專利名稱：：茶薪菇胞外木質(zhì)纖維素酶誘導(dǎo)方法及胞外纖維素酶發(fā)酵料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種茶薪菇胞外木質(zhì)纖維素酶的誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
：目前，纖維素酶廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)療衛(wèi)生、日用化工、石油開采及飼料工業(yè)等各個領(lǐng)域，因此纖維素酶具有十分廣闊的應(yīng)用前景，專家預(yù)測纖維素酶的研究開發(fā)是新世紀(jì)可再生性資源利用的關(guān)鍵，但迄今為止，仍未很好的解決高效生產(chǎn)纖維素酶的難題，而我國對于纖維素酶又有著很高的市場需求，因而篩選高酶活菌種，是當(dāng)務(wù)之急。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種以茶薪菇為原料進行胞外木質(zhì)纖維素酶誘導(dǎo)方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種以茶薪菇為原料得到的胞外纖維素酶發(fā)酵料。本發(fā)明茶薪菇胞外木質(zhì)纖維素酶誘導(dǎo)方法包括下列步驟A、茶薪菇一級種的準(zhǔn)備；B、茶薪菇級種的制備，二級種培養(yǎng)基配方麥粒98%，碳酸鈣2%;按配方將培養(yǎng)基拌勻后裝入500毫升食用菌聚氣丙烯塑料袋中，松緊適宜，用兩次紗布和一層棉花封口，12rC滅菌1.52小時，接入茶薪菇一級種，2327'C恒溫培養(yǎng)20天得茶薪菇二級種；C、茶薪菇三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料的制備，基礎(chǔ)培養(yǎng)料拌水即得，基礎(chǔ)培養(yǎng)料包括下列質(zhì)量份配比的組份，棉籽殼30.0份45.0份、木屑20.0份40.0份、麥麩10.0份26.0份、玉米粉5.0份10.0份和石膏粉1.0份2.0份；基礎(chǔ)培養(yǎng)料還包括質(zhì)量份配比為大于O，小于等于5.0份的豆餅；基礎(chǔ)培養(yǎng)料還包括質(zhì)量份配比為大于O，小于等于2.0份的茶葉；基礎(chǔ)培養(yǎng)料還包括質(zhì)量份配比為大于O，小于等于1.0份的紅糖；基礎(chǔ)培養(yǎng)料還包括質(zhì)量份配比為大于O，小于等于0.5份的磷酸氫二鉀；基礎(chǔ)培養(yǎng)料還包括質(zhì)量份配比為大于0，小于等于0.5份的復(fù)合肥，復(fù)合肥選自磷酸二銨，購買于甘肅金昌化工(集團)有限公司。拌水量的質(zhì)量百分含量為上述組分總質(zhì)量的120°/。150%;D、茶薪菇三級種復(fù)合加富培養(yǎng)料的制備，在C步驟制得的三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料中同時加入濃度為5克/升的復(fù)合碳源和5克/升的復(fù)合氮源，即得復(fù)合加富培養(yǎng)料，復(fù)合碳源為碳素羧甲基纖維素，復(fù)合碳源加入量為三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料總質(zhì)量的20%30%，復(fù)合氮源加入量為三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料總質(zhì)量的5%15%;復(fù)合碳源選自質(zhì)量比為1:2的甘露醇羧甲基纖維素或者葡萄糖羧甲基纖維素或者纖維二糖羧甲基纖維素，復(fù)合氮源選自質(zhì)量比為1:2的酵母粉尿素或者蛋白胨尿素或者甘氨酸尿素。E、茶薪菇三級種復(fù)合加富培養(yǎng)料的發(fā)酵，將D步驟制得的復(fù)合加富培養(yǎng)料拌勻后，在聚氯乙烯塑料薄膜上建成高0.51.5米的圓錐形堆，用打孔器在培養(yǎng)料堆上均勻打2030個直徑5厘米的孔，后在培養(yǎng)料堆上再覆蓋聚氯乙烯塑料薄膜，每隔1.52天翻料一次，發(fā)酵終點以pH控制在5.57.0，發(fā)酵時間共58天，即得茶薪菇胞外纖維素酶發(fā)酵料；發(fā)酵過的復(fù)合加富培養(yǎng)料在裝袋滅菌冷卻后，從兩頭分別接入茶薪菇二級種，2327t:下恒溫培養(yǎng)得茶薪菇三級種。本發(fā)明產(chǎn)品為用上述方法制備的胞外纖維素酶發(fā)酵料。本發(fā)明從酶學(xué)角度出發(fā)，以一種新興名貴食用菌茶薪菇為生產(chǎn)原料，形成以高效生產(chǎn)茶薪燕胞外纖維素酶為主的集成技術(shù)，達到生物能源最大轉(zhuǎn)化率，以緩解目前能源緊缺的局面，維護生態(tài)平衡。圖l是本發(fā)明的工藝流程圖。圖2是本發(fā)明茶薪菇胞外纖維素酶酶活性測定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實施例方式下面的實施例可以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本項技術(shù)，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1:A、茶薪菇"^rocj^ec力a;ri/^"Huang)—級種的準(zhǔn)備茶薪菇5號由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種保藏實驗中心提供。B、茶薪菇(^rocj^ec力aw'/^/Huang)二級種的制備二級種培養(yǎng)基麥粒1960克，碳酸鈣40克。按配方將培養(yǎng)基拌勻后分別裝入500毫升食用菌聚氯丙烯塑料袋中，松緊適宜，用兩次紗布和一層棉花封口，12rC滅菌1.5小時。接入一級種，25t:恒溫培養(yǎng)20天可得茶薪燕二級種。C、茶薪菇"^rocj^ec力szi'/7^;Huang)三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料的制備棉籽殼38克，木屑30克，麥麩18克，玉米粉8克，豆餅3克，茶葉0.5克，石膏粉1.5克，紅糖0.5克，磷酸氫二鉀0.25克，復(fù)合肥0.25克，袢蒸餾水130毫升。D、茶薪菇"《rocj^ec力a;^/7^/Huang)三級種復(fù)合加富培養(yǎng)料的制備在C步驟制得的三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料中同時加入濃度為5克/升的復(fù)合碳源，甘露醇:CMC(羧甲基纖維素)=1:2(質(zhì)量比)57.5毫升和加入濃度為5克/升的復(fù)合氮源，酵母粉尿素二l:2(質(zhì)量比)23毫升。E、茶薪菇"grocrtec力a;n7^"Huang)三級種復(fù)合加富培養(yǎng)料的發(fā)酵將D步驟制得的復(fù)合加富培養(yǎng)料拌勻后，在聚氯乙烯塑料薄膜上建成高1.5米的圓錐形堆，用打孔器在培養(yǎng)料堆上均勻打30個直徑5厘米的孔，后在培養(yǎng)料堆上再覆蓋聚氯乙烯塑料薄膜，每隔2天翻料一次，發(fā)酵終點以pH控制在6.5，發(fā)酵時間共6天，即得茶薪菇胞外纖維素酶高產(chǎn)發(fā)酵料。對茶薪菇胞外纖維素酶高產(chǎn)發(fā)酵料進行高產(chǎn)試驗，即茶薪菇(力^^c/^c力a;^'/^"Huang)三級種生產(chǎn)培養(yǎng)發(fā)酵過的復(fù)合加富培養(yǎng)料在裝袋滅菌冷卻后，從兩頭分別接入茶薪菇二級種，25'C下恒溫培養(yǎng)，分別在①菌絲長至半袋(5d)，②菌絲滿袋(10d)，③一潮菇原基形成(15d)，④一潮菇幼菇形成(19d)，⑤一潮菇子實體成熟(21d)，⑥二潮菇原基形成(30d)，⑦二潮菇幼菇形成(34d)，⑧二潮菇子實體成熟(37d)八個時期取樣。茶薪菇(^ferocj^ec/ayi/^wHuang)的產(chǎn)酶測定粗酶液的制備稱取樣品10克，加入重于其5倍的蒸餾水，3(TC下浸提2小時，過濾除去殘渣，上清液即為粗酶液。CMC(羧甲基纖維素)酶活性、e-葡萄糖苷酶活性測定依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求得還原糖量。酶活力單位定義lU=lmg葡萄糖/30min.g干培養(yǎng)物。(即1克干培養(yǎng)物中的酶量與底物作用30分鐘釋放出1毫克葡萄糖為一個活力單位)(參見圖2)。FP(濾紙纖維素)酶活性測定依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求得還原糖量。酶活力單位定義1^1mg葡萄糖/60min.g干培養(yǎng)物。(即1克干培養(yǎng)物中的酶量與底物作用60分鐘釋放出1毫克葡萄糖為一個活力單位)(參見圖2)。實施例1中茶薪菇復(fù)合加富培養(yǎng)料中纖維素酶活測定結(jié)果顯示見表1。表l茶薪菇復(fù)合加富培養(yǎng)料中纖維素酶活測定<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注第5天…菌絲生長半袋；第10天…菌絲長滿全袋；第15天…一潮菇原基形成；第19天…一潮菇幼菇形成；第21天…一潮菇子實體成熟；第30天…二潮菇原基形成；第34天…二潮恭幼燕形成；第37天…二潮菇子實體成熟實施例2:為實驗對照，與實施例1不同點在于不加任何復(fù)合碳源、復(fù)合氮源等富養(yǎng)成分，三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料的成分及含量同實施例l，測定茶薪菇三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料中纖維素酶的活性。實施例3:與實施例1不同點在于三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料中加入復(fù)合碳、氮源富養(yǎng)成分的含量不同。即加入濃度為5克/升的甘露醇CMC(羧甲基纖維素)=1:2(質(zhì)量比)46毫升；加入濃度為5克/升的酵母粉尿素=1:2(質(zhì)量比)11.5毫升。實施例4:與實施例1、3不同點在于三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料中加入復(fù)合碳、氮源富養(yǎng)成分的含量不同。即加入濃度為5克/升的甘露醇CMC(羧甲基纖維素)=1:2(質(zhì)量比)69毫升；加入濃度為5克/升的酵母粉尿素=1:2(質(zhì)量比)34.5毫升。實施例5:與實施例1不同點在于三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料中所加復(fù)合碳、氮源富養(yǎng)成分不同。即加入濃度為5克/升的葡萄糖CMC(羧甲基纖維素)二l:2(質(zhì)量比)57.5毫升；加入濃度為5克/升的蛋白胨尿素=1:2(質(zhì)量比)23毫升。實施例6:與實施例1不同點在于三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料中所加復(fù)合碳、氮源富養(yǎng)成分不同。即加入濃度為5克/升的纖維二糖CMC(羧甲基纖維素)=1:2(質(zhì)量比)57.5毫升；加入濃度為5克/升的甘氨酸尿素=1:2(質(zhì)量比)23毫升。實施例7:與實施例1不同點在于三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料中組分及含量不同。三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料為棉籽殼30克，木屑20克，麥麩10克，玉米粉5克，石膏粉1克，蒸餾水85.8毫升。富養(yǎng)成分是濃度為5克/升的甘露醇CMC(羧甲基纖維素)二l:2(質(zhì)量比)37.95毫升，濃度為5克/升的酵母粉尿素=12(質(zhì)量比)15.18毫升。實施例8:與實施例1不同點在于三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料中組分及含量不同。三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料為棉籽殼45克，木屑40克，麥麩26克，玉米粉10克，豆餅5克，茶葉2克，石膏粉2克，紅糖1克，磷酸氫二鉀0.5克，復(fù)合肥0.5克，蒸餾水171.6毫升。富養(yǎng)成分是濃度為5克/升的甘露醇CMC(羧甲基纖維素)=1:2(質(zhì)量比)75.9毫升，濃度為5克/升的酵母粉尿素=1:2(質(zhì)量比)30.36毫升。實施例9:與實施例l不同點在于三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料組分不同。三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料為棉籽殼38克，木屑30克，麥麩18克，玉米粉8克，石膏粉1.5克，豆餅3克，蒸餾水128.05毫升。富養(yǎng)成分是濃度為5克/升的甘露醇CMC(羧甲基纖維素)=1:2(質(zhì)量比)56.64毫升，濃度為5克/升的酵母粉尿素=1:2(質(zhì)量比)22.66毫升。實施例10:與實施例1不同點在于三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料組分不同。三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料為棉籽殼38克，木屑30克，麥麩18克，玉米粉8克，石膏粉1.5克，豆餅3克，茶葉0.5克，蒸餾水128.7毫升。富養(yǎng)成分是濃度為5克/升的甘露醇CMC(羧甲基纖維素)=1:2(質(zhì)量比)56.93毫升，濃度為5克/升的酵母粉尿素=1:2(質(zhì)量比)22.77毫升。實施例lh與實施例1不同點在于三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料組分不同。三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料為棉籽殼38克，木屑30克，麥麩18克，玉米粉8克，石膏粉1.5克，豆餅3克，茶葉0.5克，紅糖0.5克，蒸餾水129.35毫升，富養(yǎng)成分是濃度為5克/升的甘露醇CMC(羧甲基纖維素)=1:2(質(zhì)量比)57.21毫升，濃度為5克/升的酵母粉尿素=1:2(質(zhì)量比)22.89毫升。實施例12:與實施例1不同點在于三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料組分不同。三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料為棉籽殼38克，木屑30克，麥麩18克，玉米粉8克，石膏粉1.5克，豆餅3克，茶葉0.5克，紅糖0.5克，磷酸氫二鉀0.25克，蒸餾水129.68毫升。富養(yǎng)成分是濃度為5克/升的甘露醇CMC(羧甲基纖維素)=1:2(質(zhì)量比)57.36毫升，濃度為5克/升的酵母粉尿素=1:2(質(zhì)量比)22.95毫升。茶薪菇不同培養(yǎng)料中纖維素酶活性測定結(jié)果顯示見表2。表2實施例2-12的培養(yǎng)料中纖維素酶活性測定<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注第5天…菌絲生長半袋；第10天…菌絲長滿全袋；第15天…一潮菇原基形成；第19天…一潮菇幼菇形成；第21天…一潮菇子實體成熟；第30天…二潮燕原基形成；第34天…二潮菇幼菇形成；第37天…二潮菇子實體成熟。權(quán)利要求1.一種茶薪菇胞外木質(zhì)纖維素酶誘導(dǎo)方法，其特征在于它包括下列步驟A、茶薪菇一級種的準(zhǔn)備；B、茶薪菇級種的制備，二級種培養(yǎng)基配方麥粒98％，碳酸鈣2％；按配方將培養(yǎng)基拌勻后裝入500毫升食用菌聚氯丙烯塑料袋中，松緊適宜，用兩次紗布和一層棉花封口，121℃滅菌1.5～2小時，接入茶薪菇一級種，23～27℃恒溫培養(yǎng)20天得茶薪菇二級種；C、茶薪菇三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料的制備，基礎(chǔ)培養(yǎng)料拌水即得，基礎(chǔ)培養(yǎng)料包括下列質(zhì)量份配比的組份，棉籽殼30.0份～45.0份、木屑20.0份～40.0份、麥麩10.0份～26.0份、玉米粉5.0份～10.0份和石膏粉1.0份～2.0份，拌水量的質(zhì)量百分含量為上述組分總質(zhì)量的120％～150％；D、茶薪菇三級種復(fù)合加富培養(yǎng)料的制備，在C步驟制得的三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料中同時加入濃度為5克/升的復(fù)合碳源和5克/升的復(fù)合氮源，即得復(fù)合加富培養(yǎng)料，復(fù)合碳源為碳素∶羧甲基纖維素，復(fù)合碳源加入量為三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料總質(zhì)量的20％～30％，復(fù)合氮源加入量為三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料總質(zhì)量的5％～15％；E、茶薪菇三級種復(fù)合加富培養(yǎng)料的發(fā)酵，將D步驟制得的復(fù)合加富培養(yǎng)料拌勻后，在聚氯乙烯塑料薄膜上建成高0.5～1.5米的圓錐形堆，用打孔器在培養(yǎng)料堆上均勻打20～30個直徑5厘米的孔，后在培養(yǎng)料堆上再覆蓋聚氯乙烯塑料薄膜，每隔1.5～2天翻料一次，發(fā)酵終點以pH控制在5.5～7.0，發(fā)酵時間共5～8天，即得茶薪菇胞外纖維素酶發(fā)酵料；發(fā)酵過的復(fù)合加富培養(yǎng)料在裝袋滅菌冷卻后，從兩頭分別接入茶薪菇二級種，23～27℃下恒溫培養(yǎng)得茶薪菇三級種。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶薪菇胞外木質(zhì)纖維素酶誘導(dǎo)方法，其特征在于:所述D步驟中復(fù)合碳源選自質(zhì)量比為1:2的甘露醇羧甲基纖維素或者葡萄糖:羧甲基纖維素或者纖維二糖羧甲基纖維素，復(fù)合氮源選自質(zhì)量比為1:2的酵母粉尿素或者蛋白胨尿素或者甘氨酸尿素。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的茶薪菇胞外木質(zhì)纖維素酶誘導(dǎo)方法，其特征在于所述C步驟中基礎(chǔ)培養(yǎng)料還包括質(zhì)量份配比為大于O，小于等于5.0份的豆餅。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的茶薪菇胞外木質(zhì)纖維素酶誘導(dǎo)方法，其特征在于:所述C步驟中基礎(chǔ)培養(yǎng)料還包括質(zhì)量份配比為大于0，小于等于2.0份的茶葉。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的茶薪菇胞外木質(zhì)纖維素酶誘導(dǎo)方法，其特征在于:所述c步驟中基礎(chǔ)培養(yǎng)料還包括質(zhì)量份配比為大于0，小于等于1.0份的紅糖。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的茶薪菇胞外木質(zhì)纖維素酶誘導(dǎo)方法，「其特征在于:所述C步驟中基礎(chǔ)培養(yǎng)料還包括質(zhì)量份配比為大于0，小于等于0.5份的磷酸氫二鉀。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的茶薪菇胞外木質(zhì)纖維素酶誘導(dǎo)方法，其特征在于:所述C步驟中基礎(chǔ)培養(yǎng)料還包括質(zhì)量份配比為大于0，小于等于0.5份的復(fù)合肥，復(fù)合肥選自磷酸二銨。8、由權(quán)利要求7所述的方法制備的胞外纖維素酶發(fā)酵料。全文摘要本發(fā)明公開了一種茶薪菇胞外木質(zhì)纖維素酶誘導(dǎo)方法及胞外纖維素酶發(fā)酵料，誘導(dǎo)方法包括下列步驟有茶薪菇一級種的準(zhǔn)備；茶薪菇級種的制備；茶薪菇三級種基礎(chǔ)培養(yǎng)料的制備；茶薪菇三級種復(fù)合加富培養(yǎng)料的制備；茶薪菇三級種復(fù)合加富培養(yǎng)料的發(fā)酵，即得茶薪菇胞外纖維素酶發(fā)酵料。本發(fā)明從酶學(xué)角度出發(fā)，以一種新興名貴食用菌茶薪菇為生產(chǎn)原料，形成以高效生產(chǎn)茶薪菇胞外纖維素酶為主的集成技術(shù)，達到生物能源最大轉(zhuǎn)化率，以緩解目前能源緊缺的局面，維護生態(tài)平衡。文檔編號C12N9/42GK101407798SQ20081023232公開日2009年4月15日申請日期2008年11月1日優(yōu)先權(quán)日2008年11月1日發(fā)明者鐸張,龍王,王秉峰,趙玉卉,路等學(xué),高靜梅申請人:甘肅省科學(xué)院生物研究所