專利名稱：：一種表達(dá)人cdc25b3質(zhì)粒及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物化學(xué)中基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種表達(dá)人CDC25B3質(zhì)粒及其構(gòu)建方法。二
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有技術(shù)CDC25家族是一組在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮巨大作用的蘇/酪氨酸雙功能酶，CDC25B(cdldivisioncycle25homologB)是CDC25雙功能磷酸酶家族重要成員之一。CDC25B基因位于人類染色體20p13,由M期誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和疏氰酸生成酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。不同的剪切方式可產(chǎn)生不同的剪切體，迄今為止一共發(fā)現(xiàn)5種CDC25B的mRNA，但只發(fā)現(xiàn)3種CDC25B蛋白(CDC25B1、CDC25B2、CDC25B3)，三種剪切體有約95.5%的序列是一致的。CDC25B對細(xì)胞周期的正常運(yùn)行起著重要的生物學(xué)作用，整個細(xì)胞周期都能監(jiān)測到CDC25B的mRNA的轉(zhuǎn)錄。它不僅對細(xì)胞周期的S期起推進(jìn)作用，還對G2/M期過渡起"4M幾，，作用，對G2/M期起檢驗點作用。胎鼠肝臟中過量表達(dá)CDC25B，敲除CDC25B的雌性小鼠喪失了生育能力，提示CDC25B可能與胚胎發(fā)育和卵細(xì)胞的發(fā)育相關(guān)。目前已有相當(dāng)?shù)难芯勘砻鳎诙喾N人類惡性腫瘤中，如前列腺癌、食管磷狀細(xì)胞癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、頭頸部腫瘤、胃癌、肺非小細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、非霍奇金淋巴瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、曱狀腺癌等都均存在不同比例CDC25B的過度表達(dá)。其中在乳腺癌、卵巢癌(30%)及結(jié)直腸癌(43%)的研究中發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)的CDC25B與腫瘤的惡性度，轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后相關(guān)。在非霍奇金瘤的研究中，CDC25B2的報道在56y。的樣本中過度表達(dá)，雖然未發(fā)現(xiàn)與腫瘤的侵襲性及患者預(yù)后相關(guān)，但與患者死亡率相關(guān)。在曱狀腺惡性淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn)CDC25B過量表達(dá)率為63.80/。，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于慢性甲狀腺炎，提示在CDC25B甲狀腺惡性淋巴瘤轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重大作用。食道磷狀細(xì)胞癌的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)高CDC25B的患者對放療高度敏感，高表達(dá)CDC25B是否與不良預(yù)后相關(guān)目前還沒有定論。在食道癌細(xì)胞林的研究中發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)CDC25B可以增強(qiáng)射線所誘導(dǎo)刁亡的效應(yīng)。文獻(xiàn)報道在胃癌中高達(dá)49%的標(biāo)本中有CDC25B過度表達(dá)且與腫瘤分期、浸潤的深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。在早期子宮內(nèi)膜癌中過量的CDC25B(90%)與ER-a(65%)是相關(guān)的，而在晚期子宮內(nèi)膜癌中CDC25B表達(dá)僅為42%，而ER-a則降為17。/。?？梢娫谧訉m內(nèi)膜癌發(fā)生的早期CDC25B與ER-a可能有協(xié)同刺激轉(zhuǎn)化的作用。在前列腺癌中CDC25B過度表達(dá)率高達(dá)97。/。，過度表達(dá)的CDC25B可增強(qiáng)雄激素的轉(zhuǎn)錄激活作用，有助于前列腺癌向非雄激素依賴性生長轉(zhuǎn)化。在肺非小細(xì)胞癌、頭頸部腫瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤的CDC25B的表達(dá)率為40%、50%、85%。這些都表明CDC25B過度表達(dá)對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)鍵性作用，可能是潛在的診斷標(biāo)記和治療靶點，CDC25B與胰腺癌的關(guān)系目前研究還比較少，GuoJ等研究發(fā)現(xiàn)CDC25B在胰腺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶及正常胰腺的表達(dá)分別為48.6±16.3%、71.7±3.1%、8.3±1.8%,顯然CDC25B在胰腺癌組織中是過度表達(dá)的，而且轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)明顯高于原發(fā)灶。CDC25B特異性抑制劑作用于高表達(dá)CDC25B的人胰腺癌細(xì)胞林發(fā)現(xiàn)，抑制劑可以明顯抑制該細(xì)胞眛的生長并發(fā)生G2/M期阻滯。我們的研究中，通過寡核苷酸基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，CDC25B基因在24例胰腺癌組織中，有20例(83.3%)表達(dá)上調(diào)，與正常組織相比，其在胰腺癌中表達(dá)明顯增高；通過Westemblot發(fā)現(xiàn)，所有正常胰腺組織只有很弱、甚至沒有CDC25B的蛋白表達(dá)，而胰腺癌組織中則有較強(qiáng)的CDC25B蛋白表達(dá)。經(jīng)過計算機(jī)掃描后定量分析，正常胰腺組織。00258蛋白表達(dá)為1.22±0.33,胰腺癌組織為5.56士1.57，上調(diào)4.56倍。細(xì)胞實驗中，我們通過對四種胰腺癌細(xì)胞抹中CDC25B的三種剪切異構(gòu)體的研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄水平，Panc-1中CDC25B1與CDC25B2的表達(dá)強(qiáng)度無明顯差異；CFPAC-1和SW-1990的CDC25B2的表達(dá)高于CDC25B1;而Bxpc-3的CDC25B1的表達(dá)強(qiáng)度高于CDC25B2，CDC25B3在四種胰腺癌細(xì)胞林中表達(dá)均不顯著。Westernblot結(jié)果提示CDC25B蛋白在Panc-l和CFPAC-l過度表達(dá)，SW-1990的表達(dá)強(qiáng)度中等，Bxpc-3弱表達(dá)或不表達(dá)CDC25B蛋白。上述結(jié)果表明CDC25B1和CDC25B2在四種胰腺癌細(xì)胞抹中過表達(dá)，而CDC25B3與胰腺癌關(guān)系尚不明了。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明提供一種表達(dá)人CDC25B3質(zhì)粒及其構(gòu)建方法，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染低表達(dá)CDC25B蛋白的腫瘤細(xì)胞可以使CDC25B蛋白高表達(dá)，可以用于探討CDC25B3基因的潛在致癌機(jī)制，在醫(yī)學(xué)上具有重要的應(yīng)用價值；同時本發(fā)明也提供了該質(zhì)粒的構(gòu)建方法。我們希望通過構(gòu)建CDC25B3的重組質(zhì)粒，隨后進(jìn)行體外實驗，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染低表達(dá)CDC25B蛋白的胰腺癌細(xì)胞抹，觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)生的變化，探討CDC25B3在胰腺癌發(fā)病過程中潛在機(jī)制。另外，因為CDC25B在多種人類腫瘤中存在過度表達(dá)，我們可以利用上述方法，將此類質(zhì)粒用于其他人類肺瘤的研究上，以深入研究和闡明CDC25B基因在人類腫瘤發(fā)生發(fā)展中所充當(dāng)?shù)慕巧Ｒ虼?，本發(fā)明的應(yīng)用不局限于胰腺癌，可廣泛應(yīng)用于CDC25B在人類腫瘤的研究探討上.技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)解決方案為一種表達(dá)人CDC25B3的質(zhì)粒，該質(zhì)粒是含有CDC25B3的栽體pcDNA3.1(+)，其中CDC25B3具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列，可由pcDNA3.1(+)中的PCMV啟動子表達(dá)。一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述質(zhì)粒的方法，構(gòu)建步驟為以CDC25B1的cDNA全長克隆IRATp970A0662D為模板，PCR定向擴(kuò)增剪切異構(gòu)體CDC25B3的a片段和b片段；設(shè)計兩對引物引物1:5-AGGGGCCCTCTAGACTCGAGATGGAGGTGCCCCAGCCG-3引物2:5-TTGGTACCGAGCTCGGATCCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTGGTCCTGCAGCCGGCTAC陽3引物3:5-CATGGCATCTTGAAGACAAATCCATCCGGCATAGACTGGAAGCGTC-3引物4:5-GACGCTTCCAGTCTATGCCGGATGGATTTGTCTTCAAGATGCCATC-3以IRATp970A0662D為模板，用PCR方法，用引物1和3克隆CDC25B3的a片段，引物2和4克隆CDC25B3的b片段；獲得CDC25B3基因的CDS區(qū)全長用PCR擴(kuò)增的方法，用引物1和引物2對片段a和b進(jìn)行拼結(jié)，得到CDC25B3基因的CDS區(qū)全長；獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.l-CDC25B3:首先對質(zhì)粒pcDNA3.1(+)進(jìn)行改造，用BamHI和XhoI酶切質(zhì)粒pcDNA3.1(+)，得到文造的線性化質(zhì)粒片段，再將PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的CDC25B3基因用T4連接酶與改造后的線性化質(zhì)粒片段連接，獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CDC25B3。有益效果基因的制備途徑有如下幾種方式①制備基因組DNA文庫，通過雜交篩選獲得特定的基因片段；②制備cDNA文庫，通過雜交篩選獲得特定的基因片段；③直接用限制酶從基因組DNA或其他重組質(zhì)粒上切取目的基因片段；用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增有關(guān)DNA片段；⑤用化學(xué)方法合成目的基因片段。本發(fā)明中，我們直接從RZPD公司購買了CDC25Bl的cDNA全長克隆并用PCR的方法大量獲得目的片段，而且可在上下游引物的5'端引入不同的酶切位點而實現(xiàn)定向克隆獲得其靈兩個剪切異構(gòu)體。我們認(rèn)為這是一種快速、高效、大量獲得目的片段的方法，并且可有效的避免由于逆轉(zhuǎn)錄而造成的堿基錯配。同時，本發(fā)明所用的pcDNA3.1(+)質(zhì)粒是一種哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體，屬于氨節(jié)青霉素抗性選擇系統(tǒng)，帶有氨卡青霉素抗性基因Ampr,在PCMV啟動子驅(qū)動下可在真核細(xì)胞中表達(dá)，其編碼產(chǎn)物能使新霉素類似物G418失活，故用G418篩選可獲得導(dǎo)入有表達(dá)栽體的陽性細(xì)胞克?。辉趐cDNA3.1(+)質(zhì)粒的多克隆位點上游有一個PCMV啟動子，插入到多克隆位點的外源性基因在該啟動子的驅(qū)動下可以得到有效表達(dá)；另外把基因的羧基端融合有標(biāo)記肽FLAG,非常方便用于免疫反應(yīng)的檢測以及作為誘斜蛋白檢測酵母雙雜交結(jié)果。因此，利用該載體方便用于篩選和鑒定。四圖1為pcDNA3.1(+)質(zhì)粒圖譜圖2為PCR鑒定pcDNA3.1-CDC25B3陽性克隆，Marker的條帶依次是2kb、lkb、750bp、500bp、250bp、100bp。圖3為CDC25B3外源表達(dá)Westernblot圖，1、4轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒量為0.5pg,2、3轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒量為3嗎，5與6為對照組。Westernblot檢測結(jié)果顯示，CDC25B3在瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CDC25B3載體的293T細(xì)胞中的過量表達(dá)，提示本重組質(zhì)粒的構(gòu)建是成功的，可用于進(jìn)一步實驗研究。圖4為重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CDC25B3的測序結(jié)果。圖5正常SW-1990圖6轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1圖7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.卜CDC25B3圖8芯片電泳模擬圖顯示CDC25B3mRNA的表達(dá)差異圖9轉(zhuǎn)染前后CDC25B蛋白在SW-1990中的表達(dá)差異五具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實^r方法，通常按照常規(guī)條件如JoeSambrook、DavidRussell等人，《MolecularCloning:ALaboratoryManual》3rded(ColdSpringHarborLaboratoryPress2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例l:1.重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CDC25B3的構(gòu)建1.1以本實驗室保存的從RZPD公司購買的CDC25B1的cDNA(IRATp970A0662D)為模板；1.2以IRATp970A0662D為模板，利用引物l和3從擴(kuò)增CDC25B3的a片段，2和4擴(kuò)增CDC25B3的b片段。A.反應(yīng)體系a片段試劑Primer(-)P30牟Primer(+)Pl0牟ddH2013単10xbuffer2DNTPs(2.5mM)0単pftipolymerase0.2pl模板(10ng/ul)1Total20nlb片段試劑Primer(-)P40.4^1Primer(+)P20.4nlddH2013単10xbuffer2piDNTPs(2.5mM)0.8nlpfUpolymerase0.2jil模板(10ng/ul)1piTotal20plB.反應(yīng)條件PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，按以下循環(huán)條件94°C30sec94°C30sec60°C30secf30cycle72°C30sec72。C6min1.3分離純化a片段和b片段將上述混合的反應(yīng)物置于37°C，lh后，電泳鑒定反應(yīng)產(chǎn)物，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收，獲得純化的a片段和b片段，在紫外分光光度儀測定其濃度和純度，-20'C保存?zhèn)溆谩?.4a片段與b片段的拼接為得到CDC25B3的全長，需采用PCR擴(kuò)增的方法對片段a與b進(jìn)行拼接，模板為上一輪回收的PCR產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為5(VL:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>酶切PCR片段和載體使用BamHI和XhoI進(jìn)行酶切消化上一輪的PCR產(chǎn)物和載體，酶切產(chǎn)物用DNA純化試劑盒純化，在紫外分光光度儀測定其濃度和純度后，-2(TC保存。①酶切反應(yīng)A.反應(yīng)體系在0.5mlEppendorf管中加入下列試劑酶切載體純化的DNA質(zhì)粒(1ug/nl)2pi10xbuffer5nllOOxBSA0.5piBamHI(10U1)1WXhol(10U/nl)1piH2040.5piTotal50pi酶切PCR產(chǎn)物:純化的DNA質(zhì)粒(1ug/pl)2nllOxbuffer5pllOOxBSA0.5piBamHI(10,)1^Xhol(10U/'ul)1piH2040.5piTotal50^B,反應(yīng)條件37"C作用lh后，電泳確證酶切產(chǎn)物。酶切產(chǎn)物用DNA純化試劑盒純化，在紫外分光光度儀測定其濃度和純度后，-20。C保存。1.6連接反應(yīng)A.反應(yīng)體系在0.5mlEppendorf管中加入下列試劑酶切回收的載體DNAlOOng/pl1pi酶切回收的PCR產(chǎn)物lOOng/pl110xT4嘆菌體DNA連接酶緩沖液1^T4噬菌體DNA連接酶1piddH206piTotal10(ilB.反應(yīng)條件4'C作用12h，獲得重組pcDNA3.1-CDC25B3表達(dá)質(zhì)粒。實施例2:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌2.1感受態(tài)細(xì)菌制備(略)2.2陽性克隆的篩選與鑒定'(1)陽性克隆的篩選(略)(2)陽性克隆的PCR鑒定重組陽性克隆行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠中電泳，有535bp左右長度插入片段釋放出者視為陽性重組體。(3)陽性克隆核酸測序鑒定從上述方法鑒定的克隆中任選2個克隆，接種于培養(yǎng)基上制備新鮮菌液，測序鑒定插入片段的正確性。實施例3:細(xì)胞培養(yǎng)和重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染3.1293T細(xì)胞的培養(yǎng)和鋪種3.2細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染3.3有限稀釋法篩選高效表達(dá)CDC25B3的陽性細(xì)胞克隆實施例4:CDC25B3蛋白表達(dá)的檢測Westernblot檢測CDC25B3蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)實施例5:為說明CDC25B3在腫瘤研究方面的應(yīng)用，以胰腺癌為例進(jìn)行如下實驗1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染1.1G418濃度梯度試驗G418篩選陽性克隆前要做濃度梯度試驗確定最佳篩選濃度。1)胰酶消化細(xì)胞成細(xì)胞懸液，稀釋至1,000cell/mL。2)24孔板中取20個孔，每孔加入100nL的細(xì)胞懸液及無雙抗的培養(yǎng)基900nL。3)將每孔中的G418濃度稀釋至0、200、300、400、500、600、700、800、900、1，00(Vg/mL等10個級別。4)每35天換液，培養(yǎng)10天，記錄細(xì)胞全部死亡的最低濃度。以細(xì)胞全部死亡的最低濃度加一個級別為篩選濃度。1.2轉(zhuǎn)染細(xì)胞1)取處于對數(shù)生長期的SW-1990細(xì)胞，棄去細(xì)胞液，加2mlPBS洗一次。2)加1ml月夷酶消4匕12min。3)棄去胰酶，加3-4mlDMEM(不含血清)吹打均勻。4)將細(xì)胞滴加于6孔培養(yǎng)板中(每孔2ml),使培養(yǎng)24h后，細(xì)胞融合度控制在70~80%。5)對于6孔板的每個孔，培養(yǎng)液體積調(diào)整為1ml,用2pgCDC25B3DNA質(zhì)粒與240piOpti-MEMI混合。6)將LipofectAMINE2000試劑輕柔搖勻，取5LipofectAMINE2000試劑在另一管中與i245plOpti-MEMI混合，在室溫下溫育5min。7)把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine2000進(jìn)行混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。必須在5min之內(nèi)混合。8)混合后，在室溫下溫育20min，以便形成質(zhì)粒DNA與LipofectAMINE2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。9)把質(zhì)粒DNA與LipofectAMINE2000的混合液加入培養(yǎng)細(xì)胞，輕柔前后推搖培養(yǎng)板以混勻液體。然后將培養(yǎng)板送入細(xì)胞培養(yǎng)箱。10)在轉(zhuǎn)染滿8h后需更換新鮮的含血清的培養(yǎng)液。11)轉(zhuǎn)染后36h后，然后1:2-3比例傳代，同時加G418篩選，濃度為500jig/mL12)二周后待單克隆細(xì)胞島形成后，胰酶消化細(xì)胞重新鋪板并改G418維持濃度為100pg/ml穩(wěn)定培養(yǎng)傳代。1.3以RT-PCR和Westernblot檢測CDC25B3在SW-1990中的表達(dá)100pg/mlG418維持培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞SW-1990二周，傳代5次后行RT-PCR和Westernblot檢測(方法同前)。實施例6:G418濃度梯度試驗結(jié)果以400jig/mL的G418濃度培養(yǎng)，SW-1990細(xì)胞在10天時間細(xì)胞全部死亡。500ng/mL應(yīng)為SW-19卯細(xì)胞合適的篩選濃度。實施例7:RT-PCR產(chǎn)物芯片電泳鑒定結(jié)果CDC25B3的mRNA的表達(dá)豐度為33.21±5.67，而正常細(xì)胞和轉(zhuǎn)空質(zhì)粒組CDC25B3的mRNA表達(dá)豐度只有1.957±0.112和1.645±0.242。轉(zhuǎn)染組CDC25B3mRNA的表達(dá)約為轉(zhuǎn)空質(zhì)粒組的20倍(P<0.05)，如圖5所示。說明本質(zhì)?？沙晒υ谝认侔┘?xì)胞中轉(zhuǎn)錄，為進(jìn)行下一步細(xì)胞生物學(xué)實驗奠定了基礎(chǔ)，可用來探討CDC25B3在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。實施例8:100ng/mlG418維持培養(yǎng)二周后，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和正常細(xì)胞相比，Westernblot檢測轉(zhuǎn)染組中CDC25B3蛋白表達(dá)升高，并明顯高于轉(zhuǎn)空質(zhì)粒組和正常細(xì)胞組(圖6)。說明本質(zhì)?？沙晒υ谝认侔┘?xì)胞中表達(dá)，為進(jìn)行下一步細(xì)胞生物學(xué)實驗奠定了基礎(chǔ)，可用來探討CDC25B3在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。序列表<110>東南大學(xué)<120>—種表達(dá)人CDC25B3質(zhì)粒及其構(gòu)建方法<160>5<210〉1<211>3578<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221>CDS<222>(1)".(3578)<400>11GCAGCCAGTCGCGGAGGCGGGGAGGCTGCGCGGTCAGAGGCGCCTGGAGCGAGCGAATCC61TGGCCCACCGCCTGCCCAACCGCGTGACCTTGATTGAGTTAATGAACTTCACGCCTCAGC121GTCCAGGTCTGTAAAATGGGGTGTCTAACGCAGACCGTACAGCCCAGCTGGGTTTAGCAA181ACTTCCGGGAGCCAGTTGGAGCCTCTCCCCATCCCTAGCGGTGATCCCAGGTGACGACAT241GCCGCGGGGGGTCCTGCGGAGGCCACCCTAGGGCGTTGCTGCTGCCTTTGGGAGTGTGGA301GCTCCAAACCATGTCGCGAGAGGCGGATTTTGGGAGGCCGGGATCCTCGCGCCAGGGGGA361TGTGCGAGGGTGTGGGATAAATCTTAATTCCTCCGGCCCACCCAAAGCCTGGAAATCCAG421CCTCCGCGCCTCTTGCCCTGCGGGCCCCGCCCTCAGTCCCGCCCTCATCTAACCCGCTAC481CCCATTGGTGGCGTCCGGCGGCGCGGCTGCTGTTATTTTTCGAATATATAAGGAGGTGGA541AGTGGCAGCTGCAACTAGAGGCTTCCCTGGCTGGTGCCTGAGCCCGGCGTCCCTCGCCCC601CCGCCCTCCCCGCATCCCTCTCCTCCCTCGCGCCTGGCCCTGTGGCTCTTCCTCCCTCCC661TCCTTCCCCCCCCCCCCACCCCTCGCCCGCTGCCTCCCTCGGCCCAGCCAGCTGTGCCGG721CGTTTGTTGGCTGCCCTGCGCCCGGCCCTCCAGCCAGCCTTCTGCCGGCCCCGCCGCGAT781GGAGGTGCCCCAGCCGGAGCCCGCGCCAGGCTCGGCTCTCAGTCCAGCAGGCGTGTGCGG841TGGCGCCCAGCGTCCGGGCCACCTCCCGGGCCTCCTGCTGGGATCTCATGGCCTCCTGGG901GTCCCCGGTGCGGGCGGCCGCTTCCTCGCCGGTCACCACCCTCACCCAGACCATGCACGA961CCTCGCCGGGCTCGGCAGCGAAACCCCAAAGAGTCAGGTAGGGACCCTGCTCTTCCGCAG1021CCGCAGCCGCCTGACGCACCTATCCCTGTCTCGACGGGCATCCGAATCCTCCCTGTCGTC1081TGAATCCTCCGAATCTTCTGATGCAGGTCTCTGCATGGATTCCCCCAGCCCTATGGACCC1141CCACATGGCGGAGCAGACGTTTGAACAGGCCATCCAGGCAGCCAGCCGGATCATTCGAAA1201CGAGCAGTTTGCCATCAGACGCTTCCAGTCTATGCCGGATGGATTTGTCTTCAAGATGCC1261ATGGAAGCCCACACATCCCAGCTCCACCCATGCTCTGGCAGAGTGGGCCAGCCGCAGGGA1321AGCCTTTGCCCAGAGACCCAGCTCGGCCCCCGACCTGATGTGTCTCAGTCCTGACCGGAA1381GATGGAAGTGGAGGAGCTCAGCCCCCTGGCCCTAGGTCGCTTCTCTCTGACCCCTGCAGA1441GGGGGATACTGAGGAAGATGATGGATTTGTGGACATCCTAGAGAGTGACTTAAAGGATGA1501TGATGCAGTTCCCCCAGGCATGGAGAGTCTCATTAGTGCCCCACTGGTCAAGACCTTGGA1561AAAGGAAGAGGAAAAGGACCTCGTCATGTACAGCAAGTGCCAGCGGCTCTTCCGCTCTCC1621GTCCATGCCCTGCAGCGTGATCCGGCCCATCCTCAAGAGGCTGGAGCGGCCCCAGGACAG1681GGACACGCCCGTGCAGAATAAGCGGAGGCGGAGCGTGACCCCTCCTGAGGAGCAGCAGGA1741GGCTGAGGAACCTAAAGCCCGCGTCCTCCGCTCAAAATCACTGTGTCACGATGAGATCGA1801GAACCTCCTGGACAGTGACCACCGAGAGCTGATTGGAGATTACTCTAAGGCCTTCCTCCT1861ACAGACAGTAGACGGAAAGCACCAAGACCTCAAGTACATCTCACCAGAAACGATGGTGGC1921CCTATTGACGGGCAAGTTCAGCAACATCGTGGATAAGTTTGTGATTGTAGACTGCAGATA1981CCCCTATGAATATGAAGGCGGGCACATCAAGACTGCGGTGAACTTGCCCCTGGAACGCGA2041CGCCGAGAGCTTCCTACTGAAGAGCCCCATCGCGCCCTGTAGCCTGGACAAGAGAGTCAT2101CCTCATTTTCCACTGTGAATTCTCATCTGAGCGTGGGCCCCGCATGTGCCGTTTCATCAG2161GGAACGAGACCGTGCTGTCAACGACTACCCCAGCCTCTACTACCCTGAGATGTATATCCT22212281234124012461252125812641270127612821288129413001306131213181324133013361342134813541GAAAGGCGGCCCGGCCCATGCAGCTGGGCTGGCCTGCGCCGGCCTGCCGGGGGTGTCCTGTCCTGGTGCCACCAGCTTAAACCCTTCATCGAGAGCCGTGTCTCTGCCCTTGTCTGCCATAGCCTGAACATGACTTTACGAGTTACCCACTCCCAGGGCAGTGAACCCTGGTTGGATGGAAACCAGGTGGTTTGTGTGGAGAAGCAGCTAGCTGTGCTTGCAAGTTGAGATACAAGGAGTAACCACGAGGGGGGAGCGGAAGTCCTGCTAGCTGAGGGCCCCTGTCTGCCCCCCACCCCTAGGCAGTATTTTCCTGTGTCGTCCCTGAGGGTGTACTTCCGTTGCCCCTTGAAGCTCTTACCCATCTCAGTCGGTCCCAGAGGGTTAAGGGGGCCTGACTTGGGTGGATGGAGCGTTTTGCAAAAATATTAACCAAGGACAAGGCCCTGCAAAAAAAAAATCTTCCCTCACCTTCAAGGAGCCGGCGGGACCTCCCTTGCTGCTGGAGGCCCAGCCCAGAGGAAGAGCCCTTGTGTCCTCCTGAAACGCTATGGGTCAGACGGGCCAGGGTCTCTTTTCCCTCTTTCCTAGACACTTCCGTTTTGTTGCCCCTGAATCATGCTCAGAACTGCCGTGGATGTTGAGCATGATACACTTAGG1iN_^丄TGAGTCATCTAAAAAAAAAAGCACCCGAACTGAGCTAAAGGCTCTGTAGCCTTTCGAGGCCTCAGGTGCTTTCCCCTGTGAGTCTGTTGACAGGAGCTTCCCTTTGTGTGGCTAAACTCCCTGCCCCTAACCTTTCCTGTTTTCAGTGTTTAGACTGTTTCCAGAAAGGGGAGCCTGCTGTGCTGCTGTCGCCGTGGMGCAGCCTGCAGGTTTGGAGCT\JJ>%_1%_JJ1丄丄V_上\JGTTAGGGCCTAAAAAAAATTCTGTGAACACCTTCCGCCCGGCTGCAGGCTGAAGCCAGGTCCATGGGATCATCCCATCGTTAGTTAAGTTGTTTCCTTTGTGTCAGCTTTCCTGGCCTTCTCTGTAGGCCCACCATACACCTG丁GTGCAGGTTCCCCTATGTTATTATGAAGCCCAGCTTGTTGCGGACGCAGTGCCTCAGGAATATAATTCAAGAGGTGGTTCAATACCCAGGACTATCAAGACTCGACCAGTGAGGCTGCCCTATGAAGATGGTGTATTTTCCATATTGGGTTAATGTTAGGGTTAGAGGCTGGGGGAGAGTCAGCAACCGTGGTAGAGCACCTCCTTGGTCTGTTGTCAAATATCCCTTGGGGGCCCCTACTGCTTGGATGGAAGTGCATACCCATGTGTGCCTAAAATGTCACA廣廣廣廣r17\「。丄vj^n^n。vjAAGCACTGAG<210>2<211>38<212〉DNA<213>合成引物<400>2AGGGGCCCTCTAGACTCGAGATGGAGGTGCCCCAGCCG<210>3<211>67<212>DNA<213〉合成引物<400>31TTGGTACCGAGCTCGGATCCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTGGTCCTGCAGC61CGGCTAC<210〉4<211>46<212>DNA<213>合成引物<400>41CATGGCATCTTGAAGACAAATCCATCCGGCATAGACTGGAAGCGTC<210>5<211>46<212>DNA<213>合成引物<400>51GACGCTTCCAGTCTATGCCGGATGGATTTGTCTTCAAGATGCCATC權(quán)利要求1.一種表達(dá)人CDC25B3的質(zhì)粒，其特征在于該質(zhì)粒是含有CDC25B3的載體pcDNA3.1(+)，其中CDC25B3具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列，可由pcDNA3.1(+)中的PCMV啟動子表達(dá)。2.—種構(gòu)建權(quán)利要求1所述質(zhì)粒的方法，其特征在于構(gòu)建步驟為a.以CDC25B1的cDNA全長克隆IRATp970A0662D為模板，PCR定向擴(kuò)增剪切異構(gòu)體CDC25B3的a片段和b片段；b.設(shè)計兩對引物引物1:5-AGGGGCCCTCTAGACTCGAGATGGAGGTGCCCCAGCCG-3引物2:5-TTGGTACCGAGCTCGGATCCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTGGTCCTGCAGCCGGCTAC-3引物3:5-CATGGCATCTTGAAGACAAATCCATCCGGCATAGACTGGAAGCGTC-3引物4:5-GACGCTTCCAGTCTATGCCGGATGGATTTGTCTTCAAGATGCCATC-3以IRATp970A0662D為模板，用PCR方法，用引物1和3克隆CDC25B3的a片段，引物2和4克隆CDC25B3的b片#殳；c.獲得CDC25B3基因的CDS區(qū)全長用PCR擴(kuò)增的方法，用引物1和引物2對片段a和b進(jìn)行拼結(jié)，得到CDC25B3基因的CDS區(qū)全長；d.獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CDC25B3:首先對質(zhì)粒pcDNA3.1(+)進(jìn)行改造，用BamHI和XhoI酶切質(zhì)粒pcDNA3.1(+),得到改造的線性化質(zhì)粒片段，再將PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的CDC25B3基因用T4連接酶與改造后的線性化質(zhì)粒片段連接，獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CDC25B3。全文摘要一種表達(dá)人CDC25B3的質(zhì)粒，該質(zhì)粒是含有CDC25B3的載體pcDNA3.1(+)，其中CDC25B3具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列，可由pcDNA3.1(+)中的PCMV啟動子表達(dá)。一種構(gòu)建表達(dá)人CDC25B3的質(zhì)粒的方法。本發(fā)明提供一種表達(dá)人CDC25B3質(zhì)粒及其構(gòu)建方法，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染低表達(dá)CDC25B蛋白的腫瘤細(xì)胞可以使CDC25B蛋白高表達(dá)，可以用于探討CDC25B3基因的潛在致癌機(jī)制，在醫(yī)學(xué)上具有重要的應(yīng)用價值；同時本發(fā)明也提供了該質(zhì)粒的構(gòu)建方法。文檔編號C12N15/85GK101358199SQ20081002071公開日2009年2月4日申請日期2008年2月22日優(yōu)先權(quán)日2008年2月22日公開號200810020713.9發(fā)明者衛(wèi)文俊,波孔,齊張,楊正平,欣石,志肖申請人:東南大學(xué)被以下專利引用(1),