫酶的得率和品質(zhì)的前提下，對(duì)現(xiàn)有加工工藝所產(chǎn)生的廢水廢渣進(jìn)行了綜合利用，通過(guò)聯(lián)產(chǎn)生化藥物原料，對(duì)動(dòng)物肝臟原料進(jìn)行全利用，達(dá)到了既不影響過(guò)氧化氫酶的得率和品質(zhì)，實(shí)現(xiàn)廢渣廢水廢渣零排放的目的，又能形成一套以動(dòng)物肝臟為原料同時(shí)制備過(guò)氧化氫酶和促肝細(xì)胞生長(zhǎng)液的工藝。這對(duì)于過(guò)氧化氫酶加工制造業(yè)的可持續(xù)發(fā)展而言是至關(guān)重要的。促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素是從動(dòng)物提取的肝源性的多肽類活性物質(zhì)，分子量大部分在2萬(wàn)以下。動(dòng)物肝臟提取了過(guò)氧化氫酶后剩余部分廢水，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)富含大量的人體必需氨基酸和各種具有保肝作用的肽類活性因子。廢渣經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)拿附饧庸ぬ幚?，酶解液過(guò)濾除渣后與工藝廢水(初級(jí)膜透過(guò)液)，經(jīng)過(guò)適當(dāng)截留分子量的膜處理，截取分子量在2萬(wàn)以下的液體部分，經(jīng)低溫濃縮，即可得到目的產(chǎn)物-一促肝細(xì)胞生長(zhǎng)液。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的步驟由以下幾步構(gòu)成1)原料的準(zhǔn)備將檢驗(yàn)合格的原料切碎后經(jīng)膠體磨磨成肝漿；2)溶液浸泡將肝漿與一定比例的純凈水混勻后在一定的溫度下浸泡一定的時(shí)間，使目的產(chǎn)物自溶于溶液中；3)固液分離用適當(dāng)?shù)姆蛛x方式進(jìn)行固液分離，分別得到液體——提取原液和固體廢渣；4)初級(jí)膜(過(guò)氧化氫酶)分離將得到的提取原液通過(guò)適當(dāng)?shù)哪し蛛x設(shè)備進(jìn)行提取，并根據(jù)工藝要求濃縮至適當(dāng)?shù)拿富顔挝?。分別得到初級(jí)膜分離截留液——目的產(chǎn)物之一，過(guò)氧化氫酶和膜透過(guò)液；5)廢渣的酶法水解將步驟3)收集的固體廢渣在合適的工藝條件下，利用合適的酶進(jìn)行酶法水解，過(guò)濾除渣后得到酶解液；6)料液的預(yù)處理將酶解液與初級(jí)膜透過(guò)液合并，用夾套加熱至90。C，并保持10分鐘后冷卻至20。C以下；7)次級(jí)膜分離提取用截留分子量在15CT500Da的納濾膜設(shè)備分離提取，濃縮至原體積的15-20分之一，收集次級(jí)膜截留液；8)目的產(chǎn)物之二的獲得收集的該截留液即為目的產(chǎn)物之二一一促肝細(xì)胞生長(zhǎng)液。具體實(shí)施例方式下面的實(shí)例將具體說(shuō)明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)例11)原料的準(zhǔn)備取檢驗(yàn)合格的10kg豬肝去除包膜切碎，用無(wú)菌蒸餾水反復(fù)洗滌2-3次，用膠體磨磨成豬肝漿；2)溶液浸泡向肝漿中加入40kg無(wú)菌蒸餾水混勻后儲(chǔ)于提取罐中，在28-32。C的溫度下浸泡6-9小時(shí)，使目的產(chǎn)物自溶于溶液中；3)固液分離離心分離，得到大約46L液體，13kg固體廢渣；4)初級(jí)膜(過(guò)氧化氫酶)分離將得到的液體通過(guò)40KDa中空纖維膜超濾膜進(jìn)行分離提取，并根據(jù)工藝要求濃縮，得到18L酶活單位為53，OOOU/mL的過(guò)氧化氫酶液；5)廢渣的酶法水解將步驟3)收集的13kg固體廢渣，加入15L無(wú)菌蒸餾水，在pH2-2.5，35-38°C下，用胃蛋白酶酶解12-16小時(shí)，液化的液體過(guò)濾除渣后得到酶解液13L;7)料液的預(yù)處理將13L酶解液與28L初級(jí)膜透過(guò)液合并，用夾套加熱至90'C，并保持10分鐘后冷卻至20°C以下,得到液體40L;7)次級(jí)膜分離提取用截留分子量在15CT500Da的納濾膜設(shè)備分離提取，濃縮至原體積的15-20分之一，收集次級(jí)膜截留液，得到2L液體；9)目的產(chǎn)物之二的獲得-得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)液2L。實(shí)例2將促肝細(xì)胞生長(zhǎng)液冷凍干燥后取粉5g，分析其微量元素含量、氨基酸譜,結(jié)果分別見(jiàn)表1和表2:表1總蛋白質(zhì)含量及維生素和礦物質(zhì)組成<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>該樣品經(jīng)過(guò)氨基酸譜檢測(cè)證實(shí)，其中富含人體所需的17種氨基酸，總氨基酸達(dá)到62.91g/100g。表2氨基酸組成<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>酸酸(g/100g)5.669.009.3114.802.804.451.772.814.326.872.754.374.176.634.176,372.353.730.430.684.226.711.552.463.044.833.285.215.618.925.048.012.614.1562.91經(jīng)原子吸收法測(cè)定證實(shí)，該樣品內(nèi)含豐富的對(duì)人體有益的微量元素，尤其是鐵、鋅、、鎂、鈣含量非常豐富。實(shí)例3:取促肝細(xì)胞生長(zhǎng)液適量做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)-1)動(dòng)物模型建立SD大鼠，雌雄各半,安靜條件常規(guī)飼養(yǎng)一周后，以純玉米渣加膽固醇為飼料，30%乙醇為飲料飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)第1天按0.5mL/kg皮下注射40%0:14液體石蠟液，以后每隔3天注射1次，第8周末殺鼠2只，做普通病理切片，光鏡顯示早期肝硬化病變；2)治療將8只大鼠隨機(jī)分成2組，其中一組用高濃度促肝細(xì)胞生長(zhǎng)液拌入飼料飼養(yǎng)，另一組按常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)90天后，做普通病理切片，光鏡顯示，治療組較對(duì)照組早期肝硬化病變明顯好轉(zhuǎn)。3)毒性試驗(yàn)a:急性毒性相當(dāng)于人體用量400倍給小鼠灌胃，72小時(shí)無(wú)一例死亡；b:慢性毒性相當(dāng)于人體用量20倍給小鼠灌胃6個(gè)月未見(jiàn)任何毒性反應(yīng)，任何組織器官均未見(jiàn)損傷氨酸酸酸酸酸酸酸酸酸酸酸氨氨酸酸酸基冬氨氨氨氨氨氨氨氨氨氨氨丙亮氨氨氨氨天谷絲組甘蘇精丙酪胱纈蛋苯異亮賴脯總8權(quán)利要求1、一種以動(dòng)物肝臟為原料同時(shí)制備過(guò)氧化氫酶和促肝細(xì)胞生長(zhǎng)液的工藝。該工藝組成步驟如下1)對(duì)動(dòng)物肝臟進(jìn)行切碎、磨漿、浸泡提取、固液分離，得到料液和料渣；2)將料液進(jìn)行初級(jí)膜分離和濃縮，得到膜濃縮液和膜透過(guò)液；3)將膜濃縮液的酶活力單位調(diào)整到規(guī)定要求，即得過(guò)氧化氫酶成品；4)將固體廢渣在合適的工藝條件下，利用合適的酶進(jìn)行酶法水解，過(guò)濾除渣后得到酶解液；5)料液的預(yù)處理將酶解液與初級(jí)膜透過(guò)液合并，用夾套加熱至90℃，并保持10分鐘后冷卻至20℃以下；6)次級(jí)膜分離提取用合適的膜設(shè)備分離提取，濃縮至一定體的積，收集次級(jí)膜截留液；7)收集的該截留液即為目的產(chǎn)物之二----促肝細(xì)胞生長(zhǎng)液。2，如權(quán)利要求1所述，其特征是分離提取促肝細(xì)胞生長(zhǎng)液的原料是提取過(guò)氧化氫酶后的廢水和廢渣。3、如權(quán)利要求1所述，其特征是原料可以是含過(guò)氧化氫酶的各種動(dòng)物肝臟。4、如權(quán)利要求1所述，其特征是浸泡提取的溶液可以是水或各種有機(jī)溶劑。5、如權(quán)利要求1所述，其特征是固液分離可以是離心分離、過(guò)濾分離或他們的組合。6、如權(quán)利要求1所述，其特征是所采用的初級(jí)膜為截留分子量20-60KDa的超濾膜，膜組件的構(gòu)型是管式膜、巻式膜、平板膜、中空纖維膜或它們的組合。7、如權(quán)利要求l所述，其特征是所采用的次級(jí)膜為截留分子量150-500Da的納濾膜，膜組件的構(gòu)型是管式膜、巻式膜、平板膜、中空纖維膜或它們的組合。8、如權(quán)利要求l所述，其特征是可供選用的酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、膠原蛋白酶、彈性蛋白酶，或它們的某種組合。全文摘要本發(fā)明屬生物活性物質(zhì)的分離提取
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種從提取過(guò)氧化氫酶后的廢水、廢渣中提取促肝細(xì)胞生長(zhǎng)液的工藝。本工藝適用于以動(dòng)物肝臟為原料，經(jīng)勻漿、溶液浸泡、固液分離、初級(jí)膜分離，得到過(guò)氧化氫酶；將廢渣經(jīng)酶法水解、過(guò)濾除渣后與初級(jí)膜透過(guò)液合并，經(jīng)次級(jí)膜分離、低溫濃縮，得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)液。該液體經(jīng)提純后可制備藥品——促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液，或經(jīng)低溫干燥后制成具保肝作用的功能食品。按照本發(fā)明操作，以豬肝為例，每加工1kg豬肝能夠獲得50,000U/mL液體過(guò)氧化氫酶2L，同時(shí)獲得刺激指數(shù)為2.3，總氨基酸為62.91g/100g的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)液200mL。文檔編號(hào)C12P21/06GK101560506SQ20091002711公開(kāi)日2009年10月21日申請(qǐng)日期2009年5月22日優(yōu)先權(quán)日2009年5月22日發(fā)明者馮志強(qiáng),吳保承,棟張,楊春霞,湯魯宏申請(qǐng)人:江蘇省江大綠康生物工程技術(shù)研究有限公司