專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)抑制利于軟骨形成的分子來(lái)治療肌腱病變的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域涉及通過(guò)降低受損腱中的軟骨和/或纖維軟骨產(chǎn)生 來(lái)治療肌腱病變。本發(fā)明進(jìn)一步涉及抑制與在受損腱中軟骨和/或纖維軟骨 產(chǎn)生相關(guān)的分子。
背景技術(shù)：
肌腱病變?yōu)橛脕?lái)描述多種類(lèi)型的腱病癥的通常術(shù)語(yǔ)。術(shù)語(yǔ)"腱炎"(表 示"腱的炎癥")通常用來(lái)描述腱的問(wèn)題，但炎癥很少是腱疼痛的原因。最 通常地，腱疼痛實(shí)際上是腱中或周?chē)慕Y(jié)締組織中 一 系列微撕裂的癥狀， 更加適當(dāng)?shù)胤Q(chēng)為肌腱變性(tendinosis)。其它的腱病癥包括起因于伴隨纖維 定向障礙的膠原變性的鍵疼痛、腱中的類(lèi)黏蛋白基質(zhì)增加、鈣化、腱過(guò)度 使用、血管化、老化、以M對(duì)身體突起的摩擦。越來(lái)越多數(shù)量的腱專(zhuān)家 使用肌腱病變來(lái)描述這些病癥，通常共同表征為腱炎、肌腱變性 (tendinosis)、腱圍炎(paratendinitis)、腱鞘炎(tenosynovitis)、 paratenonitis、腱過(guò)度使用損傷、以及創(chuàng)傷。Khan等人,S/7or傷Af^/ 27:393-408 (1999).
正常的腱組織包含緊密填充的結(jié)締組織，其具有規(guī)則排列的膠原纖維 束，所述的膠原纖維以相同方向運(yùn)行在初級(jí)、二級(jí)和三級(jí)、具有高抗張強(qiáng) 度的纖維束中。扁平、錐形的腱細(xì)胞(tenocyte)分散在這些纖維中，這些腱細(xì)胞合成富含I型膠原的勦性細(xì)胞外基質(zhì)(ECM) 。 I型膠原束為腱提 供彈性和結(jié)構(gòu)支持。在健康的腱中，在ECM合成和降解之間存在動(dòng)態(tài)平 衡。然而，肌腱病變負(fù)面地影響這種平衡，并導(dǎo)致膠原纖維結(jié)構(gòu)重排和解 體。膠原束的解體導(dǎo)致腱出現(xiàn)軟骨。在肌腱病變組織中清楚地觀(guān)察到ECM 中成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、新血管形成以及糖胺聚糖(GAG)的病理學(xué) 聚集。Tallon等人，M^/5WS/^rtoExe/T 33(12):1983-90 (2001); Khan等人， S/7^feAT^/27(6):393-408 (1999)。受損腱中代謝和形態(tài)上的變化導(dǎo)致疼痛 和對(duì)撕裂與破裂的易感。
目前，認(rèn)為受損腱ECM的降解和重塑由從定居結(jié)締組織細(xì)胞和侵入 性炎癥細(xì)胞釋放的金屬蛋白酶引起，其中所述的金屬蛋白酶能夠降解基質(zhì) 大分子例如聚集蛋白聚糖、飾膠蛋白聚糖和^鏈蛋白聚糖。這些金屬蛋 白酶包括MMP(MatrixMetalIoproteinases，基質(zhì)金屬蛋白酶)、ADAM(A Disintegrin And Metalloproteinase，解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶)和ADAMT(A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs, 具有血 小板反應(yīng)蛋白基序的解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶，例如聚集蛋白聚糖酶)。Riley G.， Ex/7eW/^v Mo/Af^/ 7(5):l-23 (2005); Rees等人，B/oc/ie附/ 350:180-188(2000)。然而，MMP的廣譜抑制劑在治療與肌腱病變具有病 理相似性的骨關(guān)節(jié)炎的臨床試驗(yàn)上是不成功的。Clark等人，五xpeW 0/7& 77iw7Wgeto 7(1): 19-34 (2003)。因此，抑制金屬蛋白酶不大可能有效地治 療肌腱病變。事實(shí)上，在高度受力的腱例如岡上肌腱和跟腱中需要最小水 平的金屬蛋白酶活性來(lái)提供具有適當(dāng)水平的ECM的腱。Riley G.， Ex/^" 細(xì)脅/臉"7(5): 1-23 (2005)。
目前，存在多種標(biāo)準(zhǔn)的非手術(shù)性和手術(shù)性肌腱病變治療。非手術(shù)性方 法包括休息、冷療法、活性修正、物理療法、非類(lèi)固醇類(lèi)抗炎藥物(NSAID )、 和皮質(zhì)類(lèi)固醇。休息和活性修正可以幫助患一些這種病癥的患者，但還存 在大量不能用這些療法治療的臨M體。盡管廣泛使用，但經(jīng)口的抗炎藥 物療法尚未在控制的研究中證實(shí)有用，并且具有不希望的副作用。 一些研究進(jìn)一步表明，事實(shí)上，非類(lèi)固醇類(lèi)藥物療法對(duì)康復(fù)過(guò)程具有副作用，這 是因?yàn)槠渫ㄟ^(guò)減輕疼痛而使患者忽視肌腱病變的早期癥狀。
皮質(zhì)類(lèi)固醇通常用于降低組織中的炎癥，但不建議使用此類(lèi)藥物治療 肌腱病變，特別是因?yàn)槠べ|(zhì)類(lèi)固醇抑制膠原的合成。 一些研究在用可的松 治療的患者中觀(guān)察到短期的改善，但跟蹤患者超過(guò)1年的研究顯示高的癥 狀復(fù)發(fā)率和不確定的有效率?？傻乃勺⑸湟簿哂须炱屏?、感染、皮膚脫色 和皮下萎縮的風(fēng)險(xiǎn)。在糖尿病患者中，注射可能導(dǎo)致高血糖。
腱修復(fù)的外科方法包括清創(chuàng)術(shù)和受損腱的修復(fù)。然而，開(kāi)放或關(guān)節(jié)鏡 外科手術(shù)具有許多潛在的并發(fā)癥，例如深度感染、損傷神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)、以 及形成傷疤。外科手術(shù)也很昂貴，并且具有伴隨局部或全身麻醉的額外風(fēng) 險(xiǎn)。
因此，仍然存在對(duì)治療腱相關(guān)損傷、優(yōu)于現(xiàn)有療法的方法的需求。柔 韌腱組織的損傷或其它損害痊愈慢，并且需要數(shù)月或者甚至數(shù)年才能完全 恢復(fù)。腱相關(guān)損傷對(duì)社會(huì)具有顯著影響。在美國(guó)，過(guò)度^f吏用損傷占全部損
失相關(guān)的機(jī)構(gòu)出診的將近7%。 Woodwell等人，Adv Data 346:1-44 (2004)。 基于美國(guó)勞工部4亍業(yè)就業(yè)統(tǒng)計(jì)部門(mén)(U.S. Department of Labor, Bureau of Labor Statistics)數(shù)據(jù)的信息，此類(lèi)損傷導(dǎo)致工作時(shí)間顯著損失(見(jiàn) http:〃www.bls.gov/lif)。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供新的治療肌腱病變的方法。通過(guò)對(duì)過(guò)度使用的大鼠腱進(jìn)行 轉(zhuǎn)錄概況分析，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，軟骨特異的基因例如聚集蛋白聚糖、多功 能蛋白聚糖、Col2al (1I型膠原)和Sox9的表達(dá)水平在受損的腱中增加。這 些結(jié)果表明受損的腱組織由于過(guò)度使用而轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維軟骨。與主要包含I 型膠原的腱不同，纖維軟骨含有II型膠原和大的蛋白聚糖，例如聚集蛋白 聚糖和多功能蛋白聚糖。腱中軟骨和纖維軟骨的形成對(duì)于腱修復(fù)是有害的， 因?yàn)檐浌墙M織破壞了緊密填充的腱I型膠原纖維。這種破壞降低了腱的抗 張強(qiáng)度和彈性。因此，本發(fā)明提供通過(guò)降低患者腱組織中軟骨特異性蛋白聚糖的形成 來(lái)在患者中治療肌腱病變的方法。本發(fā)明也提供減少軟骨特異性蛋白聚糖 形成的化合物在制備治療肌腱病變的藥物中的用途。
在一些實(shí)施方案中，這些方法和用途包括降低涉及在患者腱組織中合 成聚集蛋白聚糖和/或多功能蛋白聚糖的酶的活性。在特定實(shí)施方案中，這
些方法和用途包括在患者腱組織中降低硫酸軟骨素N-乙酰氨基半乳糖基 轉(zhuǎn)移酶1(CS-GalNAcT-l)和/或半乳糖胺多肽N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶 l(GalNT-l)的活性。在其它實(shí)施方案中，這些方法和用途包括降低一種或 多種涉及軟骨蛋白聚糖合成的其它酶的活性，其中所述的酶包括但不限于 UDP-D-木糖:核心蛋白質(zhì)p-D-木糖基轉(zhuǎn)移酶、Gal轉(zhuǎn)移酶、GlcA轉(zhuǎn)移酶、 GlcNAc轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、硫酸軟骨素合酶和硫酸乙酰肝素磺基轉(zhuǎn)移 酶。
涉及產(chǎn)生軟骨結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的酶和其它蛋白質(zhì)的活性可以通過(guò)直接或間 接地抑制酶或其它蛋白質(zhì)的功能來(lái)降低，或者通過(guò)抑制酶或其它蛋白質(zhì)自 身的表達(dá)來(lái)降低。
本發(fā)明也提供通過(guò)降低患者腱組織中軟骨特異性結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái) 治療患者的肌腱病變的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供降低軟骨特異性結(jié)構(gòu)蛋白 質(zhì)表達(dá)的化合物在制備治療肌腱病變的藥物中的用途。在一些實(shí)施方案中， 軟骨特異性結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)例如但不限于聚集蛋白聚糖、多配體蛋白聚糖 3(syn-3)、多功能蛋白聚糖以及II型膠原的表達(dá)受到直接抑制。在其它實(shí)施 方案中，降低了涉及軟骨特異性基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的活性。這些轉(zhuǎn)錄因 子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)包括例如Sox9。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明包括鑒定治療肌腱病變的化合物的方法， 其中包括向需要治療的受試者施用測(cè)試化合物、并檢測(cè)該物質(zhì)抑制涉A^ 組織中糖胺聚糖(glycoglycosaminoglycan)—(GAG)合成的酶的活性的能力。
在一些實(shí)施方案中，鑒定治療肌腱病變的化合物或者評(píng)估治療的方法 包括(l)提供至少一種選自CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、石克酸乙酰肝 素(葡糖胺)3-0-磺基轉(zhuǎn)移酶1(Hs3stl)、 GalNT-l和Sox9的樣品成分；(2)將樣品與測(cè)試化合物組合；(3)測(cè)量樣品成分應(yīng)答測(cè)試化合物的活性；以及 (4)確定測(cè)試化合物是否抑制樣品成分的活性。
本發(fā)明額外的目的和優(yōu)點(diǎn)將部分在下文的描述中給出，并且部分在描 述中顯而易見(jiàn)，或者可以通過(guò)實(shí)施本發(fā)明而學(xué)習(xí)到。本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn) 通過(guò)下文的詳細(xì)描述和所附權(quán)利要求書(shū)中特別指出的成分及組合來(lái)實(shí)現(xiàn)和 獲得。
應(yīng)當(dāng)理解，上述一般描述和下文的詳細(xì)描述僅為范例和解釋性的，并 不限制所述本發(fā)明。
摻入和構(gòu)成本說(shuō)明書(shū)一部分的附圖顯示了本發(fā)明的一些實(shí)施方案，并
和描述一^L解釋本發(fā)明原理的作用。
附圖簡(jiǎn)述
在圖l-7中，SST代表岡上肌腱；PT代表膝腱未損傷的內(nèi)參；R代表 進(jìn)行了過(guò)度使用步驟(Soslowsky等人，J. Shoulder Elbow Surg. 9:79-84 (2000))的動(dòng)物；C代表未進(jìn)行過(guò)度使用步驟的對(duì)照動(dòng)物；時(shí)間過(guò)程是l、 2 和4周；并且BM代表骨髓。


圖1顯示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在過(guò)度使用的腱(圖 1A)中Col2al (1I型膠原)4周的基因表達(dá)譜。如圖(圖1B)所示，也測(cè)定了正 常肌骨胳組織中Col2al基因的表達(dá)水平。表達(dá)譜表明，與正常腱組織相比， Col2al在軟骨組織和過(guò)度使用的腱組織中都高度表達(dá)。
圖2顯示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在過(guò)度使用的腱(圖 2A)中Agcl(聚集蛋白聚糖)4周的基因表達(dá)譜。如圖(圖2B)所示，也測(cè)定 了正常肌骨胳組織中Agcl基因的表達(dá)水平。表達(dá)譜表明，與正常腱組織 相比，Agcl在軟骨組織和過(guò)度使用的腱組織中都高度表達(dá)。
圖3顯示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在過(guò)度使用的腱(圖 3A)中Sox9(sry-型高泳動(dòng)族框9)4周的基因表達(dá)鐠。如圖(圖3B)所示，也 測(cè)定了正常肌骨胳組織中Sox9基因的表達(dá)水平。表達(dá)鐠表明，與正常腱組 織相比，Sox9在軟骨組織和過(guò)度使用的腱組織中都高度表達(dá)。圖4顯示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在過(guò)度使用的腱(圖 4A)中CspgZ(多功能蛋白聚糖^周的基因表達(dá)語(yǔ)。如圖(圖4B)所示，也測(cè) 定了正常肌骨胳組織中多功能蛋白聚糖基因的表達(dá)水平。表達(dá)鐠表明，與 正常腱組織相比，多功能蛋白聚糖在軟骨組織和過(guò)度使用的腱組織中都高 度表達(dá)。
圖5顯示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在過(guò)度使用的腱(圖 5A)中硫酸軟骨素N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(CS-GalNAcT-l)4周的基因 表達(dá)譜。如圖(圖5B)所示，也測(cè)定了正常肌骨胳組織中CS-GalNAcT-l基 因的表達(dá)水平。表達(dá)譜表明，與正常腱組織相比，CS-GalNAcT-l在軟骨 組織和過(guò)度使用的腱組織中都高度表達(dá)。
圖6顯示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在過(guò)度使用的腱(圖 6A)中GalNT-l (GalNTl-UDP-N-乙?；?a-D-半乳糖胺:多肽-N-乙酰^^ 半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1)4周的基因表達(dá)譜。如圖(圖6B)所示，也測(cè)定了正常肌 骨胳組織中GalNT-l基因的表達(dá)水平。表達(dá)語(yǔ)表明，與正常腱組織相比， GalNT-l在過(guò)度4吏用的腱組織中高度表達(dá)。
圖7顯示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在過(guò)度使用的腱(圖 7A)中Hs3stl (A乾酸乙酰肝素(葡糖胺)3-0-磺基轉(zhuǎn)移酶l)4周的基因表達(dá) 譜。如圖(圖7B)所示，也測(cè)定了正常肌骨胳組織中Hs3stl基因的表達(dá)水平。 表達(dá)譜表明，與正常的腱相比，Hs3stl在過(guò)度使用的腱中高度表達(dá)，并且 與正常的腱組織相比在軟骨組織中高度表達(dá)。
序列簡(jiǎn)述
CS-GalNAcT-l的核苷酸和氨基酸序列可以以下列登錄號(hào)從Genbank 獲得人(NM—018371);小鼠(NMJ72753)和大鼠(XM—224757)。
CS-GalNAcT-2的核苷酸和#^酸序列可以以下列登錄號(hào)從Genbank 獲得人(NM—018590);小鼠(NM—030165)和大鼠(XM—232316)。
GalNT-l的核苷酸和tt酸序列可以以下列登錄號(hào)從Genbank獲得 人(NM—020474);小鼠(NM—013814)和大鼠(NM—124373)。聚集蛋白聚糖的核苷酸和M酸序列可以以下列登錄號(hào)從Genbank 獲得人(NM—001135);小鼠(NM—007427)和大鼠(NM—0221卯)。
Col2al的核苷酸和M酸序列可以以下列登錄號(hào)從Genbank獲得 人(NM—001844);小鼠(NMJ)31163)和大鼠(NM—012929)。
Sox9的核苷酸和M酸序列可以以下列登錄號(hào)從Genbank獲得人 (NM—000346);小鼠(NMJ)11448)和大鼠(XM 343981)。
多功能蛋白聚糖的核苷酸和M^列可以以下列登錄號(hào)從Genbank 獲得人(NM—004385);小鼠(XM—488510)和大鼠(XM—215451)。
硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-0-磺基轉(zhuǎn)移酶1的核苷酸和M酸序列可 以以下列登錄號(hào)從Genbank獲得人(NM—005114)、小鼠(NM—010474)和 大鼠(NM—053391)。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供通過(guò)降低一種或多種涉M組織中軟骨和/或纖維軟骨形 成的分子的活性來(lái)治療肌腱病變的方法。
為了更加容易理解本發(fā)明，首先定義一些術(shù)語(yǔ)。額外的定義在本發(fā)明 的詳細(xì)說(shuō)明中給出。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"肌腱病變"包括所有發(fā)生在腱中和周?chē)牟±恚?中包括但不限于腱炎、肌腱炎、肌腱變性、腱圍炎、腱鞘炎(tenosynovitis )、 腱過(guò)度4吏用損傷和創(chuàng)傷、腱周?chē)?perintendinitis)以及paratenonitis。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"腱缺陷"指的是任何腱病癥，其中包括但不限于肌 腱病變。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"受損的腱"指的是患有肌腱病變或腱缺陷的腱組織。 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"過(guò)度使用的"腱指的是患有因?yàn)檫^(guò)度使用、而非直
接創(chuàng)傷引起的腱缺陷或肌腱病變的腱。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"患者，，或"受試者"指的是任何對(duì)腱缺損敏感、患有
腱缺損或者處于腱缺損恢復(fù)過(guò)程中、并且需要治療的人或動(dòng)物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"腱炎"指的AM^腱炎(另一種說(shuō)法)、肌腱病變、或 腱的炎癥。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"肌腱變性"指的AI/L腱病變或在腱中發(fā)生微撕裂導(dǎo) 致腱弱化、通常導(dǎo)致疼痛、僵硬和失去強(qiáng)度的任意變性病癥。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"腱損傷"指的是肌腱病變或者任意腱組織變得缺陷
或退^匕的病癥o
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"小分子"包括除多肽和核酸以外的、能起影響生物 過(guò)程作用的任意化學(xué)或其它組分。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"治療(動(dòng)詞)"或"治療(名詞)"指的是任意對(duì)哺 乳動(dòng)物包括人疾病的給藥或應(yīng)用方案，并且包括抑制疾病。其包括阻止疾 病發(fā)展和減輕疾病，例如通過(guò)復(fù)原或恢復(fù)或修復(fù)丟失、失去或缺陷的功能、 或者刺激無(wú)效的過(guò)程。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"活性"指的是可以通過(guò)多種方式進(jìn)行抑制、減低或 干擾的酶或蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"酶的活性"指的是與酶相關(guān)的一種或多種生理活性、 催化活性、調(diào)節(jié)活性或酶促活性。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"有效量"表示足夠顯示有意義的患者益處、即治愈 肌腱病變或者增加治愈和改善癥狀的速率的每種本發(fā)明抑制劑的總量。
I.腱和軟骨的組成
腱包含有序的I型膠原層，其間分敉著小量的III型膠原、成纖維細(xì) 胞樣腱細(xì)胞和軟骨細(xì)胞樣纖維軟骨細(xì)胞。I型膠原被填充進(jìn)入致密的膠原 纖維中，這在腱^t所貼附的肌肉拉伸和牽拉時(shí)為其提供強(qiáng)度和僵硬。相對(duì) 地，軟骨包含n型膠原和蛋白聚糖，并且設(shè)計(jì)來(lái)抵抗壓縮、而非張力。纖 維軟骨為腱和軟骨組織的混合物，并且主要存在于腱和骨頭之間的界面處。 在腱內(nèi)形成軟骨和纖維軟骨對(duì)腱的功能是有害的，這是因?yàn)槠淦茐木o密填 充的i型膠原纖維、并且降低腱的抗張強(qiáng)度。因此，本發(fā)明的方法可以用 來(lái)在受損或損傷的腱組織中阻止或降低軟骨和/或纖維軟骨的形成。腱中軟骨形成的一個(gè)指征是在組織中出現(xiàn)增加水平的蛋白聚糖，這通
常通過(guò)這些蛋白聚糖的糖胺聚糖(GAG)側(cè)鏈的存在來(lái)檢測(cè)。蛋白聚糖為表 征為具有一個(gè)或多個(gè)線(xiàn)性GAG鏈的核心蛋白質(zhì)的糖蛋白家族，其中所述 的GAG鏈由重復(fù)的二糖單位組成。硫酸軟骨素蛋白聚糖例如聚集蛋白聚 糖和多功能蛋白聚糖為軟骨特異的。聚集蛋白聚糖是軟骨主要的結(jié)構(gòu)成分， 并且負(fù)責(zé)軟骨的壓縮強(qiáng)度和彈性。聚集蛋白聚糖分子的7jC合和聚集產(chǎn)生多 種在軟骨組織中承擔(dān)壓縮性負(fù)荷的凝膠。Watanabe等人，/ 肌oc/^附 12《4):687-93 (1998)。軟骨組織中存在的其它蛋白聚糖包括硫酸乙酰肝素 蛋白聚糖，例如多配體蛋白聚糖3 (syn-3)。 Kirn-Safran等人，所r幼Z)e/ecto 72(C部分):69-88 (2004)。
II.促進(jìn)軟骨和纖維軟骨形成的分子
本發(fā)明部分基于下列發(fā)現(xiàn)，即軟骨特異性基因(例如聚集蛋白聚糖、 多功能蛋白聚糖和II型膠原)在受損的腱中表達(dá)增加。由在Soslowsky等 人，/S/^"Ww ￡76ow9:79-84 (2000)所述的大鼠腱過(guò)度使用模型中獲 得的基因表達(dá)譜的這一結(jié)果表明受損的腱由于過(guò)度使用而轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維軟 骨。
本發(fā)明也部分基于下列發(fā)現(xiàn)，即涉及軟骨特異性蛋白聚糖糖胺聚糖 (GAG)側(cè)鏈合成的酶在過(guò)度使用的腱中表達(dá)增加。這個(gè)發(fā)現(xiàn)即軟骨特異性 酶在受損腱中上調(diào)為在嚴(yán)重受損腱中觀(guān)察到的GAG聚集提供了機(jī)制。 Khan等人，S/^Ws Af^/ 27:393-408 (1999)和Tallon等人，AT^/S/ wte
33(12):1983-90 (2001)。這些增加的GAG水平表明，蛋白聚糖例如 聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖和syn-3的水平在受損的腱中增加。因此， 可以通過(guò)降低負(fù)責(zé)產(chǎn)生這些蛋白聚糖的酶的活性來(lái)防止軟骨特異性蛋白聚 糖聚集，進(jìn)而治療肌腱病變。A.在肌腱病變中促進(jìn)軟骨形成的分子受到上調(diào)
使用Affymetrix 061^(:出？@系統(tǒng)來(lái)鑒定正常腱和遭受過(guò)度使用步驟的 腱之間基因表達(dá)的差異?；虮磉_(dá)語(yǔ)產(chǎn)生多于400個(gè)過(guò)度使用后在岡上肌 腱中差異調(diào)節(jié)的基因。通過(guò)4周過(guò)度使用，107個(gè)基因受到上調(diào)，并且27 個(gè)基因受到下調(diào)。 一些最高上調(diào)的基因?yàn)檐浌翘禺愋缘幕?，其中包括膠 原2型a-l鏈(Col2al)、 Sox9、多功能蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖。其它上 調(diào)的基因包括涉及軟骨蛋白聚糖上GAG側(cè)鏈形成的基因，其中包括 CS-GalNAcT-l、 GalNT-l和Hs3stl?；谶@些結(jié)果，這些分子自身或者 其它負(fù)責(zé)這些分子活性的起始或維持、或者負(fù)責(zé)編碼這些分子的基因表達(dá) 的分子可能涉及過(guò)度使用的腱中軟骨和/或纖維軟骨的形成。這些分子可以 包括如下文所列的酶、轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子
酵
一種抑制腱組織中軟骨或纖維軟骨產(chǎn)生的方法為抑制涉及蛋白聚糖合 成的酶的表達(dá)或活性。涉及蛋白聚糖GAG鏈合成的酶的完整目錄見(jiàn)Silbert 等人，/f/BM5 h/e 54:177-186 (2002)和Sugahara等人,/VBMB丄《/e 54:163-175 (2002)。這些酶包括在過(guò)度使用的腱中表達(dá)增加的蛋白質(zhì)(實(shí)施 例l)。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及抑制下列任意一種酶的表達(dá)或 活性
CS-GalNAcT畫(huà)l和CS-GalNAcT-2(EC 2.4.1.174和EC 2.4.1.175)涉及硫 酸軟骨素GAG側(cè)鏈的起始和延伸。CS-GalNAcT-l涉及軟骨素GAG的 起始和延伸，而CS-GalNAcT-2涉及這些相同軟骨素GAG的延伸。關(guān)于 這些酶詳細(xì)的描述，請(qǐng)參見(jiàn)Uyama等人，/.所o/. C7ie附.277(11):8841-8846 (2002)、 Gotoh等人，丄&W. C7^附.277(41):38189陽(yáng)38196(2002)、 Sato等人 / C7^附.278(5):3063-3071 (2003)、 Uyama等人，/ C7^附. 278(5):3072-3078 (2003)。UDP-D-木糖:核心蛋白質(zhì)p-D-;Mt基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.2.269)，其涉及將 最初的木糖部分添加到蛋白聚糖核心蛋白質(zhì)上，這是GAG側(cè)鏈合成最初 的步驟之一；
Gal轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.133和EC 2.4.1.134)，其涉及將半乳糖殘基添加 到新的GAG側(cè)鏈的木糖部分上；
GlcA轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.135、 EC 2..4.1.226和EC 2.4.1.225)，其涉及將 GlcA部分添加到新的GAG側(cè)鏈的半乳糖殘基上；
GlcNAc轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.223和EC 2.4.1.224)，其涉及將GlcNAc部分 添加到通過(guò)CS-GalNAcT酶添加的石危酸軟骨素GAG的GalNAc部分上；
磺基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.8.2.5和EC 2.8.2.1),其涉及將硫酸根殘基轉(zhuǎn)移到硫 酸軟骨素GAG上；
硫酸軟骨素合成酶(EC 3.1.6.4和EC 3.1.6.12),其涉及將硫酸根殘基初 次添加到硫酸軟骨素GAG上；
GalNT-l(E.C.2.4.1.41)催化在糖蛋白上形成0-連接的寡糖側(cè)鏈中的第 一步。White等人，C7iem 270(41):24156-65 (1995);并且
Hs3stl(EC 2.8.2.23)催化硫酸根殘基添加到硫酸乙酰肝素GAG上。 Shworak等人，C7^w 272(44): 28008-19 (1997)
直接或間接抑制任意一種這些酶的活性將減少蛋白聚糖的形成。下文 討論了抑制這些酶的方法。
2,基因表達(dá)
防止軟骨和/或纖維軟骨形成的備選方法是直接或間接地防止受損腱 組織中軟骨特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)。例如，可以通過(guò)許多方法降低多功能蛋 白聚糖或聚集蛋白聚糖，軟骨特異性蛋白聚糖的表達(dá)，其中所述的方法包 括防止編碼聚集蛋白聚糖或多功能蛋白聚糖的基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯、或者防 止涉及聚集蛋白聚糖或多功能蛋白聚糖基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或功能 (這將具有防止這些基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)果)。實(shí)施本發(fā)明時(shí)重要的是確保對(duì)軟骨特異性因子的抑制作用局限在受損 的腱中，因?yàn)樵S多軟骨特異性因子包括蛋白聚糖和II型膠原是功能性關(guān)節(jié) 軟骨和其它組織重要的成分。
構(gòu)蛋白質(zhì)表達(dá)的非酶蛋白質(zhì)的活性或表達(dá)。通過(guò)抑制這些基因的表達(dá)或活
及軟骨結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)包括但不限于Sox9。
其它抑制腱組織中軟骨或纖維軟骨形成的方法涉及直接地抑制主要軟 骨結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)例如聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖和II型膠原的表達(dá)(而 非活性)。發(fā)現(xiàn)下列基因在受損的腱組織中受到上調(diào)，并且這些基因與軟 骨形成相關(guān)。
a) Sox9
Sox9 (sry-型高泳動(dòng)族框9)為涉及軟骨發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子。Sox9在軟骨 細(xì)胞中表達(dá)，這和膠原al(II)基因(Col2al)的表達(dá)一致。Sox9通過(guò)激活或 增強(qiáng)表達(dá)軟骨結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)例如II型膠原的基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)節(jié)軟骨發(fā)生。 Shum等人，爿W/iW船/ 仏4(2):94-106 (2002); Bi等人，G^w". 22(1):85-9 (1999)。
Col2al
Col2al編碼軟骨的主要成分，II型膠原的al鏈。Cheah等人，iVocA^/
(/S爿82(9):2555-9 (1985)。 Agcl
Agcl編碼聚集蛋白聚糖蛋白聚糖的核心蛋白質(zhì)。Doege等人， E;Cffce〃"/"尸A/V^r/x Gew&s f5Vwi^fe/， I. /". i oy"， Cl Z),，編著.)Academic Press (New York) 137-152 (19卯)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"聚集蛋白聚糖"指的 是軟骨組織特異的大蛋白聚糖。聚集蛋白聚糖包含包被了許多硫酸軟骨素 GAG部分的蛋白質(zhì)核心。聚集蛋白聚糖是軟骨的主要結(jié)構(gòu)成分，并且能夠 結(jié)合水和形成粘性的凝膠樣物質(zhì)。這種7JC合作用為軟骨組織提供了彈性和 壓縮強(qiáng)度。Cspg2
Cspg2編碼多功能蛋白聚糖蛋白多糖的核心蛋白質(zhì)。多功能蛋白聚糖 是另 一個(gè)具有許多硫酸軟骨素側(cè)鏈的大蛋白聚糖。像聚集蛋白聚糖一樣， 多功能蛋白聚糖結(jié)合水，并且形成增加組織強(qiáng)度和彈性的黏性凝膠。 Knudson等人，^附CW/Dev12:69-78 (2001)。
B.通過(guò)抑制促進(jìn)軟骨形成的分子來(lái)治療肌腱病變 本發(fā)明提供通過(guò)降低上文所列分子的表達(dá)和/或活性來(lái)治療或預(yù)防肌
腱病變的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供施用上文所列分子的抑制劑來(lái)治療或預(yù)
防肌腱病變的方法。 治療策略
本發(fā)明部分基于下列發(fā)現(xiàn)，即編碼聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖 Sox9、 II型膠原、CS-GalNAcT-l、 GalNT-l和HS3stl的基因的表達(dá)水平 在過(guò)度使用的腱組織中與對(duì)照組織相比顯著增加(圖1-7)。這個(gè)結(jié)果表明， 涉及蛋白聚糖合成途徑的酶或其它分子的表達(dá)增加導(dǎo)致受損的腱組織轉(zhuǎn)變 為軟骨和/或纖維軟骨。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括治療肌腱病 變的方法，其中包括通過(guò)抑制涉及軟骨和/或纖維軟骨合成的酶或其它分子 的活性、表達(dá)或聚集來(lái)降低腱組織中軟骨和/或纖維軟骨的形成。
阻斷涉A^:中軟骨或纖維軟骨形成的酶或其它分子活性的抑制劑在本
發(fā)明中是有用的。用于本發(fā)明方法的抑制劑被任選糖基化的、加入聚乙二 醇的或者連接于另一個(gè)非蛋白質(zhì)的聚合物。抑制劑可以被修飾為具有改變 的糖基化模式(即與最初的或天然的糖基化模式相比是改變的)。如本文所 用，"改變的，，表示與最初的抑制劑相比添加或刪除了一個(gè)或多個(gè)糖類(lèi)部分、 和/或添加或刪除了 一個(gè)或多個(gè)糖基化^i點(diǎn)。向抑制劑添加糖基化位點(diǎn)可以
一種增加糖部分?jǐn)?shù)量的方式是通過(guò)將糖苷化學(xué)或除波偶聯(lián)于抑制劑的M 酸殘基。這些方法在WO87/05330和Aplin等人，CW, Wev 5/od^附 22:259-306 (1981)中進(jìn)行了描述。存在于底物上的任意糖部分的移除可以化學(xué)或S^地完成，如Sojar等人，祝oc/ie附5/0/7/i戸259:52-57 (1987)、 Edge等人，^mz/肌oc/^附118:131-137 (1981)和Thotakura等人， 五"^附o/ 138:350-359 (1987)中所述。
包括例如肽、小分子和核酸的蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)抑制劑也可以用于本 發(fā)明的方法。
a)肽和小分子
用于本發(fā)明方法的抑制劑包括小的有機(jī)肽和分子、以及小的無(wú)機(jī)分子。 這些肽和小分子包括合成和純化的天然存在的抑制劑。本領(lǐng)域熟知鑒定特 異靶向于目的蛋白質(zhì)的肽和小分子的方法。例如，可以使用耙蛋白質(zhì)i^！ 和/或生物學(xué)功能的測(cè)定來(lái)篩選肽和/或'J 、分子文庫(kù)對(duì)乾蛋白質(zhì)例如 CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT國(guó)2、 GalNT-l和/或Sox9的抑制。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，可以在靼蛋白質(zhì)例如CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l和/或Sox9的竟?fàn)幮苑派湫耘潴w結(jié)合測(cè)定中用其底物或配體篩選 小分子和/或肽文庫(kù)。
備選地，可以用基于焚光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET )的測(cè)定例如時(shí)間分 辨的FRET(TR-FRET)測(cè)定來(lái)鑒定抑制劑。在示例性實(shí)施方案中，將蛋白 聚糖的核心蛋白質(zhì)用His或GST標(biāo)簽標(biāo)記，并使用偶聯(lián)了銪(熒光團(tuán)) 的抗His或GST抗體來(lái)標(biāo)記蛋白質(zhì)。備選地，將核心蛋白質(zhì)在賴(lài)氨酸或半 胱氨酸殘基上用銪進(jìn)行非特異性標(biāo)記。供體糖分子用Cy5 (熒光染料)標(biāo) 記?？梢杂糜谶@項(xiàng)測(cè)定的供體和受體分子的列表可以在Uyama等人，/肌o/ C&附278(5):3072-78 (2003)的表1中找到。
受體和供體分子以不同比率與和不與乾酶組合。TR-FRET測(cè)定通過(guò)
下列步驟進(jìn)行，即在340nm激發(fā)系統(tǒng)、分別在615和665 nm測(cè)量銪和 Cy5的發(fā)射、并計(jì)算Cy5發(fā)射與銪發(fā)射的比率。
當(dāng)不存在酶時(shí)，供體和受體分子彼此不能緊密靠近，并且Cy5和銪分 子的個(gè)體焚光不存在淬滅，進(jìn)而產(chǎn)生基線(xiàn)水平的比率。當(dāng)向測(cè)試系統(tǒng)中加 入靼酶時(shí)，供體糖分子轉(zhuǎn)移至受體蛋白質(zhì)，并且淬滅系統(tǒng)的熒光。Cy5與 銪熒光的比率隨著轉(zhuǎn)移的糖分子數(shù)量達(dá)到最大而增加。為了鑒定靶酶的抑制劑，向測(cè)定系統(tǒng)中加入肽或小分子。當(dāng)測(cè)試化合 物能夠抑制糖向蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移時(shí)，熒光的淬滅就會(huì)減少。如果測(cè)試肽能夠
抑制酶100。/。的轉(zhuǎn)移活性，那么Cy5發(fā)射與銪發(fā)射的比率就為基線(xiàn)水平。 然后在基于細(xì)胞的系統(tǒng)中評(píng)估在這項(xiàng)測(cè)定中至少抑制50。/。酶活性的化合 物來(lái)評(píng)定其降低GAG合成(如下文所述)的能力。
本發(fā)明也提供^f吏用額外的篩選測(cè)定例如二級(jí)和三級(jí)測(cè)定(secondary and tertiary assay )，來(lái)進(jìn)一步鑒定此類(lèi)分子對(duì)腱形態(tài)的作用，例如使用 上文詳細(xì)描述測(cè)試。
b) 顯性失活的突變體
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，突變的CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l、 Hs3stl或Sox9蛋白質(zhì)可以用在本發(fā)明的方法中作為抑制劑。例
體或經(jīng)改造的同源物可以用于本發(fā)明的方法。
c) 核酸
能夠阻斷上文所列的靶分子活性的核酸在本發(fā)明中是有用的。此類(lèi)抑 制劑可以編碼與例如CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l、 Hs3stl 或Sox9相互作用的蛋白質(zhì)。備選地，此類(lèi)抑制劑可以編碼能與靼分子(例 如GalNAc)的底物或配體相互作用的蛋白質(zhì)，并且如果所編碼的蛋白質(zhì) 阻斷耙分子與其底物或配體的結(jié)合、或者如果其阻斷底物或配體結(jié)合乾分 子后的活性，那么此類(lèi)抑制劑就在本發(fā)明的方法中是有效的。當(dāng)然，抑制 劑可以編碼同時(shí)與靶分子及其底物或配體相互作用的蛋白質(zhì)。此類(lèi)核酸可 以用來(lái)表達(dá)例如CS-GalNAcT-l、CS-GalNAcT-2、Hs3stl、GalNT-l或Sox9 的抑制劑來(lái)用于本發(fā)明的方法。
本發(fā)明的方法也包括使用干擾性RNA分子("RNAi")來(lái)降低上文所 列的任意分子或其蛋白質(zhì)結(jié)合配偶體的表達(dá)，其中所述的干擾性RNA分 子包括但不限于短的干擾性RNA (siRNA)、短的發(fā)夾RNA ( shRNA ) 和短的雙鏈RNA (sdsRNA) 。 RNAi可以通過(guò)引入核酸分子例如合成的 短干擾性siRNA或RNA干擾劑來(lái)起始，進(jìn)而抑制或沉默靶基因的表達(dá)。見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利^>開(kāi)號(hào)2003/0153519和2003/01674901、以及美國(guó)專(zhuān)利 號(hào)6，506，559和6,573,099。
siRNA可以化學(xué)合成，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，或者在宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。 一般而言，siRNA至少長(zhǎng)15-50個(gè)核苷酸，例如長(zhǎng)20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或30個(gè)核苷酸。siRNA可以是大約15至大約40個(gè) 核苷酸長(zhǎng)度的雙鏈RNA (dsRNA)，例如大約15至大約28個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度， 其中包括大約19、 20、 21或22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，并且可以在每條鏈上包含 具有大約O、 1、 2、 3、 4、 5或6個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的3，和/或5，突出端。siRNA 可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄沉默來(lái)抑制乾基因。優(yōu)選地，siRNA能夠通過(guò)降解乾信使 RNA或者特異地轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS )乾信使RNA來(lái)促進(jìn)RNA干擾。
用于本發(fā)明方法的siRNA也包括小的發(fā)夾RNA ( shRNA ) 。 shRNA 包含短的(例如大約19至大約25個(gè)核苷酸)的反義鏈、接著是大約5個(gè) 至大約9個(gè)核苷酸的核苷酸環(huán)、以及類(lèi)似有義鏈(analogous sense strand)。 備選地，有義鏈可以在核苷酸環(huán)結(jié)構(gòu)之前，并且反義鏈可以在之后。這些 shRNA可以包含在質(zhì)粒和病毒載體中。
siRNA分子的耙向區(qū)域可以選自所給的耙序列。例如，核苷酸序列可 以從起始密碼子下游大約25-100個(gè)核苷酸處起始。核苷酸序列可以含有5， 或3，非翻譯區(qū)，以及靠近起始密碼子的區(qū)域。本領(lǐng)域熟知設(shè)計(jì)和制備siNRA 分子的方法，其中包括多種選擇序列作為RNAi反應(yīng)物的規(guī)則。見(jiàn)，例如 Boese等人，Af"/ioA五rtgwo/ 392:73-96 (2005)。
siRNA可以寸吏用Hannon等人，7Vfl似"418:244-251 (2002)、 McManus 等人，A^/^Wews 3:737-747 (2002)、 Heasman等人，所o/ 243:209-214 (2002)、 Stein等人，/ C/," /wwW， 108:641-644 (2001)和Zamore等人， Aw"肌o/8(9):746-750 (2001)所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生。優(yōu)選的siRNA為5， 磷酸化的。
siRNA可以用來(lái)耙向例如CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT畫(huà)l、 Hs3stl、 Sox9、 Agcl、 Cspgl或Col2al、或者上文所列的其它分子、及其 底物或配體。核酸可以從其自然環(huán)境，以基本純的或同質(zhì)的形式獲得、分離和/或純 化。熟知在多種不同宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞
包括細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和桿狀病毒(baculovirus)系統(tǒng)。本領(lǐng)域 可用的表達(dá)異源多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、HeLa 細(xì)胞、幼地鼠腎細(xì)胞、NSO小鼠黑素瘤細(xì)胞、以及許多其它細(xì)胞。關(guān)于適 合從核酸產(chǎn)生蛋白質(zhì)的其它細(xì)胞見(jiàn)Gene Expression Syst ems, Fernandez等人，Academic Press (1999)。 RNAi分子可以化學(xué)合成，或者 從編碼siRNA或shRNA序列的DNA序列表達(dá)。
為了產(chǎn)生上文所列分子顯性失活突變體，可以選擇或構(gòu)建含有適當(dāng)調(diào) 節(jié)序列的適當(dāng)載體，其中所述的調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子序列、終止子序列、 多聚腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、選擇或標(biāo)記基因以及其它適當(dāng)?shù)男蛄小?根據(jù)需要，載體可以是質(zhì)粒或病毒，例如噬菌體或噬菌粒。更多細(xì)節(jié)參見(jiàn)， 例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook等人，第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)。許多操作核酸的已知技術(shù)和 方法，例如制備核酸構(gòu)建體、誘變、測(cè)序、將DNA引入細(xì)胞和基因表達(dá)、 以及蛋白質(zhì)分析中，都在Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 等人編輯，第2版，John Wiley & Sons (1992)中詳細(xì)描述。
可以將核酸融合至編碼額外多肽序列的其它序列，例如用作標(biāo)記或才艮 告基因的序列。標(biāo)記或報(bào)告基因的實(shí)例包括內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 (CAT)、腺苷脫氨酶(ADA)、 M糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(負(fù)責(zé)新霉素(G418)抗性)、 二氫葉酸還原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPH)、胸腺嘧咬核苷激 酶(TK)、 lacZ(編碼半乳糖苷酶)、黃噤呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)、 熒光素酶。本領(lǐng)域也熟知許多其它基因。
2.抑制酶活性
在本發(fā)明特定的實(shí)施方案中，治療肌腱病變的方法包括降低、抑制或 下調(diào)涉及蛋白聚糖生物合成的酶的活性，其中所述酶例如涉及將硫酸軟骨 素GAG添加到聚集蛋白聚糖和/或多功能蛋白聚糖上的那些。這些酶包括 例如CS-GaINAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 UDP-D-木糖:核心蛋白質(zhì)p-D-木糖基轉(zhuǎn)移酶、Gal轉(zhuǎn)移酶、GlcA轉(zhuǎn)移酶、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、硫 酸軟骨素合酶、Hs3stl和Ga證-l。
在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明包括降低、抑制或下調(diào)受損腱中 CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l和/或Hs3stl酶的活性。在其 它實(shí)施方案中，本發(fā)明包括降低、抑制或下調(diào)受損腱中Xyl轉(zhuǎn)移酶、Gal 轉(zhuǎn)移酶、GlcA轉(zhuǎn)移酶、GalNAc轉(zhuǎn)移酶、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶或 硫酸軟骨素合酶的活性。上述肽或小分子抑制劑可以用來(lái)實(shí)行這些方法。
a)鑒定酶活性的抑制劑
本發(fā)明進(jìn)一步包含鑒定和評(píng)估在受損腱組織中作為CS-GalNAcT-l 、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l、 Hs3stl、 Xyl轉(zhuǎn)移酶、Gal轉(zhuǎn)移酶、GlcA轉(zhuǎn)移 酶、GalNAc轉(zhuǎn)移酶、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶或硫酸軟骨素合酶的抑 制劑的物質(zhì)的功效的方法。
此類(lèi)抑制劑阻斷或降低涉;^M中軟骨或纖維軟骨形成的酶的活性。這
些抑制劑包括修飾的可溶性底物、蛋白質(zhì)、小分子以及核酸。
鑒定治療肌腱病變的物質(zhì)的方法包括測(cè)定每個(gè)獨(dú)立物質(zhì)對(duì)上文所列酶 的酶活性、蛋白質(zhì)-耙相互作用或者蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的效果。多種 體內(nèi)或體外的測(cè)定可以用來(lái)測(cè)定抑制劑治療肌腱病變的功效。在一示例性
實(shí)施方案中，通過(guò)類(lèi)似于高通量篩選(HTS)的方法，通過(guò)測(cè)定小分子影 響例如上文所列酶的酶活性、靶結(jié)合或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的能力而對(duì) 其潛在的治療用途進(jìn)行了體外評(píng)估。
在典型的HTS測(cè)定中，候選化合物對(duì)例如酶活性、配體-受體結(jié)合等的 抑制效果可以通過(guò)將存在已知濃度候選者時(shí)的測(cè)試測(cè)定與參照進(jìn)行比較來(lái) 測(cè)定，其中所述的參照在不存在候選者和/或在存在已知抑制劑化合物時(shí)進(jìn) 行。 一般地，可以使用常規(guī)染料、熒光或放射性活性分子來(lái)監(jiān)測(cè)候選化合 物的效果。因此，例如，可以鑒定出抑制配體與其受體結(jié)合、或者抑制酶 活性、降低酶過(guò)程周轉(zhuǎn)的候選化合物。
本發(fā)明的示例性實(shí)施方案提供在體外鑒定治療肌腱病變的物質(zhì)的方 法，其中包括(l)提供至少一種選自CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、GalNT-l和Hs&tl的樣品成份的樣品；("組合樣品成分和測(cè)試物質(zhì)；p)測(cè) 定樣品成分應(yīng)答測(cè)試物質(zhì)的活性；并(4)確定測(cè)試物質(zhì)是否抑制樣品成分的 活性。
在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，鑒定治療肌腱病變的物質(zhì)的體外方法包括 用BMP-2蛋白質(zhì)或表達(dá)BMP-2蛋白質(zhì)的腺病毒處理軟骨外植體、初級(jí)軟骨 細(xì)胞顆粒培養(yǎng)物或者軟骨細(xì)胞系。BMP-2刺激ECM和GAG合成。然后將 測(cè)試化合物加入培養(yǎng)物中，并通過(guò)測(cè)量35S到GAG側(cè)鏈中的摻入和/或通過(guò) DMMB測(cè)定來(lái)評(píng)估抑制劑對(duì)GAG合成的效果。測(cè)試化合物的效果將與適當(dāng) 的載體對(duì)照進(jìn)行比較。
潛在的酶抑制劑的體內(nèi)測(cè)定可以包括(l)重復(fù)向哺乳動(dòng)物(例如 Sprague-Dawley大鼠)施用至少2、 4、 6或8周時(shí)間的測(cè)試抑制劑；(2)將哺 乳動(dòng)物每周5天、每天l小時(shí)以17米/分鐘進(jìn)行下坡跑步方案(實(shí)施例l);
肌腱的效果，其^認(rèn)為腱變:生(例如:胞和形態(tài)-學(xué)上的異常)的變緩歸因 于抑制劑，并且表明抑制劑對(duì)于治療腱變性病癥是有效的。
應(yīng)當(dāng)理解，用于本發(fā)明方法的測(cè)試抑制劑可以在一種或多種腱變性病 癥的動(dòng)物模型和/或人中進(jìn)行評(píng)估。
本領(lǐng)域已知多種在體內(nèi)和體外在存在抑制劑時(shí)測(cè)量酶活性的測(cè)定。一 些較常用的測(cè)定的實(shí)例包括分光光度法、熒光分光測(cè)定法、圓二色性 (circular dichroism )、自動(dòng)化的分光光度法和熒光分光測(cè)定法、偶聯(lián)測(cè) 定、自動(dòng)化的酸或堿滴定法、放射性方法、無(wú)標(biāo)記的光學(xué)檢測(cè)和酶抑制測(cè) 定。在示例性實(shí)施方案中，CS-GalNAcT-l和/或CSGalNAcT-2的酶活性如 Uyama等人，J Biol Chem 277(11):8841-46 (2002)中所述進(jìn)行檢測(cè)。在另一 示例性實(shí)施方案中，GalNT-l的酶活性如White等人，J Biol Chem 270 (41):24156-65 (1995)所述進(jìn)行檢測(cè)。
例如，用于本發(fā)明方法的酶抑制劑可以與其抑制的酶相互作用。備選 地，抑制劑可以與例如酶底物(例如GalNAc )或其它結(jié)合配偶體相互作用。 如果抑制劑阻斷酶與其底物的結(jié)合、并且/或者如果抑制劑阻斷底物結(jié)合酶后的活性，那么其可以降低或者并且在本發(fā)明中有效。當(dāng)然，抑制劑可以
與酶和第二種因子例如其底物都相互作用。在這個(gè)方面，CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l和/或Hs3stl的抑制劑包括例如^f務(wù)飾的可溶性底 物、其它蛋白質(zhì)(包括結(jié)合酶和/或酶底物的蛋白質(zhì))、修飾形式的酶或其 片段、前肽、肽和所有這些抑制劑的模擬物。
酶的抑制劑可以例如是直接的酶抑制劑，結(jié)合并中和酶的活性；降低 酶的表達(dá)水平；影響前體分子的穩(wěn)定性或向活性、成熟形式的轉(zhuǎn)變；干擾 酶與其一個(gè)或多個(gè)底物的結(jié)合；或者其干擾酶的細(xì)胞內(nèi)功能。
3.抑制轉(zhuǎn)錄因子活性
用于本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)錄因子抑制劑可以直接通過(guò)結(jié)合、或者間接通過(guò)
在這個(gè)方面，Sox9的抑制劑可以包括經(jīng)々務(wù)飾的可溶性配體或靶分子、小分 子和核酸。
本領(lǐng)域已知在存在抑制劑時(shí)在體內(nèi)和體外測(cè)量Sox9活性的測(cè)定。 一些 較常用的Sox9抑制劑的測(cè)定的實(shí)例包括酵母雙雜交系統(tǒng)、熒光素酶報(bào)告基 因、測(cè)定存在Sox9抑制劑時(shí)軟骨細(xì)胞特異性基因(例如Col2al、 Agcl)表 達(dá)水平的PCR測(cè)定、Sox9或軟骨特異性基因的Western印跡分析、瞬時(shí)轉(zhuǎn) 染、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)測(cè)定和Northern印跡分析。
可以使用多種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白 質(zhì)-核酸相互作用的測(cè)定來(lái)測(cè)定抑制劑對(duì)Sox9與其結(jié)合配偶體相互作用的 壯闊用。例如，可以使用AlphaScreenTM擴(kuò)增的發(fā)光近似性同質(zhì)測(cè)定(購(gòu)自 普金艾爾莫公司(PerkinElmer⑧))，或者可以采用生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn) 移(Bioluminesence Resonance Energy Transfer)(購(gòu)自普金艾爾莫公司
(PerkinElmer )的BRETTM)來(lái)進(jìn)行干擾Sox9結(jié)合性相互作用的抑制劑的 體外測(cè)定。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于鑒定治療肌腱病變的物質(zhì)的體外 測(cè)定的方法，其中包括(l)提供融合于供體熒光分子的上文所列靶分子； 組合靶分子和測(cè)試物質(zhì)；(3)加入融合于受體熒光分子的靶分子的結(jié)合配偶體；(4)檢測(cè)靶分子和其結(jié)合配偶體之間的熒光能量轉(zhuǎn)移水平；并(5)測(cè)定測(cè) 試物質(zhì)是否抑制靶分子與其結(jié)合配偶體的相互作用。
抑制劑能夠干擾靶分子與其結(jié)合性配偶體的結(jié)合，并進(jìn)而影響兩者間 的FRET水平。因此，可以使用FRET測(cè)量來(lái)鑒定多種效力的抑制劑。 一旦 在體外鑒定了靶分子的抑制劑，就可以進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)測(cè)試來(lái)測(cè)定抑制 劑在預(yù)防腱中軟骨和纖維軟骨形成中的功效和適用性。
4. 抑制蛋白質(zhì)表達(dá)
在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療肌腱病變的方法包括降低、抑制或下調(diào)基 因例如CS-GalNAcT畫(huà)l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l 、 Hs3stl 、 Col2al、 Cspgl、 Agcl和/或Sox9、及其編碼的多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或聚集。用于抑制這 些基因表達(dá)的組合物包括例如上文II(B)(l)(c)部分中所述的干擾性RNA分 子。
這些抑制劑可以以任意方式施用，但在特定實(shí)施方案中，將表達(dá)RNAi 抑制劑的DNA摻入腺病毒栽體，然后將所述載體注射進(jìn)入需要腱修復(fù)的患 者。在示例性實(shí)施方案中，編碼RNAi的核苦酸序列位于polII啟動(dòng)子的下游， 如Wahdwa等人，Curr Opin Mol Ther 6(4):367-72 (2004)中所述。將siRNA 和shRNA插入腺病毒載體的方法為本領(lǐng)域熟知，并在Krom等人，BMC Biotech 6(11):[先于印刷的電子發(fā)行中進(jìn)行了描述。備選地，直接將RNAi 抑制劑注射i^受損的腱組織、并通過(guò)電穿孔法將其轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，如 Schiffelers等人，Arthritis & Rheumatism 52(4):1314-18 (2005)中所述。
5. 肌腱病變病癥
本發(fā)明的方法可以用來(lái)在任何需要該治療的哺乳動(dòng)物中治療或預(yù)防肌 腱病變，其中所述的哺乳動(dòng)物包括人、靈長(zhǎng)類(lèi)、猴、嚙齒動(dòng)物、羊、兔、 狗、豚鼠、馬、牛和貓?？梢灾委熁蝾A(yù)防的病癥包括例如腱炎、肌腱炎、 肌腱變性、腱圍炎、腱鞘炎(tenocynovitis)、腱過(guò)度使用損傷、腱創(chuàng)傷、腱 周?chē)?、paratenonitis、和"肌腱病變"病癥家族中的任意其它病癥。
肌腱病變可以由于過(guò)度使用和重復(fù)運(yùn)動(dòng)、突然損傷(從輕度到重度)、 逐漸變性或老化導(dǎo)致。大多數(shù)腱損傷由一系列疾愈緩慢的小裂傷(肌腱變性)組成，所述小裂傷減弱腱、通常導(dǎo)致疼痛、僵硬和失去強(qiáng)度。肌腱病變通 常需要數(shù)周的治療、減少或改變活動(dòng)、以及休息。太快恢復(fù)使用受損的腱 將導(dǎo)致更多的腱損傷，使受損的腱更加容易撕裂或破裂。因此，通過(guò)本發(fā) 明治療或預(yù)防的病癥包括伴隨過(guò)度使用、體育或事故相關(guān)損傷和創(chuàng)傷、營(yíng) 養(yǎng)缺乏和年齡增長(zhǎng)的腱變性病癥(急性和慢性?xún)煞N)。
肌腱病變的一個(gè)實(shí)例是外上髁炎，也已知為"網(wǎng)球肘(tennis elbow)"， 這是熟知的體育醫(yī)學(xué)和矯形外科病癥。這種病癥潛在的病理涉及過(guò)度使用 和微撕裂肘部處的橈側(cè)腕短伸肌腱。身體嘗試修復(fù)這些微撕裂，但在許多 情況中，愈合過(guò)程是不完全的。進(jìn)行慢性外上髁炎手術(shù)的患者的病理學(xué)樣 品顯示受損腱中紊亂的血管成纖維細(xì)胞發(fā)育異常。這種不完全的修復(fù)嘗試 導(dǎo)致變性的、不成熟的、并且血管化的組織。不完全修復(fù)的組織比正常的 腱組織弱，并且缺乏行使正常功能的強(qiáng)度。這種弱化的組織也通過(guò)引起疼 痛，并消極地影響生活質(zhì)量而限制患者。類(lèi)似的不完全修復(fù)存在于其它類(lèi) 型的腱相關(guān)損傷或損害中，例如膝腱炎(跳躍者膝)、跟腱炎(常見(jiàn)于跑步運(yùn) 動(dòng)員)、和肩袖腱炎(常見(jiàn)于"過(guò)頭頂，，的運(yùn)動(dòng)員，例如棒球投手)。
肌腱病變也可以由于例如增長(zhǎng)的年齡、不好的飲食、體育活動(dòng)、創(chuàng)傷、 損傷或藥物例如培氟沙星(pefloxacin)引起。例如，前列腺素E1(PGE1) 誘導(dǎo)的、前列腺素E2(PGE2)誘導(dǎo)的或者培氟沙星誘導(dǎo)的肌腱病變是人肌腱 病變建立的很好的動(dòng)物模型。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在個(gè)體中治 療或預(yù)防藥物誘導(dǎo)的肌腱病變例如培氟沙星誘導(dǎo)的肌腱病變的方法。在其 它示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療或預(yù)防由于過(guò)度使用、體育或事故 相關(guān)的損傷和創(chuàng)傷、營(yíng)養(yǎng)缺乏和年齡增長(zhǎng)誘導(dǎo)的肌腱病變的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供通過(guò)向哺乳動(dòng)物施用分子活性和/或表達(dá)的抑制劑 來(lái)治療或預(yù)防腱變性病癥、延緩腱退化、恢復(fù)腱品質(zhì)、維持腱健康、治療 或預(yù)防腱組織的低氧變性、治療或預(yù)防腱組織的透明素變性、治療或預(yù)防 腱組織的類(lèi)黏蛋白或myxoid變性、治療或預(yù)防腱組織的類(lèi)血纖維蛋白變 性、治療或預(yù)防腱組織的脂類(lèi)變性、治療或預(yù)防腱組織的鈣化、治療或預(yù) 防腱組織的纖維軟骨和骨的組織轉(zhuǎn)化、維持腱的微觀(guān)結(jié)構(gòu)完整性、維持腱中的纖維結(jié)構(gòu)、維持腱中的纖維排列、維持正常的腱血管供應(yīng)、維持腱組
織中正常的細(xì)胞構(gòu)成、恢復(fù)腱組織中正常的ECM含量、減少腱組織中GAG 的病理學(xué)聚集、和/或維持腱的質(zhì)量、抗張強(qiáng)度和/或柔性品質(zhì)的方法，其中 所述的分子例如CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l、 Xyl轉(zhuǎn)移酶、 Gal轉(zhuǎn)移酶、GlcA轉(zhuǎn)移酶、GalNAc轉(zhuǎn)移酶、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、 硫酸軟骨素合酶、Col2al、聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、Hs3stl和/或 Sox9，并且施用上述抑制劑的量為在肌腱病變組織中預(yù)防或降低此類(lèi)分子 活性和/或表達(dá)的有效量。 6.評(píng)估治療和動(dòng)物模型
本發(fā)明的方法可以用來(lái)在腱組織中治療肌腱病變或微缺陷。治療后或 者治療期間的腱品質(zhì)可以例如通過(guò)評(píng)估腱的耀Jf見(jiàn)結(jié)構(gòu)完整性、腱皎原穩(wěn)定 性、腱組織細(xì)胞構(gòu)成的變異、腱血管化、和/或GAG含量來(lái)測(cè)定。在治療后 或者治療期間評(píng)估腱健康的方法為本領(lǐng)域已知，并且包括但不限于磁共振 成像(MRI)、超聲波掃描術(shù)、以及功能性和/或疼痛評(píng)估。備選地，腱的健 康可以通過(guò)評(píng)估腱組織中GAG的水平來(lái)測(cè)定。
一種測(cè)定腱G AG含量的測(cè)定為對(duì)于測(cè)量腱中硫酸化糖胺聚糖(G AG) 濃度的1，9-二甲基亞甲藍(lán)(DMMB)測(cè)定。另 一種測(cè)定腱GAG含量的測(cè)定為 組織學(xué)的愛(ài)茜藍(lán)(AB)染色，其可以用來(lái)檢測(cè)腱組織中增加數(shù)量的GAG。
III.治療的方法和藥物組合物
用于本發(fā)明方法的抑制劑可以通過(guò)局部的、經(jīng)口的、靜脈內(nèi)的、 內(nèi)的、肌內(nèi)的、腔內(nèi)的、皮下的、植入的或者經(jīng)皮的方式局部或全身施用。
在示例性實(shí)施方案中，也可以通過(guò)基因療法的方式向個(gè)體施用抑制劑， 其中在體內(nèi)向患者施用編碼抑制劑的核酸序列。在示例性實(shí)施方案中，將
病毒表達(dá)載體。然后直接將腺病毒注射進(jìn)入患者的腱，在所述的腱中表達(dá) 核酸抑制劑。例如，Mehta等人，J Hand Surg30A(l):136畫(huà)41 (2005)、 Lou等人，J Orthoped Res 19:1199-1202 (2001)和Lou， Clin Orthopaed Rel Res 379S:S252-55 (2000)中描述了腺病毒介導(dǎo)的核酸向腱組織遞送的實(shí)例。
在其它示例性實(shí)施方案中，將核酸抑制劑摻入其它病毒表達(dá)載體，例 如慢病毒、皰滲病毒和腺伴隨病毒。適當(dāng)?shù)妮d體可以通過(guò)評(píng)估每種類(lèi)型病 毒在初級(jí)腱細(xì)胞中的體外傳染性來(lái)進(jìn)行選擇。
備選地，將核酸抑制劑直接注射"腱組織，并通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)移" 細(xì)胞，如Schiffelers等人，Arthritis & Rheumatism 52(4):1314曙18 (2005)中所 述。
在其它示例性實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法的肽或小分子抑制劑可以 包被在經(jīng)皮膚的貼劑上，并直接應(yīng)用于覆蓋腱組織的皮膚，如Paoloni等人, J Bone Joint Surg 86A(5):916-22 (2004)中所述。
本領(lǐng)域已知治療肌腱病變的分子的施用方法。"施用"不限于任意的特 定遞送系統(tǒng)，并且可以不限制地包括腸胃外的(包括皮下的、靜脈內(nèi)的、髓 內(nèi)的、關(guān)節(jié)內(nèi)的、肌內(nèi)的、腔內(nèi)的或腹膜內(nèi)的注射)、直腸的、局部的、經(jīng) 皮膚的或者經(jīng)口的(例如在膠嚢、混懸劑或片劑中)?？梢跃植炕蛉淼匕l(fā) 生向個(gè)體施用，以單次劑量，或者連續(xù)或間斷地重復(fù)施用，并且以任何的 多種生理學(xué)上可接受的鹽形式，和/或與作為藥物組合物(上文所述)部分 的可藥用載體和/或添加劑一起施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知生理學(xué)上可接受 的鹽形式、標(biāo)準(zhǔn)的藥物制劑才支術(shù)和賦形劑。見(jiàn)Physicians， Desk Reference (PDR) 2003，第57版，Medical Economics Company, 2002和Remington: The Science and Practice of Pharmacy,編著。Gennado等人，第20版， Lippincott, Williams & Wilkins， 2000)。
用于本發(fā)明方法的抑制劑可以施用從大約l jiig/kg至大約20 mg/kg的劑 量,這取決于癥狀的嚴(yán)重度和疾病的i^艮。適當(dāng)?shù)挠行┝坑芍髦吾t(yī)生從 下列范圍選擇例如大約l照/kg至大約20mg/kg、大約l jng/kg至大約10 mg/kg、大約l fig/kg至大約l mg/kg、大約10照/kg至大約l mg/kg、大約10 ^g/kg至大約100 pg/kg、大約IOO jig至大約l mg/kg、以及大約500 pg/kg至 大約l mg/kg。在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，重復(fù)施用抑制劑至少2、 4、 6、 8、 10、 12、 20或40周的時(shí)期，或者至少l、 1.5或2年或者高達(dá)受試者的終身，從而 來(lái)例如治療肌腱病變。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，以單次劑量施用抑 制劑來(lái)例如刺激恢復(fù)腱的正常結(jié)構(gòu)和組成。
一般而言，用于本發(fā)明方法的抑制劑可以施用在10-8和10-7、 10-7和 10-6、 10-6和10-5或者10-5和10-4g/kg之間的劑量。在一種動(dòng)物模型中完成 的治療有效劑量可以轉(zhuǎn)換為用在另 一動(dòng)物包括人中，使用本領(lǐng)域已知的換 算系數(shù)。見(jiàn)，例如Freireich等人，Cancer Chemother Reports 50(4):219-244 (1966)。
在本發(fā)明方法中使用的抑制劑的確切劑量基于想要的結(jié)果憑經(jīng)驗(yàn)確 定。示例性結(jié)果包括(l)腱變性病癥得到治療或預(yù)防；(2)腱退化得到緩解； (3)腱的品質(zhì)得到恢復(fù)；(4)腱的健康得到維持；(5)腱的低氧變性得到治療或 預(yù)防；(6)腱的透明素變性得到治療或預(yù)防；(7)腱的類(lèi)黏蛋白或myxioid變 性得到治療或預(yù)防；(8)腱的類(lèi)血纖維蛋白變性得到治療或預(yù)防；(9)腱的脂 類(lèi)變性得到治療或預(yù)防；(10)腱的鈣化得到治療或預(yù)防；(ll)腱的纖維軟骨 和骨的組織轉(zhuǎn)化得到治療或預(yù)防；(12)腱的纖維結(jié)構(gòu)得到維持；(13)腱中的 纖維排列得到維持；(14)腱正常的血管供應(yīng)得到維持；(15)腱中正常的細(xì)胞 構(gòu)成得到維持；(16)腱中正常的ECM含量得到恢復(fù)；和/或(17)腱的質(zhì)量、 抗張強(qiáng)度和/或柔性品質(zhì)得到維持。例如，施用有效量的抑制劑來(lái)至少20、 30、 40、 50、 100、 200、 300、 400或500%地減緩腱的退化(例如腱質(zhì)量的、 結(jié)構(gòu)組成、和/或?qū)ξ⑺毫押吞弁疵舾行缘膿p失)。
在一些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法的組合物還包含可藥用的賦形劑。 如本文所用，詞語(yǔ)"可藥用的賦形劑，，指的是任意和所有與藥物施用兼容的 溶劑、*劑、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收劑等。本領(lǐng) 域熟知此類(lèi)介質(zhì)和物質(zhì)作為藥物活性物質(zhì)的用途。組合物也可以含有其它 提供補(bǔ)充的、額外的或者增強(qiáng)的治療功能的活性化合物。藥物組合物也可 以與施用說(shuō)明一起包括在容器、包裝或者分樣器(dispenser)中。與本發(fā)明方法聯(lián)合施用的藥物組合物應(yīng)當(dāng)被配制成與其預(yù)期的施用途 徑兼容。此類(lèi)制劑的實(shí)例包括結(jié)晶蛋白質(zhì)制劑，其是以棵露的或者與生物
可降解聚合物(例如PEG、 PLGA)組合來(lái)提供。
用于本發(fā)明方法的抑制劑可以作為藥物組合物與載體凝膠和基質(zhì)或者 其它用于引導(dǎo)骨再生和/或骨替換的組合物一起施用。此類(lèi)基質(zhì)的實(shí)例包括 合成的聚乙二醇(PEG)、羥磷灰石、基于膠原和血纖蛋白的基質(zhì)、Tisseel 血纖蛋白膠等。
在一些實(shí)施方案中，抑制劑可以與其它治療性化合物例如NSAID、皮 質(zhì)類(lèi)固醇、 一氧化氮、睪酮、雌激素、生長(zhǎng)因子(例如BMP-12、 BMP-13 和MP52)《且合或伴隨地施用。
用于本發(fā)明方法的抑制劑可以被包被在腱植入物、基質(zhì)和貯存系統(tǒng)上、 或者摻入其中來(lái)促進(jìn)治療或預(yù)防腱損傷。
實(shí)施例
實(shí)施例l:大鼠岡上肌腱由于過(guò)度使用表達(dá)軟骨標(biāo)記
了研究。先前已經(jīng)描述了腱過(guò)度使用的大鼠模型。Soslowsky等人，J Shoulder Elbow Surg 9:79-84 (2000)。已經(jīng)表明，炎性和生血管標(biāo)記在這個(gè) 模型中被改變(Perry等人，J Shoulder Elbow Surg 14:79S-83S (2005))，但采
取更廣泛的途徑來(lái)理解圍繞過(guò)度使用損傷的事件。
對(duì)24只雄性Sprague-Dawley大鼠(400-450 g)進(jìn)行岡上肌腱(SST)過(guò)度 使用方案1周(11=8)、 2周(11=8)和4周(11=8)。方案由每周5天、每天l小時(shí)的以 17米/分鐘的下坡跑(10%坡度)組成。額外的6只大鼠用作籠內(nèi)活動(dòng)的對(duì)照 (時(shí)間0)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，兩只額外的非跑動(dòng)大鼠被用作年齡匹配的同齡 組對(duì)照。
在尸體剖檢時(shí)，從每個(gè)肩部取出岡上肌腱，并從每個(gè)膝部取出膝腱 (PT)。膝腱用作運(yùn)動(dòng)效果的內(nèi)參，因?yàn)橛么朔桨钙洳伙@示過(guò)度使用的明顯 征狀。稱(chēng)量采集的腱，并速凍在液氮中。將組織冷凍破碎，并用TRIzol試劑(英杰生命科技公司(Invitrogen ))抽提。用RNeasy試劑盒(強(qiáng)基因公司 (QIAGEN))從抽提物的水相中分離RNA。用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃 度。監(jiān)測(cè)大于30，000個(gè)轉(zhuǎn)錄物表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄概況分析用Affymetrix大鼠基 因組230 2.0陣列進(jìn)行。對(duì)所有陣列圖像都在視覺(jué)上檢查缺陷和品質(zhì)。在進(jìn) 一步的分析中排除高背景、低信號(hào)強(qiáng)度、或者主要缺陷的陣列。信號(hào)值用 Gene Chip Operating System 1.0 (GCOS， Affymetrix)測(cè)定。對(duì)于每組陣列， 將統(tǒng)計(jì)值標(biāo)準(zhǔn)化為100的平均信號(hào)強(qiáng)度值。將默認(rèn)的GCOS統(tǒng)計(jì)值用于所有 分析。如果基因在任意組織中的平均表達(dá)大于100個(gè)信號(hào)單位、并且具有通 過(guò)GCOS默認(rèn)設(shè)置測(cè)定的Present (P) call的樣品百分?jǐn)?shù)大于或者等于66。/。， 那么就認(rèn)為基因是可檢測(cè)的。將標(biāo)準(zhǔn)化的信號(hào)值轉(zhuǎn)變?yōu)榈讛?shù)為10的對(duì)數(shù)。 如果ANOVA檢測(cè)的p值《.01，并且在任意時(shí)間點(diǎn)跑動(dòng)和對(duì)照間的差異都為 至少2倍，那么就認(rèn)為基因是差異表達(dá)的。
過(guò)度^f吏用后，在岡上肌腱中超過(guò)400個(gè)基因受到差異調(diào)節(jié)。通過(guò)跑動(dòng)4 周，107個(gè)基因受到上調(diào)，并且27個(gè)基因受到下調(diào)。在最高上調(diào)的基因中， 許多是在軟骨組織中高度表達(dá)的，其中包括II型膠原al、多功能蛋白聚糖 和聚集蛋白聚糖。這些結(jié)果表明，過(guò)度使用的腱轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維軟骨的表型。 這些相同基因在跑動(dòng)動(dòng)物的膝腱中未受到上調(diào)(見(jiàn)圖l-7)。 實(shí)施例2:制備siRNA抑制劑
siRNA如下選擇，即通過(guò)將CS-GalNAcT-l、 GalNT-l或Hs3stl的核苷
列輸入商業(yè)網(wǎng)站(例^口sirnawizard.com或Ambion⑧siRNA Target Finder)來(lái)設(shè)計(jì)特異的siRNA。序列選擇指導(dǎo)包含在這些工具中。
siRNA的功效通過(guò)將其轉(zhuǎn)染進(jìn)入C-20/A4和/或C-28/I2軟骨細(xì)胞，并通 過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCRJli測(cè)CS-GalNAcT-l和/或GalNT-l的表達(dá)來(lái)測(cè)量。具相同核 普酸組成的適當(dāng)亂序(scramble)siRNA被用作實(shí)驗(yàn)對(duì)照。
實(shí)施例3:蛋白聚糖合成的抑制劑的體外測(cè)試系統(tǒng)
如果siRNA能夠降低C-20/A4和/或C-28/I2軟骨細(xì)胞中CS-GalNAcT-l、 GalNT-l或Hs3stl的表達(dá)，那么就測(cè)試其降低蛋白聚糖GAG側(cè)鏈產(chǎn)生的能 力。用BMP-2蛋白質(zhì)或表達(dá)BMP-2的腺病毒處理C-20/A4和/或C-28/I2軟骨細(xì)胞來(lái)刺激細(xì)胞外基質(zhì)和GAG的合成。將siRNA或者備選地，小分子、GAG 合成的抑制劑加入到培養(yǎng)物中，并通過(guò)比較在存在或不存在抑制劑時(shí)35S 到蛋白聚糖中的摻入來(lái)評(píng)估抑制劑的效果。備選地，通過(guò)用DMMB測(cè)定比 較在存在或不存在抑制劑時(shí)GAG的水平來(lái)評(píng)估抑制劑的效果，如Arai等人， Osteoarthritis and Cartilage 12:599-613 (2004)中所述。
實(shí)施例4:通過(guò)CS-GalNAcT-l、 GalNT-l或Hs3stl的siRNA抑制來(lái)治療 肌腱病變的方法
用跑臺(tái)過(guò)度使用方案(實(shí)施例l)或者局部注射PGE1、 PGE2或培氟 沙星(300 mg/ml)l周(每周5次)來(lái)在大鼠中+秀導(dǎo)肌腱病變。
一旦在體外發(fā)現(xiàn)siRNA降低了CS-GalNAcT-l、 GalNT-l或Hs3stl的活 性，就將其轉(zhuǎn)換為shRNA，并將shRNA序列克隆和插入腺病毒，例如Krom 等人，BMC Biotech 6(11):[電子發(fā)行]中所述。使用腺病毒來(lái)在體內(nèi)表達(dá) shRNA、并隨后抑制CS-GalNAcT-l和/或GalNT-l的表達(dá)。將注射方法在 初級(jí)腱細(xì)胞中進(jìn)行優(yōu)化。
將表達(dá)shRNA的功能性腺病毒直接注射ii7v受損的腱(Mehta等人，J Hand Surg 30A(1):136-41 (2005))來(lái)局部降低CS-GalNAcT-l和/或GalNT-l 基因的表達(dá)。包括亂序序列(Scramble sequence )作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。通過(guò)評(píng) 估GAG水平來(lái)評(píng)估腱中軟骨組織形成的量。使用組織學(xué)的愛(ài)茜藍(lán)染色來(lái)檢 測(cè)腱組織中糖胺聚糖(GAG)的增加的量。使用DMMB試劑定量從腱中抽提 的石克酸化GAG的量。
抑制CS-GalNAcT-l和/或GalNT-l對(duì)肌腱病變的效果的體內(nèi)評(píng)估通過(guò) 組織學(xué)和腱強(qiáng)度的機(jī)械性或功能性檢測(cè)來(lái)測(cè)定。如果與未處理的對(duì)照相比， GAG水平顯著下降和/或被降低到與正常、未受損傷的腱相似的水平，就認(rèn) 為抑制劑是有效的。備選地，當(dāng)與未處理的對(duì)照相比，如果功能或機(jī)械測(cè) 試證明改善的功能和/或降低的疼痛，就認(rèn)為抑制劑是有效的。
權(quán)利要求
1. 在患者中治療肌腱病變的方法，其包括降低患者腱組織中軟骨特異性蛋白聚糖的形成。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中所述的患者為人。
3. 權(quán)利要求l的方法，其中所述的患者選自靈長(zhǎng)類(lèi)、猴、嚙齒動(dòng)物、 羊、兔、狗、豚鼠、馬、牛和貓。
4. 權(quán)利要求l的方法，其包括降低患者腱組織中涉及蛋白聚糖合成的 酶的活性，所述蛋白聚糖選自聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖和多配體蛋 白聚糖-3。
5. 權(quán)利要求1的方法，其包括降低患者腱組織中硫酸軟骨素N-乙酰氨 基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1(CS-GalNAcT-l)和/或半乳糖胺多肽N-乙酰氨基半乳 糖基轉(zhuǎn)移酶l(GalNT-l)的活性。
6. ^又利要求1的方法，其中所述的活性通過(guò)抑制CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 Hs3stl和/或GalNT-l的酶活性來(lái)降低。
7. 沖又利要求l的方法，其中所述的活性通過(guò)抑制CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 Hs3stl和/或GalNT-l基因的表達(dá)來(lái)降4氐。
8. 權(quán)利要求l的方法，其包括降低涉及軟骨產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子的活性。
9. 權(quán)利要求8的方法，其包含降低Sox9的活性。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述的活性通過(guò)抑制Sox9增強(qiáng)軟骨特異 性基因表達(dá)的能力來(lái)降低。
11. 權(quán)利要求8的方法，其中所述的活性通過(guò)抑制Sox9基因的表達(dá)來(lái) 降低。
12. 權(quán)利要求l的方法，其包括降低軟骨特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)。
13. 權(quán)利要求12的方法，其包括降低選自聚集蛋白聚糖、多功能蛋白 聚糖和多配體蛋白聚糖-3的蛋白聚糖的表達(dá)。
14. 權(quán)利要求12的方法，其包括降低Col2al的表達(dá)。
15. 權(quán)利要求l的方法，其中所述的肌腱病變?yōu)殡煅住?br> 16. 權(quán)利要求l的方法，其中所述的肌腱病變?yōu)榧‰熳冃浴?br> 17. 權(quán)利要求l的方法，其中所述的肌腱病變?yōu)殡鞊p傷。
18. 在患者中治療肌腱病變的方法，其包括向患者的腱組織中施用 CS畫(huà)GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2 、 GalNT-l、 Hs3stl和/或Sox9的抑制劑。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述的抑制劑降低CS-GalNAcT-l和/ 或GalNT-l的酶活性。
20. 權(quán)利要求18的方法，其中所述的抑制劑降低CS-GalNAcT-l和/ 或GalNT-l的表達(dá)。
21. 權(quán)利要求18的方法，其中所述的抑制劑局部施用。
22. 權(quán)利要求18的方法，其中所述的抑制劑包含干擾性RNA分子。
23. 權(quán)利要求18的方法，其中所述的抑制劑包含小分子。
24. 在患者中治療肌腱病變的方法，其包括降低患者腱組織中軟骨特 異性蛋白質(zhì)的表達(dá)。
25. 權(quán)利要求24的方法，其包括抑制聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖 和/或II型膠原的表達(dá)。
26. 權(quán)利要求24的方法，其包括抑制Sox9的表達(dá)。
27. 權(quán)利要求24的方法，其包括抑制Sox9的活性。
28. 鑒定治療肌腱病變的物質(zhì)的方法，其包括向需要治療的受試者施 用測(cè)試物質(zhì)，并測(cè)量該物質(zhì)抑制腱組織中涉及糖胺聚糖(GAG)生物合成 的酶的活性的能力。
29. 鑒定在治療肌腱病變中有用的化合物的方法，其包括向需要治療 的受試者施用測(cè)試化合物，并測(cè)量化合物抑制腱組織中涉及糖胺聚糖合成 的酶的活性的能力。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其進(jìn)一步包括步驟(a) 提供至少一種選自CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、石危酸乙酰肝 素(葡糖胺)3-0-磺基轉(zhuǎn)移酶1、 GalNT-l和Sox9的樣品成分；(b) 將樣品與測(cè)試化合物組合；(c) 測(cè)量樣品成分應(yīng)答測(cè)試化合物的活性；以及(d)確定測(cè)試化合物是否抑制樣品成分的活性。
31. 化合物在制備治療肌腱病變的藥物中的用途，所述化合物降低軟 骨特異性蛋白聚糖的形成。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31的用途，其中所述的化合物降低涉及軟骨合成的 酶或其它蛋白質(zhì)的活性。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32的用途，其中所述的化合物直接或間接抑制酶或 蛋白質(zhì)的功能。
34. 根據(jù)權(quán)利要求32或33的用途，其中所述的化合物抑制酶或蛋白 質(zhì)的表達(dá)。
35. 才艮據(jù)權(quán)利要求32至34中任意一項(xiàng)的用途，其中所述的酶選自 UDP-D-木糖:核心蛋白質(zhì)P-D-木糖基轉(zhuǎn)移酶、Gal轉(zhuǎn)移酶、GlcA轉(zhuǎn)移酶、 GlcNAc轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、硫酸軟骨素合酶和硫酸乙酰肝素磺基轉(zhuǎn)移 酶。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35的用途，其中所述的酶選自硫酸軟骨素N-乙酰氨 基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1(CS-GalNAcT-l)、硫酸軟骨素N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn) 移酶2(CS-GalNAcT-2)、半乳糖胺多肽N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶 1(GalNAcT-l)和硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-0-磺基轉(zhuǎn)移酶1(Hs3stl)。
37. 才艮據(jù)權(quán)利要求31的用途，其中所述的化合物降低軟骨特異性結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的表達(dá)。
38. 根據(jù)權(quán)利要求31的用途，其中所述的化合物降低涉及軟骨特異性 結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的活性。
39. 根據(jù)權(quán)利要求38的用途，其中所述的轉(zhuǎn)錄因子為Sox9。
40. 根據(jù)權(quán)利要求31至39中任意一項(xiàng)的用途，其中所述的蛋白聚糖 選自聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、多配體蛋白聚糖-3和II型膠原。
41. 根據(jù)權(quán)利要求31至40中任意一項(xiàng)的用途，其中所述的肌腱病變 選自肌腱炎、腱炎、肌腱變性、腱圍炎、腱鞘炎、腱損傷、腱創(chuàng)傷、腱周 圍炎和paratenonitis。
42.根據(jù)權(quán)利要求31至41中任意一項(xiàng)的用途，其中向選自靈長(zhǎng)類(lèi)、 猴、嚙齒動(dòng)物、羊、兔、狗、豚鼠、馬、牛和貓的患者施用藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供治療肌腱病變的方法。治療或預(yù)防的病癥包括腱炎、肌腱炎、肌腱變性、腱圍炎、腱鞘炎、腱過(guò)度使用損傷和創(chuàng)傷、腱周?chē)?、paratenonitis或其它腱變性病癥。公開(kāi)的治療方法包括向患者施用有效量的、涉及肌腱病變的腱中軟骨或纖維軟骨形成的分子的抑制劑來(lái)治療或預(yù)防腱變性病癥、減緩腱退化、恢復(fù)腱的健康結(jié)構(gòu)、刺激腱的再生、和/或維持腱的質(zhì)量和/或品質(zhì)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101432026SQ200780015676
公開(kāi)日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2007年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月3日
發(fā)明者J·M·阿查姆褒特, S·葉林斯基 申請(qǐng)人:惠氏公司