專利名稱：一種利用離子交換樹脂直接提取蚯蚓纖溶酶的工業(yè)化生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用離子交換樹脂直接提取蚯蚓纖溶酶的工業(yè)化生產(chǎn)方法，是 一種利用離子交換樹脂直接提取、作為原料藥或保健食品功效成分的蚯蚓纖溶酶的 工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
二背景技術(shù)：
選用適合的樹脂在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行離子交換或吸附層析，直接從動(dòng)植物或微 生物粗提液中、直接從發(fā)酵液中提取一濃縮目標(biāo)蛋白或目標(biāo)多糖或其他生化物質(zhì)， 是目前最常用的快速簡便、成本低廉的工業(yè)化分離純化技術(shù)。
蚯頓纖溶酶亦稱蚓激酶，作為口服溶血栓藥的主要原料藥在我國與日本已經(jīng)應(yīng) 用多年，同時(shí)還有若干種以蚯蟲引纖溶酶為功效成分的保健食品上市，兩大類產(chǎn)品在 我國年銷售額已超過10億元，目前仍呈快速上升趨勢(shì)。
蚯頓纖溶酶的實(shí)驗(yàn)室提取、提純，通常采用蚯蚓勻漿一抽提一離心一硫酸銨分 級(jí)鹽析或有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀一透析或凝膠過濾、脫鹽一離交層析或親和層析一透析 一冷凍干燥。
藥用蚯KI纖溶酶的工業(yè)化提取，在我國和日本目前是將鮮蚯蚓(或蚯蚓粉)加
水(或0.1mol/LNaCl)保溫、攪拌、自溶，或者蚯蚓勻漿加水(或0.1mol/LNaCl)
抽提一離心或過濾取上清一硫酸銨分級(jí)鹽析或乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀一超 過濾、洗滌、濃縮一冷凍干燥或有機(jī)溶劑沉淀、真空干燥。有的還插入活性炭等吸 附劑吸附、脫色、脫腥工序。
上述工業(yè)化制備蚯頓纖溶酶的生產(chǎn)工藝，缺點(diǎn)是收得率低、產(chǎn)品純度和生物活 性較低、生產(chǎn)成本高、需要耗費(fèi)大量硫酸銨或乙醇、丙酮等化工原料。因此，尋找 一種簡易、高效的工業(yè)化制備蚯蚓纖溶酶生產(chǎn)工藝，取代目前國內(nèi)外采用的生產(chǎn)工 藝，是一項(xiàng)具實(shí)用價(jià)值的迫切任務(wù)。
三、
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明是針對(duì)目前蚯蚓纖溶酶工業(yè)化生產(chǎn)工藝收得率低、產(chǎn)品純度和生物活性 較低、生產(chǎn)成本高、需要耗費(fèi)大量硫酸銨或乙醇、丙酮等化工原料等缺點(diǎn)，公開一
種簡易、高效的工業(yè)化制備蚯蚓纖溶酶的工藝技術(shù)。該提取工藝的核心工序離子交換，即直接從蚯蚓粗提液中提取并濃縮纖溶酶。蚯蚓纖溶酶的收得率、生物活性
得到提高，生產(chǎn)周期縮短、生產(chǎn)成本降低。
技術(shù)方案
利用離子交換樹脂直接提取蚯蚓纖溶酶的工業(yè)化生產(chǎn)方法，包括
(1) 洗凈的鮮蚯蚓或冷凍的鮮蚯蚓加0. 14mol/L NaCl溶液、勻漿，攪拌提取l-2 小時(shí)，離心或過濾取上清液，沉渣加0. 14mol/L NaCl溶液攪拌提取0.5小時(shí)、離 心、合并上清；
(2) 上清液用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH7. 5_9. 5，加無離子水調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度(按電 導(dǎo)率計(jì))至1-5 m
(3) 靜態(tài)離子交換-階梯洗脫加入活化的大孔陰離子交換樹脂攪拌交換2-4小 時(shí)、抽干；常水漂洗、抽干，重復(fù)洗滌一次；加入0.8-1.2 mol/L NaCl溶液攪拌 洗滌、抽干，重復(fù)洗滌一次；加入2. 5-4. 5 mol/L pH 5-6 NaCl溶液攪拌洗脫2-4 小時(shí)、抽干、收集洗脫液，重復(fù)洗脫1次、合并洗脫液；
或者采用動(dòng)態(tài)離交層析-梯度洗脫活化的樹脂裝層析柱，第(2)項(xiàng)下的上清液 上柱，無離子水洗滌，0. 5-4. 5 raol/L pH 5-6 NaCl溶液梯度洗脫，收集、合并纖 溶酶洗脫峰；
(5)洗脫液用冷酒精或冷丙酮沉淀，有機(jī)溶劑脫水，真空干燥；或者洗脫液通 過超過濾洗滌、濃縮，冷凍干燥。
所用大孔陰離子交換樹脂是指大孔強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂或大孔弱堿性陰離 子交換樹脂如D254、 D2卯、ZGA351或ZGA451。 有益效果
目前國內(nèi)外普遍利用赤子愛勝蚓(Eisenia Foetide)作為提取纖溶酶的原料， 赤子愛勝蚓至少含有6種纖溶酶的同工酶，它們的分子量范圍在2. 5—4. 5萬D.， 等電點(diǎn)范圍3.5—4.5， pH穩(wěn)定范圍5—12，完全失活溫度70°C、 60分鐘。對(duì)于這 種穩(wěn)定的酸性蛋白，選擇適合的陰離子交換樹脂直接從蚯蚓粗提液中提取，照理并 不十分困難，但實(shí)際并非如此。正因?yàn)榇?，至今國?nèi)外仍沿用硫酸銨或有機(jī)溶劑分 級(jí)沉淀從蚯蚓粗提液中提取纖溶酶。即便利用離子交換、疏水層析、親和層析等提 純技術(shù)，也只能放在初步分離提純之后才能有效地進(jìn)行。
我們的試驗(yàn)證明，是因?yàn)樯a(chǎn)過程中含量占細(xì)胞核98%以上、等電點(diǎn)pll.0左 右的DNA及其降解產(chǎn)物一分子量大小不一的核苷酸，干擾并阻礙了蚯蚓纖溶酶與離 子交換樹脂的結(jié)合與洗脫。只有消除了數(shù)量與荷電量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的DNA與核苷酸的千擾，才有可能利用適合的離子交換樹脂直接從蚯蚓粗提液中提取、濃縮蚯蚓纖溶酶。
蚯蚓纖溶酶工業(yè)化生產(chǎn)過程中，防止DNA溶解與降解，并通過離心或過濾將DNA 沉淀從蚯蚓粗提液中除去乃是技術(shù)之關(guān)鍵。新鮮或冰凍的蚯蚓，在0. 14mol/L NaCl 中勻漿、提取，占細(xì)胞核98。/。以上的DNA易溶于水，但在O. 14mol/LNaCl溶液中幾 乎不溶，較容易除去。在上述操作過程中扣緊生產(chǎn)環(huán)節(jié)、在夏季O. 14raol/LNaCl溶 液預(yù)冷或在較低溫度環(huán)境下操作、防止DNA被細(xì)胞固有的DNA酶降解，也是一個(gè)重 要方面。
采用本技術(shù)方案可以有效去除蚯蚓粗提物中數(shù)量和荷電量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的DNA并 防止降解，因而有可能直接用大孔陰離子交換樹脂從蚯蚓粗提液中提取、濃縮纖溶 酶。實(shí)踐表明，
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
1. 提高蚯頓纖溶酶產(chǎn)品的生物活性和純度本發(fā)明技術(shù)的產(chǎn)品白色、無異
味、易溶于水，生物活性大于40uku/mg (蚓激酶單位40000u/mg)，高于目前工業(yè) 化產(chǎn)品的一般生物活性》12uku/mg (蚓激酶單位12000u/mg)。
2. 簡化生產(chǎn)過程、降低生產(chǎn)成本、節(jié)省大量化工原料一硫酸銨、乙醇、丙酮 本發(fā)明通過核心工序一離交層析， 一次完成目標(biāo)蛋白的提取一濃縮，大幅度減少后 續(xù)工序的設(shè)備體積和化工原料用量；樹脂可反復(fù)再生使用；而且樹脂再生、洗滌、 洗脫僅僅使用最便宜、最常用的化工原料一NaCl、 Na0H、 HC1，極少量的乙醇僅用 于纖溶酶脫水千燥。據(jù)估算，本發(fā)明的工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)使生產(chǎn)成本降低50%左右。
3. 提高產(chǎn)品收得率本發(fā)明由于縮短工業(yè)化生產(chǎn)工序、提高吸附目標(biāo)蛋白的 特異性，使得纖溶酶的收得率普遍提高10%以上。
具體實(shí)施方式
1.生產(chǎn)工藝
(1) 鮮蚯躬l洗凈、瀝干，或冷凍的鮮蚯頓，加0. 14mol/L NaCl溶液、勻漿、攪 拌提取1-2小時(shí)，離心或過濾取上清液，沉渣用0. 14mol/L NaCl溶液攪拌提取0. 5 小時(shí)、離心、合并上清；
(2) 上清液用1 mol/L Na0H調(diào)節(jié)pH7. 5-9. 5，加適量無離子水調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度(按 電導(dǎo)率計(jì))1 - 5 m
(3) 加入活化的大孔陰離子交換樹脂如D254、 D290、 ZGA351、 ZGA451等、攪拌 交換2-4小時(shí)、抽干；無離子水漂洗、抽干，重復(fù)洗滌一次；(4) 加入0. 8-1. 2 mol/L NaCl溶液攪拌洗滌1-2小時(shí)、抽干，重復(fù)洗滌一次；
(5) 加入2.5-4.5 mol/L pH 5-6 NaCl溶液攪拌洗脫2-4小時(shí)、抽干、收集洗 脫液，重復(fù)洗脫1次、合并洗脫液；
(6) 洗脫液抽濾、冷酒精沉淀，收集沉淀物、有機(jī)溶劑脫水，真空干燥；或者 洗脫液經(jīng)超過濾洗滌、濃縮，冷凍干燥。
(7) 上述第(2)項(xiàng)的上清液，也可通過動(dòng)態(tài)離交層析-梯度洗脫、代替(3)-(5)項(xiàng)靜 態(tài)離子交換-階梯洗脫。即活化的離子交換樹脂裝層析柱，(2)項(xiàng)上清液在調(diào)節(jié)pH 和離子強(qiáng)度后上柱，無離子水洗滌，配制pH 5-6的梯度洗脫液0.5mol/L NaCl、 4.5mol/L NaCl溶液，梯度洗脫、收集、合并纖溶酶活性洗脫峰。以下操作同第 (6順.
2. 實(shí)施例一
鮮赤子愛勝蚓22Kg、配制0. 14mol/LNaCl溶液，蚯蚓勻漿，共加0. 14mol/L NaCl溶液22 L，攪拌、提取2小時(shí)，5000g、 10° C離心45分、取上清。沉淀物加 5 L 0. 14 mol/L NaCl溶液、攪拌提取0. 5小時(shí)，離心，合并2次離心上清。用1 mol/L Na.OH調(diào)節(jié)pH 8. 5,加無離子水調(diào)電導(dǎo)率2. 3 m 1/Q，加入活化的D254樹脂(大孔強(qiáng) 堿性陰離子交換樹脂)4.4 Kg攪拌4小時(shí)，抽干。常水充分漂洗、抽干，重復(fù)漂 洗一次。樹脂加10 L 1 mol/L NaCl溶液，攪拌洗滌2小時(shí)、抽干，重復(fù)洗滌1小 時(shí)。抽干的樹脂加6 L 3.5mol/L NaCl溶液(pH 5.5)、攪拌洗脫4小吋，抽干； 同樣攪拌洗脫2小時(shí)、抽干，合并2次洗脫液、抽濾(濾過液澄明微黃)。洗脫液攪 拌加入冷酒精至終末濃度78 %(V/V)，置4"C過夜，收集沉淀，無水酒精脫水，真 空干燥，粉碎，得白色、無異味的蚯蚓纖溶酶粉末101.4g。
以(牛血)纖維蛋白平板法、尿激酶國際標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，測(cè)得蚯頓纖溶酶活性 為48 uku/mg (48000頓激酶單位)。D254樹脂對(duì)蚯蟲引粗提液中纖溶酶的交換率為 92.6%、洗脫率為91.5%，總收得率為76. 3%。
3. 實(shí)施例二
冰凍的鮮赤子愛勝頓28Kg、勻漿，同上用0. 14mol/LNaCl抽提兩次、共用NaCl 溶液34 L。蚯蟲引粗提液用1 mol/L Na0H溶液調(diào)節(jié)pH9.0，加無離子水調(diào)節(jié)電導(dǎo)率 1.8 m 1/￡2?；罨腪GA451sc樹脂(大孔弱堿性陰離子交換樹脂)6 kg、裝離交柱 一蚯蚓粗提液上樣 一 無離子水洗滌一 0.5mol/L、 4.5mol/LNaCl溶液(pH5.3) 各8 L、梯度洗脫。繼一個(gè)大而平緩的雜蛋白洗脫峰之后，出現(xiàn)相連的纖溶酶活性 峰，收集、合并纖溶酶洗脫峰，抽濾。濾液經(jīng)中空纖維超過濾器(截留分子量10000D.)超過濾、無離子水洗滌、濃縮。濃縮液冷凍干燥，得白色、無異味的纖溶酶粉 末104. 4g。
以(牛血)纖維蛋白平板法、尿激酶國際標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，測(cè)得蚯頓纖溶酶活性 為56uku/mg (蚓激酶單位56000u/mg)。 D254樹脂對(duì)蚯蚓粗提液中纖溶酶的交換率 為92. 2%、洗脫率為86. 7%，總收得率為72. 0%。
用大孔陰離子交換樹脂D290或ZGA351代替D254和ZGA451可以同樣取得 以上的效果。
權(quán)利要求
1. 利用離子交換樹脂直接提取蚯蚓纖溶酶的工業(yè)化生產(chǎn)方法，包括(1)鮮蚯蚓或冷凍蚯蚓，在0.14mol/L NaC1溶液中勻漿并隨即攪拌提取，防止數(shù)量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)、pI1.0左右的DNA溶解或被細(xì)胞固有的DNA酶降解，隨即離心或過濾除去DNA沉淀，得蚯蚓粗提液；(2)無離子水調(diào)節(jié)蚯蚓粗提液的電導(dǎo)率1-5m1/Ω，再用大孔陰離子交換樹脂進(jìn)行靜態(tài)或動(dòng)態(tài)離子交換；(3)用2. 5-4.5mol/L pH5-6的NaCl溶液攪拌洗脫纖溶酶，或者0.5-4.5mol/L pH5-6的NaCl溶液梯度洗脫、收集纖溶酶洗脫峰；(4)洗脫液用冷酒精或其它有機(jī)溶劑沉淀、有機(jī)溶劑脫水、真空干燥，或者洗脫液通過超過濾洗滌、濃縮，冷凍干燥，得蚯蚓纖溶酶；
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用離子交換樹脂直接提取蚯蚓纖溶酶的工業(yè)化生產(chǎn)方 法，其特征在于，所用大孔陰離子交換樹脂是指大孔強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂 或大孔弱堿性陰離子交換樹脂如D254、 D290、 ZGA351或ZGA451 。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用離子交換樹脂直接提取蚯蚓纖溶酶的工業(yè)化生產(chǎn)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。鮮蚯蚓或冷凍蚯蚓加0.14mol/L NaCl、勻漿、攪拌提取、離心上清調(diào)節(jié)pH7.5-9.5、電導(dǎo)率1-5ml/Ω；加活化的大孔陰離子交換樹脂攪拌交換2-4小時(shí)，洗滌，3-4mol/L NaCl洗脫；或者樹脂裝離交柱、動(dòng)態(tài)交換、0.5-4.5mol/L NaCl梯度洗脫；洗脫液冷酒精沉淀或超過濾脫鹽、濃縮，低溫干燥得蚯蚓纖溶酶。本發(fā)明技術(shù)產(chǎn)品白色、無異味、易溶于水，生物活性由≥12uku/mg提高到40uku/mg以上，收得率提高10％以上，節(jié)約大量化工原料、生產(chǎn)成本降低50％左右。適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/68GK101544968SQ200910026780
公開日2009年9月30日 申請(qǐng)日期2009年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月6日
發(fā)明者張治國, 連桂芳 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 被以下專利引用 (1),