專利名稱：空殼納米金修飾的乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種空殼納米金修飾的乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法，屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
農(nóng)藥是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，在農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中對病、蟲、草、鼠危害的防治起到非常重要的作用。但是，農(nóng)藥污染及其產(chǎn)生的危害后果是嚴(yán)重的，農(nóng)藥對環(huán)境污染造成的損失是多方面的，包括對水環(huán)境的污染，對土壤的污染，對大氣的污染，對環(huán)境生物的影響以及對人體健康的危害等。目前由于使用者普遍缺乏科學(xué)使用農(nóng)藥知識，片面追求產(chǎn)量，造成目前市場上流通的農(nóng)業(yè)產(chǎn)品都不同程度地存在農(nóng)藥殘留問題，其危害也日益引起公眾的關(guān)注。我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，隨著我國人民生活水平不斷提高，農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全問題越來越受到關(guān)注，尤其蔬菜中農(nóng)藥殘留問題已經(jīng)成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。我國生產(chǎn)和使用的殺蟲劑絕大多數(shù)品種為有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥(約占70%)，其中高毒性的有機(jī)磷和氨基甲酸酷類殺蟲劑為70%左右，因此容易引起食物農(nóng)藥殘留中毒。可見，加強(qiáng)對農(nóng)廣品中農(nóng)藥殘留的檢測對保護(hù)生態(tài)環(huán)境，尤其是保障人類健康有著十分深遠(yuǎn)的意義，而農(nóng)藥殘留檢測的重點(diǎn)應(yīng)該放在有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥。目前農(nóng)藥殘留分析的主要方法是氣相色譜儀、液相色譜儀、氣質(zhì)聯(lián)用儀、液質(zhì)聯(lián)用儀等，這些方法雖然分析精度高，定量準(zhǔn)確，但其樣品的前處理復(fù)雜、檢測耗時(shí)長、成本高、 需要技術(shù)熟練的操作人員。我國農(nóng)藥殘留的速測方法是酶抑制試紙法和酶抑制分光光度法 (農(nóng)殘快速檢測儀)，可以實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的現(xiàn)場快速檢測，具有較好的實(shí)用價(jià)值。速測卡是通過肉眼觀察卡片的顏色變化，因此一般只能用于嚴(yán)重超標(biāo)的蔬菜樣品進(jìn)行定性測量。酶抑制分光光度法的應(yīng)用也比較廣泛，國內(nèi)已有多種農(nóng)藥殘留速測儀均是基于此原理。分光光法的原理是基于吸光度的變化進(jìn)行檢測的，但蔬菜水果中大量的色素會(huì)對分光光度法造成很大的影響，導(dǎo)致檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。并且上述方法存在回收率低、錯(cuò)檢、漏檢比例較高、重復(fù)性差、難以滿足低殘留和定量檢測的要求等缺點(diǎn)。發(fā)明的目的在于提供一種能克服上述缺陷以及操作簡單、價(jià)格低廉、靈敏度高的檢測農(nóng)藥殘留的電流型乙酰膽堿酯酶傳感器的制備方法。其技術(shù)方案為一種空殼納米金修飾的乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法，其特征在于乙酰膽堿酯酶傳感器的組裝過程為滴涂殼聚糖溶液，形成一層殼聚糖膜，然后浸泡在空殼納米金溶液中12 h，再浸入L-半胱氨酸溶液中3 h，最后滴涂乙酰膽堿酯酶。所述的一種空殼納米金修飾的乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法，其特征在于玻碳電極(d=3mm)的清洗，乙酰膽堿酯酶傳感器敏感界面的構(gòu)建及過程表征，乙酰膽堿酯酶傳感器工作曲線的建立，乙酰膽堿酯酶傳感器性能的檢測，乙酰膽堿酯酶傳感器對實(shí)際樣品的檢測。所述的一種空殼納米金修飾的乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法，其特征在于所制備的電流型乙酰膽堿酯酶傳感器的工作曲線為毒死蜱濃度O. 1-30 yg/
3L時(shí)，其線性范圍為y=1.0329x+17. 429，毒死蜱濃度30-150 μ g/L時(shí)，其線性范圍為 y=0. 2411X+40. 021 ;克百威濃度O. 1-30 μ g/L時(shí)，其線性范圍為y=l. 113χ+14· 047，毒死蜱濃度30-200 μ g/L時(shí)，其線性范圍為y=0. 2307Χ+41. 218。檢測限為毒死蜱為O. 06 μ g/ L，克百威為O. 08 μ g/L。乙酰膽堿酯酶傳感器性能檢測包括準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性，可再生性以及乙酰膽堿酯酶傳感器對蔬菜樣品回收率的測定。其制備原理為由于有機(jī)磷農(nóng)藥與乙酰膽堿酯酶具有較高的特異性結(jié)合，因此常用乙酰膽堿酯酶作為檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的分子識別元件。乙酰膽堿酯酶生物傳感器是將乙酰膽堿酯酶固定在電極表面，酶催化底物乙酰膽堿水解生成膽堿和乙酸。農(nóng)藥在結(jié)構(gòu)上與底物乙酰膽堿有些類似，它可以和乙酰膽堿的活性中心有效結(jié)合，抑制乙酰膽堿酯酶的活性。 膽堿是一種電活性物質(zhì)，能在一定電位下發(fā)生氧化反應(yīng)，通過伏安掃描過程中硫代膽堿氧化峰的大小可以測定農(nóng)藥殘留的濃度，通過比較有無農(nóng)藥時(shí)酶促反應(yīng)電流信號的變化得到農(nóng)藥對酶的抑制率，該抑制率與農(nóng)藥的濃度成對應(yīng)關(guān)系，便可測得有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的含量。本發(fā)明采用殼聚糖，空殼納米金，L-半胱氨酸對玻碳電極進(jìn)行修飾，殼聚糖有著類似網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的籠形分子，對金屬離子有極好的配合能力，它帶有大量正電荷的氨基，通過靜電作用，將納米空殼金吸附到殼聚糖薄膜上?？諝ぜ{米金內(nèi)外殼之間存在著電勢差，因此可以作為微小的導(dǎo)電中心，在電化學(xué)反應(yīng)中促進(jìn)電子的傳遞，此外，由于金納米空球擁有良好的生物兼容性，因此可以作為蛋白質(zhì)的固定載體。L-半胱氨酸是20種天然氨基酸中唯一具有巰基的化合物，因而它能穩(wěn)定的固定在金納米空殼上，并且L-半胱氨酸中的大量羧基與酶中大量氨基結(jié)合，將酶固定在電極上。將經(jīng)過上述步驟修飾過的玻碳電極，制成的酶傳感器，具有檢測限低，范圍廣，精度高、適用于現(xiàn)場檢測等優(yōu)點(diǎn)。采用本發(fā)明制成的電流型乙酰膽堿酯酶生物傳感器可以在蔬果采收、上市前，進(jìn)行農(nóng)藥殘留的快速測定，直接對農(nóng)藥殘留是否超標(biāo)量進(jìn)行檢測，避免因食含有殘留農(nóng)藥的蔬果而引起中毒，為農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)與消費(fèi)提供殘留檢測的技術(shù)支撐。為達(dá)到以上目的，采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種空殼納米金的乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法，其特征在于(I)乙酰膽堿酯酶傳感器制備前玻碳電極的清洗，活化和性能測試，如果測試循環(huán)伏安曲線中的峰電位差在80 mV以下，并盡可能接近64 mV，所述玻碳電極可使用，否則要重新返回清洗步驟中，直到符合要求。(2)清洗干凈的玻碳電極上滴涂殼聚糖溶液，室溫下自然晾干后，形成一層殼聚糖薄膜，然后將電極浸入不斷攪拌著的空殼納米金乙醇溶液中12 h，期間一直充氮?dú)?，取出后用超純水徹底沖洗干凈，以除去較弱吸附的空殼納米金。然后將電極浸入L-半胱氨酸中3 h，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗干凈，滴涂乙酰膽堿酯酶，2 h后沖洗干凈，電流型乙酰膽堿酯酶傳感器制備結(jié)束，放入冰箱里4°C保存?zhèn)溆?。為達(dá)到以上目的，采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種空殼納米金的乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法，其特征在于(I)配置一系列的毒死蜱和克百威標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，得到抑制率，進(jìn)一步得到上述制備的電流型乙酰膽堿酯酶生物傳感器的工作曲線、檢測范圍和檢測限；(2)將農(nóng)藥抑制后的電極浸入解磷定10 min，測得其乙酰膽堿酯酶生物傳感器的再生性能；(3)對乙酰膽堿酯酶生物傳感器的精確度和穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)；(4)對實(shí)際果蔬樣品進(jìn)行分析得出該傳感器的回收率和重現(xiàn)性。
本發(fā)明首先制備空殼納米金,納米空殼金顆粒能促進(jìn)電化學(xué)反應(yīng)中電子的傳遞， 提高電極上的響應(yīng)電流，因而可以作為載體材料，用來制備較大響應(yīng)信號和較高靈敏度的電化學(xué)生物傳感器；納米空殼金顆粒由于其良好的生物兼容性，可以提高生物活性物質(zhì)在電極上的固定量。殼聚糖無毒，并且價(jià)格低廉，具有類似網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的籠形分子，對金屬離子有極好的配合能力，它帶有大量正電荷的氨基，通過靜電作用，將納米空殼金吸附到殼聚糖膜上。L-半胱氨酸是20種天然氨基酸中唯一具有巰基的化合物，因而它能穩(wěn)定的固定在空殼納米金上，并且L-半胱氨酸中的大量羧基與酶中大量氨基結(jié)合，能夠?qū)⒚阜€(wěn)定的固定在電極上。所述空殼納米金乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備工藝如下(I)將5 UL 0.5 wt%殼聚糖溶液滴涂在預(yù)處理好的玻碳電極上，室溫下干燥后，形成一層殼聚糖膜。(2)然后將電極浸入不斷攪拌著的空殼納米金溶液中12 h，期間一直充氮?dú)?，取出后用超純水徹底沖洗干凈，以除去較弱吸附的空殼納米金。(3)然后將電極浸入L-半胱氨酸中3h，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗干凈。(4)取5 UL乙酰膽堿酯酶溶液滴涂在電極上，常溫下2 h，然后用PH=7. 5的磷酸鹽緩沖溶液沖洗表面，后用氮?dú)獯蹈?，乙酰膽堿酯酶生物傳感器制作完成，保存在4°C條件下備用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例(1)空殼納米金的制備首先制備鈷納米粒子，50 UL of 0.4 M CoCl2 溶液加入50 mL含有8 mM硼氫化鈉和O. 8 mM檸檬酸的去氧純水中，得到鈷納米粒子。 在此期間一直充氮?dú)猓?0 mL鈷納米粒子緩慢加入到18 mL攪拌著的I mM HAuCl4溶液中，所得到的懸浮液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為10000 rps，吸走上清液，5 mL pH 7.5磷酸鹽緩沖溶液加入到離心后得到的沉淀物中，得到空殼納米金溶液；(2)玻碳電極的清洗玻碳電極修飾前，首先浸入熱的“piranha”溶液(H2SO4:30% H2O2 = 3:1)中浸泡15 min，用水清洗干凈，接下來用O. 3 μ m、30 nm的Al2O3漿在麂皮上拋光至鏡面，拋光后用去離子水洗去表面污物，再移入超聲水浴中清洗，每次5 min,重復(fù)二次,然后依次用6 mol/L的HNO3、無水乙醇和去離子水超聲清洗，氮?dú)猸h(huán)境下干燥；(3)玻碳電極的活化徹底洗滌后，電極在O. 5 mol/L H2SO4溶液中用循環(huán)伏安法活化，掃描范圍I. OV -I. 0V,反復(fù)掃描直至達(dá)到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖為止。⑷預(yù)處理好的玻碳電極的測試最后在0.20 mol/L KNO3中記錄I X 1(Γ3 mol/L K3Fe (CN)6溶液的循環(huán)伏安曲線，以測試所述玻碳電極的性能，掃描速度50 mV/s,掃描范圍為-O. IV O. 6V;當(dāng)所述循環(huán)伏安曲線中的峰電位差在80 mV以下，并盡可能接近 64 mV，所述玻碳電極可使用，否則要重新返回步驟(I)中，處理所述玻碳電極，直到符合要求；(5)在前處理完的干凈電極表面滴上5 μ L O. 5 wt%的殼聚糖溶液，讓其在空氣中蒸發(fā)，從而形成一層殼聚糖薄膜；(6)然后將電極浸入不斷攪拌著的空殼納米金乙醇溶液中 12 h，取出后用超純水徹底沖洗干凈，以除去較弱吸附的空殼納米金；(7)將修飾好的浸入 20 mmol/L的L-半胱氨酸中3 h，通過Au-S鍵將L-半胱氨酸組裝到電極表面，用水清洗后，用氮?dú)獯蹈桑?8)取5 yL乙酰膽堿酯酶溶液滴涂在電極上，常溫下2 h，然后用 PH 7.5的磷酸鹽緩沖液沖洗表面，氮?dú)獯蹈?，乙酰膽堿酯酶生物傳感器制作完成，保存在 4°C條件下備用。(9)將上述制備好的乙酰膽堿酯酶傳感器在含有I mM的氯化硫代乙酰膽堿的PH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液中以50 mV/s掃描速度進(jìn)行循環(huán)伏安測試，電位窗口為O.OV I. 2V ; (10)配置O. 05 μ g/L-200 μ g/L的毒死蜱和克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液，農(nóng)藥測量時(shí)，將上述乙酰膽堿酯酶傳感器浸入到不同濃度的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液中10 min，然后在，含有I mM氯化硫代乙酰膽堿(ATCl)的磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，抑制率I可由下式求得
I (%) - (ip； control ip，exp) /ip, control X 100%
其中& ，和& Ρ分別為修飾電極未經(jīng)過農(nóng)藥抑制和經(jīng)過農(nóng)藥抑制后，在ATCl溶液中的峰電流，農(nóng)藥濃度與抑制率呈一定的線性關(guān)系，做出工作曲線圖，得到農(nóng)藥濃度與抑制率之間的線性關(guān)系，以及檢測限。(11)乙酰膽堿酯酶生物傳感器的精確性是通過組內(nèi)偏差實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究的。同一支電極進(jìn)行六次重復(fù)測定獲得組內(nèi)變異系數(shù)；重復(fù)六次制備不同的電極對標(biāo)準(zhǔn)濃度農(nóng)藥測定獲得組間變異系數(shù)。當(dāng)電極不用時(shí)保存在4°C冰箱中，7天和30 天后電流響應(yīng)的變化得到此傳感器的穩(wěn)定性。(12)將農(nóng)藥抑制后的的傳感器浸在4. O mM 的碘解磷定溶液中10 min，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗干凈，在I mM ATCl的磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，以檢測其再生能力；(13)把蔬菜徹底清洗干凈并用去離子水清洗3 次，噴灑上一定濃度的農(nóng)藥，放置24 h后，用磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.5)做溶劑超聲處理 30 min(換溶劑三次)，以檢測實(shí)際樣品的回收率。此種乙酰膽堿酯酶生物傳感器農(nóng)藥殘留的檢測方法操作工藝簡單，檢測時(shí)間較短，檢測農(nóng)藥范圍廣，檢測限低，靈敏度高，穩(wěn)定性好，再生能力高以及對實(shí)際樣品分析有較好的回收率和重現(xiàn)性，符合我國農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)發(fā)展和國際化要求。
權(quán)利要求
1.一種空殼納米金修飾的乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法，其特征在于電流型乙酰膽堿酯酶傳感器的組狀過程為滴涂殼聚糖溶液，在空殼納米金溶液中浸泡12 h，在 L-半胱氨酸中浸泡3 h，滴涂乙酰膽堿酯酶。
2.如權(quán)利要求I所述的一種空殼納米金修飾的乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法， 其特征在于乙酰膽堿酯酶傳感器敏感界面的構(gòu)建及過程表征，乙酰膽堿酯酶傳感器工作曲線的建立，乙酰膽堿酯酶傳感器性能的檢測，乙酰膽堿酯酶傳感器對實(shí)際樣品的檢測。
3.如權(quán)利要求I所述的一種空殼納米金修飾的乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法，其特征在于所制備的電流型乙酰膽堿酯酶傳感器的工作曲線為毒死蜱濃度O. 1-30 μ g/L時(shí)，其線性范圍為y=l. 0329x+17. 429，毒死蜱濃度30-150 μ g/L時(shí)，其線性范圍為 y=0. 2411X+40. 021 ;克百威濃度O. 1-30 μ g/L時(shí)，其線性范圍為y=l. 113χ+14· 047，毒死蜱濃度30-200 μ g/L時(shí)，其線性范圍為y=0. 2307x+41. 218 ;所制備的電流型乙酰膽堿酯酶傳感器的檢測限為毒死蜱為O. 06 μ g/L，克百威為O. 08 μ g/L ;乙酰膽堿酯酶傳感器性能檢測包括準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和再生能力，以及乙酰膽堿酯酶傳感器對蔬菜樣品回收率的測定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種空殼納米金修飾的乙酰膽堿酯酶生物傳感器的制備方法，其特征在于空殼納米金的制備，玻碳電極的清洗活化和表征，滴涂殼聚糖溶液，在空殼納米金溶液中浸泡12h，在L-半胱氨酸中浸泡3h，滴涂乙酰膽堿酯酶，乙酰膽堿酯酶傳感器工作曲線的建立，乙酰膽堿酯酶傳感器性能如準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和再生能力的檢測，乙酰膽堿酯酶傳感器對實(shí)際樣品的檢測。殼聚糖帶有大量正電荷的氨基，通過靜電作用，將納米空殼金吸附到殼聚糖膜上?？諝ぜ{米金能夠促進(jìn)電子的傳遞，并且擁有良好的生物兼容性，L-半胱氨酸具有巰基能穩(wěn)定的固定在金納米空殼上，并且L-半胱氨酸中的大量羧基與酶中大量氨基結(jié)合，將酶固定在電極上。使乙酰膽堿酯酶更加穩(wěn)定的固定在電極上，從而使制備的電流型乙酰膽堿酯酶傳感器檢測時(shí)間短，靈敏度高，穩(wěn)定性好，再生能力好以及可以用于實(shí)際樣品的檢測。
文檔編號G01N27/36GK102608187SQ201210088848
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月30日
發(fā)明者劉君峰, 孫霞, 朱盈, 王相友, 翟晨 申請人:山東理工大學(xué)