專利名稱：登革病毒2型非結(jié)構(gòu)蛋白2b、其重組表達(dá)載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及登革病毒2型非結(jié)構(gòu)蛋白2B (non-structural protein 2B, NS2B )及其重組表達(dá)載體，還涉及該重組表 達(dá)載體的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
登革病毒(dengue virus, DV )是引起人類登革熱(classical dengue fever, DF)、登革出血熱(dengue hemorrhagic fever, DHF )和登革休克綜合征(dengue shock syndrome, DSS)的病原體。近年來，隨著人口流動(dòng)的增加及全球氣侯變 暖，DF、 DHF和DSS的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，全球每年DF患者多達(dá)1億，其 中DHF患者約50萬，死亡約2. 5萬人。但迄今為止，DF、 DHF和DSS的發(fā)病機(jī) 制仍不十分清楚，也缺乏安全有效的預(yù)防疫苗和治療藥物。因此，DF、 DHF和 DSS已成為當(dāng)今世界嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，對其病原體、發(fā)病機(jī)理及防治策略的 相關(guān)研究具有重要意義。
DV屬于黃病毒家族，是有包膜的單股正鏈RNA病毒，以白蚊伊蚊和埃及伊 蚊為主要傳播i某介。DV按包膜蛋白的抗原性不同，可分為四種血清型(DV1 ~ 4 ), 其中主要流行的是DV2。 DV2的基因組全長約11 kb，編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白(C、 prM、 E)和七種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、 NS2A、 NS2B、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5 )。近年來的 研究表明，NS2B對于激活NS3的活性是必需的，NS2B能夠激活NS3并與其形成 NS2B-NS3組合酶，該組合酶對DV的復(fù)制起著決定性的作用，因此，NS2B在DV2 的發(fā)病機(jī)制及抗DV藥物研究中引起了廣泛重^L。但迄今為止，有關(guān)DV2Tr1751 抹的NS2B的氨基酸序列及其編碼基因序列等未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種NS2B,其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
本發(fā)明的目的之二在于提供編碼所述NS2B的基因。 進(jìn)一步，其核苷酸序列如SEQ ID No. l所示。
本發(fā)明的目的之三在于提供一種重組表達(dá)載體，含有編碼所述NS2B的基因，
表達(dá)載體為真核表達(dá)載體pCAGGS-P7。
本發(fā)明的目的之四在于提供一種轉(zhuǎn)化體，含有所述重組表達(dá)載體。 本發(fā)明的目的之五在于提供一種制備所述重組表達(dá)載體的方法，包括以下
步驟
a、 NS2B基因的擴(kuò)增和純化
合成1對特異性引物上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示，下游 引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示；以含有SEQ ID No. 1所示基因的重組原 核表達(dá)載體pQE-31/NS2B為才莫板，采用上述引物進(jìn)行NS2B基因的PCR擴(kuò)增，反 應(yīng)條件為溫度95。C預(yù)變性5分鐘，然后溫度94。C變性1分鐘、58。C退火1分 鐘、72T延伸1. 5分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后溫度72t:延伸10分鐘；PCR產(chǎn)物 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，進(jìn)行切膠回收純化，即得NS2B基因；
b、 重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定
將步驟a所得NS2B基因用Xho I和Not I雙酶切后，連接到同樣用Xho I和 Not I雙酶切的真核表達(dá)載體pCAGGS-P7上；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL-blue 感受態(tài)菌，用含有氨千青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，鑒定陽性克 隆質(zhì)粒并測序，質(zhì)粒中插入片段的核苷酸序列和開放閱讀框架與SEQ ID No. 1 所示序列一致者即為構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體pCAGGS-P7/NS2B。
本發(fā)明的目的之六在于提供所述重組表達(dá)載體在制備抗DV2的核酸疫苗中 的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的之七在于提供所述重組表達(dá)載體在制備抗NS2B的抗體中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的之八在于提供一種利用所述重組表達(dá)載體制得的抗NS2B的多 克隆抗體，通過下述方法制得取體重16 ~ 20 g的6 ~ 8周齡健康BALB/c小鼠， 首次免疫，于小鼠大腿肌肉內(nèi)注射所述重組表達(dá)載體，每只100 首次免疫 后第30天和第60天，分別重復(fù)免疫1次；首次免疫后第67天，取小鼠血并分 離血清，純化，即得抗NS2B的多克隆抗體。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明成功地獲得了 DV2Trl751林的NS2B的氨 基酸序列及其編碼基因序列，為后期制備重組表達(dá)載體和表達(dá)NS2B、研究 NS2B的功能和抗DV藥物等提供了必要的基礎(chǔ)；利用該編碼基因序列，本發(fā) 明成功地構(gòu)建了 NS2B的重組原核表達(dá)載體pQE-31/NS2B和高效表達(dá)的基因工 程菌，并進(jìn)一步獲得了純化的NS2B-His6融合蛋白；同時(shí)，利用該編碼基因 序列，本發(fā)明還成功地構(gòu)建了 NS2B的重組真核表達(dá)載體pCAGGS-P7/NS2B和基 因工程菌，制備方法簡單、操作方便快捷；所得重組真核表達(dá)載體在真核細(xì)胞 中成功地表達(dá)了 NS2B，并在小鼠中成功地誘導(dǎo)了特異性體液免疫，獲得了抗NS2B 的多克隆抗體，且該抗體能夠特異性地識別自然表達(dá)的NS2B;因此，本發(fā)明 的重組真核表達(dá)載體可為開展NS2B在DV感染細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)、定位和功能研究 提供有力的工具，并可用于制備抗NS2B的抗體和抗DV2的核酸疫苗，具有良好 的應(yīng)用前景。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本 發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中
圖1顯示重組原核表達(dá)載體pQE-31/NS2B的雙酶切產(chǎn)物和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
圖2顯示NS2B原核表達(dá)與純化的十二烷基石克酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)結(jié)果；圖3顯示NS2B基因的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
圖4顯示重組真核表達(dá)載體pCAGGS-P7/NS2B的雙酶切產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物的瓊 脂糖凝膠電泳結(jié)果；
圖5顯示NS2B在Vero細(xì)胞中表達(dá)的間接免疫熒光才企測結(jié)果；
圖6顯示pCAGGS-P7/NS2B免疫小鼠血清的蛋白免疫印跡(Western blot) 檢測結(jié)果；
圖7顯示pCAGGS-P7/NS2B免疫小鼠血清的間接免疫熒光檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)4亍詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例 中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第 三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
(一 )NS2B的重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建及NS2B的原核表達(dá)
一、NS2B的重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
1、 DV2總RNA的^是取
取白玟伊蚊C6/36細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液(由濃度為100 mL/L的胎牛 血清即FBS、濃度為2 mmol/L的谷氨酰胺和濃度為10 mmoi/L的HEPES緩沖液 組成)，在溫度28。C、 0)2氣體濃度為50 mL/L的條件下培養(yǎng)至單層后，按感染 復(fù)數(shù)為1進(jìn)行DV2 Trl751抹(分離自登革熱病人，由日本國立感染病研究所提 供)的感染，待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變后，收集培養(yǎng)液上清，離心去除細(xì)胞碎片， 采用RNA提取試劑盒(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司)提取DV2總 RNA,按照試劑盒說明書操作；
2、 PCR引物的設(shè)計(jì)及合成
根據(jù)GenBank登錄號為AY744148的NS2B的基因序列，用Primer Premier 5. 0 軟件設(shè)計(jì)l對特異性引物，在每條引物的5'端加上保護(hù)i威基，再在其后分別引內(nèi)切酶識別序列；引物序列如下PI: 5'-eg ggatcctagctggcctttaaatgagg-3',下劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn)(SEQ ID No.3); P2: 5' -cccaagcttccgt tgt t tct Uacttccc-3', 下劃線部分為Hind III酶 切位點(diǎn)(SEQ ID No. 4 );設(shè)計(jì)的引物委托北京三博遠(yuǎn)志生物有限責(zé)任公司進(jìn)行合 成；
3、 NS2B基因的擴(kuò)增及純化
以步驟1所得DV2總RM為模板，步驟2所得Pl、 P2為PCR上、下游引物， 采用RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增試劑盒(兩步法，Bioflux^^司)進(jìn)行NS2B基因的逆轉(zhuǎn) 錄(RT)和PCR擴(kuò)增，按照試劑盒說明書操作，PCR反應(yīng)條件為溫度95。C預(yù) 變性5分鐘，然后溫度94。C變性1分鐘、58。C退火1分鐘、72。C延伸1. 5分鐘， 共3Q個(gè)循環(huán)，最后溫度72。C延伸1Q分鐘；
PCR產(chǎn)物采用質(zhì)量百分濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，鑒定正確的 PCR產(chǎn)物采用膠回收試劑盒(Bioflux公司)進(jìn)行純化，按照試劑盒說明書操作， 切膠回收約390 bp的目的片段，獲得NS2B基因；
4、 重組原核表達(dá)載體pQE-31/NS2B的構(gòu)建
將步驟3所得NS2B基因用BamH I和Hind III ( Fermentas 乂>司)進(jìn)行雙酶 切，雙酶切方法為NS2B基因18 pL、濃度為15 U/j_iL的BamH I 3 pL、濃度 為15 U/VL的Hind III 1. 5 pL、 10 x緩沖液3 ^L、雙蒸水補(bǔ)充至總體積為30 jxL， 于溫度37。C孵育4小時(shí)；雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收純化約390 bp的片段，獲得NS2B基因片段；將原核表達(dá)栽體pQE-31按照上述同樣方法用 BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切，雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝"交電泳，切膠回收純 化約3500 bp的片段，獲得pQE-31片段；將上述NS2B基因片段與pQE-31片段 進(jìn)行連接，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pQE-31/NS2B，連接方法為濃度為50ng/VL 的NS2B基因片段7. 5 ^L、濃度為200 ng/pL的pQE-31片段l pL、濃度為5 U/jiL 的T4 DNA連接酶(TaKaRa公司)0. 5 pL、 10 x T4 DNA連接酶反應(yīng)緩沖液1 pL、 雙蒸水補(bǔ)充至總體積為10 pL，于溫度16。C孵育16小時(shí)；5、 重組原核表達(dá)載體pQE-31/NS2B的轉(zhuǎn)化
將步驟4所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109感受態(tài)菌，轉(zhuǎn)化方法為將 連接產(chǎn)物10 pL加至細(xì)胞密度為1 x 107mL的JM109感受態(tài)菌100 pL中，水浴 30分鐘，溫度42。C熱休克90秒，立即水浴2分鐘，再轉(zhuǎn)移至預(yù)熱至溫度37°C 的LB液體培養(yǎng)基900 jiL中，在溫度37°C、 95轉(zhuǎn)/分鐘的條件下振搖培養(yǎng)1小
時(shí)；
6、 陽性克隆的篩選
取步驟5所得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨爺青霉素(AMP)的LB平板上，于溫 度37。C孵育18小時(shí)，從平板上挑取單個(gè)菌落(即陽性克隆)，接種于含有AMP 的LB液體培養(yǎng)基4 mL中，在溫度37°C、 160轉(zhuǎn)/分鐘的條件下振搖培養(yǎng)18小
時(shí)；
7、 重組原核表達(dá)載體pQE-31/NS2B的鑒定
取步驟6所得培養(yǎng)菌液，用質(zhì)粒提取試劑盒(Promega公司)小量^是取重組 質(zhì)粒，按照試劑盒說明書操作；取所得重組質(zhì)粒，采用雙酶切法(BamH I和Hind III)和PCR法(以重組質(zhì)粒為模板，以步驟2所得P1、 P2為PCR引物，反應(yīng)條 件與步驟3所述條件相同)鑒定陽性克隆質(zhì)粒，耳又雙酶切產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物進(jìn)行 瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖l所示，其中M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，l泳道為重 組質(zhì)粒，2泳道為PCR產(chǎn)物，3泳道為雙酶切產(chǎn)物，從圖可知，雙酶切產(chǎn)物和PCR 產(chǎn)物均在約390 bp的位置出現(xiàn)一條特異性DNA條帶，表明重組質(zhì)粒中含有NS2B 基因；將雙酶切法和PCR法均鑒定為陽性的重組質(zhì)粒委托上海英俊生物技術(shù)有 限公司對插入片段進(jìn)行測序，獲得如SEQ IDNo. 1所示的核苷酸序列，長390 bp， 在GenBank中檢索未發(fā)現(xiàn)有相同序列，其編碼有130個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，氨基 酸序列如SEQ ID No. 2所示，將此氨基酸序列與DV2其它病毒林的NS2B序列進(jìn) 行同源性比較，結(jié)果顯示該氨基酸序列與DV2其它病毒^^的NS2B序列存在較高 同源性；表明目的基因正確插入pQE-31,并保持正確的開放閱讀框架，重組原 核表達(dá)載體pQE-31/NS2B構(gòu)建成功。二、 NS2B的表達(dá)及純化
1、 NS2B的表達(dá)
取含有pQE-31/NS2B的JM109,同時(shí)設(shè)陰性對照(以含有pQE-31的JM109 替代含有pQE-31/NS2B的JM109)，接種于含有濃度為100 jig/mL的AMP的LB 液體培養(yǎng)基中，在溫度37。C、 160轉(zhuǎn)/分鐘的條件下振搖培養(yǎng)過夜，取過夜培養(yǎng) 菌液，用含有濃度為100 jig/mL的AMP的2xYT培養(yǎng)液按1 : 100稀釋，在溫度 37°C、 160轉(zhuǎn)/分鐘的條件下振搖培養(yǎng)至光密度0仏。麵值達(dá)到0. 6,加入IPTG至 終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)，收集菌液；
2、 NS2B的純化
取收集的菌液，在溫度4。C、 7000 g條件下離心，棄上清，取細(xì)胞沉淀，按 每克沉淀加入3 mL緩沖液A (由濃度為l mol/L、 pH為7. 9的Tris-HCl緩沖液、濃 度為O. 5 mol/L的乙二胺四乙酸、濃度為5 mol/L的氯化鈉、濃度為800 mL/L的 甘油組成，調(diào)節(jié)pH至8. 0)的比例加入緩沖液A重懸沉淀，13000 g離心10分鐘， 棄上清，細(xì)胞沉淀用10倍體積的緩沖液A重懸，再加入濃度為IOO mmol/L的苯曱 基磺酰氟(PMSF)的異丙醇溶液20 pL，在冰浴條件下短時(shí)超聲裂菌，再加入濃 度為IO mL/L的曲拉通-100 (Triton-100 ) 100 ^L,于溫度4。C條件下靜置30分 鐘，13000 g離心l小時(shí)，分別收集裂菌液上清和沉淀，沉淀用3倍體積的緩沖液 A洗滌3次，最后用含有濃度為l mL/L的P-巰基乙醇的緩沖液B (由濃度為IO mmol/L、 pH為7. 6的Tris-HCl緩沖液、濃度為8 mol/L的尿素、濃度為100mmol/L 的磷酸二氫鈉組成，調(diào)節(jié)pH至8. 0)重懸，于溫度4。C條件下放置2小時(shí)使包涵體 溶解，用孔徑為O. 45 ,的微孔濾膜過濾，收集濾液；取上述收集的裂菌液上清 和濾液進(jìn)行SDS-PAGE，分析目的蛋白的可溶性，結(jié)果顯示，裂菌液上清中無目 的蛋白表達(dá)，而濾液中有目的蛋白生成，提示目的蛋白是以包涵體形式存在；
取收集的濾液，利用重組原核表達(dá)載體pQE-31/NS2B使目的蛋白帶有組氨酸 標(biāo)簽(His6),而組氨酸可與多種過渡金屬離子如Cu2+， Zn2+, Ni2+, Co2+, Fe"等 發(fā)生特殊的相互作用的性質(zhì)，采用Ni-NTA親和層析柱純化目的蛋白，用緩沖液C(由濃度為IO mmol/L、 pH為7. 6的Tris-HCl緩沖液、濃度為8 mol/L的尿素、濃 度為IOO mmol/L的磷酸二氫鈉組成，調(diào)節(jié)pH至6. 3 )洗脫去除雜蛋白，用緩沖液 D (由濃度為IO tnmol/L、 pH為7. 6的Tris-HC1緩沖液、濃度為8 mol/L的尿素、 濃度為IOO mmol/L的磷酸二氫鈉組成，調(diào)節(jié)pH至4. 5 )洗脫獲得目的蛋白，再用 濃度為O. 01 mol/L、 pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS )對目的蛋白進(jìn)行透析去除 尿素，使蛋白復(fù)性，冷凍干燥，即得純化的NS2B-His6融合蛋白，用PBS溶解， 置溫度-8(TC保存?zhèn)溆茫?br> 取步驟1收集的菌液和步驟2所得純化的NS2B-His6融合蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE鑒定，SDS-PAGE方法為濃度為50 mL/L的積層月交，濃度為120 mL/L 的分離膠，積層膠電壓60 V電泳30分鐘，分離膠電壓80 V電泳2小時(shí)；結(jié)果 如圖2所示，其中M泳道為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1泳道為含有pQE-31的JM109 加入IPTG誘導(dǎo)8小時(shí)后的菌液，2和3泳道為含有pQE-31/NS2B的JM109加入 IPTG誘導(dǎo)前的菌液，4和5泳道為含有pQE-31/NS2B的JM109加入IPTG誘導(dǎo)8 小時(shí)后的菌液，6和7泳道為純化的NS2B-His6融合蛋白；從圖可知，含有 pQE-31/NS2B的JM109加入IPTG誘導(dǎo)8小時(shí)后的菌液中有分子量約16 kD的特 異性蛋白表達(dá)，與NS2B-His6融合蛋白的預(yù)期分子量大'J、一致；純化的NS2B-His6 融合蛋白在分子量約16 kD處有特異性蛋白條帶，雜蛋白少，表明按本發(fā)明純 化方法獲得的NS2B-His6融合蛋白純度高。
(二 ) NS2B的重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其應(yīng)用
一、NS2B的重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
1、 PCR引物的設(shè)計(jì)及合成
根據(jù)SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，用Primer Premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)1 對特異性引物，在每條引物的5'端加上保護(hù)i威基，再在其后分別引入Xhol或 Not I限制性內(nèi)切酶識別序列；引物序列如下P3: 5' -ccgctcgagatgagctggc ctttaaatgagg-y ，下劃線部分為XhoI酶切4立點(diǎn)(SEQ ID No. 5 ); P4: 5' -ataagcggccgcctaccgttgtttc11tacttccc—3'，下戈'J線部分為Not I酶切位點(diǎn)(SEQID No. 6);設(shè)計(jì)的引物委托北京三博遠(yuǎn)志生物有限責(zé)任^^司進(jìn)行合成；
2、 NS2B基因的擴(kuò)增及純化
以重組原核表達(dá)載體pQE-31/NS2B為模板，以步驟1所得P3、 P4為上、下 游引物進(jìn)行NS2B基因的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為濃度為0. 5 ng"L的模板1 ^L、 濃度為100 ^tmol/L的上、下游引物各0. 5 pL、濃度為2. 5 mmol/L的dNTP混合 物2 |iL、濃度為5 U/^L的Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa公司)0. 2 |iL、 10 x Pyrobest緩沖液II 2. 5 ^L、雙蒸水補(bǔ)充至總體積為25 反應(yīng)條件為溫度 95。C預(yù)變性5分鐘，然后溫度94。C變性1分鐘、58。C退火1分鐘、72。C延伸1. 5 分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后溫度72。C延伸10分鐘；
PCR產(chǎn)物用質(zhì)量百分濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖3所 示，其中M泳道為DM分子量標(biāo)準(zhǔn)，1泳道為PCR產(chǎn)物，從圖可知，PCR產(chǎn)物在 約390 bp的位置出現(xiàn)一條特異性DNA條帶，與目的片段預(yù)期大小相符；
按照上述方法重復(fù)進(jìn)行5次PCR擴(kuò)增，取PCR產(chǎn)物100 |_iL進(jìn)行瓊脂糖凝膠 電泳，選擇約390 bp的目的片段切膠，采用膠回收試劑盒(Promega公司)回 收純化目的片段，按照試劑盒說明書操作，即得NS2B基因，用雙蒸水40)aL溶 解，備用；
3、 重組真核表達(dá)載體pCAGGS-P7/NS2B的構(gòu)建
將步驟2所得NS2B基因用Xho I和Not I (Fermentas公司)進(jìn)行雙酶切， 雙酶切方法為NS2B基因18 pL、濃度為15 U/pL的Xho I 3 pL、濃度為15 U/^L 的Not I 1. 5 ^L、 10 x緩沖液3 pL、雙蒸水補(bǔ)充至總體積為30 |aL，于溫度37 匸孵育4小時(shí)；雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收純化約390 bp的片 段，獲得NS2B基因片段，用雙蒸水30 溶解，備用；將真核表達(dá)載體pCAGGS-P7 按照上述同樣方法用Xho I和Not I進(jìn)行雙酶切，雙酶切產(chǎn)物進(jìn)4亍瓊脂糖凝膠電 泳，切膠回收純化約5200 bp的片段，獲得pCAGGS-P7片段，用雙蒸水30 pL 溶解，備用；將上述NS2B基因片段與pCAGGS-P7片段進(jìn)行連接，構(gòu)建重組真核 表達(dá)載體pCAGGS-P7/NS2B，連接方法為NS2B基因片段7. 5 ^L、 pCAGGS-P7片U/pL的T4 DNA連接酶0. 5 pL、 10 x T4 DNA連接酶反應(yīng)緩 沖液lpL、雙蒸水補(bǔ)充至總體積為10 [xL，于溫度16t:孵育16小時(shí)，65。C孵育 10分鐘；
4、 重組真核表達(dá)載體pCAGGS-P7/NS2B的轉(zhuǎn)化
將步驟3所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL-blue ( Promega公司)感受態(tài)菌， 轉(zhuǎn)化方法為將連接產(chǎn)物10pL加至細(xì)胞密度為1 x 105/mL的XL-blue感受態(tài)菌 100pL中，水浴30分鐘，溫度42。C熱休克90秒，立即冰浴2分鐘，再轉(zhuǎn)移至 預(yù)熱至溫度37。C的LB液體培養(yǎng)基900 pL中，在溫度37。C、 95轉(zhuǎn)/分鐘的條件 下振搖培養(yǎng)1小時(shí)；
5、 陽性克隆的篩選
取步驟4所得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有AMP的LB平板上，于溫度37。C孵育18 小時(shí)，從平板上挑取單個(gè)菌落(即陽性克隆)，接種于含有AMP的LB液體培養(yǎng) 基4mL中，在溫度37。C、 160轉(zhuǎn)/分鐘的條件下振搖培養(yǎng)18小時(shí)；
6、 重組真核表達(dá)載體pCAGGS-P7/NS2B的鑒定
取步驟5所得培養(yǎng)菌液，用質(zhì)粒提取試劑盒小量提取重組質(zhì)粒，按照試劑 盒說明書操作，用濃度為5mmol/L、 pH為8. 0的Tris-HCl緩沖液100 |iL溶解， 備用；取所得重組質(zhì)粒，采用雙酶切法(Xho I和Not I )和PCR法(以重組質(zhì) 粒為模板，以步驟1所得P3、 P4為PCR引物，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與步驟2所 述相同)鑒定陽性克隆質(zhì)粒，取雙酶切產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳， 結(jié)果如圖4所示，其中M泳道為DM分子量標(biāo)準(zhǔn)，l泳道為重組質(zhì)粒，2泳道為 雙酶切產(chǎn)物，3泳道為PCR產(chǎn)物，乂人圖可知，雙酶切產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物均在約390 bp的位置出現(xiàn)一條特異性DNA條帶，表明重組質(zhì)粒中含有NS2B基因；將雙酶切 法和PCR法均鑒定為陽性的重組質(zhì)粒委托上海英俊生物技術(shù)有限公司對插入片 段進(jìn)行測序，結(jié)果重組質(zhì)粒中插入片段的核香酸序列和開放閱讀框架與SEQ ID No. 1所示序列完全一致，表明重組真核表達(dá)載體pCAGGS-P7/NS2B構(gòu)建成功；
6、重組真核表達(dá)載體pCAGGS-P7/NS2B的大量制備取含有pCAGGS-P7/NS2B的XL-blue,接種于含有AMP的LB液體培養(yǎng)基，在 溫度37。C、 160轉(zhuǎn)/分鐘的條件下振搖培養(yǎng)過夜，待培養(yǎng)液的光密度0D德m值達(dá) 到1~1.5，采用超純質(zhì)粒抽提試劑盒(Promega公司)大量抽提重組質(zhì)粒，4安 照試劑盒說明書操作，去除內(nèi)毒素，所得重組質(zhì)粒用超純水重懸，紫外分光光 度計(jì)測定濃度，用PBS調(diào)節(jié)重組質(zhì)粒溶液濃度至40pg/mL,置溫度-2(TC保存?zhèn)?用。
二、 NS2B的真核表達(dá);f企測
將Vero細(xì)胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，用含有濃度為50 mL/L的FBS 的MEM培養(yǎng)液，在溫度37°C、 C02氣體濃度為50 mL/L的條件下培養(yǎng)18-24小 時(shí)，待細(xì)胞融合率達(dá)到約80%時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 (Tnvitrogen公司)將pCAGGS-P7/NS2B轉(zhuǎn)染入Vero細(xì)胞，按照試劑說明書才喿 作，轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，將培養(yǎng)液更換為含有濃度為20 mL/L的FBS的MEM培養(yǎng)液， 繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，收集細(xì)胞爬片；同時(shí)設(shè)陰性對照(以pCAGGS-P7替代 pCAGGS-P7/NS2B進(jìn)4亍轉(zhuǎn)染)；
采用間接免疫熒光法檢測，取細(xì)胞爬片，以PBS漂洗3次，用濃度為40 mL/L、 pH為7. 2-7. 6的多聚曱醛溶液于室溫下固定20分鐘，以PBS漂洗3次，再用 含有濃度為2 mL/L的Triton X-100的PBS于室溫下通透5分鐘，以PBS漂洗3 次，再用封閉液(即含有濃度為10 mL/L的BSA的PBS )于室溫下封閉1小時(shí)， 棄去封閉液，加入1 : 400封閉液稀釋的NS2B-His6融合蛋白免疫小鼠血清,于 溫度4。C孵育過夜，以PBS漂洗5次，再加入1 : 500封閉液稀釋的FITC標(biāo)記的 山羊抗小鼠IgG,于室溫下孵育l小時(shí)，以PBS漂洗5次，自然干燥后用濃度為 400 mL/L的甘油封片，置焚光顯微鏡下觀察；
結(jié)果如圖5所示，其中A和B為轉(zhuǎn)染pCAGGS-P7/NS2B的Vero細(xì)胞，A為 100倍放大圖，B為400倍放大圖，C和D為轉(zhuǎn)染pCAGGS-P7的Vero細(xì)胞，C為 IOO倍放大圖，D為400倍放大圖，從圖可知，轉(zhuǎn)染pCAGGS-P7/NS2B的細(xì)胞核 周及胞漿內(nèi)有明顯的強(qiáng)染，而轉(zhuǎn)染pCAGGS-P7的細(xì)胞只有一些非特異的比較樣吏弱的萸光，表明具有免疫反應(yīng)性的NS2B在Vero細(xì)胞中成功地獲得表達(dá)。 三、重組真核表達(dá)載體pCAGGS-P7/NS2B的應(yīng)用
1、 抗NS2B多克隆抗體的制備
取體重16 ~ 20 g的6 ~ 8周齡健康BALB/c小鼠，首次免疫，pCAGGS-P7/NS2B 于小鼠大腿肌肉內(nèi)注射，每只100 首次免疫后第30天和第60天，分別重 復(fù)免疫1次；首次免疫后第67天，取小鼠血并分離血清，即得鼠抗NS2B多克 隆抗體，置溫度-8(TC保存?zhèn)溆?；同時(shí)設(shè)陰性對照(以pCAGGS-P7替代 pCAGGS-P7/NS2B進(jìn)行免疫)；
2、 抗NS2B多克隆抗體的效價(jià)測定
采用間接酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法，將純化的NS2B-His6融合蛋白用PBS 稀釋制成濃度為20 lig/mL的包被液，加至96孔板中，每孔100 fiL,置溫度4 。C包被過夜后，棄去包被液，用PBST洗板3次，再加入封閉液(即含有濃度 為50 mL/L的FBS的PBS )，每孔100 jaL，置溫度37。C封閉3小時(shí)，棄去封閉 液，以PBST洗板3次，再加入用封閉液按10倍連續(xù)稀釋的pCAGGS-P7/NS2B 免疫小鼠血清，每孔IOO iLiL，置溫度4。C孵育過夜，棄去抗體溶液，以PBST 洗板5次，再加入1 : IOOO封閉液稀釋的辣才艮過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊 抗小鼠IgG (DAKO乂厶司)，每孔100 iuL，置溫度37。C孵育1小時(shí)，棄去標(biāo) 記抗體溶液，以PBST洗板3次，再加入鄰苯二胺(OPD)顯色液，置溫度37 。C孵育20分鐘后，用濃度為2 mol/L的硫酸終止反應(yīng)；同時(shí)設(shè)陰性對照(以 正常小鼠血清替代pCAGGS-P7/NS2B免疫小鼠血清)和空白對照(以PBS替代 pCAGGS-P7/NS2B免疫小鼠血清)；測量各組O仏，值，實(shí)驗(yàn)組004一值大于或 等于陰性對照2. 1倍者判為陽性，以判為陽性的最高稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)；結(jié) 果測得鼠抗NS2B多克隆抗體的效價(jià)為1 : 2000;
3、 抗NS2B多克隆抗體的特異性鑒定 (1 ) Western blot法檢測
將純化的NS2B-His6融合蛋白，先采用濃度為120 mL/L的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE,待電泳完畢后，半干轉(zhuǎn)印(轉(zhuǎn)印電壓為15 V,轉(zhuǎn)印時(shí)間為25分鐘) 至硝酸纖維素膜上，加入封閉液(即質(zhì)量百分濃度為5%的脫脂奶粉溶液)，置溫 度37。C封閉1小時(shí)，再加入1 : 200封閉液稀釋的pCAGGS-P7/NS2B免疫小鼠血 清，置溫度4。C孵育過夜，洗膜后加入1 : 1 000封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的山羊 抗小鼠IgG，置溫度37。C孵育1小時(shí)，洗膜后加入3, 3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯 色，觀察；同時(shí)設(shè)陰性對照(以pCAGGS-P7免疫小鼠血清替代pCAGGS-P7/NS2B 免疫小鼠血清)；
結(jié)果如圖6所示，其中1泳道為pCAGGS-P7/NS2B免疫小鼠血清，2泳道為 pCAGGS-P7免疫小鼠血清，M泳道為低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，從圖可知， pCAGGS-P7/NS2B免疫小鼠血清在分子量約16 kDa處出現(xiàn)一條特異性蛋白條帶， 與NS2B-His6融合蛋白的分子量大小相符，而pCAGGS-P7免疫小鼠血清沒有出 現(xiàn)任何蛋白條帶，表明所得鼠抗NS2B多克隆抗體能夠特異性地識別自然表達(dá)的 NS2B;
(2)間接免疫熒光法檢測
將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304 )接種于放有蓋玻片的6孔板中，每孔2xl05 個(gè)細(xì)胞，用含有濃度為100 mL/L的FBS的DMEM培養(yǎng)液，在溫度37°C、 C02 氣體濃度為50 mL/L的條件下培養(yǎng)18~24小時(shí)，待細(xì)胞單層覆蓋率達(dá)到80 %以上時(shí)，吸出培養(yǎng)上清，用無血清DMEM培養(yǎng)液洗板1次，再加入病毒滴度 為lxl06pfu/mL的DV2液，每孔1 mL,于溫度37。C吸附1小時(shí)，棄去病毒 液，再加入含有濃度為20 mL/L的FBS的DMEM培養(yǎng)液，每孔2 mL，在溫度 37°C、 C02氣體濃度為50 mL/L的條件下培養(yǎng)48小時(shí)，取出細(xì)胞爬片(即蓋 玻片)，以PBS漂洗3次，用濃度為40mL/L、 pH為7. 2 ~ 7. 6的多聚曱醛溶 液于室溫下固定20分鐘，以PBS漂洗3次，再用含有濃度為2 mL/L的Triton X-100的PBS于室溫下通透5分鐘，以PBS漂洗3次，再用封閉液(即含有 濃度為10mL/L的牛血清白蛋白即BSA的PBS)于室溫下封閉30分鐘，棄去 封閉液，加入1 : 100封閉液稀釋的pCAGGS-P7/NS2B免疫小鼠血清，于溫度4"C孵育過夜，以PBS漂洗3次，再加入1 : 400封閉液稀釋的異硫氰酸熒光 素(FITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (Sigma公司)，于室溫下孵育l小時(shí)，以 PBS漂洗3次，自然干燥后用濃度為400 mL/L的甘油封片，置熒光顯微鏡下 觀察；同時(shí)設(shè)陽性對照(以1 : 300封閉液稀釋的NS2B-His6融合蛋白免疫小 鼠血清替代1 : IOO封閉液稀釋的pCAGGS-P7/NS2B免疫小鼠血清)、陰性對 照I (以pCAGGS-P7免疫小鼠血清替代pCAGGS-P7/NS2B免疫小鼠血清)和陰 性對照II (以正常ECV304細(xì)胞替代DV2感染ECV304細(xì)月包，以正常小鼠血清 替代pCAGGS-P7/NS2B免疫小鼠血清);
結(jié)果如圖7所示，其中A為pCAGGS-P7/NS2B免疫小鼠血清染色的DV2 感染ECV304細(xì)胞，B為NS2B-His6融合蛋白免疫小鼠血清染色的DV2感染 ECV304細(xì)胞，C為pCAGGS-P7免疫小鼠血清染色的DV2感染ECV304細(xì)胞，D 為正常小鼠血清染色的正常ECV304細(xì)胞，A D均為400倍放大圖；從圖可 知，pCAGGS-P7/NS2B免疫小鼠血清染色的DV2感染ECV304細(xì)胞與NS2B-His6 融合蛋白免疫小鼠血清染色的DV2感染ECV304細(xì)胞相似，細(xì)胞核周有明顯的 強(qiáng)染，但陽性強(qiáng)度不及NS2B-His6融合蛋白免疫小鼠血清，而pCAGGS-P7免 疫小鼠血清染色的DV2感染細(xì)胞及正常小鼠血清染色的正常ECV304細(xì)胞只有 一些非特異的比較微弱的熒光，表明所得抗NS2B多克隆抗體能夠特異性地識 別自然表達(dá)的NS2B。
最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡 管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不 偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。<110〉 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
<120〉 登革病毒2型非結(jié)構(gòu)蛋白2B、其重組表達(dá)栽體及其制備方法和應(yīng)用
<160> 6
<210〉 1
<211〉 390
<212> DNA
<213> 登革病毒2型(Dengue virus 2) Trl751才朱 <220〉
<221> CDS
<222〉 (1)…(390)
<400> 1
agc tgg cca ttg
Ser Trp Pro Leu 1
ata ttg gcc agt
lie Leu Ala Ser
cca ctg gtg get Pro Leu Val Ala
gga cga teg get Gly Arg Ser Ala
tgg gaa gac cag Trp Glu Asp Gin
ata aca ata tea lie Thr lie Ser
gaa gaa caa aca Glu Glu Gin Thr
gag Asn Glu
tct Ser
20 gga Gly
35 gat Asp
50 gca Ala
65 gaa Glu
80 ctg Leu
95
etc Leu
ggg Gly
ttg Leu
gag Glu
gat Asp
acc Thr
gcc att atg Ala lie Met
tta aag aat Leu Lys Asn
etc ctt act Leu Leu Thr
gaa ttg gag Glu Leu Glu
ata tea ggg lie Ser Gly
ggc agc atg Gly Ser Met
ata etc ate lie Leu lie
gca Ala
10 gac Asp
25 gtg Val
40
aga Arg
55 agt Ser
70 tea Ser
85
aga Arg 100
gtc Val
ate lie
tgc Cys
get Ala
agt Ser
"a lie
aca Thr
ggg "g Gly Met
ccc atg Pro Met
tac gtg Tyr Val
gcc Ala
cca Pro
aag Lys
gga Gly
gac Asp
ate lie
aat Asn
ctg Leu
gtg Val
aca Thr
ctg Leu
gtc Val
ctg Leu
gaa Glu
ctg Leu
agc Ser
15 gga Gly
30 act Thr
45 aaa Lys
60 tea Ser
75
gag Glu 90 gtg Val 105
45
90
135
180
225
270
315gtt tea ggg ctt Val Ser Gly Leu
tgg Ut ctg tgg Trp Tyr Leu Trp
ttt ccc gtg tea gta cca att aca gca gca Phe Pro Val Ser Val Pro lie Thr Ala Ala 110 115 gaa gta aag aaa caa egg Glu Val Lys Lys Gin Arg 125 130
gca Ala 120
360
390
<210〉 2
<211〉 130
<212> PRT
<213〉 登革病毒2型(Dengue virus 2)Trl751氺朱
<400> 2 Ser Trp Pro Leu 1
lie Leu Ala Ser Pro Leu Val Ala Gly Arg Ser Ala Trp Gu Asp Gin lie Thr lie Ser Glu Glu Gin Thr Val Ser Gly Ixu Trp Tyr Leu Trp
Asn
Ser
20 Gly
35 Asp
50 Ala
65 Glu
80 Leu
95 Phe 110 Glu 125
Glu Ala Leu Leu Gly Leu Leu Glu Glu lie Asp Gly Thr lie Pro Val Val Lys
lie Met Ala Val 10
Lys Asn Asp lie 25
Leu Thr Val Cys 40
Leu Glu Arg Ala 55
Ser Gly Ser Ser 70
Ser Met Ser lie 85
Leu lie Arg Thr 100
Ser Val Pro lie 115
Lys Gin Arg 130
Gly Met Val Pro Met Thr Tyr Val Leu Ala Asp Val Pro lie Leu Lys Asn Glu Gly Leu Leu Thr Ala Ala
Ser
15 Gly
30 Thr
45 Lys
60 Ser
75 Glu
90 Val 105 Ala 120
<210〉 3
<211> 28
〈212〉 腿
<213〉 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述PCR引物Pl〈權(quán)> 3
cggg3tccta gctggccUt aa"gagg
<210> 4
<211〉 29
<212〉 醒
<213〉 人工序列
<220>
<223〉 人工序列的描述PCR引物P2
<400〉 4
cccaagcttc cgttgtUct ttacttccc
<210〉 5
<211> 31
<212〉 腿
<213〉 人工序列
<220>
〈22 3> 人工序列的描述PCR引物P3
〈400〉 5
ccgctcgaga tgagctggcc tttaaatgag g
〈210> 6
<2il> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
〈223> 人工序列的描述PCR引物P4
<400> 6
ataagcggcc gcctaccgtt gtttctttac ttccc
權(quán)利要求
1、一種登革病毒2型非結(jié)構(gòu)蛋白2B，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2、 編碼權(quán)利要求1所述的登革病毒2型非結(jié)構(gòu)蛋白2B的基因。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. l所示。
4、 一種重組表達(dá)載體，其特征在于含有權(quán)利要求2所述的基因，表達(dá)載 體為真核表達(dá)載體pCAGGS-P7。
5、 一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于含有權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體。
6、 一種制備權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體的方法，其特征在于包括以 下步驟a、 登革病毒2型非結(jié)構(gòu)蛋白2B基因的擴(kuò)增和純化合成1對特異性引物上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示，下游 引物的核苷S吏序列如SEQ ID No. 6所示；以^、有SEQ ID No. 1所示基因的重組原 核表達(dá)載體pQE-31/NS2B為模板，采用上述引物進(jìn)行登革病毒2型非結(jié)構(gòu)蛋白 2B基因的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為溫度95。C預(yù)變性5分鐘，然后溫度94。C變性 l分鐘、58。C退火l分鐘、72。C延伸1.5分鐘，共3G個(gè)循環(huán)，最后溫度72。C延 伸10分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，進(jìn)行切膠回收純化，即得登革 病毒2型非結(jié)構(gòu)蛋白2B基因；b、 重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定將步驟a所得登革病毒2型非結(jié)構(gòu)蛋白2B基因用Xho I和Not I雙酶切后， 連接到同樣用Xho I和Not I雙酶切的真核表達(dá)載體pCAGGS-P7上；將連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL-blue感受態(tài)菌，用含有氨爺青霉素的LB平板篩選陽性克隆， 提取質(zhì)粒，鑒定陽性克隆質(zhì)粒并測序，質(zhì)粒中插入片段的核苷酸序列和開放閱 讀框架與SEQ ID No.l所示序列一致者即為構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體 pCAGGS-P7/NS2B。
7、 權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體在制備抗登革病毒2型的核酸疫苗中的應(yīng)用。
8、 權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體在制備抗登革病毒2型非結(jié)構(gòu)蛋白2B 的抗體中的應(yīng)用。
9、 一種利用權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體制得的抗登革病毒2型非結(jié)構(gòu) 蛋白2B的多克隆抗體，其特征在于通過下述方法制得取體重16 ~ 20 g的6 ~ 8周齡健康BALB/c小鼠，首次免疫，于小鼠大腿肌肉內(nèi)注射權(quán)利要求4所述的 重組表達(dá)載體，每只100 首次免疫后第30天和第60天，分別重復(fù)免疫1 次；首次免疫后第67天，取小鼠血并分離血清，純化，即得抗登革病毒2型非 結(jié)構(gòu)蛋白2B的多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種登革病毒2型非結(jié)構(gòu)蛋白2B即NS2B，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，還公開了編碼NS2B的基因，為后期制備重組表達(dá)載體和表達(dá)NS2B、研究NS2B的功能和抗登革病毒藥物等提供了必要的基礎(chǔ)；本發(fā)明還公開了含有該基因的重組表達(dá)載體和含有該重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體，該重組表達(dá)載體的制備方法簡單，所得重組表達(dá)載體在真核細(xì)胞中成功地表達(dá)了NS2B，并在小鼠中成功地誘導(dǎo)了特異性的抗NS2B的多克隆抗體，可用于制備抗登革病毒2型的核酸疫苗和抗NS2B的抗體，可為開展NS2B在登革病毒感染細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)、定位和功能研究提供有力的工具。
文檔編號C12N15/40GK101429236SQ20081023321
公開日2009年5月13日 申請日期2008年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月3日
發(fā)明者劉麗梅, 靜 安, 陳宗濤 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)