專利名稱：一種檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物材料的檢測方法，具體地說是涉及一種檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子的方法。

背景技術(shù)：
目前，無細(xì)胞基質(zhì)是研究和應(yīng)用較多的生物材料，已經(jīng)顯示出巨大的臨床應(yīng)用前景，如小腸粘膜下層(SIS)，膀胱無細(xì)胞基質(zhì)(BAM)。研究者用尿素，鹽酸胍等將SIS和BAM中的總蛋白抽提出來，利用分子生物學(xué)技術(shù)，如免疫印記(WB)、免疫組化(IHC)對生長因子進(jìn)行定性檢測，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)對生長因子進(jìn)行定量檢測，還將抽提物用于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以觀察其生物學(xué)活性。結(jié)果表明，SIS中存在有VEGF，bFGF以及TGF-β等生長因子；豬膀胱細(xì)胞外基質(zhì)含有BMP4，PDGF-BB，KGF，TGFβ1，IGF，bFGF，EGF和TGFα等生長因子；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，SIS和BAM的抽提物能促進(jìn)細(xì)胞的增殖(Hodde等，Endothelium.2001；8(1)11-24.Voytik-Harbin等，J Cell Biochem.1997；67(4)478-91.McDevitt等，J Biomed Mater Res A.2003；67(2)637-40.Chun等，Biomaterials.2007；28(29)4251-6)。上述SIS和BAM抽提液的制備較復(fù)雜，而且會引入尿素、鹽酸胍等試劑。林茂虎等人作了改進(jìn)，將SIS在磷酸鹽緩沖液(PBS)中進(jìn)行孵育；結(jié)果表明，利用ELISA法，在孵育液中檢測到了VEGF和bFGF的存在，這些生長因子是由SIS中釋放PBS中的；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，該孵育液能促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖(林茂虎等，中國康復(fù)理論與實(shí)踐2006；12(7)578-81)。另外，也有研究者用WB、IHC證實(shí)在SIS的抽提物中有黏附因子纖維連接蛋白的存在(Timothy等，Tissue Engineering.1998，4(1)75-83)，而對于BAM中是否保留有這類黏附因子還不得而知。
利用無細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行組織、器官的替代后，組織、器官的修復(fù)和再生是一個(gè)復(fù)雜的過程，這不僅需要臨近的實(shí)質(zhì)細(xì)胞(如膀胱平滑肌細(xì)胞)的向替代區(qū)遷移，黏附到無細(xì)胞基質(zhì)上，在缺損區(qū)不斷增殖，從而修復(fù)缺損區(qū)的結(jié)構(gòu)和功能；還需要臨近的血管內(nèi)皮細(xì)胞向修復(fù)區(qū)遷移、增殖，以建立修復(fù)區(qū)的血液循環(huán)。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)本身所包含的生物活性因子成分復(fù)雜、種類繁多，除了含有促進(jìn)細(xì)胞增殖的生長因子外，還包括有促進(jìn)細(xì)胞黏附的黏附因子以及促進(jìn)細(xì)胞遷移的趨化因子。目前，無細(xì)胞基質(zhì)(如SIS和BAM)的制備方法各異，各種各樣的脫細(xì)胞技術(shù)均可能影響細(xì)胞外基質(zhì)中的生物活性因子，使得制備的無細(xì)胞基質(zhì)不保留或僅保留少量的生物活性因子。因此，制備無細(xì)胞基質(zhì)時(shí)，盡可能地保留這些細(xì)胞外基質(zhì)中的生物活性因子，將有利于組織、器官的修復(fù)和再生。
WB、IHC以及ELISA等技術(shù)均需要針對特定物種的特異性抗體，利用針對細(xì)胞外基質(zhì)中的生物活性因子的特異性抗體(如前所述的針對BMP4，PDGF-BB，KGF，TGFβ1，IGF，bFGF的抗體)即可以檢測無細(xì)胞基質(zhì)中是否保留有這些生物活性因子，但是這些檢測技術(shù)并不能區(qū)分具有生物學(xué)活性的因子和已經(jīng)變形、喪失活性的因子；也不能明確無細(xì)胞基質(zhì)中這些因子的生物學(xué)效應(yīng)。由于細(xì)胞外基質(zhì)中的生物活性因子成分十分復(fù)雜、種類繁多，因此，對于不能提供特異性抗體的生物活性因子，則不能采用此類技術(shù)進(jìn)行定性和定量檢測。而且，WB、IHC以及ELISA等定性定量檢測技術(shù)操作復(fù)雜，成本較高。
利用細(xì)胞生物學(xué)的方法，無需使用大量的特異性抗體，可以直接檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子的生物學(xué)效應(yīng)，如細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。但是，采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，僅能單一的檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生長因子，而對于在組織、器官的修復(fù)和再生中發(fā)揮重要作用的黏附因子和趨化因子還不明確。因此，除了檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生長因子外，還需要同時(shí)檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的黏附因子和趨化因子。
綜上所述，本領(lǐng)域迫切需要提供一種檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子的方法，有效地檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的黏附因子、生長因子和趨化因子。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子的方法，通過細(xì)胞生物學(xué)的方法，有效地檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子中的黏附因子、生長因子和趨化因子。
本發(fā)明的目的通過以下的技術(shù)方案實(shí)施 一種檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子的方法，其特征在于所述的生物活性因子包括黏附因子、生長因子和趨化因子，該檢測方法的步驟如下 a)種子細(xì)胞的分離和培養(yǎng)； b)將無菌的無細(xì)胞基質(zhì)浸入緩沖液中，勻漿，離心，吸取無細(xì)胞基質(zhì)勻漿上清液，保存?zhèn)溆茫? c)用上述的無細(xì)胞基質(zhì)勻漿上清液包被培養(yǎng)板，進(jìn)行種子細(xì)胞的細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)，以檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子中的黏附因子； d)分別配制種子細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和全培養(yǎng)基，將其各等分為兩份，其中一份浸入無菌的無細(xì)胞基質(zhì)，振蕩孵育后得到條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基和條件全培養(yǎng)基，另一份不浸入無菌的無細(xì)胞基質(zhì)，也同時(shí)進(jìn)行振蕩孵育，得到對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基和對照全培養(yǎng)基； e)用上述的條件全培養(yǎng)基和對照全培養(yǎng)基進(jìn)行種子細(xì)胞的培養(yǎng)，繪制細(xì)胞生長曲線，比較種子細(xì)胞的生長速率，以檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子中的生長因子； f)用步驟d中的條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基和對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行種子細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)，以檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子中的生長因子； g)用步驟d中的條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基和對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行種子細(xì)胞的遷移實(shí)驗(yàn)，以檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子中的趨化因子； h)用步驟d中的條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基和對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行種子細(xì)胞的刮傷愈合實(shí)驗(yàn)，以檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子中的趨化因子； i)根據(jù)步驟c，e，f，g和h的檢測結(jié)果以確定無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子中含有黏附因子、生長因子和趨化因子，或者含有這三種因子中的一種或兩種。
上述的檢測方法，其特征在于所述的種子細(xì)胞為人膀胱平滑肌細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。
上述的檢測方法，其特征在于所述的無細(xì)胞基質(zhì)為豬、兔、狗或牛的膀胱無細(xì)胞基質(zhì)或豬小腸粘膜下層。
上述的檢測方法，其特征在于在步驟b中所述的緩沖液為4℃預(yù)冷的無菌的10mM磷酸鹽緩沖液，PH為7.2-7.4，體積為1-3ml；進(jìn)行研磨勻漿，勻漿的溫度為4℃，時(shí)間為20-30分鐘；離心的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分，溫度為4℃，時(shí)間為10分鐘；上清液保存的溫度為-20℃-4℃。
上述的檢測方法，其特征在于在步驟c中所述的無細(xì)胞基質(zhì)勻漿上清液包被培養(yǎng)板為一次性6孔培養(yǎng)板，其無細(xì)胞基質(zhì)勻漿上清液的用量為0.2-0.6ml/孔，包被的溫度為4℃-37℃，包被的時(shí)間為30分鐘-12小時(shí)；細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞黏附的時(shí)間為20分鐘-5小時(shí)。
上述的檢測方法，其特征在于在步驟d中所述的種子細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和全培養(yǎng)基，其中種子細(xì)胞中的人膀胱平滑肌細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和全培養(yǎng)基分別為含0.5％胎牛血清、0.5％牛血清白蛋白的DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基和含10％胎牛血清的DMEM/F-12全培養(yǎng)基；種子細(xì)胞中的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和全培養(yǎng)基分別為含0.5％胎牛血清的EBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基和含生長因子MVBulletKit、10％胎牛血清的EGM-2全培養(yǎng)基；分別配制的體積均為20ml；振蕩為采用手搖人工振蕩，每日2次，每次持續(xù)0.5分鐘；孵育的溫度為4℃，持續(xù)時(shí)間為7天。
上述的檢測方法，其特征在于在步驟e中所述的細(xì)胞生長曲線為利用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒所繪制的細(xì)胞數(shù)-細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的生長曲線。
上述的檢測方法，其特征在于在步驟f中所述的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)為利用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒所進(jìn)行的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。
上述的檢測方法，其特征在于在步驟g中所述的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)為利用細(xì)胞遷移小室所進(jìn)行的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明的檢測方法中，將無細(xì)胞基質(zhì)(如豬BAM和豬SIS)進(jìn)行勻漿處理，所得的勻漿液用來包被培養(yǎng)板后，進(jìn)行種子細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)，觀察經(jīng)無細(xì)胞基質(zhì)勻漿上清液包被的培養(yǎng)板是否能促進(jìn)人膀胱平滑肌細(xì)胞(HBSMC)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的快速黏附，以檢測無細(xì)胞基質(zhì)是否保留有黏附因子。胎牛血清(FBS)和牛血清白蛋白(BSA)是許多生物活性因子的結(jié)合蛋白，因此，將無細(xì)胞基質(zhì)浸入含有FBS和(或)BSA的培養(yǎng)基中，F(xiàn)BS和BSA能與生物活性因子結(jié)合，通過振蕩，使其釋放到培養(yǎng)基中，并能保持這些因子的活性穩(wěn)定，延長其失活時(shí)間。據(jù)此原理，以浸入無細(xì)胞基質(zhì)的培養(yǎng)基制備條件培養(yǎng)基(包括條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基和條件全培養(yǎng)基)，以含相同濃度的同批次FBS和(或)BSA的培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基(包括對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基和對照全培養(yǎng)基)。然后，用細(xì)胞生物學(xué)的方法，觀察條件培養(yǎng)基中是否含有促進(jìn)細(xì)胞增殖的生長因子和促進(jìn)細(xì)胞遷移的趨化因子，從而確定無細(xì)胞基質(zhì)中是否保留有生長因子和趨化因子。
豬BAM勻漿上清液包被培養(yǎng)板后，能促進(jìn)HBSMC和HUVEC快速黏附，這表明我們所制備的豬BAM保留有黏附因子；HBSMC和HUVEC在豬BAM條件全培養(yǎng)基中具有更高的生長速率，在豬BAM條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基具有更高的增殖活性，這表明我們所制備的豬BAM保留有生長因子；同時(shí)，豬BAM條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基能促進(jìn)HBSMC和HUVEC遷移、刮傷愈合，這表明我們所制備的豬BAM還保留有趨化因子。相似地，豬SIS勻漿上清液包被培養(yǎng)板后，也能促進(jìn)HBSMC和HUVEC快速黏附，這表明我們所制備的豬SIS保留有黏附因子；HBSMC和HUVEC在豬SIS條件全培養(yǎng)基中具有更高的生長速率，在豬SIS條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基中具有更高的增殖活性，這表明我們所制備的豬SIS也保留有生長因子；同時(shí)豬SIS條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基能促進(jìn)HBSMC和HUVEC遷移、刮傷愈合，這表明我們所制備的豬SIS還保留有趨化因子。
綜上所述，我們所制備的豬BAM和豬SIS不僅保留有黏附因子，還同時(shí)保留有生長因子和趨化因子。因此，我們所制備的豬BAM和豬SIS是保留有生物活性因子的無細(xì)胞基質(zhì)。
有益效果 本發(fā)明所提供的一種檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子的方法，與傳統(tǒng)的分子生物學(xué)的方法相比，有如下優(yōu)點(diǎn)(1)直接檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子的生物學(xué)效應(yīng)；(2)不僅能檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的促進(jìn)細(xì)胞黏附的黏附因子，還能同時(shí)檢測促進(jìn)細(xì)胞增殖的生長因子和促進(jìn)細(xì)胞遷移的趨化因子；(3)避免了WB、IHC和ELISA等檢測技術(shù)，無需使用大量的特異性抗體，降低了經(jīng)濟(jì)成本；(4)避免了WB、IHC和ELISA等技術(shù)的無法區(qū)分有活性的因子和已經(jīng)失活的因子，本檢測方法可判斷這些因子是否具有生物學(xué)活性，結(jié)果更有價(jià)值；(4)本檢測方法操作簡單，所需的試劑、設(shè)備較少；(5)本方法可進(jìn)一步改進(jìn)條件培養(yǎng)基的配制，以對多種無細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行同時(shí)檢測。



圖1豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)(BAM)和豬小腸粘膜下層(SIS)勻漿上清液包被培養(yǎng)板，均能促進(jìn)人膀胱平滑肌細(xì)胞(HBSMC)黏附(*p＜0.05)。
圖2豬BAM和豬SIS勻漿上清液包被培養(yǎng)板，均能促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的黏附(*p＜0.05)。
圖1和圖2的附圖標(biāo)記

對照組

豬小腸粘膜下層勻漿上清液包被組

豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)勻漿上清液包被組 圖3HBSMC和HUVEC在豬BAM條件全培養(yǎng)基中的生長速率快于對照全培養(yǎng)基。
附圖標(biāo)記

人膀胱平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)于對照全培養(yǎng)基

人膀胱平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)于豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)條件全培養(yǎng)基

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于對照全培養(yǎng)基

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)條件全培養(yǎng)基 圖4HBSMC和HUVEC在豬SIS條件全培養(yǎng)基中的生長速率快于對照全培養(yǎng)基。
附圖標(biāo)記

人膀胱平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)于對照全培養(yǎng)基

人膀胱平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)于豬小腸粘膜下層條件全培養(yǎng)基

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于對照全培養(yǎng)基

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于豬小腸粘膜下層條件全培養(yǎng)基 圖5HBSMC和HUVEC在豬BAM條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的增殖活性明顯高于對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基(*p＜0.05)。
附圖標(biāo)記

對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基

豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基 圖6HBSMC和HUVEC在豬SIS條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的增殖活性明顯高于對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基(*p＜0.05)。
附圖標(biāo)記

對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基

豬小腸粘膜下層條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基 圖7HBSMC和HUVEC在豬BAM條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的遷移活性明顯高于對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基(*p＜0.05)。
附圖標(biāo)記

對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基

豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基 圖8HBSMC和HUVEC在豬SIS條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的遷移活性明顯高于對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基(*p＜0.05)。
附圖標(biāo)記

對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基

豬小腸粘膜下層條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基 圖9豬BAM條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基更能促進(jìn)HBSMC和HUVEC的刮傷愈合(*p＜0.05)。
附圖標(biāo)記

對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基

豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基 圖10豬SIS條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基更能促進(jìn)HBSMC和HUVEC的刮傷愈合(*p＜0.05)。
附圖標(biāo)記

對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基

豬小腸粘膜下層條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)的制備，其制備步驟如下 a)豬膀胱的獲取將體重為20公斤的豬的膀胱和部分尿道全部取出，置于4℃預(yù)冷的10mM磷酸鹽緩沖液，PH7.2-7.4中，迅速帶到實(shí)驗(yàn)室后仔細(xì)去除外表面的脂肪和漿膜組織，經(jīng)尿道插入輸液皮條導(dǎo)管并將其用絲線固定在尿道上，然后經(jīng)此輸液皮條導(dǎo)管用4℃預(yù)冷的10mM磷酸鹽緩沖液，PH7.2-7.4沖洗膀胱3次，將膀胱腔內(nèi)的尿液沖洗干凈； b)經(jīng)輸液皮條導(dǎo)管向膀胱腔內(nèi)灌入100ml含0.25％/0.038％的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸四鈉的消化液，PH為7.2-7.4，夾閉輸液皮條導(dǎo)管，再將整個(gè)膀胱完全浸入此消化液中，室溫中振蕩消化2小時(shí)，然后倒出此消化液； c)再經(jīng)輸液皮條導(dǎo)管用4℃預(yù)冷的10mM磷酸鹽緩沖液，PH7.2-7.4，沖洗3次，然后倒出此緩沖液； d)再經(jīng)輸液皮條導(dǎo)管向膀胱腔內(nèi)灌入300ml的10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，PH 8.0，內(nèi)含5mM乙二胺四乙酸四鈉和10KIU/ml抑肽酶，夾閉輸液皮條導(dǎo)管，再將整個(gè)膀胱完全浸入此低滲緩沖液中，4℃靜置過夜，然后倒出此低滲緩沖液； e)再經(jīng)輸液皮條導(dǎo)管用4℃預(yù)冷的10mM磷酸鹽緩沖液，PH7.2-7.4，沖洗3次，然后倒出此緩沖液； f)再經(jīng)輸液皮條導(dǎo)管向膀胱腔內(nèi)灌入300ml的含1.0％曲拉通X-100的50mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，PH 8.0，內(nèi)含0.5M氯化鈉，10mM乙二胺四乙酸四鈉和10KIU/ml抑肽酶；夾閉輸液皮條導(dǎo)管，再將整個(gè)膀胱完全浸入此含曲拉通X-100的高滲緩沖液中，室溫中振蕩洗滌24小時(shí)，然后倒出此含曲拉通X-100的高滲緩沖液； g)再經(jīng)輸液皮條導(dǎo)管用4℃預(yù)冷的10mM磷酸鹽緩沖液，PH7.2-7.4，沖洗3次，然后倒出此緩沖液； h)再經(jīng)輸液皮條導(dǎo)管向膀胱腔內(nèi)灌入300ml的含50U/ml I型脫氧核糖核酸酶和1U/ml A型核糖核酸酶的10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，PH 7.6，內(nèi)含2mM氯化鎂，2mM氯化鈣和150mM氯化鈉，夾閉輸液皮條導(dǎo)管，再將整個(gè)膀胱完全浸入此含核酸酶的緩沖液中，室溫中振蕩洗滌24小時(shí)，然后倒出此含核酸酶的緩沖液，得到豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)； i)將上述的豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)用4℃預(yù)冷的10mM磷酸鹽緩沖液，PH7.2-7.4，沖洗3次； j)將上述的豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)用4℃預(yù)冷的無菌去離子水沖洗3次； k)將上述的豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)置于-70℃的深低溫冰箱中冷凍3小時(shí)，再在冷凍干燥機(jī)中凍干48小時(shí)，得到凍干的豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)； l)將上述的凍干的豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行環(huán)氧乙烷滅菌，得到無菌的豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)； m)將上述的無菌的豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)4℃密封保存，備用。
上述制備的豬BAM，不含細(xì)胞，無尿路上皮層、無粘膜下層、無血管系統(tǒng)。免疫組化染色表明豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)的平滑肌肌動(dòng)蛋白、結(jié)蛋白和波形蛋白染色均陰性，I型膠原蛋白染色陽性，具有良好的生物相容性。
實(shí)施例2豬小腸粘膜下層的制備，其制備步驟如下 a)豬小腸的獲取取一段長約20cm的豬小腸，用4℃預(yù)冷的10mM磷酸鹽緩沖液(PH7.2-7.4)沖洗干凈后帶到實(shí)驗(yàn)室； b)用眼科剪仔細(xì)剪去腸系膜，用解剖刀仔細(xì)刮去小腸外膜層及肌層，然后翻轉(zhuǎn)小腸，使小腸粘膜層朝外，同法刮去粘膜上皮層和固有層，得到一層厚約0.1mm的半透明的薄膜； c)將上述的半透明的薄膜置于40ml的含0.2％曲拉通X-100的50mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液中，PH 8.0，內(nèi)含0.5M氯化鈉，10mM乙二胺四乙酸四鈉和10KIU/ml抑肽酶，室溫中振蕩洗滌2小時(shí)； d)然后用4℃預(yù)冷的10mM磷酸鹽緩沖液，PH7.2-7.4，洗滌3次； e)然后置于40ml的含50U/ml I型脫氧核糖核酸酶和1U/ml A型核糖核酸酶的10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液中，PH 7.6，內(nèi)含2mM氯化鎂，2mM氯化鈣和150mM氯化鈉，室溫中振蕩洗滌2小時(shí)； f)然后置于40ml的0.1％過氧乙酸中，4℃浸泡過夜； g)然后用4℃預(yù)冷的10mM磷酸鹽緩沖液，PH7.2-7.4，洗滌3次，得到豬小腸粘膜下層； h)將上述的豬小腸粘膜下層用4℃預(yù)冷的無菌去離子水洗滌3次； i)將上述的豬小腸粘膜下層置于-70℃的深低溫冰箱中冷凍2小時(shí)，再在冷凍干燥機(jī)中凍干24小時(shí)，得到凍干的豬小腸粘膜下層； j)將上述的凍干的豬小腸粘膜下層進(jìn)行環(huán)氧乙烷滅菌，得到無菌的豬小腸粘膜下層； k)將上述的無菌的豬小腸粘膜下層4℃密封保存，備用。
經(jīng)上述方法所制備的豬SIS無細(xì)胞成分殘留，具有良好的組織相容性。
實(shí)施例3.種子細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 3.1HBSMC的分離、培養(yǎng)和鑒定 經(jīng)根治性全膀胱切除的膀胱癌患者同意，取一小塊無明顯腫瘤生長的膀胱組織，用機(jī)械分離法將尿路上皮層完整去除，采用濃度為0.25％/0.038％的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸四鈉和0.1％I型膠原酶序貫消化，將所得的細(xì)胞懸液接種于含10％FBS的DMEM/F-12全培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并用細(xì)胞爬片免疫染色觀察平滑肌肌動(dòng)蛋白，結(jié)蛋白的表達(dá)。
倒置顯微鏡下觀察，體外培養(yǎng)的人膀胱平滑肌細(xì)胞呈長梭形，融合后呈典型的“峰谷”樣形態(tài)；平滑肌肌動(dòng)蛋白和結(jié)蛋白染色均陽性，陽性率大于98％。本發(fā)明選用第2-5代的HBSMC. 3.2HUVEC的分離、培養(yǎng)和鑒定 經(jīng)產(chǎn)婦同意，取一段長約20cm的臍帶，用生理鹽水將臍靜脈沖洗3次，然后在臍靜脈中灌入0.1％I型膠原酶溶液消化10分鐘，將消化下來的細(xì)胞收集重懸于含生長因子MV BulletKit、10％FBS的EGM-2全培養(yǎng)基，接種到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。利用倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；利用流式細(xì)胞技術(shù)觀察CD146和CD105的表達(dá)情況。
倒置顯微鏡下觀察，體外培養(yǎng)的HUVEC呈橢圓形；流式細(xì)胞分析，其表達(dá)CD146和CD105，雙陽性率達(dá)100％。本發(fā)明中均使用2-5代的HUVEC。
實(shí)施例4.檢測豬BAM和豬SIS中保留的生物活性因子中的細(xì)胞黏附因子 4.1BAM勻漿，取上清液 取一塊2cm×2cm的無菌的豬BAM放玻璃組織勻漿器中，加入2ml 4℃預(yù)冷的無菌的10mM PBS(PH7.2-7.4)中，4℃研磨勻漿30分鐘；然后將勻漿液移至離心管中，4℃、12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；吸取上清液，將上清液4℃保存?zhèn)溆谩?br> 4.2SIS勻漿，取上清液 取一塊2cm×2cm的無菌的豬SIS放玻璃組織勻漿器中，加入2ml 4℃預(yù)冷的無菌的10mM PBS(PH7.2-7.4)中，4℃研磨勻漿30分鐘；然后將勻漿液移至離心管中，4℃、12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；吸取上清液，將上清液4℃保存?zhèn)溆谩?br> 4.3細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 分別取上述豬BAM和豬SIS勻漿后得到的上清液，預(yù)熱至37℃；取一次性6孔培養(yǎng)板，以0.4ml/孔的上清液，37℃包被培養(yǎng)孔1小時(shí)作為實(shí)驗(yàn)組，以0.4ml/孔的10mM的無菌的PBS(PH7.2-7.4)，37℃包被培養(yǎng)孔1小時(shí)作為對照組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔；實(shí)驗(yàn)組和對照組分別加入細(xì)胞密度為5×105/ml的細(xì)胞懸液1.5ml，然后每組分別培養(yǎng)0.5，1，3小時(shí)；培養(yǎng)結(jié)束后，將黏附細(xì)胞用胰蛋白酶消化下來，計(jì)數(shù)出黏附細(xì)胞數(shù)，然后計(jì)算出黏附細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)。數(shù)據(jù)用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理(p＜0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。
細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(見圖1和圖2)表明，培養(yǎng)板用豬BAM和豬SIS勻漿上清液包被后，均能明顯地促進(jìn)HBSMC和HUVEC黏附(p＜0.05)。這表明，豬BAM和豬SIS中均保留有促進(jìn)細(xì)胞黏附的黏附因子。
實(shí)施例5.檢測豬BAM和豬SIS中保留的細(xì)胞生物活性因子中的細(xì)胞生長因子和趨化因子 5.1制備豬BAM條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基、BAM條件全培養(yǎng)基，對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基、對照全培養(yǎng)基 首先分別配制20ml的含0.5％胎牛血清、0.5％牛血清白蛋白的DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基和20ml的含0.5％胎牛血清的EBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基；20ml的含10％胎牛血清的DMEM/F-12全培養(yǎng)基和20ml的含生長因子MV BulletKit、10％胎牛血清的EGM-2全培養(yǎng)基；分別將上述四種培養(yǎng)基均分為兩份，即每份10ml；分別于10mlDMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10ml EBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10ml DMEM/F-12全培養(yǎng)基和10ml EGM-2全培養(yǎng)基中各浸入一塊5cm×5cm大小的無菌的豬BAM；浸入BAM和未浸入BAM的培養(yǎng)基同時(shí)置于4℃孵育7天，孵育期間每日手搖人工振蕩2次，每次持續(xù)0.5分鐘；最后得到BAM條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基、BAM條件全培養(yǎng)基，對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基、對照全培養(yǎng)基，備用。
5.2制備豬SIS條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基、SIS條件全培養(yǎng)基，對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基、對照全培養(yǎng)基 方法同5.1所述，首先分別配制20ml的含0.5％胎牛血清、0.5％牛血清白蛋白的DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基和20ml的含0.5％胎牛血清的EBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基；20ml的含10％胎牛血清的DMEM/F-12全培養(yǎng)基和20ml的含生長因子MV BulletKit、10％胎牛血清的EGM-2全培養(yǎng)基；分別將上述四種培養(yǎng)基均分為兩份，即每份10ml；分別于10ml DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10ml EBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10mlDMEM/F-12全培養(yǎng)基和10ml EGM-2全培養(yǎng)基中各浸入一塊5cm×5cm大小的無菌的豬SIS；浸入SIS和未浸入SIS的培養(yǎng)基同時(shí)置于4℃孵育7天，孵育期間每日手搖人工振蕩2次，每次持續(xù)0.5分鐘；最后得到SIS條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基、SIS條件全培養(yǎng)基，對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基、對照全培養(yǎng)基，備用。
5.3繪制生長曲線，比較HBSMC和HUVEC在豬BAM條件全培養(yǎng)基和對照全培養(yǎng)基中的生長速率 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線HBSMC和HUVEC分別以不同細(xì)胞數(shù)接種于0.1％明膠預(yù)包被的96孔板，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)3小時(shí)細(xì)胞貼壁后每孔加入10μl的CCK-8；HBSMC孔繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，HUVEC孔繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)；然后將96孔板在酶標(biāo)儀上讀取450/620nm的吸光度(OD)值，制作0D(450/620nm)-細(xì)胞數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
HBSMC和HUVEC的生長曲線用全培養(yǎng)基分別調(diào)整HBSMC的細(xì)胞密度為2.5×104/ml、HUVEC的細(xì)胞密度為4×104/ml，以100μl細(xì)胞懸液/孔接種于0.1％明膠預(yù)包被的96孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)過夜后換用豬BAM條件全培養(yǎng)基和對照全培養(yǎng)基分別培養(yǎng)1，2，4，6，8天。然后每孔加入10μl的CCK-8溶液，HBSMC孔繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，HUVEC孔繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，然后讀取450/620nm的OD值，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算HBSMC和HUVEC在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖3)表明，與對照全培養(yǎng)基相比，HBSMC和HUVEC在豬BAM條件全培養(yǎng)基中的生長速率更快，這表明豬BAM中保留有生長因子。
5.4繪制生長曲線，比較HBSMC和HUVEC在豬SIS條件全培養(yǎng)基和對照全培養(yǎng)基中的生長速率 方法如5.3所述。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖4)表明，HBSMC和HUVEC在豬SIS條件全培養(yǎng)基中的生長速率快于對照全培養(yǎng)基中，這表明豬SIS中保留有生長因子。
5.5進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，比較HBSMC和HUVEC在豬BAM條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基和對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的增殖活性 用全培養(yǎng)基將種子細(xì)胞以4×103個(gè)HBSMC/孔或5×103個(gè)HUVEC/孔接種于0.1％明膠預(yù)包被的96孔板，同時(shí)設(shè)立對應(yīng)的不含細(xì)胞只有培養(yǎng)基的空白孔，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)過夜；然后，HBSMC孔換用DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM/F-12含0.5％FBS和0.5％BSA)周期同步化48小時(shí)，HUVEC孔換用EBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EBM-2含0.5％FBS)周期同步化24小時(shí)；然后分別換用豬BAM條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)孔，對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照孔，不含細(xì)胞的孔作為空白孔，培養(yǎng)48小時(shí)；培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10μl的CCK-8溶液，HBSMC孔繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，HUVEC孔則繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)；最后讀取450/620nm的OD值，實(shí)驗(yàn)孔和對照孔的OD值分別減去對應(yīng)空白孔的OD值，用Independent Samples Student’st-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(p＜0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖5)表明，HBSMC和HUVEC在豬BAM條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的增殖活性明顯高于對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基(p＜0.05)，這表明豬BAM中保留有生長因子。
5.6進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，比較HBSMC和HUVEC在豬SIS條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基和對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的增殖活性 方法同5.5所述。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖6)表明，HBSMC和HUVEC在豬SIS條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的增殖活性明顯高于對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基(p＜0.05)，這表明豬SIS中保留有生長因子。
5.7進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，比較HBSMC和HUVEC在豬BAM條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基和對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的遷移活性 融合80％的HBSMC和HUVEC分別在DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM/F-12含0.5％FBS和0.5％BSA)和EBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EBM-2含0.5％FBS)中培養(yǎng)過夜；將Millicell小室PET膜(孔徑8μm)的下表面包被0.1％明膠；消化細(xì)胞，分別用上述兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整HBSMC和HUVEC細(xì)胞密度為5×103/ml。將Millicell小室放入24孔板，下室加入1300μl的豬BAM條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，下室加入1300μl的對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照組；上室加入HBSMC或HUVEC細(xì)胞懸液200μl，上室只含培養(yǎng)基不含細(xì)胞的孔作為空白孔，各設(shè)三個(gè)復(fù)孔；HBSMC孔培養(yǎng)10小時(shí)，HUVEC孔培養(yǎng)6小時(shí)；培養(yǎng)結(jié)束后，取出Millicell小室，95％酒精室溫固定10分鐘；室溫條件下，0.2％結(jié)晶紫溶液染色20分鐘；用大量PBS洗滌去除多余的結(jié)晶紫染液后用棉棒輕輕地去除PET膜上表面的細(xì)胞；然后將Millicell小室轉(zhuǎn)移到含有300ul的10％乙酸溶液的24孔板中，在室溫下振蕩抽提10分鐘；最后將抽提的藍(lán)色液體轉(zhuǎn)移到96孔板，讀取570nm的OD值。將實(shí)驗(yàn)孔、對照孔的OD值分別減去對應(yīng)空白孔的OD值，用Independent Samples Student’s t-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(p＜0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖7)表明，HBSMC和HUVEC在豬BAM條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的遷移活性明顯高于對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基(p＜0.05)，這表明豬BAM中保留有趨化因子。
5.8進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，比較HBSMC和HUVEC在豬SIS條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基和對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的遷移活性 方法同5.7所述。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖8)表明，HBSMC和HUVEC在豬SIS條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的遷移活性明顯高于對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基(p＜0.05)，這表明豬SIS中保留有趨化因子。
5.9進(jìn)行細(xì)胞刮傷愈合實(shí)驗(yàn)，比較豬BAM條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基和對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基促進(jìn)HBSMC和HUVEC刮傷愈合的潛能 分別接種HBSMC和HUVEC于24孔板，全培養(yǎng)基培養(yǎng)至80％融合后，HBSMC換用DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM/F-12含0.5％FBS和0.5％BSA)周期同步化48小時(shí)，HUVEC孔換用EBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EBM-2含0.5％FBS)周期同步化24小時(shí)；利用200μl的黃色槍頭在單層細(xì)胞上做一刮傷，PBS洗滌兩次去除脫落的細(xì)胞碎片，記錄刮傷區(qū)的初始面積；加入豬BAM條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)孔，加入對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照孔，每組三個(gè)復(fù)孔。HBSMC孔培養(yǎng)48小時(shí)，HUVEC孔培養(yǎng)36小時(shí)；然后再次記錄刮傷區(qū)的愈合后面積。刮傷區(qū)的初始面積減去愈合后面積，得到細(xì)胞愈合面積，細(xì)胞愈合的面積除以刮傷區(qū)的初始面積即得到刮傷愈合率，所得數(shù)據(jù)用Independent Samples Student’s t-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(p＜0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。
刮傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖9)表明，豬BAM條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基更能促進(jìn)HBSMC和HUVEC的刮傷愈合(p＜0.05)，這表明豬BAM中保留有趨化因子。
5.10進(jìn)行細(xì)胞刮傷愈合實(shí)驗(yàn)，比較豬SIS條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基和對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基促進(jìn)HBSMC和HUVEC刮傷愈合的潛能 方法同5.9所述。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖10)表明，豬SIS條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基更能促進(jìn)HBSMC和HUVEC的刮傷愈合(p＜0.05)，這表明豬SIS中保留有趨化因子。
綜上所述，根據(jù)實(shí)施例4和實(shí)施例5的檢測結(jié)果，可以確定，我們所制備的豬BAM和豬SIS保留的生物活性因子中，不僅有黏附因子，還有生長因子和趨化因子。
權(quán)利要求
1.一種檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子的方法，其特征在于所述的生物活性因子包括黏附因子、生長因子和趨化因子，該檢測方法的步驟如下
a)種子細(xì)胞的分離和培養(yǎng)；
b)將無菌的無細(xì)胞基質(zhì)浸入緩沖液中，勻漿，離心，吸取無細(xì)胞基質(zhì)勻漿上清液，保存?zhèn)溆茫?br> c)用上述的無細(xì)胞基質(zhì)勻漿上清液包被培養(yǎng)板，進(jìn)行種子細(xì)胞的細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)，以檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子中的黏附因子；
d)分別配制種子細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和全培養(yǎng)基，將其各等分為兩份，其中一份浸入無菌的無細(xì)胞基質(zhì)，振蕩孵育后得到條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基和條件全培養(yǎng)基，另一份不浸入無菌的無細(xì)胞基質(zhì)，也同時(shí)進(jìn)行振蕩孵育，得到對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基和對照全培養(yǎng)基；
e)用上述的條件全培養(yǎng)基和對照全培養(yǎng)基進(jìn)行種子細(xì)胞的培養(yǎng)，繪制細(xì)胞生長曲線，比較種子細(xì)胞的生長速率，以檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子中的生長因子；
f)用步驟d中的條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基和對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行種子細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)，以檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子中的生長因子；
g)用步驟d中的條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基和對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行種子細(xì)胞的遷移實(shí)驗(yàn)，以檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子中的趨化因子；
h)用步驟d中的條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基和對照基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行種子細(xì)胞的刮傷愈合實(shí)驗(yàn)，以檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子中的趨化因子；
i)根據(jù)步驟c，e，f，g和h的檢測結(jié)果以確定無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子中含有黏附因子、生長因子和趨化因子，或者含有這三種因子中的一種或兩種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的種子細(xì)胞為人膀胱平滑肌細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的無細(xì)胞基質(zhì)為豬、兔、狗或牛的膀胱無細(xì)胞基質(zhì)或豬小腸粘膜下層。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于在步驟b中所述的緩沖液為4℃預(yù)冷的無菌的10mM磷酸鹽緩沖液，PH為7.2-7.4，體積為1-3ml；進(jìn)行研磨勻漿，勻漿的溫度為4℃，時(shí)間為20-30分鐘；離心的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分，溫度為4℃，時(shí)間為10分鐘；上清液保存的溫度為-20℃-4℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于在步驟c中所述的無細(xì)胞基質(zhì)勻漿上清液包被培養(yǎng)板為一次性6孔培養(yǎng)板，其無細(xì)胞基質(zhì)勻漿上清液的用量為0.2-0.6ml/孔，包被的溫度為4℃-37℃，包被的時(shí)間為30分鐘-12小時(shí)；細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞黏附的時(shí)間為20分鐘-5小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于在步驟d中所述的種子細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和全培養(yǎng)基，其中種子細(xì)胞中的人膀胱平滑肌細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和全培養(yǎng)基分別為含0.5％胎牛血清、0.5％牛血清白蛋白的DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基和含10％胎牛血清的DMEM/F-12全培養(yǎng)基；種子細(xì)胞中的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和全培養(yǎng)基分別為含0.5％胎牛血清的EBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基和含生長因子MV BulletKit、10％胎牛血清的EGM-2全培養(yǎng)基；分別配制的體積均為20ml；振蕩為采用手搖人工振蕩，每日2次，每次持續(xù)0.5分鐘；孵育的溫度為4℃，持續(xù)時(shí)間為7天。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于在步驟e中所述的細(xì)胞生長曲線為利用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒所繪制的細(xì)胞數(shù)-細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的生長曲線。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于在步驟f中所述的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)為利用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒所進(jìn)行的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于在步驟g中所述的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)為利用細(xì)胞遷移小室所進(jìn)行的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子的方法，通過細(xì)胞生物學(xué)的方法，以檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的黏附因子、生長因子和趨化因子。將無細(xì)胞基質(zhì)勻漿處理，吸取上清液包被培養(yǎng)板，進(jìn)行種子細(xì)胞的黏附實(shí)驗(yàn)，以檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的黏附因子；制備無細(xì)胞基質(zhì)的條件培養(yǎng)基，觀察種子細(xì)胞在此條件培養(yǎng)基中的生長速率，增殖、遷移活性和刮傷愈合的潛能，來檢測無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生長因子和趨化因子。本發(fā)明著眼于無細(xì)胞基質(zhì)中保留的生物活性因子的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，檢測技術(shù)簡單，方便，成本較低，可進(jìn)一步推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/02GK101328493SQ200810020809
公開日2008年12月24日 申請日期2008年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月1日
發(fā)明者斌 楊, 孫則禹, 戴玉田 申請人:南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院