專利名稱：乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測(cè)神經(jīng)束性質(zhì)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)周圍神經(jīng)束性質(zhì)的傳感器，具體地說是一種乙酰膽堿酯 酶壓電生物傳感器在檢測(cè)周圍神經(jīng)束性質(zhì)中的應(yīng)用。
技術(shù)背景在現(xiàn)有的技術(shù)中，對(duì)神經(jīng)束性質(zhì)進(jìn)行判斷的方式主要有以下幾種1、 解剖方式對(duì)神經(jīng)干內(nèi)的神經(jīng)束的定位圖譜進(jìn)行研究，很多學(xué)者已將周 圍神經(jīng)(如正中神經(jīng)、橈神經(jīng)、尺橈神經(jīng)干、坐骨神經(jīng)干等)分別進(jìn)行了分析， 觀察了神經(jīng)干的位置、形態(tài)、束數(shù)，測(cè)量其大小，繪制了神經(jīng)斷面的神經(jīng)束局部 定位圖，但在臨床中，往往因神經(jīng)損傷后兩斷端易發(fā)生扭曲，改變了原有的正常 解剖位置，故臨床應(yīng)用收到限制。2、 電刺激法通過電刺激神經(jīng)束所產(chǎn)生的反應(yīng)來鑒別，若電刺激出現(xiàn)肌肉 收縮則為運(yùn)動(dòng)束，而感覺束則無反應(yīng)。但此法需保持病人清醒，且限于新鮮損傷， 個(gè)體差異大，而且刺激引起肌肉收縮是神經(jīng)傳導(dǎo)結(jié)果還是電流擴(kuò)散所致，不能區(qū) 分。故臨床應(yīng)用價(jià)值不大。3、 放射生物化學(xué)法用放射性同位素標(biāo)記酶的底物，再根據(jù)酶反應(yīng)所產(chǎn)生 的放射性產(chǎn)物來測(cè)定酶的含量，推測(cè)神經(jīng)束的性質(zhì)，但此法涉及同位素技術(shù)，設(shè) 備要求高，且放射物質(zhì)對(duì)患者及術(shù)者都有損害，故實(shí)用性不大。4、 酶組織化學(xué)法根據(jù)運(yùn)動(dòng)束與感覺束中某些生物含量物質(zhì)的含量差別， 作為鑒別運(yùn)動(dòng)束與感覺束的標(biāo)準(zhǔn)，如運(yùn)動(dòng)束神經(jīng)纖維中乙酰膽堿酯酶含量遠(yuǎn)高于 感覺束，因此以乙酰膽堿酯酶含量為鑒別運(yùn)動(dòng)束與感覺束的方法得到廣泛認(rèn)可。 目前檢測(cè)乙酰膽堿酯酶主要為酶組織化學(xué)染色法，根據(jù)反應(yīng)形成亞鐵氰化銅(一 種棕色沉淀)出現(xiàn)于酶含量部位，運(yùn)動(dòng)纖維呈強(qiáng)陽性，感覺纖維大部位呈陰性， 少部分呈弱陽性的原理，對(duì)神經(jīng)束性質(zhì)進(jìn)行判定。但此法存在問題是(1)染色 時(shí)間長(zhǎng)(約50分鐘)，過程復(fù)雜；(2)需切取兩斷端神經(jīng)片段，不能進(jìn)行原位染 色。故臨床應(yīng)用也收到一定的限制。5、 免疫組化法利用特異性抗原抗體反應(yīng)，觀察研究組織細(xì)胞特定抗原(或 抗體)的定位和定量技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了感覺神經(jīng)元的特異蛋白，并以該蛋白作為抗原 制備了單克隆抗體，通過免疫染色來鑒別感覺纖維，其特點(diǎn)是特異性高，對(duì)人體無毒，染色時(shí)間較以往方法縮短，需25至30分鐘。但這種方法現(xiàn)階段仍需要切取組織片段，且存在染色特異性與時(shí)間問題，時(shí)間過短染色不深，過長(zhǎng)則其它組織亦染上色，臨床醫(yī)生難以控制，且操作比較復(fù)雜，實(shí)用性不夠。目前，生物傳感器在生物醫(yī)學(xué)中得到了廣泛應(yīng)用，主要表現(xiàn)在以下方面1、 免疫生物傳感器壓電免疫傳感器在生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用十分的廣泛，檢測(cè)范圍不斷拓寬，可以用 來檢測(cè)環(huán)境中的硫磷農(nóng)藥、有機(jī)磷神經(jīng)毒氣、可卡因，白色念珠菌、大腸桿菌、 沙門氏菌、皰疹病毒、甲肝乙肝病毒、霍亂弧菌等病原微生物的檢測(cè)，人的補(bǔ)體、 酶等蛋白質(zhì)分析，甲狀腺素、人絨毛膜性腺激素、皮質(zhì)醇等激素檢測(cè)，血液中紅 細(xì)胞、T細(xì)胞及粒細(xì)胞含量測(cè)定，此外還可用于免疫反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)分析，可對(duì)免 疫反應(yīng)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。2、 DNA生物傳感器最初被用于測(cè)定RNA/DNA分子雜交反應(yīng)，現(xiàn)在可以用于對(duì)DNA與蛋白質(zhì)的分 子交聯(lián)，DNase、 RNase、 DNA連接酶的水解、聚合、連接功能的實(shí)時(shí)、原位監(jiān)控 檢測(cè)及分子雜交過程的動(dòng)力學(xué)分析，食品的衛(wèi)生檢測(cè)等。3、 仿生傳感可以用來模擬人或生物的嗅、味覺感官細(xì)胞，早期主要是采用與之功能相近 的類脂或既親水又親脂的高分子物質(zhì)來修飾壓電晶體表面，從而對(duì)香味或氣味物 質(zhì)、苦味或甜味食品實(shí)現(xiàn)物品種類、濃度及作用機(jī)理的判定；最近被用于實(shí)現(xiàn)多 組分同時(shí)測(cè)定，采用分子印記技術(shù)提高傳驊器選擇性和使用壽命，采用人工神經(jīng) 網(wǎng)絡(luò)等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法用于仿生傳感可對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行智能化處理。此外，將酶、細(xì)胞固定于晶體表面可制成酶、細(xì)胞傳感器，除了使用單一酶 外，采用多種酶構(gòu)成復(fù)合酶?jìng)鞲衅饕嘤袌?bào)道。到目前為止，未見有關(guān)于檢測(cè)乙酰 膽堿酯酶含量的壓電生物傳感器的報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容為了克服以往對(duì)神經(jīng)束性質(zhì)進(jìn)行判斷方法的不足，本發(fā)明的目的是提供一種 乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測(cè)神經(jīng)束性質(zhì)中的應(yīng)用及其使用方法。該生物 傳感器從周圍神經(jīng)運(yùn)動(dòng)束與感覺束中的乙酰膽堿酯酶(AchE)含量的差別入手， 可快速檢測(cè)AchE的壓電生物傳感系統(tǒng)、快速鑒別出周圍神經(jīng)運(yùn)動(dòng)束與感覺束， 實(shí)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)束對(duì)運(yùn)動(dòng)束、感覺束對(duì)感覺束正確縫合。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測(cè)神經(jīng)束性質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于它通過在石英晶體上固定的乙酰膽堿酯酶抗體與待測(cè)神經(jīng)樣本中所含的乙酰膽堿酯酶起反應(yīng)，反應(yīng)過程中發(fā)生石英晶體振蕩頻率的改變，繼而通過計(jì)算機(jī)監(jiān) 測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)并反映出乙酰膽堿酯酶的含量高低，含量高的待測(cè)神經(jīng)束為運(yùn)動(dòng)束， 含量低的待測(cè)神經(jīng)束則為感覺束。本發(fā)明中，使用乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測(cè)神經(jīng)束性質(zhì)時(shí)，包括以 下步驟1) 石英晶體芯片上結(jié)合戊二醛；2) 在石英晶體芯片上標(biāo)記乙酰膽堿酯酶抗體；3) 剪取l 2mm神經(jīng)片斷，放入200ul改良細(xì)胞裂解液中振蕩數(shù)次；4) 將振蕩后的改良細(xì)胞裂解液加入進(jìn)樣孔，在監(jiān)測(cè)器上觀察到乙酰膽堿酯酶的含量高低變化，含量髙的神經(jīng)束為運(yùn)動(dòng)束，反之則為感覺束。在等待180秒之后在監(jiān)測(cè)器上觀察乙酰膽堿酯酶的含量變化。本發(fā)明所述的乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器，由壓電晶體、振蕩電路、差頻電路、頻率計(jì)數(shù)器及計(jì)算機(jī)等部分組成。使用乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測(cè)神經(jīng)束性質(zhì)中的流程見圖1。本發(fā)明所述改良細(xì)胞裂解液為0.5%Triton X-100細(xì)胞裂解緩沖液，配方如下Triton X-100 0.5%調(diào)節(jié)pH至7.4， -7(TC保存 PMSF (100,1/L) Na3V04 (200mmol/L) Cocktail Calyculin ATris E腦 Sucrose5mmol/Lv 2mmol/L 0.3mol/L臨用前加 5 y 1/ml 5 u 1/ml10u 1/ml 1. 0 w g/ml
本發(fā)明通過膽堿酯酶抗體與結(jié)合在石英晶體芯片表面的戊二醛交聯(lián)，在晶體 表面包被膽堿酯酶抗體，待測(cè)神經(jīng)樣品中若有與之相對(duì)應(yīng)的乙酰膽堿酯酶抗原， 則與待測(cè)神經(jīng)樣品中乙酰膽堿酯酶的特異性結(jié)合，增加了晶體的質(zhì)量并改變振蕩 頻率。頻率的變化與待檢測(cè)神經(jīng)內(nèi)所含得乙酰膽堿酯酶抗原的濃度呈正比，這種 變化可以通過電信號(hào)從監(jiān)測(cè)器中直觀的反應(yīng)出來，既準(zhǔn)確又方便。①Sauerbrey導(dǎo)出壓電石英晶體頻率變化A F與晶體表面均勻吸附外加質(zhì) 量厶M的關(guān)系為厶F=-F2 A M/ (ANp)
式中，AF是石英晶體的頻率、F2是諧振頻率、AM是晶體表面的沉積質(zhì)量、A是參與晶振的面積、N是頻率常數(shù)、p是晶體密度。 ②由經(jīng)驗(yàn)公式AF^:dd"2 + C2 11172—c3e —c4k +c。式中d代表液體的密度、il代表粘度、e代表介電常數(shù)、ic代表電導(dǎo)率，Cl、 c2、 c:,、 c4 、 c。分別是由晶體和電路決定的常數(shù)?？傻檬⒕w在液相中有穩(wěn) 定的振蕩頻率。由此可以看出當(dāng)外來物質(zhì)沉積于石英晶體表面時(shí)，其質(zhì)量的變化于諧振頻率 的變化成正比。本發(fā)明采用戊二醛交聯(lián)法首先在晶體金屬表面建立一層惰性疏水物質(zhì)，主 要是聚乙烯亞胺和3-氨丙基-三乙氧基硅烷，然后再用戊二醛作為交聯(lián)試劑乙酰 膽堿酯酶抗體結(jié)合。戊二醛是一種常用的雙功能基試劑，很容易使蛋白質(zhì)交聯(lián)， 這種交聯(lián)是通過蛋白質(zhì)中賴氨酸殘基進(jìn)行的。本發(fā)明采用目前使用較為廣泛的固定方法。固定化之前，首先在基質(zhì)表面上 建立一層聚乙烯亞胺(PEI)或r-氨丙基三乙氧基硅垸(3-APTES)惰性疏水性 水性物質(zhì)，然后用交聯(lián)試劑聯(lián)接乙酰膽堿酯酶抗體。戊二醛是一個(gè)常用的雙功能 團(tuán)交聯(lián)試劑，極易與蛋白中賴氨酸殘基交聯(lián)。具體方法如下① PEI固定法室溫下用含4M(V/V)的PEI甲醇5ml涂在晶體的電極上， 干燥后用甲醇沖洗晶體，然后浸入濃度為0. 4mol/L戊二醛(P^7)溶液中30min, 然后用低濃度抗原溶液涂在晶體兩側(cè)，未發(fā)生反應(yīng)的水合醛類用0. 5mol/L的甘 氨酸(在20mmol/LPBS中，pH7)封閉，隨后用PBS和蒸餾水沖洗，空氣中干澡。② 硅垸(APTES)固化法把晶體浸入35咖ol/L的APTES的丙酮溶液中l(wèi)h， 在7(TC條件下真空干燥，用丙酮洗幾次，在0.6raol/L的戊二醛(pl^7)中孵育1 h，然后用蒸餾水洗，再用5ul的5mg/ml抗原液涂在晶體的兩側(cè)，干燥 3(T45min，晶體用PBS和蒸餾水沖洗之后，在空氣中干燥。本發(fā)明將壓電生物傳感器技術(shù)應(yīng)用到周圍神經(jīng)運(yùn)動(dòng)束與感覺束的鑒別，利用 生物傳感器靈敏、快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，制成了可以檢測(cè)乙酰膽堿酯酶 含量的壓電生物傳感器。該傳感器可以檢測(cè)每根神經(jīng)束上乙酰膽堿酯酶的含量， 原理是在石英晶體上固定的膽堿酯酶抗體與神經(jīng)樣本中所含的乙酰膽堿酯酶起 反應(yīng)，反應(yīng)過程中有石英晶體振蕩頻率的改變，繼而通過計(jì)算機(jī)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)并 反映出乙酰膽堿酯酶的含量髙低，含量高的神經(jīng)束為運(yùn)動(dòng)束，反之則為感覺束。 整個(gè)反應(yīng)過程在3分鐘之內(nèi)，較以往方法大大縮短了時(shí)間，使用方便，滿足了臨 床要求并減少了誤差及干擾。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取得了較好的效果。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)是-① 該檢測(cè)裝置簡(jiǎn)單而且靈敏度高達(dá)10—12mol/L，因此樣本不需特別處理，而 且只需切取極少組織就能檢測(cè)出很明顯地差異；② 檢測(cè)效率很高， 一個(gè)樣本只需3分鐘；③ 由于檢測(cè)樣本中的物質(zhì)是通過抗原和抗體的形式結(jié)合的，因此特異性很高；④ 此裝置可以實(shí)時(shí)定量的檢測(cè)樣本中需檢測(cè)的物質(zhì)，可以形象直觀的在計(jì) 算機(jī)上顯示出來；⑤ 檢測(cè)物質(zhì)不需要事先做任何物理、化學(xué)修飾；⑥ 芯片可以反復(fù)多次應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)。因此改裝置可以做到快速、準(zhǔn)確、直觀地 鑒定神經(jīng)斷端兩側(cè)神經(jīng)束地性質(zhì)，方法簡(jiǎn)單快捷，無需化學(xué)試劑，對(duì)人體無害， 實(shí)現(xiàn)機(jī)械化、集成化和智能化。這種鑒別周圍神經(jīng)束性質(zhì)的壓電生物傳感器，將為周圍神經(jīng)損傷后地顯微外 科修復(fù)提供一種快捷有效的方法，大大提高周圍神經(jīng)損傷修復(fù)后的功能恢復(fù)率。 有利于在以后的臨床應(yīng)用中得到廣泛推廣。


圖1是使用乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測(cè)神經(jīng)束性質(zhì)中的流程圖； 圖2是采用本發(fā)明得到的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果曲線圖。
具體實(shí)施方式
一種本發(fā)明所述的乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測(cè)神經(jīng)束性質(zhì)中的應(yīng) 用，它通過在石英晶體上固定的膽堿酯酶抗體與待測(cè)神經(jīng)樣本中所含的乙酰膽堿 酯酶起反應(yīng)，反應(yīng)過程中發(fā)生石英晶體振蕩頻率的改變，繼而通過計(jì)算機(jī)監(jiān)測(cè)系 統(tǒng)檢測(cè)并反映出乙酰膽堿酯酶的含量高低，含量高的待測(cè)神經(jīng)束為運(yùn)動(dòng)束，含量 低的待測(cè)神經(jīng)束則為感覺束。乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器由壓電晶體、振蕩電 路、差頻電路、頻率計(jì)數(shù)器及計(jì)算機(jī)等部分組成。使用乙酰膽堿酯酶壓電生物傳 感器在檢測(cè)神經(jīng)束性質(zhì)中的流程見附圖1。首先在石英晶體芯片上結(jié)合戊二醛；然后在石英晶體芯片上標(biāo)記膽堿酯酶抗 體；剪取1 2皿神經(jīng)片斷，放入200ul改良細(xì)胞裂解液中振蕩數(shù)次；將振蕩后 的改良細(xì)胞裂解液加入進(jìn)樣 L，在等待180秒之后，在監(jiān)測(cè)器上觀察到乙酰膽堿 酯酶的含量高低變化，含量高的神經(jīng)束為運(yùn)動(dòng)束，反之則為感覺束。本發(fā)明將壓電生物傳感器技術(shù)應(yīng)用到周圍神經(jīng)運(yùn)動(dòng)束與感覺束的鑒別，利用 生物傳感器靈敏、快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，制成了可以檢測(cè)乙酰膽堿酯酶含量的壓電生物傳感器。該傳感器可以檢測(cè)每根神經(jīng)束上乙酰膽堿酯酶的含量， 整個(gè)反應(yīng)過程在3分鐘之內(nèi)，較以往方法大大縮短了時(shí)間，使用方便，滿足了臨 床要求并減少了誤差及干擾。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取得了較好的效果。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)材料膽堿酯酶單克隆抗體(南京醫(yī)科大學(xué)抗體中心提供，犬坐骨神經(jīng)、頸 叢神經(jīng)、面神經(jīng)，細(xì)胞裂解液，磷酸鹽緩沖液，1M Glycine, 10%谷胱甘肽溶液。 設(shè)備ADS plus Affinity Sensor壓電生物傳感器(臺(tái)灣ANT公司出品，亞新科 技股份有限公司提供)。實(shí)驗(yàn)步驟1、 10%谷胱甘肽溶液孵育芯片10min。2、 抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋后(1: 1000)孵育芯片10min。3、 1 M Glycine孵育芯片lmin。4、 分別取犬坐骨神經(jīng)、臂神經(jīng)從、面神經(jīng)斷端lmm，放入細(xì)胞裂解液中， 震蕩5-10s，放入ADS plus Affinity Sensor壓電生物傳感器中，讀取數(shù)據(jù)。 結(jié)果如圖2。(1) 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)1(2) 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)2(3) 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)3(4) 感覺運(yùn)動(dòng)混合神經(jīng)1(5) 感覺運(yùn)動(dòng)混合神經(jīng)2(6) 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)4(7) 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)4(8) 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)5(9) 感覺神經(jīng)1(10) 感覺神經(jīng)1(11) 感覺神經(jīng)l(12) 感覺神經(jīng)1備注GA:谷胱甘肽感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)編號(hào)代表不同的標(biāo)本來源。 結(jié)論；感覺、運(yùn)動(dòng)和混合神經(jīng)，其膽堿酯酶的含量不同，通過本方法在傳感 器的顯示屏上呈現(xiàn)不同的曲線。差異明顯，并且重復(fù)性好。本法具有良好的可行
權(quán)利要求
1、一種乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測(cè)神經(jīng)束性質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于它通過在石英晶體上固定的膽堿酯酶抗體與待測(cè)神經(jīng)樣本中所含的乙酰膽堿酯酶起反應(yīng)，反應(yīng)過程中發(fā)生石英晶體振蕩頻率的改變，繼而通過計(jì)算機(jī)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)并反映出乙酰膽堿酯酶的含量高低，含量高的待測(cè)神經(jīng)束為運(yùn)動(dòng)束，含量低的待測(cè)神經(jīng)束則為感覺束。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測(cè)神經(jīng)束性質(zhì) 中的應(yīng)用，其特征在于它包括以下步驟1) 在石英晶體芯片上結(jié)合戊二醛；2) 在石英晶體芯片上標(biāo)記乙餓膽堿酯酶抗體；3) 剪取神經(jīng)片斷，放入改良細(xì)胞裂解液中振蕩數(shù)次；4) 將振蕩后的改良細(xì)胞裂解液加入進(jìn)樣孔，在監(jiān)測(cè)器上觀察到乙酰膽堿酯酶的含量高低變化，含量高的神經(jīng)束為運(yùn)動(dòng)束，反之則為感覺束。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測(cè)神經(jīng)束性質(zhì) 中的應(yīng)用，其特征在于所述改良細(xì)胞裂解液為0.5%Triton X-100細(xì)胞裂解緩沖液，配方如下Triton X-100 0. 5%Tris EDTA Sucrose調(diào)節(jié)pH至7.4， -70。C保存 PMSF (100隱ol/L) Na3V04 (200mmol/L) Cocktail Calyculin A5咖ol/L 2mraol/L 0.3mol/L 臨用前加 5 P 1/ml 5 U 1/ml(10u 1/ml 1.0y g/ml
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乙酰膽堿酯酶壓電生物傳感器在檢測(cè)神經(jīng)束性質(zhì)中的應(yīng)用，它通過在石英晶體上固定的膽堿酯酶抗體與待測(cè)神經(jīng)樣本中所含的乙酰膽堿酯酶起反應(yīng)，反應(yīng)過程中發(fā)生石英晶體振蕩頻率的改變，繼而通過計(jì)算機(jī)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)并反映出乙酰膽堿酯酶的含量高低，含量高的待測(cè)神經(jīng)束為運(yùn)動(dòng)束，含量低的待測(cè)神經(jīng)束則為感覺束。本發(fā)明從周圍神經(jīng)運(yùn)動(dòng)束與感覺束中的乙酰膽堿酯酶含量的差別入手，可快速檢測(cè)乙酰膽堿酯酶的壓電生物傳感系統(tǒng)、快速鑒別出周圍神經(jīng)運(yùn)動(dòng)束與感覺束，實(shí)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)束對(duì)運(yùn)動(dòng)束、感覺束對(duì)感覺束正確縫合。在以后的臨床應(yīng)用中可得到廣泛推廣。
文檔編號(hào)C12Q1/44GK101231286SQ20081002068
公開日2008年7月30日 申請(qǐng)日期2008年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月21日
發(fā)明者波 劉, 史苑鄉(xiāng), 寧 張, 戈應(yīng)濱, 曹曉建, 金正帥 申請(qǐng)人:江蘇省人民醫(yī)院