專利名稱：一種生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人體組織培養(yǎng)裝置，涉及生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品，特別是組織 工程皮膚的生物反應(yīng)器。
技術(shù)背景組織工程是近三十年來發(fā)展起來的新興交叉學(xué)科領(lǐng)域，其最終目的是生 產(chǎn)出用于恢復(fù)、維持、或增進人體受損器官或組織結(jié)構(gòu)和功能的產(chǎn)品，例 如組織工程皮膚、骨、軟骨、肌腱等。而組織工程皮膚是進展最快的 -類產(chǎn)品，目前已有多個產(chǎn)品用于臨床。美國Organogenesis公司生產(chǎn)的 Apligraf是第一種同時含表皮和真皮層的組織工程皮膚，是以膠原為支架 的代表，其生產(chǎn)過程是采用傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)方法，先將成纖維細胞與牛膠 原溶液混合制成細胞凝膠，培養(yǎng)4-6天后再在表面接種角質(zhì)形成細胞，浸 沒培養(yǎng)一周后改用氣液界面培養(yǎng)兩周，這種手工制備方法操作復(fù)雜，不易 大規(guī)模生產(chǎn)。Dermagraft是以合成材料為支架的代表，其基本過程是將第 8代新生兒包皮成纖維細胞種植于聚乳酸、聚羥基乙酸纖維網(wǎng)中，培養(yǎng)14 17天，成纖維細胞大量增殖并分泌膠原、纖維粘連蛋白、蛋白聚糖、生長 因子等，形成由成纖維細胞、細胞外基質(zhì)和可降解生物材料構(gòu)成的人工皮 膚，目前已經(jīng)實現(xiàn)通過Dermagraft生物反應(yīng)器來生產(chǎn)，這是一種專用的反 應(yīng)器，它由多個多管生長系統(tǒng)組成，每一個生長系統(tǒng)包括了多個操作單元， 每個操作單元垂直附在生長系統(tǒng)上，操作單元上有Vicryl支架并經(jīng)激光焊 接在EVA (乙烯-乙烯基乙酸鹽)上，成纖維細胞注入時會粘附在Vicryl 支架上并存活，產(chǎn)生細胞外基質(zhì)和細胞因子，形成真皮組織， 一次可以生 長出上千個工程化的Ddermagraft (見《組織工程方法》楊志明主譯，化 學(xué)工業(yè)出版社，北京2006年第1版P1034 )。但是此生物反應(yīng)器存在以下 一些缺點 一是支架是垂直的，細胞粘附于支架的數(shù)量有限，二是操作單 元的生產(chǎn)相對較復(fù)雜，三是需要的培養(yǎng)液需要量大，四是反應(yīng)器體積較大， 五是只能是適合合成支架類產(chǎn)品的培養(yǎng)，六是不能培養(yǎng)雙層組織工程皮膚， 不能做氣液界面培養(yǎng)。在現(xiàn)有技術(shù)中，孫濤報道了一種適合于皮膚氣液界面培養(yǎng)的簡易生物反應(yīng)器(Sun T， Norton D， Haycock JW， et al. Development of a closed bioreactor system for culture of tissue-engineered skin at an air-liquid interface. Tissue Engineering 2005， 11:1824_1831 )， 它是 由一個蠕動泵、 一個培養(yǎng)小室和兩個培養(yǎng)液體瓶組成的封閉式環(huán)路結(jié)構(gòu)， 在培養(yǎng)小室內(nèi)有細胞接種網(wǎng)架、細胞接種限制環(huán)、支架材料和支撐架，還 有一個微型泵能夠?qū)?5%空氣/5%0)2壓入培養(yǎng)小室內(nèi)以維持合適的pH值。 但它只能用于實驗室的研究，而且只適合于合成材料為支架的組織工程皮 膚產(chǎn)品的研究。有一件名稱為《組織工程皮膚體外構(gòu)建的新型生物反應(yīng)器》 的CN2565838Y于2003年8月13日公開，其結(jié)構(gòu)與孫濤的反應(yīng)器類似但復(fù) 雜，另外還設(shè)計了培養(yǎng)液環(huán)形通道、儲液槽、支撐園臺等結(jié)構(gòu)。還有一件 名稱為《雙層活性皮膚體外構(gòu)建的灌注式生物反應(yīng)器系統(tǒng)》的CN1560225A 于2005年01月05日公開，它包括加液裝置、灌注式生物反應(yīng)器、收液裝 置、液體回流裝置和供氣裝置，其缺點是體積大、控制閥和管路過多。匕 述現(xiàn)有技術(shù)的生物反應(yīng)器都只能用于組織工程皮膚的培養(yǎng)，而對其它組織 工程產(chǎn)品如骨、軟骨、肌腱等的體外構(gòu)建不適用。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種生產(chǎn)組織 工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，使之區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)，結(jié)構(gòu)緊湊，體積小，適用 范圍廣，并能實現(xiàn)組織工程產(chǎn)品的規(guī)?；a(chǎn)和確保產(chǎn)品質(zhì)量。采取以下技術(shù)方案來實現(xiàn)本發(fā)明的目的。一種生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，包括有廢液瓶，補液瓶，儲液 瓶，四氣混合器，酸液瓶，堿液瓶，它還有一個由反應(yīng)盒體、反應(yīng)盒蓋、層盤、恒溫夾套和密封墊圈組裝而成的生物反應(yīng)盒；反應(yīng)盒蓋上設(shè)有液體 進口和空氣交換口，在靠近液體進口的反應(yīng)盒蓋底面設(shè)有液體擋板，恒溫 夾套設(shè)置在反應(yīng)盒體外圍，在反應(yīng)盒體一側(cè)下部設(shè)有穿過恒溫夾套的液體 出口，密封墊圈安裝在反應(yīng)盒蓋與反應(yīng)盒體端口之間；層盤是具有邊壁的 方形盤，在盤面內(nèi)均布設(shè)置有絲網(wǎng)模具，絲網(wǎng)模具可根據(jù)產(chǎn)品品種要求而 設(shè)計成圓型、方型或異型結(jié)構(gòu)，在盤面一端設(shè)有高度低于邊壁的溢流堰， 溢流堰與相鄰邊壁之間開有溢流槽，與溢流槽相對一端的盤底兩邊設(shè)有定位腳，溢流堰相鄰邊壁伸出盤底與定位腳等高使盤面水平；層盤在反應(yīng)盒 體內(nèi)由下而上正向反向交替疊加安裝，使上一層層盤的溢流槽在下一層層 盤的溢流槽相對一端的上面，最下層層盤的溢流槽一端靠近反應(yīng)盒體的液 體出口，最上層層盤的定位腳一端位于液體擋板下方。上述生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，所說的生物反應(yīng)盒的液體進口 用管道通過蠕動泵與儲液瓶連通，所說的生物反應(yīng)盒的液體出口用管道通 過蠕動泵和控制閥與儲液瓶和廢液瓶并聯(lián)連通，所說的生物反應(yīng)盒的空氣 交換口用管道與空氣過濾器連通。上述生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，所說的補液瓶、酸液瓶和堿液瓶分別用管道通過蠕動泵與儲液瓶連通，四氣(02、 N2、 C02和空氣)混合 器用管道通過空氣過濾器與儲液瓶連通。補液瓶、儲液瓶和廢液瓶中盛裝 細胞培養(yǎng)液。酸液瓶、堿液瓶和四氣混合器用于調(diào)節(jié)儲液瓶內(nèi)細胞培養(yǎng)液 的溶氧值和pH值上述生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，所說的儲液瓶在外圍設(shè)置有恒 溫夾套，并在儲液瓶中設(shè)置有分別與溶氧值測定儀和pH值測定儀相連的溶 氧電極和pH電極，并可通過電腦對儲液瓶內(nèi)細胞培養(yǎng)液的溶氧值和pH值 進行控制。上述生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，所說的廢液瓶、補液瓶、儲液 瓶、酸液瓶和堿液瓶分別用管道與空氣過濾器連通。廢液瓶設(shè)置有取液管， 以便檢測使用過的細胞培養(yǎng)液的質(zhì)量。在生物反應(yīng)盒和儲液瓶的恒溫夾套內(nèi)，用溫控液循環(huán)并通過溫控器將 生物反應(yīng)盒的溫度控制在所要求的范圍內(nèi)。本發(fā)明生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，其工作基本過程是先在層 盤的絲網(wǎng)模具內(nèi)植入擬生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的支架材料(膠原類凝膠溶液或 支架)、種子細胞或細胞與支架的復(fù)合物，并將生物反應(yīng)盒的溫度控制在所 要求的范圍內(nèi)，再將質(zhì)量合格的細胞培養(yǎng)液用蠕動泵從儲液瓶送入生物反 應(yīng)盒的液體進口，同時用空氣交換口使空氣過濾并使生物反應(yīng)盒內(nèi)外的壓 力調(diào)節(jié)平衡，細胞培養(yǎng)液從液體擋板引流到最上一層層盤中，然后翻過溢 流堰從溢流槽流到下一層層盤中，如此逐層交替正反向流動，直至從最下 一層層盤的溢流槽流到生物反應(yīng)盒的底部；由于溢流堰的作用使每一層層 盤內(nèi)絲網(wǎng)模具中的支架材料、種子細胞或細胞與支架的復(fù)合物恰好被流動的培養(yǎng)液蓋上，從而使絲網(wǎng)模具內(nèi)待培養(yǎng)的產(chǎn)品始終處于氣液界面培養(yǎng)狀 態(tài)；生物反應(yīng)盒底部的細胞培養(yǎng)液從液體出口用蠕動泵再送回儲液瓶中循 環(huán)使用；細胞培養(yǎng)液循環(huán)使用一段時間后，要將其送入廢液瓶中檢測使用 過的細胞培養(yǎng)液的質(zhì)量，如質(zhì)量下降應(yīng)及時用蠕動泵從補液瓶補充入儲液 瓶中。這樣，使絲網(wǎng)模具內(nèi)待培養(yǎng)的產(chǎn)品經(jīng)過一定時期的細胞培養(yǎng)液氣液 界面培養(yǎng)，直至成長為質(zhì)量合格的組織工程產(chǎn)品。本發(fā)明生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu) 點(1)擴展性好，生物反應(yīng)盒內(nèi)的層盤數(shù)量可多可少，產(chǎn)量大時可以通 過增加層盤數(shù)量或是增加生物反應(yīng)盒便可擴產(chǎn)，適合規(guī)模化生產(chǎn)。(2)層 盤和生物反應(yīng)盒可大可小，根據(jù)產(chǎn)量能夠進行隨間縮放。(3)結(jié)構(gòu)簡單， 體積小，由于采用層盤一層層疊加，既保證了細胞培養(yǎng)所需要的面積，又 大大地縮小了設(shè)備占用面積。(4)管路少，層盤的設(shè)計是采用水自然流向 的原理，不需要過多的管路。(5)通用性較強、適用范圍廣，不僅適合組 織工程皮膚的氣液界面培養(yǎng)生產(chǎn)組織工程皮膚，還可用于合成支架類組織 工程產(chǎn)品(如骨、軟骨、肌腱等)的生產(chǎn)。


圖1為本發(fā)明生物反應(yīng)器的整體結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明生物反應(yīng)器中層盤的盤面結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為圖1中的層盤放大結(jié)構(gòu)示意圖。在圖中，A—生物反應(yīng)盒，l一反應(yīng)盒體，2—液體進口， 3—液體擋板， 4一空氣過濾器，5—反應(yīng)盒蓋，6—層盤，601—絲網(wǎng)模具，602—溢流堰， 603—溢流槽，604—定位腳，7—恒溫夾套，8—液體出口， 9一蠕動泵，10 一廢液瓶，ll一取液管，12—補液瓶，13—儲液瓶，14一溶氧電極，15— pH電極，16—四氣混合器，17—酸液瓶，18—堿液瓶，19—密封墊圈，20 一空氣交換口， 21—控制閥。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖進一步說明本發(fā)明生物反應(yīng)器的具體結(jié)構(gòu)。 一種生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，包括有廢液瓶IO，補液瓶12， 儲液瓶13，四氣混合器16，酸液瓶17，堿液瓶18，它還有一個由反應(yīng)盒 體l、反應(yīng)盒蓋5、層盤6、恒溫夾套7和密封墊圈19組裝而成的生物反應(yīng)盒A;反應(yīng)盒蓋5上設(shè)有液體進口 2和空氣交換口 20，在靠近液體進口2的反應(yīng)盒蓋底面設(shè)有液體擋板3，恒溫夾套7設(shè)置在反應(yīng)盒體1的外圍， 在反應(yīng)盒體1 一側(cè)下部設(shè)有穿過恒溫夾套的液體出口 8，密封墊圈19安裝 在反應(yīng)盒蓋5與反應(yīng)盒體1端口之間；層盤6是具有邊壁的方形盤，在盤 面內(nèi)均布設(shè)置有絲網(wǎng)模具601，在盤面一端設(shè)有高度低于邊壁的溢流堰 602，溢流堰與相鄰邊壁之間開有溢流槽603，與溢流槽603相對一端的盤 底兩邊設(shè)有定位腳604，溢流堰相鄰邊壁伸出盤底與定位腳604等高使盤 面水平；層盤6在反應(yīng)盒體1內(nèi)由下而上正向反向交替疊加安裝，使上一 層層盤的溢流槽603在下一層層盤的溢流槽603相對一端的上面，最下層 層盤的溢流槽603 —端靠近反應(yīng)盒體1的液體出口 8，最上層層盤的定位 腳604 —端位于液體擋板3下方。上述生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，所說的絲網(wǎng)模具601是根據(jù)產(chǎn) 品品種要求而設(shè)計成圓型、方型或異型結(jié)構(gòu)。上述生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，所說的生物反應(yīng)盒A的液體進 口 2用管道通過蠕動泵9與儲液瓶13連通，所說的生物反應(yīng)盒A的液體出 口 8用管道通過蠕動泵9和控制閥21與儲液瓶13和廢液瓶10并聯(lián)連通， 所說的生物反應(yīng)盒A的空氣交換口 20用管道與空氣過濾器4連通。上述生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，所說的補液瓶12、酸液瓶17 和堿液瓶18分別用管道通過蠕動泵9與儲液瓶13連通，四氣(02、 N2、 C02 和空氣)混合器16用管道通過空氣過濾器4與儲液瓶13連通。補液瓶 12、儲液瓶13和廢液瓶10中盛裝細胞培養(yǎng)液。酸液瓶17、堿液瓶18和 四氣混合器16用于調(diào)節(jié)儲液瓶13內(nèi)細胞培養(yǎng)液的溶氧值和pH值。上述生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，所說的儲液瓶13在外圍設(shè)置有 恒溫夾套7，并在儲液瓶13中設(shè)置有分別與溶氧測定儀和pH值測定儀相 連的溶氧電極14和pH電極15，并可通過電腦對儲液瓶13內(nèi)細胞培養(yǎng)液 的溶氧值和pH值進行控制。上述生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，所說的廢液瓶IO、補液瓶12、 儲液瓶13、酸液瓶17和堿液瓶18分別用管道與空氣過濾器4連通。廢液 瓶10設(shè)置有取液管11，以便檢測使用過的細胞培養(yǎng)液的質(zhì)量。
權(quán)利要求
1、一種生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，包括有廢液瓶(10)，補液瓶(12)，儲液瓶(13)，四氣混合器(16)，酸液瓶(17)，堿液瓶(18)，其特征在于1)它還有一個由反應(yīng)盒體(1)、反應(yīng)盒蓋(5)、層盤(6)、恒溫夾套(7)和密封墊圈(19)組裝而成的生物反應(yīng)盒(A)；2)反應(yīng)盒蓋(5)上設(shè)有液體進口(2)和空氣交換口(20)，在靠近液體進口(2)的反應(yīng)盒蓋底面設(shè)有液體擋板(3)，恒溫夾套(7)設(shè)置在反應(yīng)盒體(1)的外圍，在反應(yīng)盒體(1)一側(cè)下部設(shè)有穿過恒溫夾套的液體出口(8)，密封墊圈(19)安裝在反應(yīng)盒蓋(5)與反應(yīng)盒體(1)端口之間；3)層盤(6)是具有邊壁的方形盤，在盤面內(nèi)均布設(shè)置有絲網(wǎng)模具(601)，在盤面一端設(shè)有高度低于邊壁的溢流堰(602)，溢流堰與相鄰邊壁之間開有溢流槽(603)，與溢流槽(603)相對一端的盤底兩邊設(shè)有定位腳(604)，溢流堰相鄰邊壁伸出盤底與定位腳(604)等高使盤面水平；4)層盤(6)在反應(yīng)盒體(1)內(nèi)由下而上正向反向交替疊加安裝，使上一層層盤的溢流槽(603)在下一層層盤的溢流槽(603)相對一端的上面，最下層層盤的溢流槽(603)一端靠近反應(yīng)盒體(1)的液體出口(8)，最上層層盤的定位腳(604)一端位于液體擋板(3)下方。
2、 按照權(quán)利要求l所述的生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，其特征在 于，所說的絲網(wǎng)模具(601)是根據(jù)產(chǎn)品品種要求而設(shè)計成圓型、方型或異 型結(jié)構(gòu)。
3、 按照權(quán)利要求l所述的生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，其特征在 于，所說的生物反應(yīng)盒(A)的液體進口 (2)用管道通過蠕動泵(9)與儲 液瓶(13)連通，所說的生物反應(yīng)盒(A)的液體出口 (8)用管道通過蠕 動泵(9)和控制閥(21)與儲液瓶(13)和廢液瓶(10)并聯(lián)連通，所說 的生物反應(yīng)盒(A)的空氣交換口 (20)用管道與空氣過濾器(4)連通。
4、 按照權(quán)利要求l所述的生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，其特征在 于，所說的補液瓶(12)、酸液瓶(17)和堿液瓶(18)分別用管道通過蠕 動泵(9)與儲液瓶(13)連通，四氣混合器(16)用管道通過空氣過濾器(4)與儲液瓶(13)連通。
5、 按照權(quán)利要求l所述的生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，其特征在于，所說的儲液瓶(13)在外圍設(shè)置有恒溫夾套(7)，并在儲液瓶(13) 中設(shè)置有分別與溶氧測定儀和pH值測定儀相連的溶氧電極(14)和pH電 極(15)。
6、 按照權(quán)利要求l所述的生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，其特征在 于，所說的廢液瓶(10)、補液瓶(12)、儲液瓶(13)、酸液瓶(17)和堿 液瓶(18)分
全文摘要
一種生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的生物反應(yīng)器，包括有廢液瓶，補液瓶，儲液瓶，四氣混合器，酸液瓶，堿液瓶，還有一個由反應(yīng)盒體、反應(yīng)盒蓋、層盤、恒溫夾套和密封墊圈組裝而成的生物反應(yīng)盒；層盤在反應(yīng)盒體內(nèi)由下而上正向反向交替疊加安裝，上一層層盤的溢流槽在下一層層盤的溢流槽相對一端的上面，最下層層盤的溢流槽一端靠近反應(yīng)盒體的液體出口，最上層層盤的定位腳一端位于液體擋板下。與現(xiàn)有技術(shù)相比，它的擴展性好，適合規(guī)?；a(chǎn)；結(jié)構(gòu)簡單，體積小，管路少，通用性較強、適用范圍廣，不僅適合組織工程皮膚的氣液界面培養(yǎng)生產(chǎn)組織工程皮膚，還可用于合成支架類組織工程產(chǎn)品(如骨、軟骨、肌腱等)的生產(chǎn)。
文檔編號C12M3/00GK101402917SQ20081023311
公開日2009年4月8日 申請日期2008年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月25日
發(fā)明者伍津津 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院