專利名稱：：抗人Endoglin單鏈抗體及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種抗體，特另'j涉及抗人Endoglin單Mi元體(singlechainvariablefragment,scFv),還涉及i亥scFv的制備方法禾口應用。
背景技術：
：Endoglin又名CD105,是轉(zhuǎn)化生長因子-P(TGF-p)超家族受體復合物的成分之一，調(diào)節(jié)細胞對TGF-p的反應，參與血管生成，在腫瘤組織邊緣部分血管起源的內(nèi)皮細胞上高表達，與腫瘤血管生成存在密切關系，目前已成為腫瘤診斷、治療、抑制腫瘤血管生成的重要生物靶分子。與單克隆抗體相比，scFv具有分子量小、穿透力強、異源性低、體內(nèi)清除快、缺乏Fc段等特點，并具有良好的抗原親和性和穩(wěn)定性，容易穿透致密的腫瘤屏障進入實體瘤周圍的微環(huán)境，在腫瘤的影像診斷和導向治療方面有重要的應用價值。但迄今為止，有關抗人EndoglinscFv的研究才艮道極少。
發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，為克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種抗人EndoglinscFv,其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示;本發(fā)明的目的之二在于提供所述抗人EndoglinscFv的編碼基因。進一步，所述編碼基因，具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明的目的之三在于提供含有所述編碼基因的重組載體。進一步，載體為p藍菌粒載體pCANTAB5E。本發(fā)明的目的之四在于提供一種轉(zhuǎn)化體，將所述重組載體導入宿主大腸桿菌HB2151而得到。本發(fā)明的目的之五在于提供所述抗人EndoglinscFv的放射性核素標記物。進一步，所述》t射性核素為99mTc。本發(fā)明的目的之六在于提供所述抗人EndoglinscFv的制備方法，包括以下步驟a、抗人EndoglinscFv的可溶性表達取權利要求5所述的重組載體，加入大腸桿菌HB2151,于溫度3037。C條件下振蕩培養(yǎng)3060分鐘，接種于SOBAG-N平板上，于溫度28~31。C條件下培養(yǎng)，從平板上挑取陽性克隆，接種于2xYT-AG培養(yǎng)液中，于溫度28~31。C條件下振蕩培養(yǎng)至A,值為0.6~0.8，離心，棄上清，細菌沉淀用2xYT-AI培養(yǎng)液重懸，于溫度2831。C、振蕩速度200-250轉(zhuǎn)/分鐘條件下振蕩培養(yǎng)至少3小時，離心，收集上清，得培養(yǎng)上清液；將細菌沉淀用水冷的lxTES和l/5xTES渦旋振蕩重懸，水上孵育25-35分鐘，離心，收集上清，得周質(zhì)提取液；b、抗人EndoglinscFv的純化取周質(zhì)提取液或/和培養(yǎng)上清，采用抗E-tag親和層析法純化抗人Endoglin單鏈抗體，再將抗人EndoglinscFv的溶解試劑更換為中性pH的磷酸鹽緩沖液，即制4尋純化的抗人EndoglinscFv。本發(fā)明的目的之七在于提供所述抗人EndoglinscFv在制備腫瘤診斷試劑中的應用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明用重組人Endoglin(rhEndoglin)胞外段蛋白成功免疫Balb/c小鼠，提取脾臟組織mRNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)分別擴增出重鏈可變區(qū)(VH)基因和輕鏈可變區(qū)(VL)基因，經(jīng)重疊延伸PCR拼接和擴增scFv基因，再把scFv基因克隆到謹菌粒載體pCANTAB5E,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1,經(jīng)輔助噬菌體M13K07拯救后建成噬菌體表面呈現(xiàn)文庫；用rhEndoglin胞外段蛋白對所得噬菌體表面呈現(xiàn)文庫進行5輪panning淘篩，獲得一個能與rhEndoglin胞外段蛋白特異性結(jié)合的重組噬菌體，測序結(jié)果顯示該scFv基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，為全新序列；將所得重組噬菌體感染大腸桿菌HB2151,經(jīng)IPTG誘導培養(yǎng)5小時，提取細菌周質(zhì)，用抗E-標簽(E-tag)親和層析法純化抗人EndoglinscFv，再將抗人EndoglinscFv的溶解試劑更換為中性pH的磷酸鹽緩沖液，所得抗人EndoglinscFv的分子量約29kD，純度高于95%，親和常數(shù)為(2.14±0.84)xio7L/mol,能與抗rhEndoglin單克隆抗體竟爭性結(jié)合同一抗原表位，且竟爭作用隨scFv濃度增加而加強，能夠識別人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)胞膜表達的Endoglin抗原；將所得抗人EndoglinscFv用MmTc標記后，注射入荷人卵巢癌棵鼠動物模型，單光子發(fā)射型計算機斷層掃描儀(SPECT)觀察到移植卵巢癌的放射性核素顯像，腫瘤組織與非腫瘤組織放射性計數(shù)之比(T/NT值)顯示了抗人EndoglinscFv在荷瘤鼠體內(nèi)的分布特點；以上研究結(jié)果表明本發(fā)明抗人EndoglinscFv具有分子量小、穿透力強、異源性低、體內(nèi)清除快、缺乏Fc段等特點，并具有良好的抗原親和性和穩(wěn)定性，可以作為靶向腫瘤血管內(nèi)皮的導向載體，用于制備腫瘤診斷試劑和免疫治療藥物，在腫瘤臨床診斷和治療方面發(fā)揮重要作用，有著良好的應用前景；本發(fā)明的抗人EndoglinscFv的制備方法簡便易行，產(chǎn)品穩(wěn)定性好、純度高。為了使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述，其中圖1為全套VH基因和VL基因的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；圖2為全套scFv基因的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；圖3為重組噬菌粒pCANTAB5E-scFv的雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；圖4為抗人EndoglinscFv的可溶性表達的十二烷基石克酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定圖；圖5為抗人EndoglinscFv的可溶性表達的蛋白免疫印跡(WesternBlot)鑒定圖；圖6為純化的抗人EndoglinscFv的SDS-PAGE鑒定圖;圖7為抗人EndoglinscFv竟爭性抑制抗rhEndoglin單克隆抗體與rhEndog1in胞外段蛋白的結(jié)合反應曲線圖；圖8為抗人EndoglinscFv與rhEndoglin胞外^殳蛋白的結(jié)合反應曲線圖；圖9為HUVEC原代培養(yǎng)5天的100倍放大顯微圖；圖10為HUVEC的免疫細胞化學(ICC)的400倍放大顯微圖；圖11為HUVEC表達Endoglin的免疫熒光染色鑒定圖；圖12為移植瘤HE染色的400倍放大顯微圖；圖13為移植瘤石蠟切片的免疫組織化學(IHC)的400倍放大顯微圖；圖14為荷瘤鼠尾靜脈注射99mTc標記的抗人EndoglinscFv后3小時的腫瘤顯像圖。具體實施方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、抗人EndoglinscFv喧菌體表面呈現(xiàn)文庫的構(gòu)建1、動物免疫以rhEndoglin胞外^殳蛋白(購自R&D公司)為抗原，免疫體重16~18g的6周齡雌性健康Ba1b/c小鼠(購自中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學實驗動物中心)，免疫步驟如下初次免疫，將抗原與福氏完全佐劑等量混勻后，于小鼠背部皮下多點注射，每只小鼠免疫抗原25|ig;2周后，第二次免疫，將抗原與福氏不完全佐劑等量混勻后，于小鼠背部皮下多點注射，每只小鼠免疫抗原25pg;再2周后，第三次免疫，將不加佐劑的抗原于小鼠腹腔內(nèi)注射，每只小鼠免疫抗原25嗎；再2周后，第四次免疫，將不加佐劑的抗原于小鼠腹腔內(nèi)注射，每只小鼠免疫抗原50pg;再3天后，小鼠尾靜脈采血，采用間接酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定免疫小鼠血清的抗體效價；2、總RNA的提取將步驟1免疫成功的小鼠脫頸稚處死，立即于無菌狀態(tài)下取出脾臟，采用Trizol試劑(購自invitrogen公司)提取脾臟組織總RNA，按照試劑說明書操作；再采用UNIQ-10柱式mRNA抽提純化試劑盒(購自上海生工生物工程技術有限公司)從所得總RNA中提取純化mRNA,按照試劑盒說明書操作；3、全套VH基因和VL基因的擴增以步驟2所得純化的mRNA為模板，以PrimedFirst-StrandMix(購自Pharmacia公司)為反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA第一鏈；采用小鼠scFv試劑盒(購自Pharmacia公司)，分別進行全套VH基因和VL基因的PCR擴增，以所得cDNA第一鏈為模板，以重鏈引物混合物或輕鏈引物混合物為引物，反應條件為溫度94。C變性1分鐘，55。C退火2分鐘，72。C延伸2分鐘，共30個循環(huán)；PCR產(chǎn)物釆用質(zhì)量百分濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，結(jié)果如圖1所示，其中DL2000泳道為DNA分子量標準，VH泳道為全套VH基因的PCR產(chǎn)物，VL泳道為全套VL基因的PCR產(chǎn)物，從圖可知，全套VH基因的PCR產(chǎn)物在約340bp的位置出現(xiàn)一條特異性DNA條帶，全套VL基因的PCR產(chǎn)物在約325bp的位置出現(xiàn)一條特異性DNA條帶，與預期結(jié)果相符；鑒定正確的PCR產(chǎn)物采用B型小量DNA片段快速膠回收試劑盒(購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司)進行純化，按照試劑盒說明書操作，選擇約340bp和325bp的目的片段進行切膠回收，獲得純化的全套VH基因和VL基因，用紫外分光光度計定量；4、全套scFv基因的構(gòu)建和擴增采用小鼠scFv試劑盒進行全套scFv基因的構(gòu)建和擴增，以步驟3所得純化的全套VH基因和VL基因為模板，以連接引物混合物(與VH基因的3，端和VL基因的5，端互補)為引物，將三者等摩爾混合后進行重疊延伸反應，從而將VH基因和VL基因隨機拼接為scFv基因，反應條件為溫度94'C變性1分鐘，63。C延伸4分鐘，共7個循環(huán)；再以所得全套scFv基因為模板，以RS引物混合物(RSPrimerMix,包括帶有SfiI酶切位點的VH基因5'端引物和帶有NotI酶切位點的VL基因3'端引物)為引物，進行全套scFv基因的PCR擴增，反應條件為溫度94。C變性1分鐘，55。C退火2分鐘，72。C延伸2分鐘，共30個循環(huán)；PCR產(chǎn)物采用質(zhì)量百分濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，結(jié)果如圖2所示，其中DL2000泳道為DNA分子量標準，scFv泳道為全套scFv基因的PCR產(chǎn)物，從圖可知，全套scFv基因的PCR產(chǎn)物在約750bp的位置出現(xiàn)一條特異性DNA條帶，與預期結(jié)果相符；鑒定正確的PCR產(chǎn)物采用B型小量DNA片段快速膠回收試劑盒進行純化，按照試劑盒說明操作，選擇約75Qbp的目的片段進行切膠回收，獲得純化的全套scFv基因，用紫外分光光度計定量；5、全套scFv基因的克隆將步驟4所得純化的全套scFv基因用SfiI和NotI限制性內(nèi)切酶(購自Takara公司)雙酶切，再與同樣經(jīng)SfiI和NotI雙酶切的噬菌粒載體pCANTAB5E(由北京軍事醫(yī)學科學院提供)進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TG1感受態(tài)細胞，接種于S0BAG瓊脂板(取胰蛋白胨20g、酵母提取物5g、氯化鈉0.5g、瓊脂15g，加入蒸餾水900mL使溶解，高壓滅菌，待冷卻至溫度5060。C時，加入無菌的濃度為1mmol/L的氯化鎂溶液10mL、濃度為2mmol/L的葡萄糖溶液55.6mL、濃度為20g/L的氨千青霉素5mL，用蒸餾水補足體積至1000mL，立即鋪板，即得)上，于溫度30。C過夜培養(yǎng)，隨機挑取9個菌落，提取噬菌粒，用SfiI和NotI雙酶切，雙酶切產(chǎn)物釆用質(zhì)量百分濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，結(jié)果如圖3所示，其中l(wèi)kb泳道為1kbLadder(DNA分子量標準)，DL2000泳道為DNA分子量標準，1~9泳道分別為9個隨機菌落提取的噬菌粒的雙酶切產(chǎn)物，從圖可知，9個隨機菌落提取的噬菌粒的雙酶切產(chǎn)物均在約750bp的位置出現(xiàn)一條特異性DM條帶，表明重組噬菌粒pCANTAB5E-scFv構(gòu)建成功，全套scFv基因克隆成功；6、scFv噬菌體表面呈現(xiàn)文庫的構(gòu)建收集步驟5所得陽性克隆菌落，用2xYT-AG培養(yǎng)液(取胰蛋白胨l7g、酵母提取物IOg、氯化鈉5g，加入蒸鎦水900mL使溶解，高壓滅菌，待冷卻至溫度50~60。C時，加入無菌的濃度為400g/L的葡萄糖溶液50mL、濃度為20g/L的氨芐青霉素5mL，用蒸餾水補足體積至1000mL，即得)稀釋細菌至A,值為0.3,于溫度37。C、振蕩速度250r/min條件下培養(yǎng)l小時，按感染復數(shù)M0卜5加入輔助，寇菌體M13K07(購自Pharmacia公司)，于溫度37°C、振蕩速度250r/min條件下培養(yǎng)l小時，1000g離心10分鐘，棄上清，細菌沉淀用10mL2xYT-AK培養(yǎng)液(取胰蛋白胨17g、酵母提取物10g、氯化鈉5g,加入蒸餾水900mL使溶解，高壓滅菌，待冷卻至溫度5060。C時，加入無菌的濃度為20g/L的氨芐青霉素5mL、濃度為10g/L的卡那霉素5mL,用蒸餾水補足體積至1000mL,即得)重懸，于溫度37。C、振蕩速度250r/min條件下培養(yǎng)過夜，1000g離心20分鐘，收集上清，加入相當于0.2倍上清體積的PEG/NaCl(由質(zhì)量百分濃度為20%的聚乙二醇8000和濃度為2.5mol/L的氯化鈉組成)，冰浴30~60分鐘，于溫度4。C條件下10000g離心20分鐘，棄上清，噬菌體沉淀用16mL2xYT培養(yǎng)液(取胰蛋白胨17g、酵母提取物10g、氯化鈉5g,加入蒸餾水900mL使溶解，蒸餾水補足體積至1000mL，高壓滅菌，即得)重懸，即得抗人EndoglinscFv喧菌體表面呈現(xiàn)文庫。二、抗人EndoglinscFyp藍菌體的淘篩(panning)第一輪淘篩(吸附-洗脫-擴增)在25cii^培養(yǎng)瓶中，加入濃度為lO^g/mL的rhEndoglin胞外段蛋白溶液5mL,于溫度4。C包被過夜，棄去液體，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗并瓦3次，加入封閉液(含有濃度為100g/L的脫脂奶的PBS)至裝滿培養(yǎng)瓶，于室溫下封閉l小時，棄去液體，PBS洗瓶3次；在所得的抗人EndoglinscFv噬菌體表面呈現(xiàn)文庫中，加入含有質(zhì)量百分濃度為0，01%的疊氮化鈉的封閉液14mL，于室溫下孵育10-15分鐘，取20mL加于上述培養(yǎng)瓶中，于溫度37。C孵育2小時使scFv噬菌體與rhEndoglin胞外段蛋白特異性結(jié)合，棄去液體，PBS洗瓶20次，含有質(zhì)量百分濃度為0.1%的吐溫-20的PBS洗瓶20次以洗去未結(jié)合的scFv噬菌體，加入對數(shù)生長期的大腸桿菌TG110mL，于溫度37°C、振蕩速度250r/min條件下培養(yǎng)1小時使吸附的scFv噬菌體感染TG1細胞，轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，加入氨千青霉素至終濃度為100pg/mL，加入葡萄糖至最終質(zhì)量百分濃度為2%，加入4xl(Tpfu的M13K07,于溫度37。C、振蕩速度250r/min條件下培養(yǎng)l小時以擴增scFv噬菌體，進行下一輪淘篩；按第一輪淘篩方法重復進行五輪淘篩，在第二輪和第三輪淘篩中用濃度為5網(wǎng)/mL的rhEndoglin胞外段蛋白溶液進行包被，在第四輪和第五輪淘篩中用濃度為2.5pg/mL的rhEndoglin胞外段蛋白溶液進行包被；經(jīng)過五輪淘篩，與rhEndoglin胞外段蛋白特異性結(jié)合的抗人EndoglinscFv噬菌體得到高度富集。三、抗人EndoglinscF"藍菌體的鑒定1、抗原結(jié)合活性鑒定將所得抗人EndoglinscFv噬菌體感染TGI細胞，作倍比稀釋，涂布于S0AGB瓊脂板上，于溫度3(TC培養(yǎng)過夜，隨機挑取94個菌落，分別接種于2xYT-AG培養(yǎng)液400pL中，于溫度30。C、振蕩速度250r/min條件下培養(yǎng)過夜，各取菌液40pL，分別加入含有密度為5x108pfu/mL的M13K07的2xYT-AG培養(yǎng)液400pL，于溫度37。C、振蕩速度150r/min條件下培養(yǎng)2小時，1500g離心20分鐘，棄上清，沉淀用2xYT-八K培養(yǎng)液400pL重懸，于溫度37。C、振蕩速度250r/min條件下培養(yǎng)過夜，1500g離心20分鐘，取上清，即得94個scFv嗟菌體克隆(單個克隆)；采用間接ELISA法鑒定上述94個scFv噬菌體克隆的抗原結(jié)合活性，設樣品組、陰性對照組和陽性對照組，樣品組以rhEndoglin月包外,史蛋白為包^皮抗原，以所得各上清和封閉液于室溫下孵育10分鐘的混合物為第一抗體，以辣才艮過氧化物酶(HRP)標記的羊抗M13單克隆抗體為第二抗體，以2，2'-連氮-雙(3-乙基苯并遂唑-6-磺酸)(ABTS)顯色，測量405nm波長處的吸光度A值；陰性對照組以封閉液包被，其余操作同樣品組；陽性對照組以Pharmacia公司提供的陽性抗原為包被抗原，以陽性對照噬菌體為第一抗體，其余操作同樣品組；樣品組A值大于或等于陰性對照組A值2.1倍者判為陽性；結(jié)果陰性對照組的A柳值為0.216,陽性對照組的A柳值為1.301，94個scFv噬菌體克隆的A柳值見表1，其中37個scFv噬菌體克隆呈現(xiàn)陽性反應，其A^值在0.458~1.109之間，陽性率為39.36%。表l、94個scFv噬菌體克隆與rhEndoglin胞外段蛋白的結(jié)合活性鑒定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2、序列測定取前述ELISA法鑒定Aw值最高的抗人EndoglinscFv噬菌體克隆，提取質(zhì)粒，委托上海生工生物工程技術有限公司進行序列測定；結(jié)果抗人EndoglinscFv的基因全長為738bp,如SEQIDNo.1所示，共編碼246個氨基酸殘基，其中，VH基因為366bp，編碼122個氨基酸殘基，位于scFv的氨基(N)端；VL基因為327bp，編碼109個氨基酸殘基，位于scFv的羧基(C)端；VH基因與VL基因之間通過45bp的連接序列(編碼15個氨基酸殘基)進行連接；經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢，本發(fā)明抗人EndoglinscFv的氨基酸序列(如SEQIDNo.2所示)未見報道，為全新序列。四、抗人EndoglinscFv的可溶性表達及純化1、抗人EndoglinscFv的可溶性表達取抗人EndoglinscFv嗟菌體2pL,加入對數(shù)生長期的大腸桿菌HB2151400HL，于溫度37°C、振蕩速度150r/min條件下培養(yǎng)30分鐘，劃線接種于SOBAG-N平板(取胰蛋白胨20g、酵母提取物5g、氯化鈉0.5g、Bacto-agar細菌瓊脂15g,加入蒸餾水900mL使溶解，高壓滅菌，待冷卻至溫度5560。C時，加入無菌的濃度為1mol/L的氯化鎂溶液10mL、濃度為2mol/L的葡萄糖溶液6mL、濃度為20g/L的氨千青霉素5mL、終濃度為100mg/L的萘啶酮酸，用蒸餾水補足體積至1000mL，立即鋪板，即得)上，于溫度3(TC培養(yǎng)至長出單菌落,從平板上隨機挑取4個克隆，設為4個樣品組單個克隆接種于2xYT-AG培養(yǎng)液5mL中，于溫度3(TC、振蕩速度250r/min條件下培養(yǎng)過夜，再轉(zhuǎn)移至新鮮2xYT-AG培養(yǎng)液50mL中，于溫度3(TC、振蕩速度250r/min條件下培養(yǎng)至A礙值為0.6~0.8，1500g離心20分鐘，棄上清；樣品組2~4的細菌沉淀用新鮮2xYT-AI培養(yǎng)液(取胰蛋白胨17g、酵母提取物10g、氯化鈉5g,加入蒸餾水900mL使溶解，高壓滅菌，待冷卻至溫度506(TC時，加入無菌的濃度為20g/L的氨芐青霉素5mL、終濃度為1鵬ol/L的異丙基-B-D硫代半乳糖苷即IPTG，用蒸餾水補足體積至1000mL，即得)50mL重懸，于溫度30°C、振蕩速度250r/min條件下培養(yǎng)，樣品組2培養(yǎng)3小時、樣品組3培養(yǎng)5小時，樣品組4培養(yǎng)7小時；樣品組1的細菌沉淀用未加入IPTG的新鮮2xYT-AI培養(yǎng)液重懸，于溫度3(TC、振蕩速度250r/min條件下培養(yǎng)5小時；將每個樣品組的培養(yǎng)物等分到兩個離心管中，1500g離心20分鐘，取兩管上清合為一管(此為培養(yǎng)上清，標記為A)，用孔徑為O.45nm的微孔濾膜過濾，濾液置溫度-20。C保存，備用；將其中一管沉淀用水冷的lxTES(由濃度為0.2mol/L、pH值為8.0的Tris-HC1緩沖液、濃度為0.5mmol/L的乙二胺四乙酸溶液、濃度為0.5moi/L的蔗糖溶液組成，過濾除菌，即得)0.5mL重懸，再加入冰冷的1/5xTES(將1xTES用蒸餾水稀釋5倍，即得)0.75mL渦旋，冰浴30分鐘，12000g離心10分鐘，取上清(此為周質(zhì)提取液，標記為B)，置溫度-2(TC保存，備用；將另一管沉淀用PBS0.5mL重懸，煮沸5分鐘，12000g離心10分鐘，取上清(此為全菌提取液，標記為C)，置溫度-2(TC保存，備用；將上述所得細菌各部提取液用SDS-PAGE進行鑒定，以判斷抗人EndoglinscFv產(chǎn)生和集中的部位，結(jié)果如圖4所示，marker泳道為低分子量標準蛋白(購自Takara公司)，1~4為樣品組1~4，A、B、C泳道分別為培養(yǎng)上清、周質(zhì)提取液、全菌提取液；從圖可知，未經(jīng)IPTG誘導的全菌提取液未見預期條帶；經(jīng)IPTG誘導培養(yǎng)3小時的培養(yǎng)上清和周質(zhì)提取液中均可見到約29kD條帶，與預期分子量大小相符，而全菌提取液中未見預期條帶，說明抗人EndoglinscFv集中在培養(yǎng)上清和細菌周質(zhì)，且周質(zhì)中抗人EndoglinscFv的表達量高于培養(yǎng)上清；隨著誘導培養(yǎng)時間的延長，周質(zhì)提取液中抗人EndoglinscFv的表達量增加明顯，培養(yǎng)5小時達到高峰，而培養(yǎng)上清中抗人EndoglinscFv的表達量變化不大；根據(jù)上述SDS-PAGE鑒定結(jié)果，將經(jīng)IPTG誘導培養(yǎng)5小時的樣品蛋白轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，用抗E-tag單克隆抗體(購自Pharmacia公司)進行WesternBlot鑒定(重組噬菌粒pCANTAB5E-scFv使合成的抗人EndoglinscFv的C端帶有E-tag，可被抗E-tag單克隆抗體識別)，結(jié)果如圖5所示，M泳道為低分子量標準蛋白，A、B、C泳道分別為經(jīng)IPTG誘導培養(yǎng)5小時的培養(yǎng)上清、周質(zhì)提取液和全菌提取液；從圖可知，培養(yǎng)上清和周質(zhì)提取液在約29kD處出現(xiàn)預期的蛋白免疫印跡條帶，而全菌提取液中未見預期條帶，說明抗人EndoglinscFv產(chǎn)生的位置集中在培養(yǎng)上清和細菌周質(zhì)，且周質(zhì)中抗人EndoglinscFv的表達量明顯高于培養(yǎng)上清；2、抗人EndoglinscFv的純J匕按照步驟1所述方法制備大量經(jīng)IPTG誘導培養(yǎng)5小時的菌液，提取細菌周質(zhì)，采用HiTrapAnti-ETag柱(購自Pharmacia7>司)親和層析純化抗人EndoglinscFv,按照色譜柱說明書操作，抗人EndoglinscFv在中性pH時與Anti-ETag柱結(jié)合，降低pH時可被輕+>洗脫，^f旦溶解在洗脫液(濃度為1.0mol/L、pH值為3.0的甘氨酸緩沖液)中的抗人EndoglinscFv易在凍存過程中形成多聚體，因此，采用HiTrapDesalting柱(購自Pharmacia公司)將抗人EndoglinscFv的溶解試劑由洗脫液更換為磷酸鹽緩沖液(包含濃度為12mmol/L的磷酸鹽、濃度為140mmol/L的氯化物、質(zhì)量百分濃度為0.05%的疊氮化鈉，pH值為7.4)，按照色譜柱說明書操作，即制得純化的抗人EndoglinscFv,置溫度-20。C保存，備用；純化的抗人EndoglinscFv用SDS-PAGE進行鑒定，并用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析其純度，結(jié)果如圖6所示，M泳道為低分子量標準蛋白，1泳道為未經(jīng)IPTG誘導培養(yǎng)的周質(zhì)提取液，2泳道為經(jīng)IPTG誘導培養(yǎng)5小時的周質(zhì)提取液，3為純化的抗人EndoglinscFv;乂人圖可知，純化處理后的抗人EndoglinscFv的純度高，凝膠灰度掃描分析其純度高于95%;純化的抗人EndoglinscFv經(jīng)聚乙二醇8000濃縮后，采用Bradford法蛋白定量試劑盒(購自上海捷瑞生物工程有限公司)測得其濃度為1.12mg/mL。五、抗人EndoglinscFv的鑒定1、相對抗原結(jié)合活性鑒定采用竟爭性ELISA法鑒定抗人EndoglinscFv竟爭性抑制抗rhEndoglin單克隆抗體與rhEndoglin胞外段蛋白的結(jié)合反應情況，設樣品組、陰性對照組和空白對照組，每組設雙復孔，樣品組將rhEndoglin胞外段蛋白用濃度為O.05mol/L、pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋，制成濃度為2.5pg/mL的包被液，加至96孔反應板中，每孔100iuL，置溫度4。C包被過夜后，棄去包被液，洗板3次，加入封閉液I(即質(zhì)量百分濃度為3%的脫脂乳)，每孔300|iL,置溫度4。C封閉過夜，棄去封閉液I,洗板3次；取經(jīng)IPTG誘導培養(yǎng)5小時的周質(zhì)提取液，與等體積封閉液I混合，于室溫孵育10分鐘，fl不同體積(100、80、60、40、20、10^L)加至封閉后的反應孔中，并用PBS補足體積至100jLiL,于溫度37。C孵育60分鐘，棄去封閉的周質(zhì)提取液，洗板3次，加入用PBS稀釋的濃度為10(ig/niL的抗rhEndoglin單克隆抗體(購自R&D公司)，每孔IOO^L，于溫度37。C孵育60分鐘，棄去抗體液，洗板3次，加入稀釋度為l:5000的HRP標記的羊抗小鼠IgG(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)，每孔IOOiaL，于溫度37。C孵育60分鐘，棄去標記抗體液，洗才反3次，加入ABTS顯色液，每孔10GjiL，于室溫孵育20分鐘，加入濃度為2mol/L的好u酸50^L終止反應；陰性對照組不加入封閉的周質(zhì)提取液，其余操作同樣品組；空白對照組不加入封閉的周質(zhì)提取液，并用PBS替代抗rhEndoglin單克隆抗體，其余^喿作同樣品組；用酶標4義測量405nm波長處的吸光度A值，結(jié)果以雙復孔均值表示，按下述公式計算抑制率抑制率(y。H[(陰性對照組A值-樣品組A值)/陰性對照組A值]xl00%,并作竟爭抑制曲線；結(jié)果如圖7所示，經(jīng)IPTG誘導培養(yǎng)5小時的周質(zhì)提取液中的抗人EndoglinscFv能與抗rhEndoglin單克隆抗體竟爭性結(jié)合同一抗原表位，且竟爭作用隨周質(zhì)提取液的體積增加而增強，表明竟爭作用隨抗人EndoglinscFv量的增加而增強。2、抗原(rhEndoglin胞外段蛋白)結(jié)合活性鑒定采用間接ELISA法測定抗人EndoglinscFv的功能性親和常數(shù)，將rhEndoglin胞外段蛋白用濃度為O.05mol/L、pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋，分別制成濃度為5、2.5、1.25、0.625網(wǎng)/mL的包被液，加至96孔反應板中，每孔IOOpL，每個濃度設14個復孔，置溫度4。C包被過夜后，棄去包被液，洗板3次，加入封閉液I，每孔300iuL,置溫度4。C封閉過夜，棄去封閉液I，洗板3次；將純化的抗人EndoglinscFv用PBS稀釋，分別制成濃度為IO、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625i!g/mL的溶液，加至封閉后的反應孔中，每孔IOO|tiL，每個濃度設雙復孔，于溫度37。C孵育60分鐘，棄去scFv液，洗板3次，加入稀釋度為l:5000的HRP標記的抗E-tag單克隆抗體(購自Pharmacia公司)，每孑L100iiL,于溫度37。C賻育60分鐘，棄去標記抗體液，洗板3次，加入ABTS顯色液，每孔100(xL，于室溫孵育20分鐘，加入濃度為2mol/L的^l酸50^L終止反應；用酶標儀測量405nm波長處的吸光度A值，結(jié)果以雙復孔均值表示，作抗人EndoglinscFv與rhEndoglin胞外段蛋白的結(jié)合反應曲線，計算抗人EndoglinscFv的功能性親和常數(shù)；結(jié)果如圖5所示，參照Beatty等建立的方法[Measurementofmonoclonalantibodyaffinitybynon-competitiveenzymeimmunoassay.BeattyJD，BeattyBG,VlahosWG.JImmunolMethods,100(1—2):173~179,1987.],以5%遞減法確定出四條曲線的結(jié)合反應平臺期，四條曲線的rhEndog1in胞外段蛋白濃度之比為8:4:2:1,通過作圖法取各濃度最大A值一半(即A50。/。)處對應的抗人EndoglinscFv的濃度，rhEndoglin胞外,爻蛋白在濃度分別為5pg/mL、2.5(ig/mL、1.25pg/mL、0.625(ag/mL時，其結(jié)合反應曲線A50%處對應的抗人EndoglinscFv的濃度分別為O.813pg/mL(2.80xl()-8mol/L)、0.599(ig/mL(2.07x10—W/L)、0.664pg/mL(2,29xl(T8mol/L)、0.833(ig/mL(2.87xl(T8mol/L);根據(jù)下述公式計算親和常數(shù)親和常數(shù)(K)=(n-l)/2(nAb'-Ab),式中，Ab和Ab'分別表示當抗原濃度為Ag和Ag'時，產(chǎn)生半數(shù)吸光值(A50%)的抗體濃度(mol/L),n=Ag/Ag';兩兩比較，當11=2時，可得3個K值，分別為K,3.73xl07L/mol，K2=l,99xl07L/mol,K3=l.45x107L/mol;當n:4時，可得2個K值，分別為K產(chǎn)2.36x107L/mol,K產(chǎn)l.59x107L/mol;當n:8時,可得1個K值，K6=1.74xio7L/mol;計算得到6個K值的均值為(2.14±0.84)x107L/mol,即抗人EndoglinscFv的功能性親和常數(shù)為(2.14±0.84)xl07L/mol,表明抗人EndoglinscFv具有較強的抗原結(jié)合活性。3、抗原(天然Endoglin)結(jié)合活性鑒定采用間接免疫熒光染色法鑒定抗人EndoglinscFv與天然Endoglin結(jié)合的能力，分離HUVEC，以細胞密度為lx1(T細胞/mL接種于放有蓋玻片(預先用多聚賴氨酸包被)的12孔板中，用內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液(ECM,購自Sciencell公司)于溫度37。C、(:02氣體體積百分濃度為5%的條件下培養(yǎng)，每48小時更換培養(yǎng)液1次，培養(yǎng)5天后細胞達到80%匯合，收集細胞爬片，用濃度為O.01mol/L的PBS漂洗3次，再用質(zhì)量百分濃度為4。/。的多聚曱醛溶液于溫度4。C固定30分鐘，經(jīng)VI1I因子相關抗原ICC染色鑒定培養(yǎng)細胞為HUVEC后，以可溶性抗人EndoglinscFv為第一抗體、抗E-tag單克隆抗體為第二抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗小鼠IgG為第三抗體作間接免疫熒光染色，用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復染細胞核，激光共聚焦顯微鏡檢測，同時設陰性對照(以PBS替代第一抗體)和陽性對照(以抗rhEndoglin單克隆抗體為第一抗體)；結(jié)果如圖9所示，原代培養(yǎng)5天的HUVEC呈單層"鋪路石樣"生長；如圖IO所示，培養(yǎng)細胞經(jīng)V111因子相關抗原ICC染色，胞漿內(nèi)可見呈陽性的棕黃色顆粒，證實培養(yǎng)細胞為HUVEC;如圖ll所示，A和B為抗人EndoglinscFv，C和D為陰性對照，E和F為陽性對照，A、C和E未用DAPI復染細月包核，B、D和F用DAPI復染細胞核，從圖可知，抗人EndoglinscFv能夠識別HUVEC胞膜上表達的Endoglin抗原，表現(xiàn)為胞膜上彌漫性綠色熒光點。六、抗人EndoglinscFv在制備肺瘤i貪斷試劑中的應用1、荷人卵巢癌棵鼠動物模型的構(gòu)建取人卵巢漿液性乳頭狀嚢腺癌細胞系SK0V3(購自中國科學院細胞庫)，用RPMI-1640培養(yǎng)液(含有濃度為100(ig/mL的青霉素、濃度為100pg/mL的鏈霉素、質(zhì)量百分濃度為10%的胎牛血清)于溫度37。C、C02氣體體積百分濃度為5%的條件下培養(yǎng)，每48小時更換培養(yǎng)液l次，培養(yǎng)至80%匯合，收集細胞，用生理鹽水漂洗2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄上清，臺盼藍染色，活細胞計數(shù)大于90%,用生理鹽水調(diào)節(jié)細胞懸液至細胞密度為1.0~3.0x1(T細胞/mL;取細胞懸液200|iL,于體重16~18g的4周齡SPF級雌性4果鼠(購自中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學實驗動物中心)右前肢腋窩皮下接種，接種棵鼠于SPF級環(huán)境下繼續(xù)喂養(yǎng)，待腫瘤長到直徑810mm時用于后續(xù)實驗；2、移植瘤的鑒定取荷瘤鼠，脫頸推處死，解剖，得移植瘤，如圖14A所示，肉眼觀察，移植瘤表面為灰白色或淡紅色，凹凸不平或呈分葉狀，分界清楚，質(zhì)韌；將移植瘤用體積百分濃度為10%的福爾馬林溶液固定，按常規(guī)方法制備石蠟切片(4jum)并行HE染色，于光鏡下觀察，結(jié)果如圖12所示，細胞大小形態(tài)不一，極性紊亂，呈巢狀或片狀排列；胞漿豐富，嗜酸性，空泡變性；胞核大，卵圓形，可見核分裂像(如圖中箭頭所示)；符合卵巢癌移植瘤的特點，表明移植瘤接種成功；取棵鼠移植瘤組織石蠟切片，行免疫組織化學(IHC)鑒定，將棵鼠移植瘤組織石蠟切片脫蠟和水化后，PBS漂洗3次，用pH值為6.0的檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復，滴加體積百分濃度為3%的過氧化氫溶液50pL，于室溫下孵育IO分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS漂洗3次，甩去PBS，滴加體積百分濃度為10%的正常山羊血清50pL，于室溫下孵育15分鐘，以封閉非特異性抗原，甩去血清，滴加濃度為10)Lig/fflL的抗人EndoglinscFv50pL,于室溫下孵育1小時，溫度4。C孵育過夜，PBS漂洗3次，甩去PBS,滴加稀釋度為1:100的抗E-tag單克隆抗體，于室溫下孵育1小時，PBS漂洗3次，甩去PBS,滴加生物素標記的第二抗體，于室溫下孵育l小時，PBS漂洗3次，甩去PBS，滴加HRP標記的鏈白卵素，于室溫下孵育1小時，PBS漂洗3次，甩去PBS，滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液10QfiL,于室溫下孵育IO分鐘，自來水沖洗終止反應，蘇木精復染，體積百分濃度為1%的鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二曱苯透明，中性樹膠封片；同時設陰性對照(以PBS替代抗人EndoglinscFv和抗E-tag單克隆抗體)；于光鏡下觀察；結(jié)果如圖13所示，A為陰性對照，B為抗人EndoglinscFv，箭頭指示移植瘤組織內(nèi)血管，從圖可知，陰性對照的^菩ctl古細H白B白JM:去l.卩0,W:善多.'A始.人Fnr1n(r1insr;v"SJV乂tX別；f多才直瘤中血管內(nèi)皮細胞胞膜上表達的Endog1in抗原，使內(nèi)皮細胞胞膜呈陽性著色，表明抗人EndoglinscFv與小鼠移植瘤的血管內(nèi)皮有交叉反應；3、抗人EndoglinscFv的"mTc標記采用預亞錫直接標記法進行標記，取注射用亞錫亞曱基二膦酸鹽(MDP，購自上海醫(yī)科大學紅旗制藥廠)，用生理鹽水溶解制成濃度為2.5mg/mL的溶液；取抗人EndoglinscFv1mg,加入上述MDP溶液40fiL，加入i文射性活度為37MBq的高锝r"c]酸鈉注射液(購自中國原子能科學研究院同位素研究所)150pL,混勻，于室溫下》文置5分鐘，即得99mTc標記的抗人EndoglinscFv,用紙層析法測定標記率為83%;4、99mTc標記的抗人EndoglinscFv的腫瘤放射免疫顯像將荷人卵巢癌棵鼠隨機分為樣品組和對照組，樣品組9只，對照組3只；樣品組每只荷瘤鼠尾靜脈注射99mTc標記的抗人EndoglinscFv100(3700KBq/80(ig抗人EndoglinscFv)，對照組每只荷瘤鼠尾靜脈注射99mTc3700KBq;再用質(zhì)量百分濃度為0.1%的戊巴比妥鈉溶液于荷瘤鼠腹腔內(nèi)注射，注射劑量為30mg/kg體重，麻醉荷瘤鼠后，用MillenniumSPECT儀(購自美國GE公司)觀察腫瘤顯像情況，顯像參數(shù)為釆集矩陣128x128，窗寬20%，放大系數(shù)2.67，能量140Kev,靜態(tài)采集15min;樣品組荷瘤鼠又隨機分成3組，每組3只，分別在注射99mTc標記的抗人EndoglinscFv后1小時、3小時和6小時脫頸推處死1組小鼠，取眼球后血、心、肺、肝、脾、腎、胃、腸、肌肉、后大腿骨骼和腫瘤等組織器官，用濾紙吸干表面血液，稱量標本濕重，用GC-911型y放射免疫計數(shù)器(購自安徽科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)測定各組織的放射性計數(shù)，計算T/NT值；結(jié)果注射^Tc標記的抗人EndoglinscFvl小時后，樣品組小鼠的腫瘤部位均有不同程度顯像，注射3小時后顯像最為清晰；而對照組小鼠的腫瘤部位未見顯像；如圖14所示，A為顯像體位和腫瘤部位；B為放射免疫顯像，左邊為樣品組小鼠，箭頭指示顯像的腫瘤，右邊為對照組小鼠，其腫瘤部位未見顯像；C為陰性對照；衡Tc標記的抗人EndoglinscFv在荷瘤鼠體內(nèi)的分布見表2，注射^Tc標記的抗人EndoglinscFvl小時后，荷瘤鼠心、肺、肝、脾的放射活性較高，血本底亦較高；注射3小時后，大部分臟器的T/NT值達到最高，腎臟T/NT值較低提示腎臟內(nèi)的放射性計數(shù)高于肺瘤組織，可能與放射性藥物從腎臟濾過有關。表2、注射'^Tc標記的抗人EndoglinscFv后不同時間荷瘤鼠各臟器的T/NT值(^±s,n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>上述實-險結(jié)果表明抗人EndoglinscFv可以作為l巴向腫瘤血管內(nèi)皮的導向載體，用于制備腫瘤診斷試劑，在腫瘤臨床診斷方面發(fā)揮重要作用，有著良好的應用前景。當然，制備抗人EndoglinscFv的放射性核素標記物時，》丈射性核素可選自131I、"'In、，Tc中的一種，均能達到發(fā)明目的。因，Tc具有良好的物理特性，半衰期短(約6小時)，能量低(140Kev)，用其標記scFv可提高T/NT值，改善腫瘤顯像質(zhì)量，故優(yōu)選^Tc。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。序列表<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學<120〉抗人Endoglin單鏈抗體及其制備方法和應用<160>2<210>1<211>738<212>腿<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)...(738)<220〉<223>人工序列的描述抗人Endoglin單鏈抗體的編碼基因<400>1gcccagccggccatggcccaggtgaaactgcagcagteagggget45AlaGinProAlaMetAlaGinValLysLeuGinGinSerGlyAla151015gaactggcaagacctggggccteagtgaagatgtectgcaagact90GluLeuAlaArgProGlyAlaSerValLysMetSerCysLysThr202530tctggctacacctUactagecacacgatgcactgggtaaaacag135SerGlyTyrThrPheThrSerHisThrMetHisTrpValLysGin354045aggcctggacagggtctggaatggattggatatattaatcctage180ArgProGlyGinGlyLeuGluTrplieGlyTyrlieAsnProSer505560agtgattatactaattacgatcagaagttcaaggacaaggccaca225SerAspTyrThrAsnTyrAspGinLysPheLysAspLysAlaThr657075ttgactLeuThrgcaAlagacAspa汪aLys80tecSertecSeraacAsnacaThrgccAla85tacTyrEttaliecaaGinctgLeuageSer90270agectgSerLeuacaThrtctSergagGlu95gacAsptctSergcaAlagtcValtttPhe100tacTyrtgtCysgcaAlaaggArgggcGly105315gttaacValAsncctProtttPhegetAla110tacTyrtggTrpggcGlycaaGingggGly115accThracgThrgtcValaccThrgtcVal120360tecteaSerSerggtGlyggaGlyggcGly125ggtGlyteaSerggcGlyggaGlyggtGly130ggcGlytctSerggcGlyggtGlyggcGly135405ggatcgGlySergatAspateliegagGlu140etcLeuactThrcagGintctSerccaPro145gcaAlalieatgMettctSergcaAla150450tctccaSerProgggGlygagGluaagLys155gtcValaccThratalietecSertgcCys160agtSergccAlaageSerteaSeragtSer165495ataagtlieSertacTyratgMettatTyr170tggTrpUcPhecagGincagGinaagLys175ccaProggcGlyactThrtctSercccPro180540aaaetcLysLeutggTrpattlietatTyr185ageSeracaThrtecSeraacAsnctgLeu190getAlatctSerggaGlygtcValcctPro195585getcgcAlaArgUcPheagtSerggcGly200agtSerggaGlytctSergggGlyaccThr205tctSertacTyrtctSeretcLeuacaThr210630ateagecgattggaggetgaagatgetgccacttattactgccag675lieSerArgLeuGlu215caaaggagtacttacGinArgSerThrTyr230gaaataaaaegggcgGlulieLysArgAla245<210>2<211>246<212〉PRT<213〉人工序列<220><223>人工序列的描述抗人Endoglin單鏈抗體<400>2AlaGinProAlaMetAlaGinValLysLeuGinGinSerGlyAla151015GluLeuAlaArgProGlyAlaSerValLysMetSerCysLysThr202530SerGlyTyrThrPheThrSerHisThrMetHisTrpValLysGin354045ArgProGlyGinGlyLeuGluTrplieGlyTyrlieAsnProSer505560SerAspTyrThrAsnTyrAspGinLysPheLysAspLysAlaThr657075LeuThrAlaAspLysSerSerAsnThrAlaTyrlieGinLeuSer808590SerLeuThrSerGluAspSerAlaValPheTyrCysAlaArgGly95100105ValAsnProPheAlaTyrTrpGlyGinGlyThrThrValThrVal110115120SerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGly125130135GlySerAsplieGluLeuThrGinSerProAlalieMetSerAla24AlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysGin220225ccacccacgUcggaggggggaccaagctg720ProProThrPheGlyGlyGlyThrLysLeu235240gec738Ala140SerProGlyGluLysVal155lieSerTyrMetTyrTrp170LysLeuTrplieTyrSer185AlaArgPheSerGlySer200lieSerArgLeuGluAla215GinArgSerThrTyrPro230GlulieLysArgAlaAla245145150ThrlieSerCysSerAlaSerSerSer160165PheGinGinLysProGlyThrSerPro175180ThrSerAsnLeuAlaSerGlyValPro190195GlySerGlyThrSerTyrSerLeuThr205210GluAspAlaAlaThrTyrTyrCysGin220225ProThrPheGlyGlyGlyThrLysLeu235240權利要求1、抗人Endoglin單鏈抗體，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。2、權利要求1所述的抗人Endoglin單鏈抗體的編碼基因。3、根據(jù)權利要求2所述的編碼基因，其特征在于具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。4、含有權利要求2所述的編碼基因的重組載體。5、根據(jù)權利要求4所述的重組載體，其特征在于載體為噬菌粒載體pCANTAB5E。6、轉(zhuǎn)化體，將權利要求4所述的重組載體導入宿主大腸桿菌HB2151而得到。7、權利要求1所述的抗人Endoglin單鏈抗體的放射性核素標記物。8、根據(jù)權利要求7所述的放射性核素標記物，其特征在于所述放射性核素為"mTc。9、權利要求1所述的抗人Endoglin單鏈抗體的制備方法，包括以下步驟a、抗人Endoglin單鏈抗體的可溶性表達取權利要求5所述的重組載體，加入大腸桿菌HB2151,于溫度3037。C條件下振蕩培養(yǎng)3G~60分鐘，接種于SOBAG-N平板上，于溫度28~31。C條件下培養(yǎng)，從平板上挑取陽性克隆，接種于2xYT-AG培養(yǎng)液中，于溫度28-3rC條件下振蕩培養(yǎng)至A,值為0.6~0.8,離心，棄上清，細菌沉淀用2xYT-AI培養(yǎng)液重懸，于溫度283rC、振蕩速度200-250轉(zhuǎn)/分鐘條件下振蕩培養(yǎng)至少3小時，離心，收集上清，得培養(yǎng)上清液；將細菌沉淀用冰冷的lxTES和l/5xTES渦旋振蕩重懸，冰上孵育25-35分鐘，離心，收集上清，得周質(zhì)提取液；b、抗人Endoglin單鏈抗體的純化取周質(zhì)提取液或/和培養(yǎng)上清，采用抗E-tag親和層析法純化抗人Endoglin單鏈抗體，再將抗人EndoglinscFv的溶解試劑更換為中性pH的磷酸鹽援沖液，即制得純化的抗人Endoglin單鏈抗體。10、權利要求1所述的抗人Endoglin單鏈抗體在制備腫瘤診斷試劑中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種抗人Endoglin單鏈抗體，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；還公開了該抗人Endoglin單鏈抗體的編碼基因、含有該編碼基因的重組載體、含有該重組載體的轉(zhuǎn)化體、以及該抗人Endoglin單鏈抗體的放射性核素標記物；還公開了該抗人Endoglin單鏈抗體的制備方法，包括可溶性表達和純化兩個步驟，方法簡便易行，產(chǎn)品穩(wěn)定性好、純度高；研究結(jié)果顯示，本發(fā)明抗人EndoglinscFv具有分子量小、穿透力強、異源性低、體內(nèi)清除快、缺乏Fc段等特點，并具有良好的抗原親和性和穩(wěn)定性，可以作為靶向腫瘤血管內(nèi)皮的導向載體，用于制備腫瘤診斷試劑和免疫治療藥物，有著良好的應用前景。文檔編號C12N15/13GK101402686SQ20081023289公開日2009年4月8日申請日期2008年10月20日優(yōu)先權日2008年10月20日發(fā)明者梁志清,趙澤文申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學