專利名稱：地鱉蟲纖溶酶基因及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種地鱉蟲纖溶酶基因及其制備 方法。 豕忟不
地鱉蟲w'/ie/w^ Walker,又名土元、土鱉，屬節(jié)肢動物門昆蟲 綱蜚蠊科動物，是傳統(tǒng)的活血化瘀類動物藥。醫(yī)學(xué)記載和豐富的臨床實(shí)踐均早 已證明其具有破血逐瘀、續(xù)筋接骨、消炎散結(jié)、舒經(jīng)活血和療傷止痛等重要藥 用功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)試驗(yàn)也充分證明地鱉蟲具有溶解脈血栓，抑制血小板聚集， 抗凝血等藥用療效。
通過對地鱉蟲研究發(fā)現(xiàn)，其體內(nèi)含有多種纖溶酶成分。纖溶酶具有溶解纖 溶蛋白的作用，在抑制血栓形成和溶解血栓的過程中起重要作用，具有可觀的 醫(yī)用前景。
現(xiàn)在國內(nèi)外對地鱉蟲體內(nèi)的纖溶酶成分多是通過分離純化等技術(shù)獲得，然 而從生物體內(nèi)分離純化纖溶酶的過程非常繁瑣，而且生物體來源的蛋白質(zhì)也容 易在純化過程中失活，因此不能大量獲得纖溶酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種地鱉蟲纖溶酶基因。 '本發(fā)明的進(jìn)一步目的在于提供上述地鱉蟲纖溶酶基因的制備方法。
本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實(shí)現(xiàn)的
一種地鱉蟲纖溶酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示，由811個核苷酸組成，其中l(wèi)一672位核苷酸是地鱉蟲纖溶酶基因成熟肽序列，編碼224 個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，673—675位核苷酸是終止子 序列TAA。
上述地鱉蟲纖溶酶基因的制備方法為
(1) 提取地鱉蟲總RNA， mRNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA;
(2) 以上述cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到本發(fā)明地鱉蟲纖溶酶基因的5' 端序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
(3) 根據(jù)上述已得到的5'端序列設(shè)計引物，用3'RACE的方法獲得本發(fā)明 地鱉蟲纖溶酶基因的3'端序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
(4) 將步驟(2)得到的5'端序列和步驟(3)得到的3'端序列拼接即得完 整的地鱉蟲纖溶酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示。
上述步驟(2)中，首先是以mRNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，根據(jù)來源 于不同物種的纖溶酶所獲得的同源氨基酸序列設(shè)計簡并引物(其序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示)，PCR擴(kuò)增得到一個基因片段(其核苷酸序列 如SEQIDNO，4所示)，然后根據(jù)這個基因片段設(shè)計下游引物(其核苷酸序列 如SEQ ID NO:9所示)，同時根據(jù)同源序列設(shè)計的地鱉蟲纖溶酶基因成熟肽N 端引物(其核苷酸序列如SEQIDNO:10所示)，PCR擴(kuò)增得到本發(fā)明目的基 因的5'序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
上述步驟G)中，3'RACE的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員通用的方法，3'RACE 時所用到的引物， 一條是根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)計的接頭引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO:ll所示，另一條引物是根據(jù)上述得到的5'序列設(shè)計的，其核苷酸序列 如SEQIDNO:12所示。上述步驟(1)中的總RNA提取，以及mRNA反轉(zhuǎn)錄，其實(shí)驗(yàn)步驟都是 采用本領(lǐng)域技術(shù)人員通用的常規(guī)做法。
上述步驟(4)中所述的將5，端序列和3，端序列拼接的實(shí)驗(yàn)方法也是本領(lǐng) 域技術(shù)人員通用的常規(guī)做法。
步驟(4)中，將5'端序列和3'端序列拼接后，進(jìn)行T載體連接、轉(zhuǎn)染感 受態(tài)細(xì)胞、菌液PCR鑒定和酶切鑒定等本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)驗(yàn)后，將重組質(zhì)粒的菌 株送去測試，測試所得核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示，進(jìn)行同源比較后， 確定所得核苷酸序列為地鱉蟲纖溶酶基因。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
1、 本發(fā)明從地鱉蟲體內(nèi)獲得了完整的纖溶酶基因序列及其部分編碼氨基 酸序列，這極大地擴(kuò)充了纖溶酶基因的基因庫；
2、 本發(fā)明得到的地鱉蟲纖溶酶基因序列，可以通過基因工程的方法大量 獲得纖溶酶蛋白，應(yīng)用于抑制血栓形成和溶解血栓方面，具有可觀的醫(yī)用價值。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l 土鱉蟲總RNA提取
取活健壯雌土鱉蟲一只，0.1體積％的焦磷酸二乙酯(DEPC)溶液清洗， 用無RNA酶的剪刀剖開腹部，剪取土鱉蟲消化腔及中腸肌肉約30mg，加1.2ml 冰冷Trizol溶液(分兩次加入)充分研磨，將勻漿液放入1.5ml Eppendorf離 心管中，冰浴放置5min使其充分裂解。4°C， 12000rpm離心5min，取上清， 加入0.21111氯仿，振蕩20sec后冰浴放置10min 。4°C， 12000rpm離心15min， 小心吸取上層水相，至另一離心管中。每管加入0.5ml異丙醇混勻，冰浴放置 10min。 4°C， 12000rpm離心15min，棄上清。沉淀用lml75免乙醇洗滌一次，超凈臺中晾干，加30jJ RNase-free水溶解即得RNA樣品。 實(shí)施例2mRNA的反轉(zhuǎn)錄
20^1的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，含l昭實(shí)施例1制備得到的總RNA， 2.0嗎 oligo(dT)18，無RNA酶雙蒸水補(bǔ)至llpl， 70。C加熱5min后冰浴10min，再 加入5 X buffer ( 250腿ol/L Tris-HC1， 250mmol/L KCl， 20mmol/L MgCl2， 50mmol/L二硫蘇糖醇DTT)4ial， 1Ommol/L dNTP mix 2jxl，無RNA酶雙蒸 水補(bǔ)至19|il， 37。C保溫5min，再加入M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶l^il (200U)， 42 。C保溫lh， 7(TC加熱10min終止反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，冰浴冷卻后放入-2(TC冰箱保 存。
實(shí)施例3EFE-1片段的獲得
1) EFE-1片段引物的設(shè)計
參考NCBI上已發(fā)表的蚯弼l纖溶酶和蜈蚣纖溶酶激酶的序列，用Clusta11.8 軟件分析序列間的保守區(qū)段，輔助Primer Premier 5軟件設(shè)計一對簡并引物
上游引物5，-CTNACYGCWGCYCAYTG-3， ， SEQIDNO:7，簡并度 64，編碼氨基酸序列LTAAHC;
下游引物5，-CCNCCNGARTCWCCCT-3，， SEQIDNO:8，簡并度64， 編碼氨基酸序列QGDSGG;
其中R:A+G Y=T+C W=A+T N=A+T+G+C。
2) EFE-1片段的PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增采用25ul反應(yīng)體系 實(shí)施例2得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 lul;
lXBuffer (0.5mol/LKCl， O.lmol/LTris-HC1， pH8.4);MgCl2 2.0mmol/L; dNTPs 0.2mmol/L; 上游引物lfimol/L;
下游引物l^mol/L;
TaqDNA聚合酶1.5U。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)前先95t變性2 min，每個循環(huán)包括94。C變性 lmin， 5rC復(fù)性1.5min， 72"延伸2 min，共35個循環(huán)，最后一次循環(huán)結(jié)束 時72。C延伸5min。
3) EFE-1片段的回收
參考UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海生工)的使用說明書進(jìn)行，
① PCR產(chǎn)物電泳后，在紫外燈下用潔凈的手術(shù)刀割下含需回收DNA瓊脂塊；
② 按每40(Vl/100mg瓊脂糖凝膠比例加入Binding Buffer,置50 60。C水浴 10min，使膠徹底融化(每2min混勻一次)；③將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到套放于 收集管內(nèi)的UNIQ—10柱中，室溫放置2min， 8000rpm室溫下離心lmin;④ 取下UNIQ—10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ—10柱放入同一個收集管 中，加入500jil Wash Solution, 8000rpm室溫離心lmin。重復(fù)一次；⑤取下 UNIQ—IO柱，倒掉收集管中廢液，將UNIQ—IO柱放入同一個收集管中， 12000ipm室溫離心20sec;將UNIQ—IO柱放入一新1.5ml離心管中，在柱子 膜中央加30^Elution Buffer,室溫放置3min; 12000rpm室溫離心lmin，離心 管中液體即為回收的DNA片段。
4) EFE-1片段的測序
EFE-1片段經(jīng)UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收后，克隆至載體pUCiu-T中，轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌，提取質(zhì)粒酶切鑒定片段插入后，進(jìn)行DNA 測序，測序結(jié)果如SEQ ID NO:4所示。 實(shí)施例4EFE-2片段的獲得
1) EFE-2片段引物的設(shè)計
根據(jù)已獲得的EFE-1片斷序列，設(shè)計下游引物(SEQ ID NO:9)5'-CTC CCT GGC ATG CAT-3，，并參考NCBI上已發(fā)表的蚯蚓纖溶酶和蜈蚣纖溶酶激酶的 序列，用Clustall.8軟件分析序列間的保守區(qū)段，設(shè)計了地鱉蟲纖溶酶基因成 熟肽N端引物(SEQIDNO:10所示)5，-ARRATYGTNGGWGGW-3，，簡并 度128，其中，R=G+A， Y=T+C， N=A+T+G+C， W=A+T。
2) EFE-2片段的PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增的總體系為25uh 實(shí)施例2制備得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物lul;
lXBuffer (0.5mol/LKC1， 0.1mol/LTris-HCl， pH8.4); MgCl2 2.0mmol/L; dNTPs 0.2mmol/L;
下游引物lpmol/L; N端引物l拜ol/L;
TaqDNA聚合酶1.5U。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為反應(yīng)前先95'C變性2 min，每個循環(huán)包括94。C變 性lmin， 45i:復(fù)性1.5min， 72。C延伸2 min，共35個循環(huán)，最后一次循環(huán)結(jié) 束時72"C延伸5min。
3) EFE-2片段的回收同EFE-1 。
4) EFE-2片段的測序
同EFE-1 ，測序結(jié)果如SEQ ID NO:5所示。
實(shí)施例5用3，RACE的方法獲得地鱉蟲纖溶酶基因的3'序列(EFE-3 片段)
1) EFE-3片段引物的設(shè)計
根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)計接頭的接合體引物[d(T)16-adaptor] 5'-CTG ATC TAG AGG TAC CGG ATC (T)16-3'，接頭引物，SEQIDNO:ll， 5'-CTG ATC TAG AGG TAC CGG ATC -3';
根據(jù)實(shí)施例4所得EFE-2片段設(shè)計特異性引物，SEQ ID NO:12， 5'-ACAAG TTATC CGTCATGCCA GC-3'。
2) mRNA的反轉(zhuǎn)錄
以接頭的接合體引物[d(T)i6-adaptor]對土鱉的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄 條件與實(shí)施例2相同。
3) EFE-3片段的3'RACE擴(kuò)增 3'RACE擴(kuò)增25ul反應(yīng)體系 上述步驟(2)得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物lul，
IXBuffer (0.5mol/L KC1， 0.1mol/LTris-HCl， pH8.4); MgCl2 2.0mmol/L; dNTPs 0.2mmol/L;
接頭引物lMmol/L;
牛寺異性引物lumol/L,TaqDNA聚合酶L5U。
3'RACE擴(kuò)增反應(yīng)條件為反應(yīng)前先95。C變性2min，每個循環(huán)包括94'C 變性lmin， 6rC復(fù)性50s， 72'C延伸1.5 min，共35個循環(huán)，最后一次循環(huán)結(jié) 束時72"C延伸5min。
4) EFE-3片段擴(kuò)增產(chǎn)物的回收 同EFE-1 。
5) EFE-3片段的測序
同EFE-1 ，測序結(jié)果如SEQ ID NO:6所示。 實(shí)施例6 地鱉蟲纖溶酶基因全長序列的獲得
將EFE-2片段的序列與EFE-3片段的序列進(jìn)行拼接，即得地鱉蟲纖溶酶基 因全長序列，如SEQ ID NO: 1所示。
將SEQ ID NO:l所示序列進(jìn)行同源性比對，證明所得序列確實(shí)為纖溶酶 基因序列。
該基因序列長度為811bp，單鏈，直鏈狀(拓?fù)鋵W(xué))； 該基因成熟肽序列為1-672位核苷酸，編碼224個氨基酸，其氨基酸序列 如SEQIDNO:3所示；
該基因的終止子密碼位于基因673-675位，終止密碼為TAA; 該基因的676-811位核苷酸為3'末端非編碼序列。地鱉蟲纖溶酶基因及其制備方法序列表.txt SEQUENCE LISTING
<110〉廣東工業(yè)大學(xué)
<120〉地鱉蟲纖溶酶基因及其制備方法
〈130〉
<160> 12
<170〉 Patentln version 3.5
<210> 1
〈211〉 811
<212> DNA
<213> 地鱉蟲(Eupolyphage sinensis Walker) <柳〉1
atcgtgggtggttctacaactacaatccagaacttcccataccaggtctctctccaatat60
ggcggctctcgcatctgcggtggttcaatcatcagtgccaactatgttctgacagctgcc120
cattgcatcattgggagcgctagtcaacac3g33ttCg3gttggatcaaccttctcaaac180
tcaggtggcaccatctacaatgctgcacaagttatccgtcatgccagctacaactccaga240
accttggactatgacatcggcctcgtcagg3C33gCtC3ggaatcgtgggaggcagcggt300
gtcgcctctatcgctctgcaatccgcaaatattgctgcaggaacttcagcagtcgtc8gc360
ggttgggg33caacttcggaaggaggctctgctagcaccaccctgcgtcaagtcgccgta420
CC83ttgtCgccgacgccgcctgtaacagtgcctatgcctC3t3tggtggaatcactgct480
cgtatgatctgCgC3ggtttcaccgccggaggcaggg3tgcatgccagggcgattctggc540
ggtccactggttgccggcggcagactggtaggtgtcgtatcctggggagtcggttgcgcc600
cgacctaacttccctggagt3t3CgCC33ggtttcg犯ccttcgaagctggatccaaagc660
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atacatctctgttcta8cactaagc犯taactgtcatgtaacaatccaat780
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<210> 2
〈211〉 811
<212〉 D懸
<213> 地鱉蟲(Eupolyphage sinensis Walker)
<220〉 <221〉 < 〈222〉CDS (l)..(672)
<400〉 3tC gtg lie Val 12 ggt Glyggt Glytct Ser 5ThrThrThrlieC3g Gin 1038C Asnttc PheCC3 Prot3C TyrC3g Gin 15gtc Val48
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Gin His 50卿 Argliecga Arggtt ValGly 55tea Ser3CC Thrttc PhetC3 Seraac Asn 60tea Serggt Glyggc Gly3CC Thr192
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txt
acc ttg gac tat gac ate ggc etc gtc agg aca age tea gga ate gtg Thr Leu Asp Tyr Asp lie Gly Leu Val Arg Thr Ser Ser Gly lie Val 85 90 95
288
gga ggc age ggt gtc gcc tct ate get ctg caa tec gca aat att get Gly Gly Ser Gly Val Ala Ser lie Ala Leu Gin Ser Ala Asn lie Ala 10b 105 110
336
gca gga act tea gca gtc gtc age ggt tgg gga aca act teg gaa gga Ala Glv Thr Ser Ala Val Val Ser Gly Trp Glv Thr Thr Ser Glu Gly 115 120 125
384
ggc tct get age acc acc ctg cgt caa gtc gcc gta cca att gtc gcc Glv Ser Ala Ser Thr Thr Leu Arg Gin Val Ala Val Pro lie Val Ala 130 135 140
432
gac gcc gcc tgt aac agt gcc tat gcc tea tat ggt gga ate act get Asp Ala Ala Cys Asn Ser Ala Tyr Ala Ser Tyr Gly Glv lie Thr Ala 145 150 155 160
480
cgt atg ate tgc gca ggt ttc acc gcc gga ggc agg gat gca tgc cag Arg Met lie Cys Ala Gly Phe Thr Ala Gly Gly Arg Asp Ala Cys Gin 165 170 175
528
ggc gat tct ggc ggt cca ctg gU gcc ggc ggc aga ctg gta ggt gtc Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Ala Glv Gly Arg Leu Val Gly Val 180 185 190
576
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732 792 811
〈210> 3 〈211> 224 〈212〉 PRT
〈213> 地鱉蟲(Eupolyphage sinensis Walker) <400> 3
lie Val Glv Gly Ser Thr Thr Thr lie Gin Asn Phe Pro Tyr Gin Val 15 10 15
Ser Leu Gin Tyr Gly Gly Ser Arg lie Cys Glv Gly Ser lie lie Ser 20 25 30
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Gin His Arg lie Arg Val Gly Ser Thr Phe Ser Asn Ser Gly Gly Thr 50 55 60
lie Tvr Asn Ala Ala Gin Val I]e Arg His Ala Ser Tyr Asn Ser Arg 65 70 75 80
Thr Leu Asp Tvr Asp lie Gly Leu Val Arg Thr Ser Ser Gly lie Val 85 90 95地鱉蟲纖溶酶基因及其制備方法序列表.txt
<formula>formula see original document page 13</formula>地鱉蟲纖溶酶基因及其制備方法序列表.txt ggttgggga3 cascttcgga 3ggaggctct gct3gcacca ccctgcgtca agtcgccgta 420
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cgtatgatct gcgcaggttt caccgccgga ggcagggatg cat.gcc3ggg 532
<210> 6
<211〉 500
〈212〉 麗A
<2〗.3> 地鱉蟲(Eupolyphage sinensis Walker)
<400〉 6
cgctctgcaatccgcaaatattgctgcagg aacttcagca gtcgtcagcg gttggggaac60
朋cttcgg3actagcaccaccctgcgtcaa gtcgccgtac caattgtcgc120
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<210〉 7
<211> 17
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<220>
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<222〉 (3).. (3)
<223〉 n is a, c， g， or t
<400> 7
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<211〉 16
<212〉 D脆 <213>人工序列
<220〉
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<222> (3).. (3)
<223〉 n is a， c, g, or t
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<222> (6). 7"(6)
<223〉 n is a， c, g, or t
<400〉 8
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<210> 9 〈211> 15 <212〉 DM <213>人工序列
〈400〉 9 ^ ctccctggca tgcat 15地鱉蟲纖溶酶基因及其制備方法序列表.txt
<210〉 10
<211> 15
<212〉 腿 <213〉人工序列
<400〉 10 1S arr3tygtng gwggw 15
<210> 11
<211> 21
<212〉 腿 <213>人工序列
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<211> 22
<212> DNA <213>人工序列
<400> 12
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<220> <221〉 <222> 〈223〉
—feature
:(9)
a, c, g, or t
權(quán)利要求
1、一種地鱉蟲纖溶酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述地鱉蟲纖溶酶基因，其特征在于所述核苷酸序列 中的l一672位核苷酸是地鱉蟲纖溶酶基因成熟肽序列，編碼224個氨基酸， 其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，673_675位核苷酸是終止子序列TAA。
3、 一種權(quán)利要求1所述地鱉蟲纖溶酶基因的制備方法，其特征在于該方 法包括如下步驟(1) 提取地鱉蟲總RNA， mRNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA;(2) 以上述cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到地鱉蟲纖溶酶基因5'端序列，其 核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；(3) 根據(jù)上述已得到的5'端序列設(shè)計引物，用3'RACE的方法獲得地鱉蟲 纖溶酶基因的3'端序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；(4) 將步驟(2)得到的5，端序列和步驟(3)得到的3'端序列拼接即得地 鱉蟲纖溶酶基因。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中PCR 擴(kuò)增的引物，其核苷酸序列如SEQIDNO:7、 SEQIDNO:8、 SEQ ID NO:9和 SEQIDNO:10所示。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述歩驟(3)中3'RACE 所用引物，其核苷酸序列如SEQIDNO:ll和SEQIDNO:12所示。
全文摘要
本發(fā)明公開一種地鱉蟲纖溶酶基因及其制備方法，該基因由811個核苷酸組成，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，其中1-672位核苷酸是地鱉蟲纖溶酶基因成熟肽序列，編碼224個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO3所示。本發(fā)明的基因是通過先mRNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，PCR擴(kuò)增得到基因5’端序列，然后用3’RACE的方法獲得基因的3’端序列，最后將5’端序列和3’端序列拼接即得地鱉蟲纖溶酶基因。本發(fā)明的基因序列擴(kuò)充了纖溶酶基因的基因庫，同時根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列，通過基因工程的方法大量獲得纖溶酶蛋白，應(yīng)用于抑制血栓形成和溶解血栓方面，具有可觀的醫(yī)用價值。
文檔編號C12N15/57GK101413008SQ20081021940
公開日2009年4月22日 申請日期2008年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月25日
發(fā)明者李興暖, 李張偉, 韓雅莉 申請人:廣東工業(yè)大學(xué)