專利名稱：一種抑制內(nèi)毒素活性的小分子dna適配子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是--種能抑制內(nèi)毒素活性的小分子 DNA適配子及其制備方法。
(二) 背景技術(shù)：
膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、外科大手術(shù)后等常見的并發(fā)癥，進(jìn)一步發(fā) 展可導(dǎo)致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征等，已成為臨床危重患者的 重要死亡原因。至今仍無特殊的治療措施，死亡率居高不下，是創(chuàng)傷外科 及相關(guān)領(lǐng)域研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問題之 一 。研究表明內(nèi)毒素 [Lipopolysaccharide, LPS]是引起G—菌膿毒癥及膿毒性休克的最主要原因之 一，LPS及其引起的內(nèi)毒素血癥是G—菌膿毒癥、膿毒性休克發(fā)生的最主要 誘因或始動因素。因此，抗內(nèi)毒素治療在膿毒癥、膿毒性休克及LPS相關(guān) 疾病的治療中具有重要地位。至今仍無直接針對G—菌的有效抗生素可用于 治療G—菌膿毒癥、膿毒性休克等疾病。以LPS本身為耙，通過拮抗并阻斷 內(nèi)毒素作用的設(shè)想，已得到越來越多研究者的認(rèn)同和關(guān)注，并取得一定進(jìn) 展。主要包括以下幾個方面(1)細(xì)菌內(nèi)毒素合成抑制劑通過阻斷內(nèi)毒 素合成的關(guān)鍵限速酶等阻斷LPS的合成，如2002年的BB78484及BB78485 等顯示了良好的運(yùn)用前景；(2)阻斷LPS與其受體結(jié)合研究主要集中在 LPS的結(jié)合蛋白及Lipid A (脂質(zhì)A， LPS的核心結(jié)構(gòu))的結(jié)構(gòu)類似物等， 前者包括來自人體的和非人體的LPS結(jié)合蛋白,同時也包括經(jīng)過改建的內(nèi)毒 素結(jié)合蛋白及其衍生肽類制劑和基因工程制劑。后者以Eisai (衛(wèi)材)研究 所報道的E5331為代表，顯示良好的臨床運(yùn)用前景，目前已經(jīng)進(jìn)入臨床I 期,有望被FDA (美國食品藥品監(jiān)督管理局)批準(zhǔn)。其次也包括抗內(nèi)毒素抗 體及疫苗抗內(nèi)毒素單抗己廣泛用于實驗室和大規(guī)模臨床實驗研究。還有 報道的不同來源的Lipid A的結(jié)構(gòu)類似物諸如Lipid A的前體一脂質(zhì)X等也 在進(jìn)一步研究開發(fā)之中。(3)中和內(nèi)毒素作用主要以殺菌性/通透性增加 蛋白(BPI)為代表，其中Rbpi21/23目前已被FDA批準(zhǔn)進(jìn)行擴(kuò)大的III期臨床實驗，用于兒童腦膜炎及創(chuàng)傷后出血性休克的治療。以LPS為靶點(diǎn)的 策略，把握了膿毒癥病理發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，相應(yīng)的制劑已取得一定效果， 有的已經(jīng)進(jìn)入臨床前期實驗，顯示良好的應(yīng)用前景，但至今尚未運(yùn)用于臨 床。同時，上述制劑在一定程度上也存在著不足抗體的特異性決定了抗 體僅能特異地與某種細(xì)菌的內(nèi)毒素結(jié)合，對其他細(xì)菌內(nèi)毒素?zé)o作用；抗體 的異源性也限制其臨床運(yùn)用；結(jié)合蛋白的免疫原性與其半衰期短易降解和 需長期反復(fù)用藥之間又存在著矛盾；雖然有些制劑有較好的應(yīng)用前景，但 大多均經(jīng)過計算機(jī)設(shè)計或化學(xué)合成，也不免存在著作用的特異性不高、拮
系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù) (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX技術(shù))是20世紀(jì)90年代初研制的一種新 的組合化學(xué)技術(shù)，其基本原理是運(yùn)用一個大容量的隨機(jī)寡核苷酸庫，并結(jié) 合PCR技術(shù)以指數(shù)級富集每一輪篩選到的與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸配 基(aptamer)，經(jīng)過幾輪或十幾輪篩選過程，獲得高親和力、高特異性的 核酸配基。自發(fā)現(xiàn)以來，SELEX技術(shù)得到迅速的發(fā)展，在藥物的快速開發(fā)、 臨床診療及生命進(jìn)化等基礎(chǔ)研究中均有廣闊的運(yùn)用前景。具有庫容量大、 靶分子范圍廣、親和力高等優(yōu)點(diǎn)，而且核酸藥物與蛋白質(zhì)、多肽藥物相比， 具有無免疫原性、組織滲透性強(qiáng)、體內(nèi)不易降解和容易保存運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)。 目前利用該技術(shù)已篩選到角細(xì)胞生長因子、血小板源性生長因子、血管內(nèi) 皮生長因子、堿性成纖維生長閑子及其受體、凝血因子、HIV轉(zhuǎn)錄酶的抑制 性DNA或RNA核酸配基，申請的專利達(dá)30多項，其中一種代號為NX1838 的VEGF適配子已開始應(yīng)用于臨床試驗以阻止病理性的血管生成，目前已被 FDA批準(zhǔn)用于眼科治療。而且Internet還專門建立了 SELEX數(shù)據(jù)庫，匯集 全球各實驗室的篩選結(jié)果，資源共享，便于分析比較。
在2008年8月30日公開了有關(guān)建立應(yīng)用SELEX篩選LPS寡核苷酸適 配子的方法(見楊清武，文愛清，呂鳳林等，SELEX篩選LPS寡核苷酸適 配子方法的建立。重慶醫(yī)學(xué)，2008; 37 (16): 1773-1775)。在這篇文章中， 我們比較了二種不同的篩選方法的效果，目的只是為后續(xù)大規(guī)模的篩選建 立基本的方法，因此SELEX篩選的輪次和篩選條件存在著如下的不足，一 是只進(jìn)行4輪篩選，二是篩選條件中的20mmol/LTris2鹽酸(HC1)的PH值為7.4并不適合后續(xù)的篩選體系。經(jīng)大量實驗證明，在這樣的篩選輪次
和條件下，只可能獲得能與LPS結(jié)合的適配子，并不能保證適配子的高親
和力和高特異性，所得到的適配子對抑制內(nèi)毒素的生物活性效果并不明顯。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種抑制內(nèi)毒素活性的小分子DNA適配子, 它可以顯著地抑制內(nèi)毒素的生物活性，為預(yù)防和治療膿毒癥提供了新 型的拮抗劑，為新型抗內(nèi)毒素藥物的研制奠定良好基礎(chǔ)。
本發(fā)明的另一 目的就是提供一種制備抑制內(nèi)毒素活性的小分子 DNA適配子的方法，它可以方便準(zhǔn)確地獲取抑制內(nèi)毒素活性的小分子DNA 適配子，便于大規(guī)模的制備，而且效果顯著。
本發(fā)明的第---個目的是通過這樣的技術(shù)方案實現(xiàn)的，它的DNA分 子的核苷酸序歹lj為5，-GCGTCCACTCCCAGCCGCTCACTAGTTTCTGC GTGGGTGG -3，。
本發(fā)明的第二個目的是按下列歩驟順序進(jìn)行的
a、 構(gòu)建單鏈DNA文庫5，-TAGGGAATTCGTC GACGGATCC-N40-CT GCAGGTCGACGCATGCGCCG-3',兩端為固定序歹U，中間N40為隨機(jī)序列，
庫容約為1015;聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增引物
上游引物5，-TAGGGAATTCGTCGACG-3 ，； 下游引物5 ， -CGGCGCATGCGTCGACCTG-3 ，；
上述的上游引物和下游引物均是現(xiàn)有的成熟技術(shù)。
b、 文庫的擴(kuò)增、保存
(1)、采用常規(guī)PCR反應(yīng)法得到雙鏈DNA文庫將步驟a中的單鏈DNA文 庫O.lug、上游引物100pmo1、下游引物100prao1、 IOXPCR緩沖液IOu 1、 氯化鎂(MgCl》6ul、 dNTPs 100iimol/L、 Taq酶2U混合在一起，加去離子 水使總體積為100ul;然后放入PCR儀中，94"C反應(yīng)預(yù)變性5分鐘，94。C反 應(yīng)變性40秒，58。C退火1.5分鐘，72i:延伸3分鐘，最后72。C延伸10分鐘， 得到雙鏈DNA文庫，并進(jìn)行保存；文庫為模板擴(kuò)增出單鏈DNA 文庫,即得到雙鏈DNA文庫PCR擴(kuò)增產(chǎn)物將上步驟中得到的雙鏈DNA文庫 O.lug、 10XPCR緩沖液10" 1、氯化鎂(MgCl》6yl、 dNTPs lOOumol/U Taq酶2U、上游引物100pmo1、下游引物100pmol混合在一起，其中上游引
物與下游引物的濃度比為1: 100，加去離子水使總體積為100U 1;然后
放入PCR儀中，94。C預(yù)變性5分鐘，94。C變性40秒,58"C退火1.5分鐘，72°C 延伸5分鐘，最后72"C延伸10分鐘，得到雙鏈DNA文庫PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即擴(kuò) 增出單鏈DNA文庫以備篩選；
c、 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收將步驟b中的PC財廣增產(chǎn)物用含0.5y g/ml溴化乙 錠的1.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后將其放在260nm熒光透視板上，將呈橘 紅色條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切下，用DNA純化回收試劑盒回收純化；
d、 篩選按照下述方法共做12輪重復(fù)性SELEX篩選，第l輪篩選中的被 篩選物是步驟c中得到單鏈DNA，第2-12輪篩選中的被篩先物是上一輪篩選 所得到的單鏈DNA隨機(jī)庫；第5-9輪篩選中，反應(yīng)體積200pl ，單鏈DNA隨機(jī) 庫與LPS的用量各為250pmo1和2.5嗎；第10-12輪篩選中，反應(yīng)體積200(il, 單鏈DNA隨機(jī)庫與LPS的用量各為lOOpmol禾卩0.5 u g;緩沖液為濃度 20mmol/L、pH為7. 35的Tris2鹽酸(HC1)與137mmo1/L的氯化鈉(NaCl)、 5mmol/L的氯化鉀(KCl)、 2mmo1/L氯化l丐(CaCl2 ) 、 lmmol/L氯化鎂
(MgCl2)的混合液，每輪篩選方法如下
取被篩選物400pmo1，置于85"C水浴20分鐘，再冰浴5分鐘，然后與4嗎 LPS在400(il緩沖液中混勻，37°C孵育lh;加入雙蒸水浸潤過的直徑2.5cm、 孔徑O. 45pm的硝酸纖維膜后，放到真空抽濾器上,經(jīng)真空濾過后，用緩沖液A 洗滌濾膜3次,剪碎濾膜，用7mo1尿素或酚或氯仿從濾膜中回收單鏈DNA;再 把單鏈DNA按照步驟b(l)常規(guī)PCR反應(yīng),重復(fù)循環(huán)做20次,而后按照步驟b(2) 進(jìn)行非對稱PCR反應(yīng),獲得富集單鏈DNA隨機(jī)庫；該文庫作為下一輪篩選的 文庫。
經(jīng)過上述12輪篩選獲得富集單鏈DNA隨機(jī)庫，即適配子庫(電泳結(jié)果 見圖.l)
7e、與LPS親和力的適配子克隆及測序?qū)⒉襟Ed獲得的適配子庫按照步
驟b的方法擴(kuò)增成雙鏈DNA,經(jīng)DNA限制性內(nèi)切酶消化后，連于質(zhì)粒 pMD18-T (Yanisch-Pereon， C.，etal。， 1985)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a
(Hanahan， D. ， 1983; Tartof， K. D. , et al. , 1987),氨芐抗性篩選，挑取 單個生長菌落進(jìn)行測序，即得到上述技術(shù)方案所述的核苷酸序列。
在本發(fā)明的方法中，首先對SELEX篩選輪次做了很大的改變，其進(jìn)行 12輪篩選，特別是對第5-9輪、第10-12輪篩選的反應(yīng)體積、單鏈DNA隨 機(jī)庫與LPS的用量作了關(guān)鍵性調(diào)整，這不僅減少了單鏈DNA隨機(jī)庫與LPS 的用量，還能獲得高富集的單鏈DNA隨機(jī)庫；同時，還將影響篩選的關(guān)鍵 性條件作了調(diào)整，即把Tris2鹽酸(HC1)的PH值調(diào)整為7.35，這是通過 大量的實驗獲得的數(shù)據(jù)(因為實驗顯示隨著篩選輪數(shù)的增加及篩選體系 的改變，采用起始的Tris2鹽酸PH值7.4的條件進(jìn)行篩選，其ssDNA庫得 不到富集，而經(jīng)過反復(fù)摸索，將ra值7.4變?yōu)?.35時，ssDNA庫得到了顯 著富集)。篩選經(jīng)上述的改進(jìn)后，使所獲得的制備抑制內(nèi)毒素活性的小分子 DNA適配子具有庫容量大、靶分子范圍廣、親和力高等優(yōu)點(diǎn)，具有與LPS 的高親和力和高特異性，并對LPS有顯著的抑制作用。與蛋白質(zhì)、多肽藥 物相比，用它制成的核酸藥物，具有無免疫原性、組織滲透性強(qiáng)、體內(nèi)不 易降解和容易保存運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)。為預(yù)防和治療膿毒癥提供了新型的拮抗 劑，為新型抗內(nèi)毒素藥物的研制奠定良好基礎(chǔ)。該發(fā)明在一定程度上 克服了目前現(xiàn)有LPS抑制劑的不足。本發(fā)明克服了目前現(xiàn)有LPS抑制 劑的不足。
由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)
1、 通過新的組合化學(xué)技術(shù)一SELEX技術(shù)篩選LPS的的抑制性適配子， 具有高特異、高親和力的特點(diǎn)，可直接與大量的LPS結(jié)合，從而封閉了 LPS 活性部位LipidA與其受體(如CD14、 TLR4)等的結(jié)合位點(diǎn)，因此本發(fā)明 可明顯抑制內(nèi)毒素的生物活性，直接作為內(nèi)毒素的拮抗劑的使用，用于膿 毒癥及膿毒癥休克的防治。l天l此克服了目前內(nèi)毒素抑制劑的特異性不高、 拮抗效果不強(qiáng)和抗體的宿主異源性及蛋白的免疫源性的缺陷。
2、 由于SELEX技術(shù)具有高特異、高親和力的特點(diǎn)，獲得的DNA適配子 封閉了LPS活性部位LipidA與其受體(如CD14、 TLR4)等的結(jié)合位點(diǎn)，因此與現(xiàn)有內(nèi)毒素抑制劑相比，本發(fā)明具有廣譜性，可抑制多種細(xì)菌來源的
內(nèi)毒素的活性，如對來源于E c/^r/c/2/a co// 055:B5細(xì)菌、E.co// Lipid A (F583,Rd mutant)細(xì)菌及Salmonella minnesota R595(Rd mutant)細(xì)菌的LPS
均有明顯的抑制作用。
3、由于通過SELEX技術(shù)所得的小分子核酸適配子，本發(fā)明具有無免疫 原性、組織滲透性強(qiáng)、體內(nèi)不易降解和容易保存運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，便于大規(guī)模 的制備與運(yùn)輸，同時無明顯副作用。因此，克服了目前大多蛋白、多肽類 藥物具有免疫源性、易降解和不易保存及運(yùn)輸?shù)娜毕荨?br> (四)

本發(fā)明的

如下
圖l是經(jīng)過本發(fā)明步驟d的12輪篩選后的電泳圖譜；
圖2是抑制LPS刺激的人單核細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-k B (NF-k B)的活 化示意圖3降低內(nèi)毒素剌激的單核細(xì)胞培養(yǎng)上清炎癥因子白介素-l (IL-1)的含量示意圖4降低內(nèi)毒素刺激的單核細(xì)胞培養(yǎng)上清炎癥因子中腫瘤壞死因 子-a (TNF-a )的含量示意圖5延長膿毒癥大鼠生存時間和提高生存率示意圖。
(五) 具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明
本發(fā)明所述的抑制內(nèi)毒素活性的小分子DNA適配子,它的DNA分子的 核苷酸序歹'J為5，-GCGTCCACTCCCAGCCGCTCACTAGTTTCTGCGTGG GTGG -3，。
制備上述的抑制內(nèi)毒素活性的小分子DNA適配子的方法是按下列步 驟順序進(jìn)行的
a、構(gòu)建單鏈DNA文庫5，-TAGGGAATTCGTC GACGGATCC-N40-CT GCAGGTCGACGCATGCGCCG-3，,兩端為固定序歹iJ，中間N40為隨機(jī)序列， 庫容約為1015;聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增引物
上游引物5 ， -TAGGGAATTCGTCGACG-3,;
下游引物5 ，-CGGCGCATGCGTCGACCTG-3 ，；
上述的上游引物和下游引物均是現(xiàn)有的成熟技術(shù)。b、 文庫的擴(kuò)增、保存-
(1) 、采用常規(guī)PCR反應(yīng)法得到雙鏈DNA文庫將步驟a中的單鏈DNA文 庫0.1tig、上游引物100pmo1、下游引物100pmo1、 IOXPCR緩沖液IO" 1、 氯化鎂(MgCl》6ul、 dNTPs 100umol/L、 T叫酶2U混合在一起，加去離子 水使總體積為100" 1;然后放入PCR儀中，94。C反應(yīng)預(yù)變性5分鐘，94t:反 應(yīng)變性40秒，58。C退火1.5分鐘，72。C延伸3分鐘，最后72'C延伸10分鐘， 得到雙鏈DNA文庫，并進(jìn)行保存；
(2) 、采用非對稱PCR反應(yīng)法，以雙鏈DNA文庫為模板擴(kuò)增出單鏈DNA 文庫,即得到雙鏈DNA文庫PCR擴(kuò)增產(chǎn)物將上步驟中得到的雙鏈DNA文庫 O.lug、 10XPCR緩沖液10iU、氯化鎂(MgCl》6"1、 dNTPs 100limol/L、 Taq酶2U、上游引物100pmo1、下游引物100pmol混合在一起，其中上游引
物與下游引物的濃度比為1: 100，加去離子水使總體積為100U1;然后
放入PCR儀中，94。C預(yù)變性5分鐘，94。C變性40秒，58。C退火l. 5分鐘，72°C 延伸5分鐘，最后72。C延伸10分鐘，得到雙鏈DNA文庫PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即擴(kuò) 增出單鏈DNA文庫以備篩選；
c、 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收將步驟b中的PC財廣增產(chǎn)物用含O. 5ug/ml溴化乙 錠的1.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后將其放在260nm熒光透視板上，將呈橘 紅色條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切下，用DNA純化回收試劑盒回收純化；
d、 篩選按照下述方法共做12輪重復(fù)性SELEX篩選，第l輪篩選中的被 篩選物是步驟c中得到單鏈DNA，第2-12輪篩選中的被篩先物是上一輪篩選 所得到的單鏈DNA隨機(jī)庫；第5-9輪篩選中，反應(yīng)體積200pl ，單鏈DNA隨機(jī) 庫與LPS的用量各為250pmo1禾口2.5(ig;第10-12輪篩選中，反應(yīng)體積200pl, 單鏈DNA隨機(jī)庫與LPS的用量各為lOOpmol禾B0.5 u g;緩沖液為濃度 20mmol/L、 pH為7. 35的Tris2鹽酸(HC1)與137mmo1/L的氯化鈉(NaCl)、 5mmol/L的氯化鉀(KCl)、 2mmol/L氯化辛丐(CaCl2 ) 、 lmmol/L氯化鎂
(MgCl2)的混合液，每輪篩選方法如下
取被篩選物400pmo1，置于85。C水浴20分鐘，再冰浴5分鐘，然后與4嗎 LPS在400(il緩沖液中混勻，同時加5倍ssDNA摩^ifi勺tRNA與牛血清白 蛋白(BSA) ,37°C孵育lh;加入雙蒸水浸潤過的直徑2.5cm、孔徑O. 45jim的硝酸纖維膜后，放到真空抽濾器上，經(jīng)真空濾過后,用緩沖液A洗滌濾膜3次,剪
碎濾膜,用7mo1尿素或酚或氯仿從濾膜中回收單鏈DNA;再把單鏈DNA按
照步驟b(l)常規(guī)PCR反應(yīng),重復(fù)循環(huán)做20次,而后按照步驟b(2)進(jìn)行非對稱
PCR反應(yīng),獲得富集單鏈DNA隨機(jī)庫；
經(jīng)過上述12輪篩選獲得富集單鏈DNA隨機(jī)庫，即適配子庫；
e、與LPS親和力的適配子克隆及測序?qū)⒉襟Ed獲得的適配子庫按照步
驟b的方法擴(kuò)增成雙鏈DNA，經(jīng)DNA限制性內(nèi)切酶消化后，連于質(zhì)粒
pMD18-T (Yanisch-Pereon， C.，etal。， 1985)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a (Hanahan， D。， 1983; Tartof， K. D. ， et al. ， 1987),氨節(jié)抗性篩選，挑取
單個生長菌落進(jìn)行測序，即得到本發(fā)明所述的核苷酸序列。
現(xiàn)結(jié)合實驗例及附圖對本發(fā)明的效果作進(jìn) 一 步的說明 實驗例1:經(jīng)過本發(fā)明步驟d的12輪篩選后的電泳圖譜 如圖1所示，l為空別對照，只有原始文庫；2-10為原始庫與LPS篩選12
輪后的示意圖；由圖l可以知道，通過12輪篩選，能結(jié)合LPS的核酸適配子
得到明顯富集，電泳呈明顯單一條帶。
實驗例2:應(yīng)用ELISA法檢測單核細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(NF- k B)的活性
1、 目的驗證所得DNA適配子對內(nèi)毒素活性的抑制作用，即對LPS剌 激的人單核細(xì)胞NF- k B活化的抑制效果。
2、 方法
(1) 、應(yīng)用常規(guī)方法分離人外周血單核細(xì)胞，于后應(yīng)用含5%的小牛血 清的RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司)中培養(yǎng)24小時，調(diào)整細(xì)胞計數(shù)為2 Xl()6個/L,應(yīng)用Giemsa法檢測細(xì)胞純度在90%以上，酞盤藍(lán)染色鑒定細(xì)胞 生存率為95%。
(2) 、實驗分兩組 一組細(xì)胞分別用E^/^n'c/n'a co// 055:B5細(xì)菌、E.co// Lipid A (F583，Rd mutant)細(xì)菌及Salmonella minnesota R595(Rd mutant)細(xì)菌
來源的LPS 100ng/ml刺激；另一組用上述LPS100ng/ml+10nmol或LPS100ng/ ml+20nmol的DNA適配子刺激，培養(yǎng)6h后；
(3) 、應(yīng)用NF-kb酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒(美國Active Motif公司)檢測單核細(xì)胞NF-kB的活性按試劑盒說明書進(jìn)行，結(jié)果如圖2所示。具體如下用預(yù)冷的PBS洗滌液輕洗不同方法處理的單核細(xì)胞3次，
按常規(guī)方法提取細(xì)胞核蛋白，經(jīng)蛋白定量后，按2.5y g每孔加入預(yù)先處理 的96孔酶聯(lián)板(已包被NF-KB特異結(jié)合序列的DNA，由試劑盒中提供)，37 。C孵育lh后，用200lU/孔的洗滌液洗滌3次后，加入100"1/孔的1: 1000 的抗NF-kB p65抗體，37。C孵育lh后，用200 y 1/孔的洗滌液洗滌3次，再 加入100ul/孔的辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的二抗，37。C孵育lh后加入100 ul/孔的顯色液，室溫放置10min后，于酶聯(lián)檢測儀(Beckman公司)450nm 波長檢測吸光度A值。
3、結(jié)果
如圖2所示，對照組未用LPS刺激組；a組:LPS 100ng/L刺激組；b組: LPS 100ng/L+DNA適配子10nmol: c組:LPS 100ng/L+DNA適配子20nmo1。 由圖2可以清楚知道，在離體實驗中，采用內(nèi)毒素血癥的離體模型，該適配 子能明顯抑制&c/zen'c/7/aco〃055:B5細(xì)菌(055)、 E.co//LipidA (F583,Rd mutant)細(xì)菌及Salmonella minnesota R595(Rd mutant)細(xì)菌來源的LPS刺激的 人單核細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(NF- k B)的活化。
實驗例3:應(yīng)用ELISA法檢測單核細(xì)胞培養(yǎng)上清炎癥因子IL-1及TNF-a的含量
1、 目的體外進(jìn)一步驗證所得DNA適配子對內(nèi)毒素活性的抑制作用， 即對對LPS刺激的人單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子(在由內(nèi)毒素引起的膿毒癥中 起關(guān)鍵作用)的抑制效果。
2、 方法
(1) 、應(yīng)用常規(guī)方法分離人外周血單核細(xì)胞，于后應(yīng)用寒5%的小牛血 清的RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司)中培養(yǎng)24小時，調(diào)整細(xì)胞計數(shù)為2 X 10"個/L,應(yīng)用Giemsa法檢測細(xì)胞純度在90%以上，酞盤藍(lán)染色鑒定細(xì)胞 生存率為95%。
(2) 、實驗分兩組 一組細(xì)胞分別用Esc/2m'c/i/a co// 055:B5細(xì)菌、E.co// Lipid A (F583,Rd mutant)細(xì)菌及Salmonella minnesota R595(Rd mutant)細(xì)菌來源的LPS 100ng/ml刺激；另一組用上述LPS100ng/ml+10nmo1或 LPS100ng/ml+20醒o1的DNA適配子刺激，培養(yǎng)6h后。
(3)、吸取培養(yǎng)上清液，用IL-1及TNF-aELISA檢測試劑盒(北京晶 美公司)檢測上清IL-1及TNF-a的含量，如圖3、 4所示。具體按試劑盒 說明書進(jìn)行。 3、結(jié)果
如圖3、 4所示，對照組未用LPS刺激組；a組LPS 100ng/L刺激組； b組LPS lOOng/L+DNA適配子10nmol; c組LPS lOOng/L+DNA適配子20nmol; 圖3是針對IL-1，圖4是針對TNF-a;由圖3、 4可以清楚地知道，本發(fā)明的 適配子能明顯抑制不同細(xì)菌來源LPS對單核細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞炎癥因子 IL-1及TNF-a的分泌。
實驗例4: DNA適配子延長膿毒癥小鼠生存時間和提高生存率
1、 目的利用動物實驗觀察獲得的DNA適配子對由LPS引起的膿毒癥 的治療效果。
2、 方法
應(yīng)用LPS注射C57BL/6小鼠復(fù)制膿毒癥小鼠模型，實驗分二組，-一組 膿毒癥組20只小鼠，尾注射^c/2m'c/7/a c。// 055:B5細(xì)菌LPS l呢，二組 DNA適配子治療組20只小鼠在注射LPS lmg同時注射lOnmol的DNA 適配子。分別注射后12h、 24h、 72h小鼠的存活只數(shù)，計算小鼠的存活率 (%，存活只數(shù)/小鼠總數(shù))。
3、 結(jié)果
如圖5所示，動物實驗中，利用內(nèi)毒素復(fù)制膿毒癥大鼠模型，可發(fā)現(xiàn) 應(yīng)用本發(fā)明的適配子處理后，能明顯降低大鼠的死亡率，明顯提高055LPS 所致膿毒癥小鼠的生存率，以24h及72小時明顯。這進(jìn)一步表明，該適配 子可顯著抑制內(nèi)毒素的生物活性，可直接作為內(nèi)毒素的拮抗劑，用于膿毒 癥的防治。抑制內(nèi)毒素活性的小分子DNA適配子的核苷酸序列的計算機(jī)可讀形式 〈110〉中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
〈120〉 一種抑制內(nèi)毒素活性的小分子DNA適配子及其制備方法 <130〉 無 〈160〉 5
<170〉 Patentln version 3.4 <210〉 1 〈211〉 40 〈212〉 DNA
〈213〉 Phytophthora nicotianae 〈400〉 1
gcgtccactcccagccgctcactagtttctgcgtgggtgg 40
權(quán)利要求
1. 一種抑制內(nèi)毒素活性的小分子DNA適配子，其特征在于它的DNA分子的核苷酸序列為5’-GCGTCCACTCCCAGCCGCTCACTAGTTTCTGCGTGGGTGG-3’。
2. 制備權(quán)利要求1所述的抑制內(nèi)毒素活性的小分子DNA適配子的方法， 其特征在于，該方法是按下列步驟順序進(jìn)行的a、 構(gòu)建單鏈DNA文庫5，-TAGGGAATTCGTC GACGGATCC-N40-CT GCAGGTCGACGCATGCGCCG-3，，兩端為固定序歹iJ，中間N40為隨機(jī)序列， 庫容約為10|5;聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增引物上游引物5'陽TAGGGAATTCGTCGACG-3,; 下游弓I物5 ， -CGGCGCATGCGTCGACCTG陽3 ，；b、 文庫的擴(kuò)增、保存(1) 、采用常規(guī)PCR反應(yīng)法得到雙鏈DNA文庫將步驟a中的單鏈DNA文 庫O.lwg、上游引物100pmo1、下游引物100pmo1、 IOXPCR緩沖液IO卩1、 氯化鎂(MgCL) 6ul、 dNTPs 10Oymol/L、 Taq酶2U混合在一起，加去離子 水使總體積為100ul;然后放入PCR儀中，94。C反應(yīng)預(yù)變性5分鐘，94X:反 應(yīng)變性40秒，58。C退火1.5分鐘，72。C延伸3分鐘，最后72i:延伸10分鐘， 得到雙鏈認(rèn)A文庫，并進(jìn)行保存；(2) 、采用非對稱PCR反應(yīng)法，以雙鏈DNA文庫為模板擴(kuò)增出單鏈DNA 文庫,即得到雙鏈DNA文庫PCR擴(kuò)增產(chǎn)物將上步驟中得到的雙鏈DNA文庫 0.1 ug、 IOXPCR緩沖液,1、氯化鎂(MgCl》6ul、藩Ps 100txmol/L、 Taq酶2U、上游引物100pmo1 、下游引物100pmol混合在一起，其中上游引 物與下游引物的濃度比為1: 100，加去離子水使總體積為100til;然后放入PCR儀中，94。C預(yù)變性5分鐘，94。C變性40秒，58。C退火l. 5分鐘，72°C 延伸5分鐘，最后72'C延伸10分鐘，得到雙鏈DNA文庫PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即擴(kuò) 增出單鏈DNA文庫以備篩選；c、 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收將步驟b中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用含0.5u g/ml溴化乙 錠的1.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后將其放在260nm熒光透視板上，將呈橘 紅色條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切下，用DNA純化回收試劑盒回收純化；d、 篩選按照下述方法共做12輪重復(fù)性SELEX篩選，第l輪篩選中的被 篩選物是步驟c中得到單鏈DNA，第2-12輪篩選中的被篩先物是上一輪篩選 所得到的單鏈DNA隨機(jī)庫；第5-9輪篩選中，反應(yīng)體積200pl ，單鏈DNA隨機(jī) 庫與LPS的用量各為250pmo1禾卩2.5昭；第10-12輪篩選中，反應(yīng)體積200W , 單鏈DNA隨機(jī)庫與LPS的用量各為lOOpmol禾Q0.5jig;緩沖液為濃度 20mmol/L、pH為7. 35的Tris2鹽酸(HC1)與137mmo1/L的氯化鈉(NaCl)、 5mmol/L的氯化鉀(KCl)、 2mmo1/L氯化l丐(CaCl2 ) 、 lmmol/L氯化鎂(MgCl2)的混合液,每輪篩選方法如下取被篩選物400pmo1，置于85T水浴20分鐘，再冰浴5分鐘，然后與4嗎 LPS在400pl緩沖液中混勻，37。C孵育lh;加入雙蒸水浸潤過的直徑2.5cm、 孔徑O. 45pm的硝酸纖維膜后，放到真空抽濾器上,經(jīng)真空濾過后，用緩沖液A 洗滌濾膜3次，剪碎濾膜,用7mo1尿素或酚或氯仿從濾膜中回收單鏈DNA;再 把單鏈DNA按照步驟b(l)常規(guī)PCR反應(yīng)，重復(fù)循環(huán)做20次,而后按照步驟b(2) 進(jìn)行非對稱PCR反應(yīng),獲得富集單鏈DNA隨機(jī)庫；該文庫作為下一輪篩選的 文庫。經(jīng)過上述12輪篩選獲得富集單鏈DNA隨機(jī)庫，即適配子庫；e、 與LPS親和力的適配子克隆及測序?qū)⒉襟Ed獲得的適配子庫按照步 驟b的方法擴(kuò)增成雙鏈DNA，經(jīng)DNA限制性內(nèi)切酶消化后，連于質(zhì)粒 pMD18-T (Yanisch-Pereon， C.，etal。， 1985)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a(Hanahan， D。， 1983; Tartof， K. D. ， et al. ， 1987),氨節(jié)抗性篩選，挑取 單個生長菌落進(jìn)行測序，即得到所述的核苷酸序列。
全文摘要
一種抑制內(nèi)毒素活性的小分子DNA適配子及其制備方法，所述的適配子的核苷酸序列為5’-GCGTCCACTCCCAGCCGCTCACTAGTTTCTGCGTGGGTGG-3’。該適配子是分別通過構(gòu)建單鏈DNA文庫、文庫的擴(kuò)增、保存、擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、12輪SELEX篩選、與LPS親和力的適配子克隆及測序等步驟而得到。本發(fā)明的方法可以方便準(zhǔn)確地獲取抑制內(nèi)毒素活性的小分子DNA適配子，便于大規(guī)模的制備，所述的適配子具有廣譜性、無免疫原性、組織滲透性強(qiáng)、體內(nèi)不易降解和容易保存運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，它可以顯著地抑制內(nèi)毒素的生物活性，為預(yù)防和治療膿毒癥提供了新型的拮抗劑，為新型抗內(nèi)毒素藥物的研制奠定良好基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/11GK101445798SQ20081023322
公開日2009年6月3日 申請日期2008年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月5日
發(fā)明者呂鳳林, 文愛清, 楊清武, 陳彩宇 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)