化妝品用蚯蚓活性蛋白的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種化妝品用祇蝴活性蛋白的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著藥妝品工業(yè)的持續(xù)發(fā)展，研究和開發(fā)策略將更多地轉(zhuǎn)向醫(yī)藥類型的產(chǎn)品， 利用先進(jìn)醫(yī)學(xué)技術(shù)的藥妝品已經(jīng)得到了快速發(fā)展，而且該一趨勢(shì)還將會(huì)更加強(qiáng)勁。目前， 美容手術(shù)包括微晶磨皮術(shù)和化學(xué)磨皮術(shù)、肉毒素護(hù)理和激光更新皮膚等，該些方法都能消 除不平滑的皮膚表面、老年斑和細(xì)小的皺紋，然而，大部分消費(fèi)者更加青睞于使用化妝水 和枯皺精華等化妝品來(lái)美化肌膚。
[0003] 本研究所使用的祇蝴品種為赤子愛勝蝴，本品種在分類學(xué)上屬于正蝴科愛勝屬。 赤子愛勝蝴繁殖率高、適應(yīng)性強(qiáng)，很適合人工養(yǎng)殖，是目前世界上養(yǎng)殖最為普遍的一個(gè)品 種，其體內(nèi)的藥用成分也十分豐富，所W臨床上的制劑多W赤子愛勝蝴為原料。隨著生物技 術(shù)的發(fā)展，赤子愛勝蝴的藥用價(jià)值越來(lái)越多的被人們研究和關(guān)注。
[0004] 祇蝴的藥用價(jià)值與其體內(nèi)的活性物質(zhì)關(guān)系密切；實(shí)驗(yàn)室前期的研究中發(fā)現(xiàn)祇蝴活 性蛋白提取物在動(dòng)物水平上能夠促進(jìn)燙傷創(chuàng)面的愈合，在細(xì)胞水平上能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞 的增殖和遷移；但是，還未見從祇蝴中提取抗皺成分的資料，現(xiàn)有技術(shù)中祇蝴提取物提取工 藝還不是很完善，提取物中往往包含小分子成分的混合物、純度低；本發(fā)明的研究的主要任 務(wù)是科學(xué)提取出赤子愛勝蝴中促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的活性蛋白，并W其為原料研制出具有 抗皺活性的優(yōu)質(zhì)化妝品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種化妝品用祇蝴活性蛋白的提取方法，通過(guò)該方法提取 的蟲丘蝴活性蛋白不含小分子雜質(zhì)，純度高，使用效果好。
[0006] 本發(fā)明的化妝品用祇蝴活性蛋白的提取方法，包括W下步驟： a、 取清洗干凈的鮮祇蝴，加入20mmol/L、抑為6. 8~7. 2的磯酸鹽緩沖液，冰浴條件下高 速勻漿，得到祇蝴勻漿液，并在4°C下靜置2~化，使蛋白充分溶出； b、 將祇蝴勻漿液分裝于離屯、管中，在4°C下，高速離屯、20~30min，取上清液；在室溫條 件下，加研細(xì)的硫酸錠進(jìn)行鹽析，達(dá)到50%飽和度，使雜蛋白沉淀析出，得鹽析液； C、將鹽析液分裝于離屯、管中，在4°C下，高速離屯、20~30min，取上清液過(guò)0. 45化的膜， 取濾液； d、鹽析所述濾液采用0. 2化的中空纖維膜組件超濾的方式除去大分子物質(zhì)，然后用截 留分子量為20k-50k中空纖維膜組件超濾的方式脫鹽，最后冷凍干燥即得所述化妝品用蟲丘 蝴活性蛋白。
[0007] 本發(fā)明的有益效果是；本方法W新鮮的赤子愛勝蝴為原料，采用勻漿、離屯、、鹽析、 微濾、超濾、冷凍干燥等技術(shù)對(duì)其中的活性蛋白進(jìn)行分離純化、采用NIH3T3成纖維細(xì)胞進(jìn) 行活性跟蹤，獲得了具有較高增殖活性的祇蝴活性蛋白；在此基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)考 察溶劑、料液比、溫度、提取時(shí)間四因素對(duì)活性蛋白提取的影響，通過(guò)不同鹽析濃度的研究 考察鹽析對(duì)祇蝴活性蛋白提取的影響，通過(guò)考察不同截留分子量中空纖維膜脫鹽的效果， 獲得的祇蝴活性蛋白不含小分子雜質(zhì)，純度高，使用效果好；為從祇蝴中提取具有促成纖維 細(xì)胞增殖活性的蛋白提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)；將本發(fā)明方法制備的祇蝴活性蛋白應(yīng)用于化妝品， 具有使皮膚柔滑、補(bǔ)水保濕及延緩衰老的作用，可作為護(hù)膚品，直接用于皮膚。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的方案進(jìn)行清楚、完整的描述，基于本發(fā)明的實(shí)施例， 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā) 明保護(hù)的范圍。
[000引實(shí)施例1; 取清洗干凈的鮮祇蝴500g，加入1000ml20mmol/L、抑7. 2的磯酸鹽緩沖液，用高速勻 漿機(jī)W220(K)巧m，冰浴條件下勻漿5min;將祇蝴勻漿液4°C靜置化，使蛋白充分溶出。
[0010] 將勻漿液分裝于離屯、管中，在4°C下，W15000巧m高速離屯、25min，取上清液。在 室溫條件下，加研細(xì)的硫酸錠進(jìn)行鹽析，達(dá)到50%飽和度，使雜蛋白沉淀析出，此過(guò)程中要 不斷攬拌；硫酸錠須在30min內(nèi)加完，加完后繼續(xù)攬拌30min使硫酸錠充分溶解，4°C靜置 Ih，使雜蛋白充分沉淀。
[0011] 將鹽析液分裝于離屯、管中，在4°C下，W16500巧m離屯、28min，取上清液過(guò)0. 45化 的膜，取濾液。
[0012] 鹽析上清液采用0. 2化的中空纖維膜組件超濾的方式除去大分子物質(zhì)，然后用截 留分子量為20k-50k中空纖維膜組件超濾的方式脫鹽，最后冷凍干燥即得本發(fā)明的化妝品 用蟲丘蝴活性蛋白。
[001引實(shí)施例2; 取清洗干凈的鮮祇蝴500g，加入800ml20mmol/L、p冊(cè).8的磯酸鹽緩沖液，用高速勻漿 機(jī)W180(K)巧m，冰浴條件下勻漿5min。將祇蝴勻漿液4°C靜置2.化，使蛋白充分溶出。
[0014] 將勻漿液分裝于離屯、管中，在4°C下，W15000巧m高速離屯、25min，取上清液。在 室溫條件下，加研細(xì)的硫酸錠進(jìn)行鹽析，達(dá)到50%飽和度，使雜蛋白沉淀析出，此過(guò)程中要 不斷攬拌。硫酸錠須在30min內(nèi)加完，加完后繼續(xù)攬拌30min使硫酸錠充分溶解，4°C靜置 Ih，使雜蛋白充分沉淀。
[0015] 將鹽析液分裝于離屯、管中，在4°C下，W12000巧m離屯、30min，取上清液過(guò)0. 45化 的膜，取濾液。
[0016] 鹽析上清液采用0. 2化的中空纖維膜組件超濾的方式除去大分子物質(zhì)，然后用截 留分子量為20k-50k中空纖維膜組件超濾的方式脫鹽，最后冷凍干燥即得本發(fā)明的化妝品 用蟲丘蝴活性蛋白。
[0017] 實(shí)施例3; 采用祇蝴活性蛋白制備化妝水及其理化性質(zhì)的檢測(cè)： (1)化妝水的配方：甘油Ig;1%透明質(zhì)酸lOg;蘆芭膠Ig;海藻糖2g;水溶性維生素E0. 2g;杰馬0. 4g;蟲丘蝴活性蛋白5g;人參提取液5g;香精0.Olg;純凈水補(bǔ)足到lOOg。
[0018] (2)化妝水的制備方法為：按照W上配方精確稱量甘油，1%透明質(zhì)酸溶液，海藻 糖，水溶性維生素E及杰馬置燒杯中，玻璃椿攬勻后，加入5g人參提取液及5g祇蝴活性蛋 白提取液；繼續(xù)攬拌至均勻后加雙蒸水至lOOg，全部溶解后加入1滴香精對(duì)化妝品的香型 進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0019] (3)檢測(cè)結(jié)果如表1所示；化妝水的抑為6. 8,在非陽(yáng)光直射條件下觀察化妝水 的色澤，呈均勻透明的淺黃色，無(wú)雜質(zhì)；將化妝水擦于皮膚上，在室內(nèi)及非陽(yáng)光直射條件下 觀察，結(jié)構(gòu)細(xì)膩，親和性較好；嗅覺辨別化妝水的香型，味道符合規(guī)定香型。在耐熱實(shí)驗(yàn)中， 40°C保持2化后，恢復(fù)室溫后與試驗(yàn)前無(wú)明顯的性狀差異。在耐寒實(shí)驗(yàn)中，4°C保持2化后， 恢復(fù)室溫后與試驗(yàn)前無(wú)明顯性狀差異。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.化妝品用蚯蚓活性蛋白的提取方法，其特征是包括如下步驟： a、 取清洗干凈的鮮蚯蚓，加入20mmol/L、pH為6. 8~7. 2的磷酸鹽緩沖液，冰浴條件下高 速勻漿，得到蚯蚓勻漿液，并在4°C下靜置2~3h，使蛋白充分溶出； b、 將蚯蚓勻漿液分裝于離心管中，在4°C下，高速離心20~30min，取上清液；在室溫條 件下，加研細(xì)的硫酸按進(jìn)行鹽析，達(dá)到50%飽和度，使雜蛋白沉淀析出，得鹽析液； c、 將鹽析液分裝于離心管中，在4°C下，高速離心20~30min，取上清液過(guò)0. 45Mm的膜， 取濾液； d、 鹽析所述濾液采用0. 2Mm的中空纖維膜組件超濾的方式除去大分子物質(zhì)，然后用截 留分子量為20k-50k中空纖維膜組件超濾的方式脫鹽，最后冷凍干燥即得所述化妝品用蚯 蚓活性蛋白。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種化妝品用蚯蚓活性蛋白的提取方法，包括以下步驟：取清洗干凈的鮮蚯蚓，加入磷酸鹽緩沖液，冰浴條件下高速勻漿，得到蚯蚓勻漿液；并分裝于離心管中，高速離心，取上清液；加研細(xì)的硫酸銨進(jìn)行鹽析，使雜蛋白沉淀析出；將鹽析液分裝于離心管中，取上清液過(guò)0.45μm的膜，取濾液；采用超濾的方式除去大分子物質(zhì)，然后用截留分子量為20k-50k中空纖維膜組件超濾的方式脫鹽，最后冷凍干燥即得蚯蚓活性蛋白；本方法以新鮮的赤子愛勝蚓為原料，采用勻漿、離心、鹽析、微濾、超濾、冷凍干燥等技術(shù)對(duì)其中的活性蛋白進(jìn)行分離純化獲得了具有較高增殖活性的蚯蚓活性蛋白，不含小分子雜質(zhì)，純度高，使用效果好。
【IPC分類】C07K1-36, C07K1-34, A61K8-64, A61Q19-00, C07K1-30, A61Q19-08
【公開號(hào)】CN104725466
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510088980
【發(fā)明人】李振, 張勇, 單輝, 周海洋, 卞憲名, 葉素艷
【申請(qǐng)人】濟(jì)寧華能制藥廠有限公司
【公開日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年2月27日