專利名稱：：融合蛋白TT-B7-H4IgV及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及融合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建、在原核細(xì)胞中的表達(dá)、目的蛋白的純化，特別涉及一種能夠誘導(dǎo)出抗B7-H4抗血清的融合蛋白TT-B7-H4IgV及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：1、B7-H4分子及其研究B7-H4(B7-S1，B7x)是在2003年時，由Chen等三個實(shí)驗(yàn)室利用生物信息學(xué)的方法相繼發(fā)現(xiàn)的B7家族新成員。他們是以現(xiàn)有的B7家族成員的胞外段可變區(qū)(IgV+IgC)為査詢序列，對GenBank中的EST序列(表達(dá)序列標(biāo)簽)進(jìn)行搜索時發(fā)現(xiàn)的，并在人胎盤cDNA文庫中得到了全長序列。B7-H4不能與CD28、CTLA-4和IC0S結(jié)合，它與未知受體結(jié)合，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。近年來，越來越多的資料表明，B7-H4可能與腫瘤免疫逃逸、自身免疫性疾病等的發(fā)病機(jī)理與治療息息相關(guān)。1.1B7-H4的結(jié)構(gòu)與分布特點(diǎn)1.1.1B7-H4的結(jié)構(gòu)經(jīng)査找美國NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，B7-H4蛋白由信號肽區(qū)、一對VC免疫球蛋白胞外段、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)組成，共282個氨基酸，屬I型跨膜糖蛋白，通過GPI鉚定于細(xì)胞膜，其中IgV區(qū)為54-130位氨基酸。B7-H4分子最顯著的特征是胞漿區(qū)僅含有兩個氨基酸殘基。在空間結(jié)構(gòu)上，該分子在配體-受體結(jié)構(gòu)域上與B7家族的同源性分別為:B7-113%,B7-213%，B7h14%，B7-H120°/。，B7-DC160/。及B7-H324%。hB7-H4分子的IgV區(qū)和mH7-H4的IgV區(qū)同源性高達(dá)91。/。，然而該區(qū)同CD80和CD86的同源性僅為23y。。B7-H4的氨基酸序列如下MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEG隨LSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRL麗QLTDAGTYKCYIITSKGKG畫LEYKTGAFSMPE麗DYNASSETLRCEAPRWFPQPTWWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKWSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKASLCVSSFFAISWALLPLSPYLMLK。1.1.2B7-H4的分布RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示正常組織中發(fā)現(xiàn)有B7-H4mRNA表達(dá)，如胎盤、肝臟、肺、脾、骨骼肌、腎、小腸等等。然而，免疫組化的結(jié)果顯示，正常組織中不表達(dá)B7-H4，僅在某些腫瘤組織中能檢領(lǐng)倒表達(dá)，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌;與B7-H1表達(dá)情況不同，在黑色素瘤細(xì)胞表面檢測不到B7-H4的表達(dá)。通過細(xì)胞流式術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)在活化后的人T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC細(xì)胞上B7-H4呈誘導(dǎo)性表達(dá)。此外，小鼠脾B220+B細(xì)胞組成性表iiB7-H4，而活化后則下調(diào)表達(dá)。對小鼠組織的Northernblot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)組織類型的不同，小鼠的B7-H4共有4種不同的mRNA剪切形式。肝組織具有這四種剪切形式的高水平表達(dá)，它們的大小分別為7.5，4，2.6和1.8kb。靈敏的RT-PCR分析顯示，人類組織至少擁有兩個轉(zhuǎn)錄本。同時還有研究表明，正常外周組織能在轉(zhuǎn)錄水平上對B7-H4的表達(dá)進(jìn)行嚴(yán)密的調(diào)控。1.2B7-H4的受體研究B7-H4-Ig融合蛋白標(biāo)記和流式細(xì)胞分析(FCM)發(fā)現(xiàn)，B7-H4-Ig融合蛋白可以結(jié)合佛波脂和離子毒素或抗CD3/CD28抗體活化的T細(xì)胞，這提示在活化T細(xì)胞上存在B7-H4的可能受體。將B7-H4-Ig融合蛋白分別和高表達(dá)CD28，ICOS,PD-l和CTLA-4的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞相互作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，B7-H4-Ig融合蛋白不能與上述各轉(zhuǎn)基因細(xì)胞結(jié)合。另外，CTLA-Ig能與轉(zhuǎn)B7-2基因的CHO細(xì)胞結(jié)合，但卻不能與轉(zhuǎn)B7-H4基因的細(xì)胞結(jié)合。這些均表明表達(dá)在活化T細(xì)胞上的B7-H4受體不同于CD28，IC0S，PD-1和CTLA-4。BTLA是CD28家族成員之一，它表達(dá)在活化的T細(xì)胞和靜止的B細(xì)胞上，在BTLA的胞漿段有兩個ITIM(免疫受體酪氨酸抑制基序)，介導(dǎo)抑制T細(xì)胞的作用，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)B7-H4-Ig明顯能與野生型(WT)細(xì)胞結(jié)合，但與突變型(BTLA-/-)細(xì)胞卻不能結(jié)合。這樣的結(jié)合差異性提示，BTLA可能是B7-H4的受體?，F(xiàn)無文獻(xiàn)報道B7-H4和BTLA的直接結(jié)合，而有實(shí)驗(yàn)表明BTLA并不能與B7-H4直接結(jié)合，同時發(fā)現(xiàn)HVEM(皰疹病毒介體)是BTLA的特異性配體，所以BTLA是否是B7-H4的受體有待進(jìn)一步驗(yàn)證。1.3B7-H4的生物學(xué)活性及其作用機(jī)理研究1.3.1B7-H4是B7家族的新成員T淋巴細(xì)胞的活化與抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的產(chǎn)生及維持至少需要2個信號，即MHC-復(fù)合物提供的特異性信號以及由APC表面分子提供的共刺激信號。共刺激信號路徑不僅提供增強(qiáng)和維持T細(xì)胞應(yīng)答的關(guān)鍵的正性第二信號，而且提供下調(diào)T細(xì)胞應(yīng)答的關(guān)鍵的負(fù)性第二信號。在T細(xì)胞活化和耐受的免疫調(diào)節(jié)中，B7-CD28家族成員介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞共刺激信號傳導(dǎo)途徑起著至關(guān)重要的作用。它們不僅在啟動、增強(qiáng)和維持T細(xì)胞應(yīng)答中提供了關(guān)鍵的正性信號，而且還可提供重要的負(fù)性信號來限制、終止或削弱T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。最近5年發(fā)現(xiàn)的B7家族的成員主要有B7-H1/PD-1，B7h/IC0S、B7-H3、B7-H4和BTLA等。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)B7-H4與B7-H1—樣，對免疫應(yīng)答反應(yīng)有著負(fù)性調(diào)節(jié)作用，它能通過抑帝IJT細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的釋放和細(xì)胞周期的進(jìn)程來負(fù)性調(diào)控T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，且B7-H4分子的表達(dá)與某些腫瘤的診斷，治療及預(yù)后息息相關(guān)。所有數(shù)據(jù)表明B7-H4參與了腫瘤免疫逃逸反應(yīng)，但其中具體的分子機(jī)制尚未闡明。1.3.2B7-H4能抑制T細(xì)胞活化和增殖實(shí)驗(yàn)證明，B7-H4的未知受體存在于活化后的T細(xì)胞上，且不同于CD28，CTLA-4，IC0S，PD-1和B7-H3的受體。在CD28的共刺激作用下，特別是在低劑量的CD3抗體存在的情況下，B7-H4-Ig與受體相結(jié)合，可以抑制T細(xì)胞的增殖，且在高劑量的TCR和CD3抗體的作用下，可以克服B7-H4的抑制作用。說明B7-H4是一種T細(xì)胞活化的負(fù)性調(diào)節(jié)分子，B7-H4-Ig會降低T細(xì)胞對TCR/CD28信號通路的反應(yīng)性。IL-2的分泌是T細(xì)胞活化的標(biāo)志，而B7-H4-Ig可以抑制T細(xì)胞分泌的IL-2的釋放。IL-2基因在活化的T細(xì)胞上表達(dá)受多條信號通路的控制，包括細(xì)胞表面的受體與配體結(jié)合，導(dǎo)致NFAT，NF-kB和API轉(zhuǎn)錄因子的激活等。研究發(fā)現(xiàn)，在B7-H4-Ig的共剌激作用下API家族成員之一JunB的表達(dá)量下降了49%，而JunB分子的過表達(dá)會導(dǎo)致IL-2的大量產(chǎn)生。因此說明B7-H4-Ig通過抑制JunB的表達(dá)影響T細(xì)胞分泌IL-2分子，從而抑制T細(xì)胞的活化。體外實(shí)驗(yàn)證明，用抗B7-H4的單抗阻斷B7-H4的功能后，可以增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖，增加IL-2的釋放水平。在小鼠EAE模型形成實(shí)驗(yàn)中，使用B7-H4單抗組的小鼠更容易形成EAE模型。檢測小鼠的腦單核細(xì)胞浸潤發(fā)現(xiàn)，使用單抗后的小鼠，其CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞浸潤也明顯增加。這些數(shù)據(jù)都表明B7-H4在T細(xì)胞活化中發(fā)揮抑制性調(diào)節(jié)作用。1.3.3B7-H4能抑制T細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)B7-H4能夠抑制T細(xì)胞的活化以及T細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，固化的B7-H4分子可以抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的釋放。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)亦證明，給B6小鼠注射B7-H4-Ig可以抑制T細(xì)胞的分化和T細(xì)胞毒作用。與之相一致的結(jié)果是，用單抗阻斷膜上B7-H4分子可以阻斷B7-H4分子的抑制作用，且該抑制作用是通過阻滯T細(xì)胞的細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)的，而對T細(xì)胞的促凋亡作用很微弱，表明B7-H4是在T細(xì)胞活化的早期階段發(fā)揮作用，對細(xì)胞因子的抑制作用無選擇性。B7-H4的這些特征為腫瘤，自身免疫性疾病，病毒感染和移植排斥的治療提供了新的耙位。1.3.4B7-H4與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制作用機(jī)制有很多種，IL-10介導(dǎo)的復(fù)雜作用是其中的一種。通過研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與APCs的相互作用，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞會觸發(fā)APCs分泌大量的IL-IO，IL-10可以誘導(dǎo)APCs細(xì)胞表達(dá)大量的B7-H4，導(dǎo)致APCs產(chǎn)生免疫抑制。敲除APCs上的B7-H4，可以抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)的APCs的免疫抑制作用。由APCs細(xì)胞分泌的IL-10可以刺激其本身表達(dá)更多的B7-H4,這是最新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制機(jī)制，這種機(jī)制是在APCs水平上發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)證明，B7-H4在APCs上過表達(dá)，產(chǎn)生了"調(diào)節(jié)性APCs"，從而抑制了免疫應(yīng)答反應(yīng)。為了進(jìn)一步研究在腫瘤環(huán)境中的B7-H4、巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞之間的病理關(guān)系，KryczekI等對103個患者體內(nèi)卵巢癌細(xì)胞和卵巢癌相關(guān)巨噬細(xì)胞上的B7-H4表達(dá)量進(jìn)行了統(tǒng)計，觀察到巨噬細(xì)胞上的B7-H4的密度與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上的數(shù)量正相關(guān)，且調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量和B7-H4的表達(dá)量與卵巢癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。同時，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能通過促使巨噬細(xì)胞自分泌IL-10和IL-6，刺激B7-H4在巨噬細(xì)胞上表達(dá)增多，通過B7-H4的作用，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞將抑制信號傳遞給APCs(巨噬細(xì)胞來源)。1.3.5B7-H4與B細(xì)胞眾所周知，B7家族的共刺激分子在調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答中起著重要的作用。如B7-1和B7-2與CD28結(jié)合時，可以發(fā)揮正性的刺激作用，當(dāng)B7-1和B7-2與CTLA-4結(jié)合時，發(fā)揮著抑制性作用。然而，B7家族共剌激分子如何調(diào)節(jié)B細(xì)胞的功能卻知之甚少。有一些研究證明，經(jīng)過LPS和CD40的刺激可以誘導(dǎo)B細(xì)胞表面B7家族分子的表達(dá)，激活B細(xì)胞。Suvas等證明了表達(dá)在細(xì)胞表面的B7家族分子，對正常的B細(xì)胞和B細(xì)胞淋巴瘤都發(fā)揮著重要的作用，因此可以認(rèn)為B7家族分子在決定B細(xì)胞的最終命運(yùn)上發(fā)揮著重要的作用。B7-H4是B7家族最新發(fā)現(xiàn)的成員，已有實(shí)驗(yàn)證明B7-H4可以抑制T細(xì)胞的激活、增殖，抑制細(xì)胞因子釋放和T細(xì)胞毒作用，B7-H4通過對免疫應(yīng)答的影響，參與腫瘤免疫逃逸。EBV是在95。/。人群都有感染的人皰疹病毒，它與一些惡性腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)，如Burttis's淋巴瘤、Hodgkin，s病等，但是EBV病毒發(fā)揮作用的具體機(jī)制還不明。效應(yīng)性T細(xì)胞可以清除EBV感染的B細(xì)胞，因此在機(jī)體對抗這些惡性腫瘤時發(fā)揮重要的作用。然而，有實(shí)驗(yàn)證明EBV能夠通過誘導(dǎo)HLA分子和共刺激分子在B細(xì)胞表面的表達(dá)，協(xié)助感染后的B細(xì)胞逃避效應(yīng)性T細(xì)胞的攻擊。HyunkeunSong等觀察轉(zhuǎn)染了EBV的B細(xì)胞，證明了EBV可以誘導(dǎo)B7-H4在B細(xì)胞上的表達(dá)，使用抗B7-H4抗體與表達(dá)在B細(xì)胞上的B7-H4相互作用后，可以增強(qiáng)Fas介導(dǎo)的B細(xì)胞凋亡。這些數(shù)據(jù)表明，B7-H4可以成為EBV相關(guān)的惡性腫瘤的治療$巴位。1.3.6B7-H4在巨噬細(xì)胞表面的表達(dá)經(jīng)過對抑制性免疫細(xì)胞數(shù)十年的研究，人們對主要的免疫抑制性細(xì)胞-CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能了解已經(jīng)比較透徹。最近在卵巢癌患者體內(nèi)又發(fā)現(xiàn)了一群新的免疫抑制性細(xì)胞，稱為B7-H4+腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是卵巢癌間質(zhì)中的重要組成成分，且與腫瘤的進(jìn)程密切相關(guān)。對人卵巢癌相關(guān)巨噬細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)有一部分腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞能夠表達(dá)B7-H4，且該細(xì)胞能夠明顯抑制腫瘤特異性T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的釋放和細(xì)胞毒作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣證明，與敲除了B7-H4的巨噬細(xì)胞相比，B7-H4+巨噬細(xì)胞能夠抑制腫瘤特異性T細(xì)胞的作用，促進(jìn)SCID/N0D小鼠上接種的腫瘤細(xì)胞生長，且B7-H4+巨噬細(xì)胞和CD4+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞共存于卵巢癌的微環(huán)境中，這些數(shù)據(jù)證明這兩種細(xì)胞有著類似的功能。IlonaKryczek等的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)B7-H4+APCs(巨噬細(xì)胞來源)禾BCD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的確存在著功能上的聯(lián)系，CD4+CD25+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過刺激APCs表達(dá)B7-H4導(dǎo)l^PC細(xì)胞的免疫抑制，且對腫瘤患者腹水和實(shí)體瘤檢測發(fā)現(xiàn)，B7-H4+巨噬細(xì)胞的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量，由此可見B7-H4+巨噬細(xì)胞在腫瘤免疫逃逸中的作用是不容忽視的。這些新的發(fā)現(xiàn)，為卵巢癌的診斷和治療提供了新的策略。1.3.7B7-H4在腎小管上皮的表達(dá)腎小管損傷的發(fā)病機(jī)制至今還不清楚，已證明腎小管上皮細(xì)胞和T細(xì)胞的相互作用在疾病進(jìn)程中占有很重要的位置，腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)共刺激分子通過促進(jìn)T細(xì)胞的激活，導(dǎo)致腎小管的損傷。B7-H4是B7家族共刺激分子中最新發(fā)現(xiàn)的成員，ChenY等對20例特發(fā)性膜性腎病患者，19例IgA腎病患者，16例狼瘡性腎病患者和15例急性腎移植排斥患者進(jìn)行腎活檢，用免疫組化檢測B7-H4在各種類型患者腎小管上皮的表達(dá)情況。結(jié)果顯示B7-H4在所有類型患者腎小管上皮細(xì)胞上均有特異性表達(dá)，特別是在腎小管嚴(yán)重?fù)p傷的患者腎小管上皮B7-H4的表達(dá)明顯。各類患者體內(nèi)B7-H4的表達(dá)水平與血清肌酸酐，血清尿素氮，24小時蛋白尿水平無關(guān)聯(lián)。體外實(shí)驗(yàn)證明表達(dá)B7-H4的腎小管上皮細(xì)胞可以促進(jìn)細(xì)胞因子(IL-2和INF-Y)的釋放和與之共培養(yǎng)T細(xì)胞的增殖，說明表達(dá)B7-H4的腎小管上皮細(xì)胞可以誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的釋放，B7-H4在腎小管損傷中是個潛在的刺激因素。1.3.8B7-H4與胰島P細(xì)胞糖尿病(DM)是一種常見的代謝性內(nèi)分泌疾病，因其發(fā)病率、死亡率、致殘率高，嚴(yán)重危害人類健康，而日益受到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。胰島素的產(chǎn)生和分泌不足是疾病的主要原因。胰島素主要由胰島P細(xì)胞產(chǎn)生，在I型糖尿病中，t細(xì)胞對胰島e細(xì)胞的殺傷作用導(dǎo)致胰島素產(chǎn)生不足，在疾病發(fā)病過程占有極其重要的地位。B7-H4通過與活化后T細(xì)胞與B細(xì)胞上的未知受體結(jié)合，參與細(xì)胞免疫和體液免疫。RT-PCR結(jié)果顯示人胰島P細(xì)胞表達(dá)B7-H4mRNA，而流式結(jié)果顯示胰島P細(xì)胞不表達(dá)B7-H4分子。為了研究I型糖尿病患者體內(nèi)胰島P細(xì)胞表達(dá)的B7-H4對T細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)作用，建立了體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，包括特異性抗胰島3細(xì)胞的t細(xì)胞，人胰島p細(xì)胞系cm和Hp62，和初始胰島P細(xì)胞，B7-H4蛋白由轉(zhuǎn)染了B7-H4載體的293T細(xì)胞產(chǎn)生。結(jié)果表明，在患者體內(nèi)，固化的B7-H4分子可以明顯地抑制由CD3單抗刺激的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖和活化，同時B7-H4分子阻滯T細(xì)胞G0/G1期，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡。通過轉(zhuǎn)染表達(dá)B7-H4載體的人胰島P細(xì)胞系CM和Hp62細(xì)胞來刺激T細(xì)胞免疫應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染了空載體的細(xì)胞相比，前者可以明顯抑制T細(xì)胞的殺傷作用。因此，激活細(xì)胞B7-H4信號通路可以抑制I型糖尿病患者體內(nèi)T細(xì)胞對胰島P細(xì)胞的殺傷，對細(xì)胞起保護(hù)作用，從而為糖尿病的免疫治療提供新策略。1.4B7-H4在腫瘤及其他疾病中的研究與應(yīng)用B7家族的分子在腫瘤免疫中占有極其重要的地位。B7-H1，B7-DC，B7-H3，B7-H4都是B7家族新發(fā)現(xiàn)的成員。它們在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著獨(dú)一無二的作用，而這種功能又往往是交叉重疊的。B7家族的共剌激分子通過各種機(jī)制，對免疫系統(tǒng)起著調(diào)節(jié)作用，這些功能都已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在腫瘤免疫逃逸的過程中，這些B7家族的分子也發(fā)揮著重要的輔助作用，最近研究火熱的人自有B7-H1，B7-H4等，它們對于腫瘤的診斷、治療和預(yù)后都有著極其重要的作用。特別是對于最新發(fā)現(xiàn)的B7-H4分子的研究逐漸深入，越來越多的實(shí)驗(yàn)證明B7-H4具有成為腫瘤治療耙位的價值。B7-H4在腫瘤組織的表面有著豐富的表達(dá)，如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌，胰腺癌等，而正常組織中幾乎檢測不到的表達(dá)B7-H4分子表達(dá)在腎癌，B7-H4mRNA則無處不在，這些數(shù)據(jù)都說明了B7-H4分子在轉(zhuǎn)錄后水平上發(fā)揮著他們不同的調(diào)節(jié)功能。它們的組織表達(dá)特異性是由微環(huán)境環(huán)境中的組織特異性促進(jìn)分子、轉(zhuǎn)錄因子等決定的，促炎因子IFN-y可以上調(diào)B7-H1在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)。目前，對于IFN-y是否可以上調(diào)B7-H4在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)尚無研究。有研究證明，腫瘤患者體內(nèi)B7-H4在APCs上表達(dá)上調(diào)，形成APCs免疫耐受，從而抑制了腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)。B7-H4分子能抑制T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，用RNAi的方法敲除腫瘤細(xì)胞上B7-H4的表達(dá)，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，腫瘤細(xì)胞上過表達(dá)B7-H4，能夠促進(jìn)小鼠接種腫瘤的形成。在腫瘤微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞上B7-H4的表達(dá)能抑制T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，而阻斷巨噬細(xì)胞上B7-H4的表達(dá)，能夠抑制小鼠接種腫瘤的生長。因此有理由假設(shè)通過阻斷B7-H4分子來阻斷B7-H4的抑制信號通路，可以提高T細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，打破腫瘤細(xì)胞的免疫耐受，阻斷免疫逃逸，及消除APCs的抑制性作用。1.5B7-H4分子與自身免疫性疾病有實(shí)驗(yàn)證明，在GVHD(移植物抗宿主反應(yīng))模型中，B7-H4-Ig可以有效抑制CTL的增殖、分化和成熟，從而延長小鼠的壽命。如果將B6小鼠的脾臟移植給接受亞致死劑量照射的BDF1(B6XDAB/2)小鼠會刺激CD8+CTL急速的擴(kuò)增和細(xì)胞毒活性的增強(qiáng)，從而伴隨多器官功能衰竭，最終導(dǎo)致小鼠的死亡。如果給與小鼠B7-H4-Ig的保護(hù)，能降低CTL的反應(yīng)，降低小鼠的免疫反應(yīng)。而受體鼠隔天給予阻斷型抗B7-H4抗體實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體組與對照組(Ig)相比呈現(xiàn)強(qiáng)烈的反應(yīng)性CTL活性。還有實(shí)驗(yàn)證明，用特異性抗體封閉B7-H4的功能，可增強(qiáng)CTL應(yīng)答，加速EAE疾病的產(chǎn)生。綜上所述，B7-H4在體內(nèi)也可抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答，對自身免疫性疾病和移植后排斥反應(yīng)的治療具有應(yīng)用價值。B7-CD28家族中新的T細(xì)胞共刺激分子及其信號傳導(dǎo)通路的發(fā)現(xiàn)，使人們對共刺激分子在免疫應(yīng)答不同階段的相互作用有了進(jìn)一步了解。人們推測，這些分子通過精細(xì)的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)和控制著T細(xì)胞活化、增殖、分化為效應(yīng)T細(xì)胞和記憶細(xì)胞以及T細(xì)胞數(shù)量的動態(tài)平衡。B7家族最新發(fā)現(xiàn)的B7-H4分子正是這樣一個重要的分子。它在T細(xì)胞應(yīng)答相對早期起明顯的抑制作用。因此,B7-H4在初始T細(xì)胞的活化過程中是對T細(xì)胞活化負(fù)性調(diào)控的一個關(guān)鍵點(diǎn)。廣泛而可誘導(dǎo)的表達(dá)譜揭示，B7-H4在外周組織中的表達(dá)也具有免疫應(yīng)答負(fù)性調(diào)控作用。特別是在腫瘤組織的特異性表達(dá)，揭示了B7-H4分子參與腫瘤免疫逃逸，是幫助腫瘤生長的關(guān)鍵分子。經(jīng)過不斷深入研究，通過控制B7-H4與其特異性受體的結(jié)合很可能為腫瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、移植后排斥等疾病的治療開辟嶄新而高效的途徑。B7-H4是否有助于腫瘤免疫逃避，而阻斷B7-H4是否能提高腫瘤免疫治療效果，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。2、腫瘤免疫逃逸與腫瘤疫苗研究進(jìn)展雖然在動物及臨床實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同腫瘤疫苗可誘發(fā)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，但其臨床治療總有效率僅為2.6%。免疫系統(tǒng)不能引起腫瘤消退是腫瘤疫苗研究所面臨的一個巨大困難。大量的研究證據(jù)表明，腫瘤存在著許多逃避免疫系統(tǒng)識別和攻擊的機(jī)制，包括腫瘤抗原表達(dá)的下調(diào)、丟失或突變；HLA-I類抗原和免疫共刺激分子表達(dá)的下調(diào)或丟失；腫瘤細(xì)胞分泌免疫抑制性可溶性因子；腫瘤細(xì)胞膜上表達(dá)免疫抑制性分子；誘導(dǎo)具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞；共刺激分子表達(dá)下調(diào)和共抑制分子表達(dá)上調(diào)等。其中，腫瘤組織中的免疫反應(yīng)抑制是腫瘤細(xì)胞逃逸免疫攻擊的重要因素。有研究表明，許多具有免疫抑制功能的可溶性因子(TGF-P、IL-IO、前列腺素E2、Fas、TRAIL等)和細(xì)胞膜分子(CTLA-4、PD-1、B7-Hl、B7-H4等)在腫瘤細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，協(xié)助腫瘤的免疫逃逸。腫瘤的免疫治療近年來發(fā)展很快，阻斷參與腫瘤免疫逃避分子的作用，已成為提高腫瘤疫苗治療效果的一種有效手段。但是由于缺乏特異性的腫瘤抗原，缺乏有效的抗原呈遞等原因，使腫瘤疫苗目前的應(yīng)用受限。因此選擇特異而有效的治療靶點(diǎn)、有效的抗原呈遞成為腫瘤免疫治療成功的關(guān)鍵。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種融合蛋白TT-B7-H4IgV及其制備方法和用途，使其能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)出針對B7-H4的多克隆抗體，鑒于B7-H4是一種參與免疫應(yīng)答及調(diào)節(jié)、腫瘤免疫逃避的信號分子且其受體分子未知，期望該多克隆抗體能夠與B7-H4分子結(jié)合，阻斷B7-H4信號通路，打破腫瘤免疫逃避，為研制抗腫瘤藥物提供新的策略和途徑。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明選擇B7-H4分子作為耙點(diǎn)，以TT作為抗原呈遞，構(gòu)建融合蛋白TT-B7-H4IgV;所采用的技術(shù)方案是所述的B7-H4IgV為B7-H4分子胞外區(qū)可變區(qū)IgV，TT為T輔助細(xì)胞表位肽或破傷風(fēng)類毒素表位，在融合蛋白的N端還連接6個His殘基，其連接方式為6XHis-TT-B7-H4IgV;其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。融合蛋白TT-B7-H4IgV的重組核苷酸序列，其連接方式為6XHis序列-BamHI酶切位點(diǎn)-TT表位序列-EcorI酶切位點(diǎn)-B7-H4IgV重組序列-SalI酶切位點(diǎn)，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。構(gòu)建于重組質(zhì)粒pQE-30-TT-hB7-H4IgV，TT-hB7-H4IgV重組核苷酸序列通過BamHI、Sail多克隆位點(diǎn)連接于質(zhì)粒pQE_30中。融合蛋白TT-B7-H4IgV的制備方法如下1)重組質(zhì)粒pQE-30-TT-B7-H4IgV的構(gòu)建根據(jù)人B7-H4的cDNA基因序列，截取B7-H4胞外段IgV序列，上游引入5am///酶切位點(diǎn)和T輔助細(xì)胞表位，T輔助細(xì)胞表位為破傷風(fēng)類毒素表位TT830-843，其氨基酸序列為Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu，下游引入&//酶切位點(diǎn)，其重組序列如SEQ.ID.NO.2所示該重組序列中的4-12bp為linker序列，13-30bp為6個His編碼序列，31國36bp為BamHI酶切位點(diǎn)，37-78bp為TT輔助表位肽編碼基因序列，79-87bp為linker序列，88-93bp為Ecorl酶切位點(diǎn)，94-326bp為B7-H4IgV區(qū)編碼序列，327-333bp為Sail酶切位點(diǎn)；通過5amHI和&/I多克隆位點(diǎn)將上述重組序列克隆入載體pBluescriptIISK-G;將上述pBluescriptIISK-G-TT-hB7-H4IgV載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，提取質(zhì)粒DNA后，將其與質(zhì)粒(^6-30分別用^^111和&/1進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，分別回收pBluescriptIISK-G-17_1^7-股18￥獲得的小片段333bp和pQE-30中的大片段，將回收后的小片段和大片段用T4連接酶在16X:連接過夜，轉(zhuǎn)4tDH5a感受態(tài)細(xì)胞，鋪板、培養(yǎng)，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，纟^5amffi和S"/I雙酶切鑒定和DNA測序，獲得含有B7-H4IgV融合基因原核克隆載體，重組質(zhì)粒pQE-30-TT-B7-H4IgV構(gòu)建成功；2)重組質(zhì)粒pQE-30-TT-B7-H4IgV的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備取DH5a甘油菌種按1:100的體積比接種入LB培養(yǎng)液，在37卩振蕩培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)接一次，繼續(xù)培養(yǎng)至OD6oo為0.4-0.6，無菌操作下將菌液冰浴10min，在離心為3000rpmX5min，溫度為4。C下棄去上清液，加入沉淀物1/2體積預(yù)冷的100mmol/L的CaCl2，吹起沉淀，冰浴40min，在離心為3000rpmX5min，溫度為4"C下棄去上清液后加入沉淀物1/25體積的含質(zhì)量濃度25%的甘油和100mmol/L的CaCl2的混合溶液再次吹起沉淀，分裝入Eppendorf管中，-70°。保存?zhèn)溆?；感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)將大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞從-7(TC中取出，冰浴融解5-10分鐘，加入含有重組質(zhì)粒pQE-30-TT-hB7-H4IgV的懸液，輕微混勻，繼續(xù)冰浴30分鐘，然后鋪板，LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，37'C孵箱培養(yǎng)過夜；3)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化pQE-30-TT-B7-H4IgV工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)將含有pQE-30-TT-B7-H4IgV重組質(zhì)粒的菌株接種于10ml含Amp的LB培養(yǎng)液中，于37'C培養(yǎng)過夜，次日按1%的體積比轉(zhuǎn)接于10ml含Amp的LB培養(yǎng)液中，于37"C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期A600nm=0.40.6時，加入IPTG至終濃度為lmmol/L誘導(dǎo)表達(dá)，于37。C振蕩培養(yǎng)3-5h，離心收集菌體，-20。C保存；按5g菌體加50mL的PBS溶液的比例將重組質(zhì)粒表達(dá)的菌體重懸，冰浴條件下進(jìn)行超聲裂菌；12000rpm離心15min，分別收集上清液和沉淀，將沉淀用4mol/L尿素洗滌，4t:條件下12000r/min離心20min;按lg沉淀加10mL的含0.1M的NaH2P04、pH8.0的0.01M的Tris和8M的尿素的混合溶液，4"C攪拌2h，12000rpm離心15min，共離心2次，收集上清；用Ni-NTA柱親和層析純化上清所溶解的目的蛋白沉淀，同樣按lg沉淀加5ml的含8mol/L尿素、0.1mol/L的NaH2PO4和pH為8.0的0.01mol/L的Tris的混合溶液充分平衡Ni柱，采用含10mmol/L的咪唑、8mol/L的尿素、0.1mol/L的NaH2P04和pH為8.0的0.01mol/L的Tris的混合液洗脫雜蛋白，再用含300醒ol/L的咪唑、8mol/L的尿素、0.1mol/L的NaH2PO4和pH為8.0的0.01mol/L的Tris的混合液洗脫目的蛋白，收集目的蛋白所在的洗脫峰溶液；將收集的目的蛋白洗脫峰溶液采用含4mol/L的尿素、0.1mol/l^NaH2PO4和0.01mol/L的Tris的混合溶液稀釋10倍，裝入透析袋，采用含2mmol/L的尿素、0.1mol/LNaH2PO4和pH為8.0的0.01mol/L的Tris的混合液透析，再采用pH為7.0的無菌水；透析袋內(nèi)液和外液的體積比為l:10，收集透析袋中的液體，4°C條件下12000r/min離心20min，取上清凍干。該融合蛋白TT-B7-H4IgV應(yīng)用于以B7-H4為靶點(diǎn)的抗腫瘤疫苗的制備。獲得pQE-30-TT-hB7-H4IgV重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)成功，并擴(kuò)大培養(yǎng)；裂菌后提取蛋白Ni-NTA親和層析純化得到純度為93%的目的蛋白，并用Westernblot鑒定。用純化的TT-B7-H4IgV蛋白免疫昆明小鼠，經(jīng)ELISA、流式細(xì)胞術(shù)測定抗血清的生物學(xué)活性，證明抗B7-H4抗血清與B7-H4有良好的結(jié)合活性，并用融合蛋白免疫B7-H4IgVSP2/0荷瘤小鼠，觀察結(jié)果表明其對腫瘤細(xì)胞生長有一定的抑制作用，證明融合蛋白TT-B7-H4IgV應(yīng)用于以B7-H4為耙點(diǎn)的抗腫瘤疫苗的制備。本發(fā)明的技術(shù)效果本發(fā)明選擇B7-H4作為靶點(diǎn)，以TT作為抗原呈遞，構(gòu)建了融合蛋白TT-B7-H4IgV;該融合蛋白經(jīng)Westernblot鑒定、測序與預(yù)期相一致；用純化的融合蛋白TT-hB7-H4IgV免疫昆明小鼠，經(jīng)ELISA、流式細(xì)胞術(shù)測定抗血清的生物學(xué)活性，證明抗B7-H4抗血清與B7-H4有良好的結(jié)合活性，說明該融合蛋白TT-hB7-H4IgV能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了抗B7-H4多克隆抗體。融合蛋白免疫SP2/0荷瘤小鼠，觀察結(jié)果表明其對腫瘤細(xì)胞生長有一定的抑制作用，為研制抗腫瘤藥物提供新的策略和途徑。圖1是重組質(zhì)粒pQE-30-TT-B7-H4IgV的質(zhì)粒圖譜，圖2重組表達(dá)質(zhì)粒pQE-30-TT-B7-H4IgV的雙酶切凝膠電泳鑒定圖圖3是重組蛋白TT-B7-H4IgV的表達(dá)純化的SDS-PAGE電泳鑒定圖。圖4是Ni-NTA柱親和層析純化洗脫蛋白的分光光度計圖譜；橫坐標(biāo)為蛋白整個純化的起止時間，縱坐標(biāo)為通過分光光度計的蛋白吸收OD值。圖5是以ELISA檢測重組蛋白TT-B7-H4IgV免疫小鼠血清抗體滴度圖。橫坐標(biāo)代表抗血清的稀釋倍數(shù)，縱坐標(biāo)代表OD值。圖6是抗11-87-114^￥抗血清與1^y刺激的B7-H4分子表達(dá)上調(diào)的SP2/0細(xì)胞結(jié)合的流式細(xì)胞術(shù)鑒定；其中，A:IFN-y刺激前SP2/0細(xì)胞上B7-H4的表達(dá)情況；B:IFN-y刺激后SP2/0細(xì)胞上B7-H4的表達(dá)情況；C:IFN-y剌激后的SP2/0細(xì)胞與B7-H4單抗的結(jié)合情況；D:IFN-y刺激后的SP2/0細(xì)胞與抗TT-B7-H4IgV抗血清的結(jié)合情況。圖7^B7-H4IgV蛋白對小鼠移植瘤的抑制作用；橫坐標(biāo)是小鼠接種腫瘤細(xì)胞后的天數(shù)；縱坐標(biāo)是腫瘤的體積。圖8是融合蛋白TT-B7-H4IgV與生理鹽水(對照)對腫瘤實(shí)體抑制圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案做詳細(xì)描述。1、重組質(zhì)粒pQE-30-TT-B7-H4IgV的構(gòu)建査詢GeneBank中人B7-H4cDNA基因序列(NM024626)，截取B7-H4胞外段IgV序列，上游引入^"柳///酶切位點(diǎn)和丁輔助細(xì)胞表位，(T輔助細(xì)胞表位為破傷風(fēng)類毒素表位TT830-843，其氨基酸序列為NSKFIGITE，以引發(fā)體內(nèi)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤疫苗更好發(fā)揮作用)，下游引入&//酶切位點(diǎn)，其重組序列如下所示(SEQ.ID.N0.2):atgagaggatcgcatcaccatc已ccatcacggatcccagtatateaaagcaaattctaaa60tttataggtataactgaagcagcagcagaattcctgagctgcacttttgaacctgacatc120aaactttctgatatcgtgatacaatggctgaaggaaggtgttttaggcttggtccatgag180ttcaaagaaggcaaagatgagctgtcggagcaggatgaaatgttccgcggccggacagca240gtgtttgctgatcaagtgatagttggcaatgcctctttgcggctgaaaaacgtgcaactc300acagatgctggcacctacaaatgttgagtcgac333其中，4-12bp為linker序列，13-30bp為6個His編碼序列，31-36bp為BamHI酶切位點(diǎn)，37-78bp為TT輔助表位肽編碼基因序列，79-87bp為linker序列，88-93bp為Ecorl酶切位點(diǎn)，94-326bp為B7-H4IgV區(qū)編碼序列，327-333bp為Sail酶切位點(diǎn)。6XHis序列的弓l入是為了融合蛋白的純化，弓l入Ecorl酶切位點(diǎn)方便日后單獨(dú)剪切TT輔助標(biāo)位肽和B7-H4IgV區(qū)編碼序列。上述序列交北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，并將其通過^^HI和多克隆位點(diǎn)克隆入載體pBluescriptIISK-G。將上述pBluescriptIISK-G-TT-hB7-H4IgV載體轉(zhuǎn)化大腸桿^DH5a，提取質(zhì)粒DNA后，將其與質(zhì)粒pQE-30分別用^mffl和&/I進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，分別回收pBluescriptIISK-G-174^7-恥18￥獲得的小片段(333bp)和pQE-30中的大片段。將回收后的小片段和大片段用T4連接酶在16'C連接過夜，轉(zhuǎn)^DH5a感受態(tài)細(xì)胞，鋪板、培養(yǎng)，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，纟^amffl和&/I雙酶切鑒定和DNA測序，獲得含有B7-H4IgV融合基因原核克隆載體，重組質(zhì)粒pQE-30-TT-B7-H4IgV構(gòu)建成功，其多克隆位點(diǎn)分布如圖l所示。2重組質(zhì)粒pQE-30-TT-B7-H4IgV的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備取DH5a甘油菌種按1:100的比例接種入的LB培養(yǎng)液中，37"C振蕩培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)接一次，繼續(xù)培養(yǎng)至OD6oo約0.4左右。(無菌操作)將菌液冰浴10min，離心(3000rpmX5min，4°C)后棄去上清，加入1/2體積預(yù)冷的100mmol/LCaCl2，輕輕吹起沉淀，冰浴40min，離心(3000rpmX5min，4'C)，棄上清后加入1/25體積的含25%甘油的100mmol/LCaCl2，吹起沉淀，分裝入Eppendorf管中，-70"C保存?zhèn)溆?。感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)將大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞從-7(TC中取出，冰浴融解5-10分鐘，加入含有重組pQE-30-TT-hB7-H4IgV質(zhì)粒，一管感受態(tài)加lPl的重組質(zhì)粒，輕微混勻，繼續(xù)冰浴30分鐘，然后鋪板，LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，37'C孵箱培養(yǎng)過夜。質(zhì)粒的提取與鑒定在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后37'C過夜培養(yǎng)的培養(yǎng)皿上挑取邊緣整齊，生長狀態(tài)良好的克隆，接種到10ml含氨節(jié)Amp的LB培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)8小時，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用BamHI和SalI雙酶切后，行瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有插入片斷以及插入的片斷是否與預(yù)期的長度一致，將酶切鑒定陽性的克隆送北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行DNA測序。結(jié)果如圖2所示:其中，泳道l:DNAmarker(DL2000)，泳道2:重組質(zhì)粒pQE-30-TT-hB7-H4IgVBamHI和SalI雙酶切；該插入片段的基因序列與預(yù)期(SEQ.ID.NO.2)完全一致，說明重組質(zhì)粒pQE-30-TT-hB7-H4IgV構(gòu)建成功。3重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化與鑒定pQE-30-TT-B7-H4IgV工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)將含有pQE-30-TT-B7-H4IgV重組質(zhì)粒的菌株，接種于10ml含Amp的LB培養(yǎng)液中，于37"C培養(yǎng)過夜，次日按1%的比例轉(zhuǎn)接于10ml含Amp的LB培養(yǎng)液中，于37'C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(A600nm=0.40.6)時，加入IPTG至終濃度為1mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)，于37'C振蕩培養(yǎng)3-5h。離心收集菌體，200810232711.6說明書第17/26頁夜，次日轉(zhuǎn)接一次，繼續(xù)培養(yǎng)-20。C保存。融合蛋白的純化和復(fù)性取含pQE-30-TT-B7-H4IgV重組質(zhì)粒的菌株大量誘導(dǎo)菌液，5000rpm離心10min，收菌，超聲裂菌；4。C條件下12000rpm離心20min，分別收集上清液和沉淀。將沉淀用8mol/L尿素溶液重懸，4'C下靜置溶解。將溶解的沉淀和上清分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，對目的蛋白的表達(dá)形式進(jìn)行分析，證實(shí)目的蛋白存在于沉淀中，說明蛋白是以包涵體的形式表達(dá)。按5g菌體加50mLPBS溶液的比例將菌體重懸，冰浴條件下進(jìn)行超聲裂菌；12000rpm離心15min，分別收集上清液和沉淀，將沉淀用4mol/L尿素洗滌，4"C條件下12000r/min離心20min;按lg沉淀加10mL的含0.1MNaH2PO4和0.01MTris(pH8.0)的8M尿素溶液，4。C攪拌2h，12000rpm離心15min，共離心2次，收集上清。用Ni-NTA柱親和層析純化上清所溶解的目的蛋白沉淀，因?yàn)镹i-NTA柱上帶的基團(tuán)能夠與融合蛋白的6XHis結(jié)合。用5mlA液(8mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，pH8.0的0.01mol/LTris)充分平渙jNi柱，先用B液(10mmol/L咪唑，8mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，pH8.0的0.01mol/LTris)洗脫雜蛋白，再用C液(300mmol/L咪唑，8mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，pH8.0的0.01mol/LTris)洗脫目的蛋白，收集目的蛋白洗脫峰。目的蛋白的復(fù)性方法為濃度梯度法，具體實(shí)施方案是，先將收集的目的蛋白洗脫峰以稀釋液(4mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，0.01mol/LTris)稀釋10倍，裝入透析袋，先透析至透析頓液(2mmol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4,pH8.0的0.01mol/LTris)，再透析入pH7.0的無菌水；透析袋內(nèi)液和外液的體積比為l:10。收集透析袋中的液體，4。C條件下12000r/min離心20min，取上清凍干。上清凍千再以10ml生理鹽水復(fù)溶，用Loweiy法測定蛋白濃度為lmg/ml,用灰度掃描法檢測蛋白純度為93%,將樣品蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用抗Ws單抗進(jìn)行WesternBlot鑒定，結(jié)果顯示目的蛋白TT-B7-H4IgV與節(jié)iis單抗有良好的反應(yīng)'性。融合蛋白TT-B7-H4IgV表達(dá)純化的鑒定重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，穩(wěn)定篩選，構(gòu)建工程菌。經(jīng)發(fā)酵后，收集大量菌體，裂菌顯示目的蛋白以包涵體形式存在，經(jīng)對包涵體洗滌，Ni-NTA柱親和層析，復(fù)性后SDS-PAGE顯示蛋白單一條帶，Western-blot鑒定顯示能與ites單克隆抗體特異性結(jié)合。其SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果、Westem-blot鑒定結(jié)果如圖3所示，其中，泳道l:蛋白mark從上至下分子量依次為U6000Da、66200D、45000Da、35000Da、25000Da、18400Da、14400Da;泳道2:誘導(dǎo)前的含pQE-30-TT-B7-H4IgV重組質(zhì)粒的全菌蛋白；泳道3:誘導(dǎo)后的含pQE-30-TT-B7-H4IgV重組質(zhì)粒的全菌蛋白；泳道4:超聲裂菌離心后的上清;泳道5:超聲裂菌后離心后的沉淀；泳道6:超聲裂菌后離心后的沉淀用4mol/L尿素洗滌；泳道7:Ni-NTA柱親和層析純化洗脫的雜質(zhì)峰；泳道8:融合蛋白TT-B7-H4IgV的Ni-NTA柱親和層析純化洗脫峰；泳道9;融合蛋白TT-B7-H4IgVWestem-blot鑒定。泳道2與3比較，明顯發(fā)現(xiàn)泳道3多出14.4KDa的目的蛋白顯色帶，說明經(jīng)過誘導(dǎo)后目的蛋白表達(dá)；泳道4、5、6比較說明目的蛋白出現(xiàn)在超聲裂菌后離心后的沉淀中，目的蛋白以包涵體形式表達(dá)，且經(jīng)4mol/L尿素洗滌后溶解；泳道7與8比較說明目的蛋白經(jīng)過Ni-NTA柱親和層析純化得到純化的融合蛋白TT-B7-H4IgV。泳道9的用抗his單抗進(jìn)行的WesternBlot鑒定說明融合蛋白TT-B7-H4IgV與擲iis單抗有良好的反應(yīng)性。圖4是Ni-NTA柱親和層析純化洗脫蛋白的分光光度計圖譜，橫坐標(biāo)為蛋白整個純化的起止時間，縱坐標(biāo)為通過分光光度計的蛋白吸收OD值；圖左的峰(峰1)為洗脫的雜蛋白峰，圖右的峰(峰2)為目的蛋白TT-B7-H4IgV洗脫峰，結(jié)果顯示得到純化的融合蛋白TT-B7-H4IgV濃度相當(dāng)高，用灰度掃描法檢測蛋白純度為93%。4.動物免疫實(shí)驗(yàn)和抗血清免疫學(xué)活性鑒定4.1昆明小鼠分組與免疫方案分組將30只昆明小鼠分成3組，分別為生理鹽水對照組，TT-B7-H4IgV+生理鹽水組和TT-B7-H4IgV+Freund佐劑組。在第4次免疫后10天摘眼球采血，測定血清中細(xì)7-H4抗體效價及其與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合作用。免疫方案背部皮下多點(diǎn)注射；TT-B7-H4IgV:50pg/只；第l次使用完全佐劑，第2和3次使用不完全佐劑，第4次不用佐劑，作腹腔注射；佐劑溶液總體積為200nL/只，分別隔周注射；第4次，使用TT-B7-H4IgV50pg/只，生理鹽水200jnL/只，腹腔注射。4.2抗血清活性鑒定4.2.1ELISA法測定血清抗TT-B7-H4IgV抗體效價在第4次免疫后10天采血，收集抗TT-B7-H4IgV抗血清，通過間接ELISA測定血清^CB7-H4抗體效價(參見《細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》)，每個樣品均設(shè)6個孔。ELISA實(shí)驗(yàn)方法所需溶液的配制a.包被緩沖液碳酸鹽緩沖液0.32gNa2CO3:(終濃度0.015mol/L)，0.59gNaHC03(終濃度O,035mol/L)，純水定容至200rnL(pH9.6)，有效期兩周；b.洗滌液含0.5%Tween-20的PBS(pH7.4);c.封閉液含1XBSA的洗滌液；d.稀釋液含(X5^BSA的洗滌液；e.底物緩沖液1.84gNa2HP04'12H20、檸檬酸0.51g純水定容至100mL(pH5.0);f.底物顯色液8mgOPD，30nL3Q%H2O2;h.終止液lmol/LH2S04。操作方法a包被取96孔ELISA板，將純化的TT-B7-H4IgV蛋白溶解于包被緩沖液中(0.5ng/mL)，按100pL/孔加入板孔中，4"C包被過夜，倒掉包被液，加入封閉液，室溫封閉2h;b棄去封閉液，用洗滌液洗6次，每次2min分別加入倍比100、1000、10000、100000的稀釋的抗TT-B7-H4IgV抗血清，IOOmL/孔，室溫孵育lh;c棄去抗TT-B7-H4IgV抗血清，用洗滌液洗6次，每次3min加入HRP標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgG二抗，100jaL/孔，室溫孵育lh;d棄去二抗，用洗滌液洗6次，每次3min，加入底物顯色液，lOO^L/孔，室溫下顯色10-20min;f加入終止液，50jjL/孔，終止反應(yīng)酶標(biāo)儀讀數(shù)，測定每孔在490nm的吸光值。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組與對照組00值之比大于2.0時的最大稀釋度判為該抗血清的抗體滴度；實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，結(jié)果顯示獲得的抗血清中的多抗與純化后的TT-B7-H4IgV蛋白有較好的結(jié)合活性，陰性對照與TT-B7-H4IgV蛋白無特異性結(jié)合。其中，非佐劑免疫組(溶解于生理鹽水)和佐劑免疫組(與Freund福氏佐劑混合)產(chǎn)生的抗TT-B7-H4IgV抗體的效價都達(dá)到l:10000，結(jié)果證實(shí)經(jīng)免疫后獲得的抗TT-B7-H4IgV抗血清可與TT-B7-H4IgV蛋白特異性結(jié)合。4.2.2抗11^7-1141§丫抗血清與15^Y刺激的b7-h4分子表達(dá)上調(diào)的sp2/0細(xì)胞結(jié)合鑒定4.2.2.1IFN-Y對TT-B7-H4IgV在SP2/0細(xì)胞上表達(dá)的剌激實(shí)驗(yàn)小鼠SP2/0細(xì)胞(小鼠骨髓瘤細(xì)胞)低表幼7-H4蛋白，傳代后加入終濃度為20ng/ml的IFN-y刺激2天后,用流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠抗小鼠B7-H4單抗(大鼠抗小鼠B7-H4單克隆抗體購于R&D公司)分別與IFN-y刺激前和刺激后的SP2/0細(xì)胞的結(jié)合情況。所需溶液的配制a儲存液(DPBSxlO):NaCl80g，KC12g，Na2HP04U.5g，KH2P042g，蒸餾水加至1000ml，臨用時用蒸餾水l:IO稀釋。b洗滌液:DPBSxl900ml，F(xiàn)CS50ml(終濃度5%),4%NaN350ml(終濃度0.2%)。c固定液:DPBSxl1000ml，葡萄糖20g(終濃度2%)，甲醛10ml，NaN30.2g(終濃度0.02)。操作步驟-(1)取對數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，用10%FCSDMEM(胎牛血清濃度為10。/。的DMEM培養(yǎng)基)調(diào)整細(xì)胞濃度為lxio7/ml。(2)各取40plSP2/0細(xì)胞懸液分別加入預(yù)先有2ulAnti-mB7-H4單抗、2plAnti-Blys單抗(對照)的塑料離心管中，再各取40^1IFN-Y刺激后的SP2/0細(xì)胞懸液分別加入預(yù)先有10ulAnti-mB7-H4單抗、10filAnti-Blys單抗(對照)塑料離心管，每管加50pl1:20(用DPBS稀釋)滅活正常兔血清，4。C靜置30min，間隔15min重懸一次。(3)用洗滌液洗滌3次，每次加入lml(1000rpmx5min，4°C)。(4)棄上清，加入50pl1:50稀釋的FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的羊抗鼠二抗，充分振搖，4'C避光靜置30min，間隔15min重懸一次。(5)用洗滌液洗滌3次，每次加入lmL(1000rpmx5min，4°C)。(6)加400^1固定液固定后，F(xiàn)CM(流式細(xì)胞計數(shù))分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6A、B所示SP2/0細(xì)胞上表達(dá)B7-H4分子(8.3%)，發(fā)現(xiàn)IFN-Y可以剌激B7-H4在SP2/0細(xì)胞膜上表達(dá)增多(52.0%)。4.2.2.2抗TT-B7-H4IgV抗血清與IFN-Y刺激的SP2/0細(xì)胞結(jié)合鑒定用IFN-Y刺激后的SP2/0細(xì)胞分別與大鼠抗小鼠B7-H4單抗和已獲得的抗血清相互作用，以生理鹽水組抗血清作為陰性對照，F(xiàn)ITC染色顯示流式細(xì)胞術(shù)檢測。大鼠抗小鼠B7-H4單抗(濃度500yg/ml)2u1和抗TT-B7-H4IgV抗血清10P1與6X1()S個細(xì)胞有較好的結(jié)合活性，檢測結(jié)果分別為52.8%、48.5%;如圖6C、D所示；證明用融合蛋白TT-B7-H4IgV免疫小鼠產(chǎn)生的抗血清能夠有效地和表達(dá)在SP2/0腫瘤細(xì)胞表面的B7-H4結(jié)合，說明用融合蛋白TT-B7-H4IgV免疫小鼠產(chǎn)生了抗B7-H4的多克隆抗體，且該多克隆抗體可以與表達(dá)在SP2/0細(xì)胞上的B7-H4結(jié)合(48.5%)。5抑瘤實(shí)驗(yàn)5.1分組并免疫小鼠BALB/c小鼠，共20只，體重1820g，隨機(jī)分2組，每10只一組。A組實(shí)驗(yàn)組，按照上述4.1有關(guān)"B7-H4IgV+生理鹽水組"所述的免疫方案，用生理鹽水溶解B7-H4IgV蛋白進(jìn)行免疫，四次免疫完畢后隔周持續(xù)進(jìn)行腹腔免疫；B組對照組，僅用生理鹽水，免疫方法與A組相同。5.2接種腫瘤細(xì)胞第4次免疫后10天檢測抗體滴度，發(fā)現(xiàn)A組小鼠抗血清中抗B7-H4抗體滴度均升高達(dá)到l:10000以上；取對數(shù)生長期狀態(tài)的SP2/0腫瘤細(xì)胞，按照5xl0V只接種至小鼠背部皮下，12天后腫瘤組織生長至可檢測的水平。每周觀察小鼠體內(nèi)抗體滴度變化，待觀察到形成腫瘤組織塊后隔天檢測腫瘤體積和小鼠體重，小鼠死亡時取出腫瘤組織稱重。腫瘤體積(0113)=寬度(cm)2x長度(cm)X0.52。統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以3F士SD表示，采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，p〈0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示在實(shí)驗(yàn)的整個過程中，實(shí)驗(yàn)組有8只小鼠成瘤，對照組有9只小鼠成瘤，兩組的成瘤小鼠都不存在腫瘤完全消退的情況，如圖8所示。對于腫瘤體積測量如圖7所示，在接種腫瘤細(xì)胞第14天(第一次測量)，A組(實(shí)驗(yàn)組)的小鼠腫瘤組織體積和B組(對照組)小鼠的腫瘤組織大小相差不大，P>0.05;在接種腫瘤細(xì)胞第16天(第二次測量)，兩組小鼠的腫瘤組織大小對比分析，無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05;到接種腫瘤細(xì)胞第18天(第三次測量)，A組的腫瘤組織生長速度有低于B組的趨勢，但仍無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05;至U了接種腫瘤的第20天(第四次測量)，B組小鼠的腫瘤生長速度明顯快于A組小鼠的生長速度，B組最大的腫瘤組織塊體積達(dá)0.86cm3，A組最大的腫瘤體積為0.370113，統(tǒng)計兩組的腫瘤組織大小，PO.05;在接種腫瘤細(xì)胞的第22天(第五次測量)，A組小鼠的腫瘤組織塊大小無明顯的變化，B組小鼠的腫瘤組織增長迅速，兩組腫瘤組織大小區(qū)別進(jìn)一步加大，PO.05;到接種后的第24天(第六次測量)，B組(對照組)有一只小鼠死亡，對兩組的腫瘤細(xì)胞生長情況觀察終止，測量兩組小鼠的腫瘤組織大小，B組最大的腫瘤組織塊為1.30cm3，A組最大的腫瘤組織塊為0.60cm3，統(tǒng)計兩組的腫瘤體積大小，B組的腫瘤體積明顯大于A組的腫瘤體積，P<0.05。小鼠死亡后取出腫瘤稱重，其結(jié)果如表l所示。在接種腫瘤細(xì)胞約18天后，對照組小鼠的腫瘤生長速度明顯快于實(shí)驗(yàn)組，且小鼠腫瘤開始破潰，明顯消瘦，活動減少，但兩組小鼠的體重均無明顯減輕，兩者間體重對比也無統(tǒng)計學(xué)意義。與生理鹽水組相比，B7-H4IgV組腫瘤體積大小在接種腫瘤細(xì)胞后20天，22天，24天與生理鹽水組有統(tǒng)計學(xué)差異(t=4.576，P=0.0004)，如圖7所示。B7-H4IgV組的腫瘤重量小于生理鹽7K對照組，B7-H4IgV蛋白的抑瘤率達(dá)到48.6%。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>融合蛋白TT-B7-H4IgV氨基酸或核苷酸序列表<110>中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)〈120〉融合蛋白TT-B7-H4IgV及其制備方法和用途〈160〉2〈210〉1〈211>108〈212>PRT<213〉人工序列〈400〉1MetArgGlySerHisHisHisHisHisHisGlySerGinTyrlieLysAlaAsnSerLys15101520PhelieGlylieThrGluAlaAlaAlaGluPheLeuSerCysThrPheGluProAsplie2125303540LysLeuSerA印lieVallieGinT卬LeuLysGluGlyValLeuGlyLeuValHisGlu4145505560PheLysGluGlyLysA印GluLeuSerGluGinAspGluMetPheArgGlyArgThrAla6165707580ValPheAlaAspGinVallieValGlyAsnAlaSerLeuArgLeuLysAsnValGinLeu81859095100ThrA印AlaGlyThrTyrLysCys101105108〈210〉2〈211〉333〈212>DNA〈213>人工合成催〉2atgagaggatcgcatcaccatcaccatcacggatcccagtatataaaagcaaattctaaa60tttaitaggtataactgeiagcagcagcagaattcctgagctgcacttttgaacctgacatc120aaactttctgatatcgtgatacaatggctgaaggaaggtgtttt郷cttggtccatgag180ttc咖gaaggcaa卿tgagctgtcggagcaggatgaaatgttccgcggccggacagcs240gtgtttgctgatcaagtgatagttggcaatgcctctttgcggctgaaaaacgtgcaactc300acagatgctggcacctacaaatgttgagtcgac33權(quán)利要求1、一種融合蛋白TT-B7-H4IgV，其特征在于，所述的B7-H4IgV為B7-H4分子胞外區(qū)可變區(qū)IgV，TT為T輔助細(xì)胞表位肽或破傷風(fēng)類毒素表位，在融合蛋白的N端還連接6個His殘基，其連接方式為6×His-TT-B7-H4IgV；其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2、一種融合蛋白TT-B7-H4IgV的重組核苷酸序列，其特征在于，其連接方式為6XHis序列-BamHI酶切位點(diǎn)-TT表位序列-EcorI酶切位點(diǎn)-B7-H4IgV重組序列-SalI酶切位點(diǎn)，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3、如權(quán)利要求2所述的融合蛋白TT-B7-H4IgV的重組核苷酸序列，其特征在于構(gòu)建于重組質(zhì)粒pQE-30-TT-hB7-H4IgV，TT-hB7-H4IgV重組核苷酸序列通過BamHI、Sail多克隆位點(diǎn)連接于質(zhì)粒pQE-30中。4、一種融合蛋白TT-B7-H4IgV的制備方法其特征在于1)重組質(zhì)粒pQE-30-TT-B7-H4IgV的構(gòu)建根據(jù)人B7-H4的cDNA基因序歹"截取B7-H4胞外段IgV序列，上游弓|入^m///酶切位點(diǎn)和T輔助細(xì)胞表位，T輔助細(xì)胞表位為破傷風(fēng)類毒素表位TT830-843，其氨基酸序列為Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu，下游引入&//酶切位點(diǎn)，其重組序列如SEQ.ID.N0.2所示該重組序列中的4-12bp為linker序列，13-30bp為6個His編碼序列，31-36bp為BamHI酶切位點(diǎn)，37-78bp為TT輔助表位肽編碼基因序列，79-87bp為linker序列，88-93bp為Ecorl酶切位點(diǎn)，94_326bp為B7-H4IgV區(qū)編碼序列，327-333bp為Sail酶切位點(diǎn)；通過5amffl和&/I多克隆位點(diǎn)將上述重組序列克隆入載體pBluescriptIISK-G;將上述pBluescriptIISK-G-TT-hB7-H4IgV載體轉(zhuǎn)化大腸桿^DH5a，提取質(zhì)粒DNA后，將其與質(zhì)粒pQE-30分別用萬"mffl和^/I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，分別回收pBluescriptIISK-G-TT-hB7-H4IgV獲得的小片段333bp禾t1pQE-30中的大片段，將回收后的小片段和大片段用T4連接酶在16'C連接過夜，轉(zhuǎn)4tDH5a感受態(tài)細(xì)胞，鋪板、培養(yǎng)，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，纟^amHI和&/I雙酶切鑒定和DNA測序，獲得含有B7-H4IgV融合基因原核克隆載體，重組質(zhì)粒pQE-30-TT-B7-H4IgV構(gòu)建成功；2)重組質(zhì)粒pQE-30-TT-B7-H4IgV的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備取DH5a甘油菌種按1:100的體積比接種入LB培養(yǎng)液，在37。C振蕩培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)接一次，繼續(xù)培養(yǎng)至OD,為0.4-0.6，無菌操作下將菌液冰浴10min，在離心為3000rpmX5min，溫度為4。C下棄去上清液，加入沉淀物1/2體積預(yù)冷的10Ommol/L的CaCl2，吹起沉淀，冰浴40min，在離心為3000rpmX5min，溫度為4'C下棄去上清液后加入沉淀物1/25體積的含質(zhì)量濃度25%的甘油和10Ommol/L的CaCl2的混合溶液再次吹起沉淀，分裝入Eppendorf管中，-70°(:保存?zhèn)溆?；感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)將大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞從-7(TC中取出，冰浴融解5-10分鐘，加入含有重組質(zhì)粒pQE-30-TT-hB7-H4IgV的懸液，輕微混勻，繼續(xù)冰浴30分鐘，然后鋪板，LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，37t:孵箱培養(yǎng)過夜；3)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化pQE_30-TT-B7-H4IgV工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)將含有pQE-30-TT-B7-H4IgV重組質(zhì)粒的菌株接種于10ml含Amp的LB培養(yǎng)液中，于37匸培養(yǎng)過夜，次日按1%的體積比轉(zhuǎn)接于10ml含Amp的LB培養(yǎng)液中，于37-C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期A600nm=0.40.6時，加入EPTG至終濃度為lmmol/L誘導(dǎo)表達(dá)，于37"C振蕩培養(yǎng)3-5h，離心收集菌體，-20。C保存；按5g菌體加50mL的PBS溶液的比例將重組質(zhì)粒表達(dá)的菌體重懸，冰浴條件下進(jìn)行超聲裂菌；12000rpm離心15min，分別收集上清液和沉淀，將沉淀用4mol/L尿素洗滌，4"C條件下12000r/min離心20min;按lg沉淀力口10mL的含0.1M的NaH2P04、pH8.0的0.01M的Tris和8M的尿素的混合溶液，4"C攪拌2h，12000rpm離心15min，共離心2次，收集上清；用M-NTA柱親和層析純化上清所溶解的目的蛋白沉淀，同樣按lg沉淀加5ml的含8mol/L尿素、0.1mol/L的NaH2PO4和pH為8.0的0.01mol/L的Tris的混合溶液充分平衡Ni柱，采用含10mmol/L的咪唑、8mol/L的尿素、0.1mol/L的NaH2PO4和pH為8.0的0.01mol/L的Tris的混合液洗脫雜蛋白，再用含300mmol/L的咪唑、8mol/L的尿素、0.1mol/L的NaH2PO4和pH為8.0的0.01mol/L的Tris的混合液洗脫目的蛋白，收集目的蛋白所在的洗脫峰溶液；將收集的目的蛋白洗脫峰溶液采用含4mol/L的尿素、0.1md/L的NaH2P04和0.01mol/L的Tris的混合溶液稀釋10倍，裝入透析袋，采用含2mmol/L的尿素、0.1mol/LNaH2PO4和pH為8.0的0.01mol/L的Tris的混合液透析，再采用pH為7.0的無菌水；透析袋內(nèi)液和外液的體積比為h10，收集透析袋中的液體，4°C條件下12000r/min離心20min，取上清凍干。5、如權(quán)利要求1所述的融合蛋白TT-B7-H4IgV，其特征在于，該融合蛋白TT-B7-H4IgV應(yīng)用于以B7-H4為耙點(diǎn)的抗腫瘤疫苗的制備。全文摘要融合蛋白TT-B7-H4IgV及其制備方法和用途，所述的B7-H4IgV為B7-H4分子胞外區(qū)可變區(qū)IgV，TT為T輔助細(xì)胞表位肽或破傷風(fēng)類毒素表位，在融合蛋白的N端還連接6個His殘基，其連接方式為6×His-TT-B7-H4IgV；該融合蛋白TT-B7-H4IgV應(yīng)用于以B7-H4為靶點(diǎn)的抗腫瘤疫苗的制備。本發(fā)明選擇B7-H4作為靶點(diǎn)，以TT作為抗原呈遞，構(gòu)建了融合蛋白TT-B7-H4IgV；該融合蛋白經(jīng)Westernblot鑒定、測序與預(yù)期相一致；用純化的融合蛋白TT-hB7-H4IgV免疫昆明小鼠，經(jīng)ELISA、流式細(xì)胞術(shù)測定抗血清的生物學(xué)活性，證明抗B7-H4抗血清與B7-H4有良好的結(jié)合活性，說明該融合蛋白TT-hB7-H4IgV能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了抗B7-H4多克隆抗體。文檔編號C12N15/70GK101544697SQ20081023271公開日2009年9月30日申請日期2008年12月11日優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日發(fā)明者張英起,朱文華申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)