專利名稱：：一種空腸彎曲菌殼聚糖納米dna疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及重組質(zhì)粒、納米-質(zhì)粒納米顆粒的制備和應(yīng)用，特別是涉及一種空腸彎曲菌殼聚糖納米DNA疫苗，以及質(zhì)粒-殼聚糖納米顆粒制備和應(yīng)用。技術(shù)背景自1990年偶然發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA在肌肉細(xì)胞中能進(jìn)行轉(zhuǎn)化和表達(dá)，并推測(cè)用DNA注入機(jī)體可能產(chǎn)生免疫反應(yīng)以來，全世界范圍內(nèi)迅速掀起了一股DNA疫苗研究熱。DNA疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，兼有減毒活疫苗的有效性和亞單位疫苗的安全性，可以非常容易操作質(zhì)粒DNA以改變免疫反應(yīng)的質(zhì)和量，并具有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、易于儲(chǔ)存運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是第三代疫苗。1995年5月，報(bào)導(dǎo)了世界第一例DNA疫苗的臨床試驗(yàn)，世界衛(wèi)生組織(WHO)把DNA疫苗納入WHO全球免疫研制開發(fā)計(jì)劃之中。DNA疫苗雖然有諸多優(yōu)點(diǎn)，但也有許多需要優(yōu)化的地方。如核酸疫苗的免疫劑量問題仍然困擾著人們；DNA疫苗免疫原性弱，不如一般傳統(tǒng)疫苗和減毒活疫苗引起的免疫反應(yīng)強(qiáng)等，成為阻止DNA疫苗應(yīng)用于臨床的障礙。如何提高DNA疫苗的免疫原性，尤其是在人和動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力，在很大程度上決定著DNA疫苗未來的命運(yùn)。DNA疫苗新技術(shù)的核心之一是將編碼抗原的核酸序列組裝到含有必要表達(dá)調(diào)控元件的真核表達(dá)載體中構(gòu)建核酸疫苗，然后將其導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，重組的核酸疫苗可以利用動(dòng)物體內(nèi)的酶系合成外源基因編碼的蛋白，從而誘發(fā)動(dòng)物對(duì)該外源蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答，達(dá)到免疫目的。DNA疫苗的免疫效果是由質(zhì)粒、佐劑的使用、免疫方案以及免疫接種的操作技術(shù)等因素決定的。質(zhì)粒的因素又包括載體和抗原基因兩個(gè)方面，一般認(rèn)為，免疫反應(yīng)的強(qiáng)度與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果和基因表達(dá)效率兩個(gè)因素正相關(guān)。不同的疾病對(duì)保護(hù)性免疫有著不同的要求，是以體液免疫為主還是以細(xì)胞免疫為主，增強(qiáng)DNA疫苗免疫效應(yīng)的策略必須反映這些要求。為了解決DNA疫苗免疫原性弱的問題，許多科學(xué)家正致力于研究提高DNA疫苗免疫原性的方法，其中一個(gè)重要的方面就是改進(jìn)載體以提高抗原的表達(dá)，提高載體的耙向性和研究更高效的輔助分子包括細(xì)胞因子及其他免疫佐劑。殼聚糖微囊是一種具有廣闊前景的新型藥物載體，具有無毒、生物相容性高、生物可降解、可控制藥物的釋放、提高藥物生物利用度以及增加藥物局部滯留性等優(yōu)點(diǎn)。1995年，Munper等人首次報(bào)道殼聚糖溶液與DNA以自聚集的方式沉淀能得到一種大小為150~500nm的復(fù)合物，初步認(rèn)為殼聚糖有用于基因治療載體的潛質(zhì)。近年來，許多研究表明殼聚糖能和DNA形成微囊，可以用做基因轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來轉(zhuǎn)運(yùn)治療性基因和基因疫苗。Roy等人的研究證明殼聚糖-DNA納米微囊系統(tǒng)能有效地在小鼠小腸釋放DNA，誘發(fā)有效的粘膜免疫保護(hù)反應(yīng)。因此，殼聚糖是發(fā)展DNA疫苗的一個(gè)有廣闊應(yīng)用前景的介質(zhì)?？漳c彎曲菌是G—菌，是引起人腸炎的首要病原菌，與人神經(jīng)炎病變關(guān)系密切。空腸彎曲菌能定殖于大多數(shù)溫血?jiǎng)游锏哪c黏膜，幾乎包括所有的食物源性動(dòng)物和人類，尤其是在野鳥、雛雞、火雞、鵪鶉、鴨和駝鳥等幾乎所有禽的腸道，而且空腸彎曲菌在禽腸道的定殖是共棲關(guān)系，禽肉加工過程中交叉污染，并通過食物鏈感染人是公認(rèn)的途徑。減少/消滅食品鏈尤其是禽類中空腸彎曲菌是控制該菌的主要策略，控制或清除禽類彎曲菌是預(yù)防和控制人空腸彎曲菌病的重要前提。多種措施被應(yīng)用于減少禽的污染率，包括通過采取生物安全措施、建立健康動(dòng)物群和提高凈化飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生等，另外，很多實(shí)驗(yàn)性研究也相繼開展，如腸道菌群的競(jìng)爭(zhēng)性抑制、抗菌性微生物或抗生素治療等，盡管這些方法很有效，但存在耐藥性等很多缺點(diǎn)。疫苗仍被認(rèn)為是控制和減少禽彎曲菌最有效、安全的方法，由于空腸彎曲菌生態(tài)和生理特征，包括滅活苗在內(nèi)的多種常規(guī)疫苗對(duì)控制雞空腸彎曲菌的作用較差，不能滿足國(guó)內(nèi)外養(yǎng)禽業(yè)對(duì)高效、安全可靠、有預(yù)防作用的雞空腸彎曲菌疫苗的迫切需求。分子生物學(xué)和疫苗設(shè)計(jì)的發(fā)展為雞空腸彎曲菌防治提供了新思路。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有傳統(tǒng)接種空腸彎曲菌滅活菌或裸DNA疫苗作為預(yù)防疫苗，產(chǎn)生的抗體滴度低、免疫效果差、易產(chǎn)生免疫逃避、僅有較弱的預(yù)防作用等缺陷，從而提供一種能有效降低雞體內(nèi)空腸彎曲菌攜帶量的殼聚糖納米DNA疫苗。本發(fā)明的另一目的是提供該殼聚糖納米DNA疫苗的制備。本發(fā)明的再一目的是提供該殼聚糖納米DNA疫苗的用途。本發(fā)明的目的是由如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種空腸彎曲菌殼聚糖納米DNA疫苗，是殼聚糖和重組質(zhì)粒構(gòu)成的納米微囊，其中，所說的重組質(zhì)粒是由空腸彎曲菌鞭毛蛋白基因_/7o4和真核表達(dá)載體pCAGGS組成的pCAGGS-flaA，所述的鞭毛蛋白基因具有SEQNO.l所示的核苷酸序列。前述的鞭毛蛋白_/7^基因是空腸彎曲菌的致病決定基因，其為彎曲菌基因組的核苷酸，應(yīng)用現(xiàn)代納米技術(shù)研制而成殼聚糖-重組的納米顆粒，用做基因轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來轉(zhuǎn)運(yùn)基因疫苗。本發(fā)明提供的所述空腸彎曲菌殼聚糖納米DNA疫苗的制備，包括如下步驟1)設(shè)計(jì)特異性引物根據(jù)GenBank登陸序列(gi:30407139)，利用DNAstar軟件分析，選取空腸彎曲菌鞭毛蛋白基因y/^4的核苷酸序列，按正確的閱讀順序設(shè)計(jì)一對(duì)引物上游引物FlaA-F5'-CATCTAGAAGCATTTAACAAGTTCATGG-3'Q^aI)下游引物FlaA-R5'-TAGAATTCGTGTTTATCCTAAAACCCAT-3'(￡coRI)2)通過PCR技術(shù)擴(kuò)增空腸彎曲菌鞭毛蛋白^a4基因，克隆、回收得到純化的yc^基因片段；3)將_/7"基因重組到質(zhì)粒pCAGGS真核表達(dá)質(zhì)粒中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pCAGGS-flaA;4)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pCAGGS-flaA溶于殼聚糖溶液中，制成一種空腸彎曲菌殼聚糖納米DNA疫苗。本發(fā)明進(jìn)一步提供了空腸彎曲菌殼聚糖納米DNA疫苗在制備用于預(yù)防雞空腸彎曲菌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的空腸彎曲菌殼聚糖納米DNA疫苗優(yōu)益之處在于1)所需的免疫量較小，50-100微克即可；2)核酸疫苗能同時(shí)高效激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫；3)口服攻毒后，泄殖腔排菌率呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，并能減少血液和小腸、大腸、盲腸中空腸彎曲菌數(shù)量；4)免疫過程安全、長(zhǎng)效(免疫能力有長(zhǎng)時(shí)間的記憶)、穩(wěn)定、操作便捷。圖l重組質(zhì)粒pCAGGS-flaA的構(gòu)建示意2殼聚糖/質(zhì)粒納米顆粒的電泳檢測(cè)，其中M.DNAMarker,1.CS-pCAGGS-flaA，2.pCAGGS-flaA圖3殼聚糖-質(zhì)粒納米顆粒的電鏡觀察(X46000)具體實(shí)施方式本發(fā)明實(shí)施中使用的白萊航雞(WhiteLeghorn)非免疫蛋(受精)購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，置孵化箱中自行孵化，去除弱雛、病雛等不健康雞，備用。空腸彎曲菌(ATCC33560，購自天恒科技有限公司)pGEM您Teasyvector:(購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)真核表達(dá)載體pCAGGS:(Miyazaki.饋贈(zèng)，見參考文獻(xiàn))大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞(購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)COS-7細(xì)胞(購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)實(shí)施例1.本發(fā)明的空腸彎曲菌DNA疫苗—pCAGGS-flaADNA疫苗的構(gòu)建本發(fā)明的pCAGGS-flaADNA疫苗的構(gòu)建步驟如下①空腸彎曲菌基因組模板的提取取空腸彎曲菌純培養(yǎng)物菌液0.5ml，8000rpm離心5min棄上清，加入100pl超純水，用移液器將其混合均勻，隔水煮沸20min，取出立即置于冰上，8000rpm離心5min，取上清置于-20'C冰箱中備用。②設(shè)計(jì)特異性引物根據(jù)GenBank登陸序列(gi:30407139)，利用DNAstar軟件分析，選取空腸彎曲菌鞭毛蛋白基因/^4的核苷酸序列，按正確的閱讀順序設(shè)計(jì)合成引物，在引物的5'端加有酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。其中上游引物中包含起始密碼子(ATG)及真核表達(dá)所必需的Kozak轉(zhuǎn)譯起始序列。上游引物FlaA-F5'-CATCTAGAAGCATTTAACAAGTTCATGG-3'I)下游引物FlaA-R5'-TAGAATTCGTGTTTATCCTAAAACCCAT-3'(￡coRI)③空腸彎曲菌鞭毛蛋白基因/o4的PCR擴(kuò)增PCR的總反應(yīng)體系為50m1，分別在滅菌的0.5mLPCR薄壁管中依次加入10xPyrobestbuffer(w池15mMMgC12)5pldNTPs(10mMeach)上游引物-F(75pm)下游引物-R(75pm)基因組DNA1^1化lPyrobestDNAPolymerase滅菌超純水0,25,.25U)33.75nl在PCR儀上運(yùn)行如下程序95。C預(yù)變性5min;94。C變性lmin，58。C退火lmin，72°C延伸1.5min，32個(gè)循環(huán)，72。C延伸5min，4。C保存。PCR產(chǎn)物的克隆、鑒定和序列測(cè)定用捷瑞生物的Gendean瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增片段，與pGEMTeasyvector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)酶切鑒定，大連寶生物工程有限公司測(cè)序。得到陽性重組質(zhì)粒pT-flaA。⑤pCAGGS-flaADNA疫苗的構(gòu)建真核表達(dá)載體pCAGGS和質(zhì)粒pT-flaA分別用￡C0RI和ZZwI酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳后，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別回收酶切后的pCAGGS和_/7^4片段，最后用15nL的滅菌超純水洗脫。T4DNA連接酶連接這兩個(gè)片段，4'C連接過夜，轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物到DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布到Amp抗性(IOOug/ml)的LB瓊脂板上，37。C培養(yǎng)16h-20h。挑取菌落接種LB肉湯(Amp+)，振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，再用五coRl和屈al酶切鑒定，得到構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCAGGS-flaA(圖1)。實(shí)施例2.pCAGGS-flaADNA疫苗外源_/7"基因體外瞬時(shí)表達(dá)鑒定建立COS-7細(xì)胞體外瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，將實(shí)施例1中構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-flaA用QIAfilterplasmidmidikit小量制備，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)在24孔板的COS-7細(xì)胞中，以形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物；48h后，通過間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)y^4基因的表達(dá)。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞用PBS洗滌3次，自然晾干后，力fl-2(TC預(yù)冷的無水甲醇置固定5min，棄去固定液，PBS洗漆3次。加入800pL1:400稀釋的雞抗空腸彎曲菌多抗血清，37'C培養(yǎng)箱中孵育60min，PBS洗滌3次，加入80(^L1:160稀釋的FITC標(biāo)記的兔抗雞熒光二抗，37t)培養(yǎng)箱中孵育40min，用PBS洗滌3次，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pCAGGS-flaA轉(zhuǎn)染COS-7后48h，能在COS-7細(xì)胞中檢測(cè)到基因的表達(dá)，蛋白水平的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(空質(zhì)粒)。實(shí)施例3.殼聚糖-質(zhì)粒納米顆粒的制備殼聚糖(Chitosan，以下簡(jiǎn)稱CS)購自浙江金殼生物化學(xué)有限公司，批號(hào)D070831151，黃色粉末，分子量201Kda,脫乙酰度87%，粘度20mpa.s。稱取殼聚糖200mg加入800^1的乙酸，然后加SW至5mL，37°C180r/min搖蕩過夜使甲殼糖(購自浙江金殼生物化學(xué)有限公司)完全溶解，次日加水至480mL后用NaOH調(diào)節(jié)pH為5.5，最后定容500mL，真空過濾(0.22ym濾膜)除菌得a液。將構(gòu)建好的pCAGGS-flaADNA疫苗溶于無菌的5mmoL/LNa2S04溶液中至300pg/mL得b液。將等量的a液和b液分別加熱至55。C1015min，按1:1混合均勻，搖動(dòng)30S即可得到殼聚糖包被的質(zhì)粒DNA的免疫微囊，用相差顯微鏡觀察有無顆粒形成。將上述制備好的懸浮液室溫下放置lh后，6000r/min離心35min，然后小心去除95%的上清液，再用無菌水稀釋即可得到殼聚糖-質(zhì)粒納米顆粒(以下簡(jiǎn)稱為CS-pCAGGS-flaA)。實(shí)施例4.殼聚糖-質(zhì)粒納米疫苗顆粒的鑒定①1%瓊脂糖電泳鑒定用殼聚糖包裹空腸彎曲菌DNA疫苗質(zhì)粒pCAGGS-flaA后(以下簡(jiǎn)稱CS-pCAGGS-flaA)。為檢測(cè)包裹效果，經(jīng)1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖電泳檢測(cè)(圖2)，在裸質(zhì)粒泳道，質(zhì)粒顯示出明顯的條帶，而由于包裹顆粒較大而存留在加樣孔中，在殼聚糖/質(zhì)粒包裹組泳道上看不出條帶，說明殼聚糖已經(jīng)包裹了質(zhì)粒。②透射電子顯微鏡觀察利用透射電子顯微鏡觀察包裹后顆粒的大小及包裹狀態(tài)(圖3)。在掃描電子顯微鏡放大46,000倍下，觀察到殼聚糖已將質(zhì)粒包裹形成直徑100nm左右的圓球形顆粒。③包裹率將質(zhì)粒進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋侗认♂?，調(diào)整濃度至0.3-0.4mg/ml，然后與殼聚糖等比例混合。經(jīng)微量分光光度計(jì)測(cè)定制備前質(zhì)粒濃度為0.32mg/ml(包裹前總的DNA)，包裹后經(jīng)離心分層后取上清液再次測(cè)定0.026mg/ml(未被包裹的DNA)，經(jīng)計(jì)算包裹率達(dá)91.9%。實(shí)施例5.運(yùn)送空腸彎曲菌yZ"基因殼聚糖納米DNA疫苗的安全性評(píng)估對(duì)于免疫雞的安全性檢測(cè)檢測(cè)不同劑量(50嗎-300ng)CS-pCAGGS-flaA疫苗免疫90只白萊航雞，120天后無一只死亡；進(jìn)行不同劑量CS-pCAGGS-flaA疫苗注射雞后的毒理性和常規(guī)生理指標(biāo)的觀察測(cè)定，利用組織化學(xué)方法確定注射疫苗后雞組織病理變化，將相應(yīng)組織器官進(jìn)行冰凍切片，在顯微鏡下觀察，沒有發(fā)現(xiàn)雞組織有病理變化。實(shí)施例6.運(yùn)送空腸彎曲菌yZfl^4基因殼聚糖納米DNA疫苗體內(nèi)免疫反應(yīng)的檢測(cè)將白萊航雞隨機(jī)分為3組，每組30只；一組為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)實(shí)驗(yàn)雞滴鼻免疫實(shí)施例3中制備的納米DNA疫苗100pg(pCAGGS-flaA的含量)；另二組為對(duì)照組，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)雞滴鼻免疫IOOpg納米pCAGGS空質(zhì)粒和生理鹽水。試驗(yàn)過程如下共進(jìn)行3次免疫，在l日齡時(shí)首免，免疫間隔2周；各組在首免后第28和42天分別采血、取脾臟，分別測(cè)定血清、黏膜抗體、雞脾臟IL-4和IFN-Y及T細(xì)胞亞群。①血清抗體、腸道黏膜抗體sIgA測(cè)定血清抗體測(cè)定各免疫組在首免后第28和42天分別取三只試驗(yàn)雞血，自然凝固后，3500rpm離心20min取上清，-2(TC保存?zhèn)溆茫荒c道黏膜抗體slgA測(cè)定各免疫組在首免后第28和42天分別每組剖殺三只試驗(yàn)雞，制備腸道黏膜樣品采集完整的小腸，去除多余的脂肪，于5mlPBS(含100ng/mlPMSF)中用剪刀將腸道剖開，剪成lcm小段，置于100ml瓶中劇烈搖振5min,4'C8000rpm離心20min取上清，-2(TC保存?zhèn)溆?。以ALM-80分離株作包被原，采用ELISA方法檢測(cè)二免、三免后2周免疫組誘導(dǎo)雞的血清抗體和腸道黏膜抗體(如表l)。從抗體產(chǎn)生情況看，免疫于二免14天均能檢測(cè)到特異性抗體，但抗體滴度較低；三免后14天抗體水平上升明顯，且與對(duì)照組具有顯著性差異(PO.01)表1疫苗對(duì)免疫雞的免疫原性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>':差異顯著。②RT-PCR檢測(cè)雞脾臟細(xì)胞IL-4和IFN-7根據(jù)GenBank中己發(fā)表的雞IL-4和IFN-7基因的mRNA序列分別用PrimerPremier5.0軟件輔助設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，擴(kuò)增雞IL-4和IFN-y基因，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為236bp和281bp。IL-4引物:上游引物5，-TGACATCCAGGGAGAGGTTT-3'下游引物5，-TCCATTGAAGTAGTGTTGCC-3'IFN-y引物上游引物5，-ACGGTGGACCTATTATTGTA-3'下游引物5'-CTGTAAGATGCTGAAGAGTT-3，無菌采集實(shí)驗(yàn)雞的脾臟，力nlmlPBS研磨后轉(zhuǎn)移至1.5ml指形管中，4°C，300rpm離心2min，取上清，重復(fù)一次。細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，取5X106的脾臟細(xì)胞4'C，1500rpm離心10min，沉淀懸于lOOjxlPBS中，然后按RNAprepTissue/BacteriaKit試劑盒說明書上的操作步驟提取脾臟細(xì)胞總RNA，用30jilRNase-freeddH20溶解RNA。分別采用IL-4、IFN-y下游引物為反轉(zhuǎn)錄的引物，以mRNA為模板合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄總反應(yīng)體系25nL，DEPC處理過的PCR管中依次加入下列組分。42'C作用1.5h后94'C處理5min后至冰水中。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為25pL:5XM-MLVbuffer5plM-MLVReverseTranscriptase0.1pi(20U)dNTPs(2.5mMeach)lplRnase抑制劑(HPR1)0.1|_ilIL-4下游(10pM)lulIFN-y下游OO)aM)l)nlRNA15plRnase-freeddH201都1PCR的反應(yīng)體系為25pL:10XPCRbuffer2.5pildNTPs(10mMeach)0.2pl上游引物(2.5Mm)lfil下游引物(2.5mM)cDNA0.1piTaqDNApolymerase0.15|_il(0.75U)swn.5niPCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)94'C預(yù)變性10min，94'C變性lmin，58。C退火25s，72'C延伸20s，32個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min，4'C保存。配制2.0。/。瓊脂糖溶液，按0.3mg/L加溴化乙錠(EB)制膠，取8jilPCR產(chǎn)物點(diǎn)樣，以DNAMarker作對(duì)照，60V電泳1.5h取出凝膠，在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。二免、三免后2周，每組宰殺3只雞，取雞脾臟，經(jīng)研磨后收集脾臟細(xì)胞、提取總RNA,RT-PCR測(cè)定IL-4、IFN-7的表達(dá)。二免、三免后14天脾臟細(xì)胞IL-4的量強(qiáng)于對(duì)照組，且IL-4的量強(qiáng)于IFN-Y。表明疫苗免疫后能激發(fā)雞機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。③雞脾臟和盲腸扁桃體004+"08+分析采取脾臟和盲腸扁桃體，研磨，300目過濾除去組織碎片，用PBS反復(fù)洗滌細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，定量為lX106/ml。取200|iil細(xì)胞懸液，分別加入PE-CD8a和FITC-CD4抗體，4°C避光作用20min，1，500rpm離心5min,洗滌三次后，定容為200|il，上機(jī)FACSAria(分析軟件為FACSDiva)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定二免、三免后2周各組雞脾臟和盲腸扁桃體CD4+/CD8+細(xì)胞的數(shù)量變化。從檢測(cè)情況看，二免和三免后14天脾臟細(xì)胞的004+"08+1細(xì)胞比值與對(duì)照組相比顯著增加，CD4+細(xì)胞較CD8+顯著增加；而盲腸扁桃體只在三免后14天CD4+ZCD8+細(xì)胞比值與對(duì)照組相比顯著增加。結(jié)果表明，CS-pCAGGS-flaA三免后導(dǎo)致脾臟和盲腸扁桃體CD4+/CD8+細(xì)胞數(shù)量比值的升高，CD4+細(xì)胞的數(shù)量高于CD8+細(xì)胞(表2)。表2免疫雞脾臟和盲腸扁桃體CD4+ZCD8+測(cè)定結(jié)果Table2RatioofCD4+/CD8+Tcellsassayinspleenandcecaltonsilofimmunizedchickens<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例7.運(yùn)送空腸彎曲菌_/7"基因殼聚糖納米DNA疫苗在雞群中實(shí)際預(yù)防的實(shí)驗(yàn)1日齡白萊航雞90只，雌雄兼有的雛雞隨機(jī)分為3組，每組30只。攻毒用菌株ALM-80為雞地方分離株。三免后二周，以口服途徑攻毒，口服前需禁食、禁水3h,每只灌服10(Hi14%碳酸氫鈉，0.5h后再用攻毒，灌服之后禁食、禁水3h，劑量為5X10々只。第1組接種納米DNA疫苗100嗎(pCAGGS-flaA的含量)，8周后ALM-80口服攻毒；第2組接種納米pCAGGS空質(zhì)粒100ng(pCAGGS的含量)，8周后ALM-80口服攻毒；第3組接種生理鹽水，8周后ALM-80口服攻毒。①泄殖腔排毒口服攻毒后，分別于7、14、21d采集泄殖腔棉拭子樣品，測(cè)定泄殖腔排毒狀況如表3，疫苗組在測(cè)定的時(shí)間內(nèi)排毒率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，21d的排毒率為0，而對(duì)照組的排毒率保持相對(duì)穩(wěn)定的水平(表3)。表3白萊航雞攻毒后泄殖腔陽性率Table3TheaveragepositiverateofswabspecimensofWhiteLeghornchickenschallengedwithALM-80組另<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>)②實(shí)驗(yàn)雞小腸、大腸、盲腸和血液中的空腸彎曲菌數(shù)量攻毒后3、6、9、12、15、18、21d應(yīng)用平板計(jì)數(shù)法分別測(cè)定小腸、大腸、盲腸和血液中的空腸彎曲菌的數(shù)量。由表4、5、6和表7可見，口服攻毒后空腸彎曲菌在疫苗組小腸、大腸、盲腸和血液中的細(xì)菌量大致呈拋物線狀，大約在9d-15d間達(dá)到高峰，然后呈下降趨勢(shì)；而對(duì)照組在各臟器的分布呈上升趨勢(shì)。免疫組小腸、大腸、盲腸和血液中細(xì)菌的細(xì)菌數(shù)量均低于對(duì)照組，18d后能有效清除小腸內(nèi)空腸彎曲菌，免疫組大腸、盲腸和血液的細(xì)菌數(shù)量較對(duì)照組分別降低2Ig-3lg、21g禾H21g-31g數(shù)量。研究表明，運(yùn)送空腸彎曲菌y"基因的殼聚糖納米DNA疫苗能有效減少血液和小腸、大腸、盲腸中空腸彎曲菌的數(shù)量。表4攻毒后雞小腸中空腸彎曲菌數(shù)量的變化Table4TheCFUcountsofC.勿','inchickensmallintestineafteroralinfection<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表5攻毒后雞大腸中空腸彎曲菌數(shù)量的變化Table5TheCFUcountsofC.勿','inchickenlargeintestineafteroralinfection<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表6攻毒后雞盲腸中空腸彎曲菌數(shù)量的變化Table6TheCFUcountsofC勿'畫.inchickencecumafteroralinfection<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表7攻毒后雞血液中空腸彎曲菌數(shù)量的變化Table7TheCFUcountsofC.勿'卿'inbloodafteroralinfection<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>SEQUENCELISTING<110>揚(yáng)州大學(xué)<120>—種空腸彎曲菌殼聚糖納米DNA疫苗及其制備方法和應(yīng)用<160>1<210>1<211>1719<212>DNA<213>雞(Chicken)<400>1ctsctgt3gtC3ttttgttggcctgtgccstggcst3aga60gccgctttgattgctttsgsgtagtttgc3ctctcggctg120atcacggstttgcgattctgctgctttaacgtttacttgagttacggtgatgttgtttat1803gttg3tgtsacttgattttgt3ccg33cc33tgtcggctctgatttgatC33gstttgt240tatsgctgtttcagctatatccatcacagccatagcgcctttaagtgtggt33C3cctgc300tgtttcatcttttactcc3333gcsgttgttttcst3gtt360sccscttgsa333cctg3gcctgcagsaacattatatsccgcgaiagcagc420tgaaatagct3tsgcgtttgC3333CCtgttt3ccgctscctacagaata■3CCtg33CCtg33g3333tccscttcctgcgctactcatatsggcactaa5403CC3CCt33C3C33CtCCtttgtttgcaga3CC333tCCCatagcstcsgcgst3tt3gc600stcaatttgtccttttgactctcttaa3g33ttgsgttgc660gattgctsccgctgattaaa3t3tCttt3CC3tcattttt7203sgcggcc3tagttttctttC3t3tcsgcsC3CCtCC3CC780t3t3tt3CC3tcgsttttaatccctctaccttctcttg33gttgtcc3tt840agcatcgatcctccagtggtatctttascc900ggctccattagcatcsccstctttgt33tct3ctttsccg3tttttaccccsttgstsgc960gsagtsgctcctgctctsactgcagct3t3cctctagtttCt3Ctgt3331020agtagctctsacscctgttttstcsgcatttttattgatctcstctgct33sgctcc3sg1080tcctgttcc33ctg3sgttgtttttgaaacCt3t3CC3tt1140gtaattttta3g3gta3attgtacttcgccactagttga3attcttcctcCtgtttC3331200gcgtgtt333cctatcttsg33g3ttg3gttgctcctatagtagcttttacagtttgatt1260tgaacttgcsccg3tttg333ttcttgsttgttgtttdcc1320gtsgtatttgcaatattgtcssgttcttcc3ttsascggttgatatctgc1380gttcttgttttt333ctttgtccatcttgagccgcttgsgttgccttsgt1440tttgsttgt3tctaagatttt3agttgctc3tcc3t3gccttstcsgcsgtttgt33g3t1500tcattaccstgt3ttagcttgsgatctt3a1560sct3tctgctstcgcc3tccctg33gc3tcstctgctgcgg3gttgsttctasgacctga1620sct3sgtctgttt3Ct3tttaaatcagcgtttgcttttgc1680atttaaagctgcs3C3ttggtgtta3tscg1719權(quán)利要求1、一種空腸彎曲菌殼聚糖納米DNA疫苗，是殼聚糖和重組質(zhì)粒構(gòu)成的納米微囊，其特征在于，所說的重組質(zhì)粒是由空腸彎曲菌鞭毛蛋白基因flaA和真核表達(dá)載體pCAGGS組成的pCAGGS-flaA，所述的鞭毛蛋白flaA基因具有SEQNO.1所示的核苷酸序列。2、一種權(quán)利要求1所述的空腸彎曲菌殼聚糖納米DNA疫苗的制備方法，包括如下步驟:1)設(shè)計(jì)特異性引物根據(jù)GenBank登陸序列g(shù)i:30407139設(shè)計(jì)一對(duì)引物上游引物FlaA-F5'-CATCTAGAAGCATTTAACAAGTTCATGG-3'I下游引物FlaA-R5'-TAGAATTCGTGTTTATCCTAAAACCCAT-3'￡coRI2)通過PCR技術(shù)擴(kuò)增空腸彎曲菌鞭毛蛋白y/^4基因，克隆、回收得到純化的/o4基因片段；3)將基因重組到質(zhì)粒pCAGGS真核表達(dá)質(zhì)粒中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pCAGGS-flaA;4)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pCAGGS-flaA溶于殼聚糖溶液中，制成空腸彎曲菌殼聚糖納米DNA疫苗。3、一種權(quán)利要求1所述的空腸彎曲菌殼聚糖納米DNA疫苗在制備用于預(yù)防雞空腸彎曲菌藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種空腸彎曲菌殼聚糖納米DNA疫苗，及其制備和應(yīng)用。所說的空腸彎曲菌殼聚糖納米DNA疫苗，是殼聚糖和重組質(zhì)粒構(gòu)成的納米微囊，所說的重組質(zhì)粒是由空腸彎曲菌鞭毛蛋白基因flaA和真核表達(dá)載體pCAGGS組成的pCAGGS-flaA，所述的鞭毛蛋白flaA基因具有SEQNO.1所示的核苷酸序列。其是將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒DNA溶于殼聚糖溶液中制得。該疫苗還能用于制備預(yù)防雞空腸彎曲菌的藥物。本發(fā)明疫苗經(jīng)試驗(yàn)表明，可激發(fā)產(chǎn)生特異性體液和局部的黏膜免疫應(yīng)答，口服攻毒后，泄殖腔排菌率呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，并能減少血液和小腸、大腸、盲腸中空腸彎曲菌數(shù)量。文檔編號(hào)C12N15/11GK101332304SQ200810020998公開日2008年12月31日申請(qǐng)日期2008年8月5日優(yōu)先權(quán)日2008年8月5日發(fā)明者林孫,尹衍新,弓張,李求春,殷月蘭,潘志明,焦新安,祥陳,黃金林申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)