專利名稱：一種光合細菌制劑的制備工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種光合細菌制劑的制備工藝。
背景技術：
光合細菌是一群能在厭氧光照或好氧黑暗條件下利用有機物作供氧體兼碳源的細菌。光 合細菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖、廢水處理、種植業(yè)等領域具有廣泛應用。目前已開發(fā)出多種培養(yǎng)光合細 菌的方法和裝置，這些方法主要是基于光合細菌是能在厭氧光照條件下生長的原理而開發(fā)的， 其設施通常是玻璃容器、塑料薄膜袋等，設施簡單，投資較小，存在的問題主要是培養(yǎng)時間長(一般要4-7天)、生產(chǎn)效率低、培養(yǎng)液含菌量較小(一般只能到30億個/mL)，容易染菌， 產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。雖然已經(jīng)有人進行了用通氣式發(fā)酵培養(yǎng)光合細菌的試驗，但由于培養(yǎng)基配 方、培養(yǎng)工藝條件等技術不夠完善的原因，仍難于使光合細菌制劑生產(chǎn)的標準化、規(guī)?；?產(chǎn)業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種應用通氣式發(fā)酵培養(yǎng)光合細菌以制備光合細菌制劑的新工 藝，克服了現(xiàn)有技術的不足之處，以期實現(xiàn)光合細菌制劑生產(chǎn)的標準化、規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化。 本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的采用沼澤紅假單胞菌(/ /wcfo戸ew^)womw; a/w^^)作為出發(fā)菌種，該菌種是紅假單胞菌屬 的沼澤紅假單胞菌，為桿狀、光能異養(yǎng)菌，革藍氏陰性，這種細菌在文獻中已公開記載(l.顧 祖宜，戚蓓靜，翁穌亂沼澤紅假單胞菌(及/wA;^Wowowa;y戸/w欲的的分離與鑒定.華東師 范大學學報(自然科學版)，1982， (4): 77-84; 2.郭慶文，吉海平.紫色非硫光合細菌的研 究.詞料工業(yè)，1994, 15 (3): 36-39; 3祝國琴，姜靜穎，劉衛(wèi)，等.高活性光合細菌的分離 培養(yǎng)及應用.水產(chǎn)科學，1994， 13 (1): 6-9.)。申請?zhí)枮?00410026930.0，名稱為"一種用于 控制河道底泥二次污染的固定化復合菌劑的制備方法"也公開記載了該細菌。上述微生物菌種 在國內(nèi)許多微生物保藏機構有保藏并出售(例如廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心 GIMCC)，可通過市購獲得，并且該微生物菌種本發(fā)明人也持有，保證可以在本發(fā)明申請日 起的20年內(nèi)提供。本發(fā)明用沼澤紅假單胞菌(i /2odo;wei^omomw ; fl/wWn》菌種按以下步驟進行培養(yǎng)(1) 斜面種子活化培養(yǎng)將沼澤紅假單胞菌菌種接種到斜面固體培養(yǎng)基上進行活化；(2) 搖床種子培養(yǎng)將活化的菌種接種到液體培養(yǎng)基中，溫度32。C 34。C，培養(yǎng)為36 48小時，獲得種子培養(yǎng)液； (3)通氣發(fā)酵罐培養(yǎng)將含菌量為6億 10億個/ml的種子培養(yǎng)液，按質(zhì)量分數(shù)10% 12%的接種量接入含有液體培養(yǎng)基的通氣發(fā)酵罐中培養(yǎng)，在黑暗條件下，溫度 32。C 34'C，溶解氧L0 2.0mg/1，培養(yǎng)36 48小時，即得光合細菌制劑。 所述的搖床種子培養(yǎng)和通氣發(fā)酵罐培養(yǎng)使用的液體培養(yǎng)基的配方按質(zhì)量分數(shù)計為 葡萄糖0.9% 1.1%、脲0.04% 0.06%、磷酸氫二鉀(K2HP04) 0.02% 0.03%、磷酸二 氫鉀(KH2P04) 0.02% 0.03%、硫酸鎂(MgS04'7H20) 0.02% 0.03%、氯化鈉(NaCl) 0.20% 0.30%、氯化鈣(CaCl2) 0.03% 0.05%、水98.40% 98.77%，然后以上述培養(yǎng) 基的總質(zhì)量為基準添加黃腐酸0.10% 0.30%。
斜面種子活化培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基是在搖床種子培養(yǎng)和通氣發(fā)酵罐培養(yǎng)使用的液 體培養(yǎng)基中加入常量的瓊脂后而形成的固體培養(yǎng)基。 本發(fā)明的有益效果如下
(1) 本發(fā)明采用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方，較廉價的黃腐酸作為光合細菌促生長劑，并采用合 理的通氣攪拌條件，與厭氧光照培養(yǎng)相比，縮短了生產(chǎn)時間，只需36 48小時就 可獲得40 60億個/ml的光合細菌沼澤紅假單胞菌制劑，提高了生長效率，降低了 生產(chǎn)成本。
(2) 本發(fā)明采用通氣式發(fā)酵罐培養(yǎng)獲得高濃度光合細菌沼澤紅假單胞菌，提高沼澤紅假 單胞菌制劑生產(chǎn)效率、產(chǎn)品質(zhì)量及穩(wěn)定性，有助于光合細菌制劑生產(chǎn)的標準化和規(guī) ?；?br> 本方法培養(yǎng)的光合細菌制劑可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、廢水處理、種植業(yè)等多個領域。
具體實施例方式
實施例1:
培養(yǎng)基的配制
按照下述成份和配比(質(zhì)量比)制備搖床培養(yǎng)和通氣發(fā)酵罐培養(yǎng)好氧培養(yǎng)的培養(yǎng)基
葡萄糖0.9%，脲0.04%，磷酸氫二鉀(K2HP04) 0.02%，磷酸二氫鉀(KH2P04) 0.02%， 硫酸鎂(MgS04'7H20) 0.02%，氯化鈉(NaCl) 0.20%，氯化鈣(CaCl2) 0.03%，水98.77%。
然后以上述培養(yǎng)基的總重量為基準，添加黃腐酸0.20%。
用于斜面種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基，是在搖床培養(yǎng)和通氣發(fā)酵罐培養(yǎng)基的基礎上，添加1.5%瓊 脂(質(zhì)量比)，制作成的固體培養(yǎng)基。
所有培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌處理。
制備工藝過程將沼澤紅假單胞菌菌種接種到斜面固體培養(yǎng)基上進行活化，斜面培養(yǎng)溫度33'C，培養(yǎng)48 小時，得到斜面種子，將經(jīng)活化的斜面種子接入已滅菌處理的含有培養(yǎng)基的三角瓶中，在搖 床上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度33r，培養(yǎng)48小時，得到種子培養(yǎng)液。然后將含菌量為6億個/ml種子 培養(yǎng)液接種到10L的通氣發(fā)酵罐培養(yǎng)，接種量12%，在黑暗條件下，溫度33'C，控制罐中溶 解氧1.5mg/L，培養(yǎng)48小時，獲得菌液濃度為50億個/ml的光合細菌制劑。 實施例2:培養(yǎng)基的配制按照下述成份和配比(質(zhì)量比)制備搖床培養(yǎng)和通氣發(fā)酵罐培養(yǎng)好氧培養(yǎng)的培養(yǎng)基葡萄糖1.0%,脲0.06%，磷酸氫二鉀(K2HP04) 0.025%,磷酸二氫鉀(KH2P04) 0.025%， 硫酸鎂(MgS04-7H20) 0.025%，氯化鈉(NaCl) 0.25%，氯化鈣(CaCl2) 0.03%，水98.58%。 以上述培養(yǎng)基的總重量為基準，添加黃腐酸0.10%黃腐酸。用于斜面種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基，是在搖床培養(yǎng)和通氣發(fā)酵罐培養(yǎng)基的基礎上，添加1.5%瓊 脂(重量比),制作成斜面培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌處理。制備工藝工程將沼澤紅假單胞菌菌種接種到斜面固體培養(yǎng)基上進行活化，斜面培養(yǎng)溫度34'C，培養(yǎng)48 小時，得到斜面種子，將經(jīng)活化的斜面種子接入已滅菌處理的含有液體培養(yǎng)基的三角瓶中， 在搖床上培養(yǎng)，黑暗條件下，培養(yǎng)溫度34'C，培養(yǎng)48小時，得到種子培養(yǎng)液，然后將含菌 量為8億個/ml接種到10L的含有液體培養(yǎng)基的通氣發(fā)酵罐培養(yǎng)，接種量10%,黑暗條件下， 溫度34'C，控制罐中溶解氧1.0mg/l，培養(yǎng)時間36小時，獲得菌液濃度為42億個/ml的光合 細菌制劑。 實施例3:培養(yǎng)基的配制按照下述成份和配比(質(zhì)量比)制備搖床培養(yǎng)和通氣發(fā)酵罐培養(yǎng)好氧培養(yǎng)的培養(yǎng)基葡萄糖1.1%，脲0.06%，磷酸氫二鉀(K2HP04) 0.03%,磷酸二氫鉀(KH2P04) 0.03%， 硫酸鎂(MgS04'7H20) 0.03%，氯化鈉(NaCl) 0.3%，氯化l丐(CaCl2) 0.05%，水98,40%。 以上述培養(yǎng)基的重量為基準，添加黃腐酸0.30% (重量比)作為促生長劑。用于斜面種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基，是在搖床培養(yǎng)和通氣發(fā)酵罐培養(yǎng)基的基礎上，添加1.5%瓊 脂(重量比),制作成斜面培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌處理。制備工藝過程將沼澤紅假單胞菌菌種接種到斜面固體培養(yǎng)基上進行活化，斜面培養(yǎng)溫度32'C，培養(yǎng)48 小時，得到斜面種子，將經(jīng)活化的斜面種子接入已滅菌處理的含有液體培養(yǎng)基的三角瓶中， 在搖床上培養(yǎng)，黑暗條件下，培養(yǎng)溫度32'C，培養(yǎng)48小時，得到種子培養(yǎng)夜，然后將含菌 量為10億個/ml種子培養(yǎng)夜接種到10L的含有液體培養(yǎng)基的通氣發(fā)酵罐中培養(yǎng)，接種量12%， 溫度32'C，控制罐中溶解氧2.0mg/1，培養(yǎng)48小時，獲得菌液濃度為60億個/ml的光合細菌 制劑。
權利要求
1、一種光合細菌制劑的制備工藝，其特征在于采用沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)菌種按以下步驟進行培養(yǎng)(1)斜面種子活化培養(yǎng)將沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)菌種接種到斜面固體培養(yǎng)基上進行活化；(2)搖床種子培養(yǎng)將活化的菌種接種到液體培養(yǎng)基中，溫度32℃～34℃，培養(yǎng)36～48小時，獲得種子培養(yǎng)液；(3)通氣發(fā)酵罐培養(yǎng)將含菌量為6億～10億個/毫升的種子培養(yǎng)液，按質(zhì)量分數(shù)10％～12％的接種量接入含有液體培養(yǎng)基的通氣發(fā)酵罐中培養(yǎng)，在黑暗條件下，溫度32℃～34℃，溶解氧1.0～2.0mg/L，培養(yǎng)36～48小時，即得光合細菌制劑；所述的搖床種子培養(yǎng)和通氣發(fā)酵罐培養(yǎng)使用的液體培養(yǎng)基的配方按質(zhì)量分數(shù)計為葡萄糖0.9％～1.1％、脲0.04％～0.06％、磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.02％～0.03％、磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.02％～0.03％、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.02％～0.03％、氯化鈉(NaCl)0.20％～0.30％、氯化鈣(CaCl2)0.03％～0.05％、水98.40％～98.77％，然后以上述培養(yǎng)基的總質(zhì)量為基準添加黃腐酸0.10％～0.30％；斜面種子活化培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基是在搖床種子培養(yǎng)和通氣發(fā)酵罐培養(yǎng)使用的液體培養(yǎng)基中加入常量的瓊脂后而形成的固體培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明提出一種光合細菌制劑的制備工藝，該工藝方法用沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)菌種經(jīng)斜面種子活化培養(yǎng)、搖床種子培養(yǎng)和通氣發(fā)酵罐培養(yǎng)等培養(yǎng)步驟，采用的培養(yǎng)基包括基本培養(yǎng)基和促生長劑?；九囵B(yǎng)基按質(zhì)量比含有葡萄糖0.9～1.1％、脲0.04～0.06％、磷酸氫二鉀0.02～0.03％、磷酸二氫鉀0.02～0.03％、硫酸鎂0.02～0.03％、氯化鈉0.20～0.30％、氯化鈣0.03～0.05％、水98.40～98.77％。促生長劑是以基本培養(yǎng)基的質(zhì)量為基準添加黃腐酸0.10～0.30％。本工藝獲得的光合細菌制劑的菌液濃度可達40～60億個/ml，菌劑可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、廢水處理、種植業(yè)等多個領域。
文檔編號C12R1/01GK101407774SQ20081021926
公開日2009年4月15日 申請日期2008年11月20日 優(yōu)先權日2008年11月20日
發(fā)明者付廣義, 余旭錄, 陳繁忠 申請人:中國科學院廣州地球化學研究所